Phát hiện vius bệnh dịch tả heo dựa trên đoạn gen NS5B

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC


KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO
DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B

Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khố: 2003 – 2007
Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ THU NGÂN

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC


KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÁT HIỆN VIRUS BỆNH DỊCH TẢ HEO
DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B

Giáo viên hƣớng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN

NGÔ THỊ THU NGÂN

KS. VƢƠNG HỒ VŨ
KS. LƢƠNG QUÝ PHƢƠNG

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007


LỜI CẢM TẠ
Trước tiên con xin gởi ngàn lời cảm ơn đến ba mẹ kính u, ba mẹ đã ln hy
sinh để dành những gì tốt đẹp nhất cho con. Con xin cảm ơn tất cả người thân đã
luôn yêu thương, quan tâm và luôn cổ vũ cho con học tập.
Em xin chân thành cảm ơn:
 Ban giám hiệu trường Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt
những kiến thức quý báu cho em trong suốt 4 năm học.
 Ban giám đốc cùng tập thể cán bộ Trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường
Đại học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện thuận lợi và tận
tình giúp đỡ em trong suốt thời gian thực tập
Em xin trân trọng biết ơn cô Trần Thị Dân và thầy Nguyễn Ngọc Tuân đã hết
lòng hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho em trong suốt quá trình thực
hiện đề tài tốt nghiệp.
Em xin chân thành cảm ơn anh Vương Hồ Vũ, anh Lương Quý Phương đã
luôn chỉ dẫn tận tình cho em trong suốt quá trình thực tập.
Em xin gởi lời cảm ơn đến:
 Thầy Phát, anh Út, chị Hưng, chị Trang, cùng với các anh chị ở Trung tâm

đã luôn giúp đỡ, động viên em trong những lúc khó khăn.
 Các bạn lớp CNSH K29 thân yêu đã luôn cùng tôi chia xẻ, cổ vũ và giúp đỡ
nhau trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.

iii


TĨM TẮT KHĨA LUẬN
Ngơ Thị Thu Ngân, Đại học Nơng Lâm TP. Hồ chí Minh, tháng 9/2007,
“PHÁT HIỆN VIRUS DTH DỰA TRÊN ĐOẠN GEN NS5B”.
Hướng dẫn khoa học:
PGS. TS. Trần Thị Dân
KS. Vương Hồ Vũ
KS. Lương Quý Phương
Đề tài được tiến hành từ ngày 01 tháng 03 năm 2007 đến ngày 01 tháng 08
năm 2007 tại Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hố sinh trường Đại học Nơng Lâm
thành phố Hồ Chí Minh.
Gen NS5B là một trong những gen của bộ gen virus DTH ngày càng được
sử dụng nhiều trong những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus
DTH. Do đó, việc phát hiện virus DTH bằng phương pháp RT-PCR khuếch đại
đoạn gen NS5B nhằm ứng dụng vào cơng tác chuẩn đốn bệnh và có thể được sử
dụng để hình thành dữ liệu di truyền đánh dấu dịch tễ virus.
Kết quả đạt được như sau:
1. Xác định được quy trình tách chiết RNA thích hợp từ mẫu lách. Nồng độ
LiCl 2,5 M cho tủa RNA với độ tinh sạch và chất lượng sản phẩm khuếch
đại cao.
2. Đưa ra được quy trình RT-PCR một bước phát hiện gen NS5B của virus
DTH với nồng độ Taq giảm từ 2,5 UI xuống 2 UI nhưng chất lượng sản
phẩm khuếch đại không thay đổi.
3. Mức tỉ số OD của ELISA lớn hơn 2 cho kết quả RT-PCR dương tính cao.

4. Kết hợp được những đặc điểm bệnh tích thường gặp ở heo nhiễm bệnh DTH
với nhau thơng qua kết quả chẩn đốn RT-PCR dương tính.

iv


SUMMARY
Ngô Thị Thu Ngân, Department of Biotechnology, Nong Lam University,
HCMC. September, 2007. The title of thesis: “DETECTION OF CLASSICAL
SWINE FEVER VIRUS BASED ON NS5B GENE”.
Thesis were carried out from 01/03/07 to 01/08/07 at Biochemical Analysis
and Experimental Center, Nong Lam University.
One of the genes of CSFV genome is NS5B gene, which is widely used for
research on CSFV isolation and genetic typing. Therefore, CSFV detecting based
on amplification of the NS5B gene by RT-PCR method for the purpose of disease
diagnostic application and this process may be used for the generation of genetic
sequence data to be used for epidemiological tracing of virus.
Results obtained from the study:
(1) Determined RNA extracted protocol suitable for spleen sample. At
LiCl 2,5 M concentration, we collected higher pure RNA precipitate
which was used in RT-PCR resulted in highly qualitative product.
(2) Advanced single RT-PCR protocol to detect CSFV NS5B gene with
Taq concentration decreased from 2,5 UI down 2 UI, but RT-PCR
product quality was not different.
(3) OD ratio of ELISA was more than 2 value resulted in high positive RTPCR diagnostic.
(4) Combined symptoms of CSFV infected pigs together through positive
RT-PCR diagnostic result.

v

MỤC LỤC
NỘI DUNG

TRANG

Bìa .............................................................................................................................. i
Trang tựa ................................................................................................................... ii
Lời cảm tạ................................................................................................................. iii
Tóm tắt khóa luận..................................................................................................... iv
Summary ....................................................................................................................v
Mục lục..................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt ...................................................................................... viii
Danh sách các bảng .................................................................................................. ix
Danh sách các hình và biểu đồ ...................................................................................x
Chƣơng 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ..........................................................................................................1
1.2. Mục tiêu và yêu cầu ...........................................................................................2
1.2.1. Mục tiêu ...........................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu.............................................................................................................2
Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3
2.1. Bệnh DTH ..........................................................................................................3
2.2. Một số bệnh tích đặc trưng của bệnh DTH ........................................................5
2.2.1. DTH điển hình..................................................................................................5
2.2.2. DTH khơng điển hình ......................................................................................6
2.3. Cấu trúc bộ gen virus DTH ................................................................................6
2.4. Một số phương pháp chẩn đốn trong phịng thí nghiệm ..................................9
2.5. Sơ lược các nghiên cứu liên quan ....................................................................15
Chƣơng 3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .............................17
3.1. Thời gian và địa điểm ......................................................................................17

3.1.1. Thời gian ........................................................................................................17

vi


3.1.2. Địa điểm .........................................................................................................17
3.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................17
3.3. Vật liệu và hóa chất ..........................................................................................17
3.3.1. Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................17
3.3.2. Hóa chất .........................................................................................................17
3.4. Bố trí thí nghiệm ..............................................................................................19
3.5. Phương pháp tiến hành .....................................................................................21
3.5.1. Thu thập mẫu bệnh phẩm ...............................................................................21
3.5.2. Ly trích RNA tổng số .....................................................................................21
3.5.3. Phản ứng RT-PCR..........................................................................................24
Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................27
4.1. Kết tủa RNA ở các nồng độ LiCl khác nhau ...................................................27
4.2. Thay đổi nồng độ Taq trong phản ứng. ............................................................28
4.3. So sánh tỉ số OD của ELISA với kết quả RT-PCR ..........................................30
4.4. Mối liên hệ giữa kết quả RT-PCR với đặc điểm bệnh tích ..............................32
Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .................................................................34
5.1. Kết luận ............................................................................................................34
5.2. Đề nghị .............................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................35
Tài liệu tiếng Việt.....................................................................................................35
Tài liệu tiếng Anh.....................................................................................................36
PHỤ LỤC ................................................................................................................38

vii

DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
BDV

: Border disease virus

BVDV

: Bovine viral diarrhoea virus

cDNA

: Complementary deoxyribonucleotide acid

ctv

: cộng tác viên

DEPC

: Diethyl pyrocarbonate

DTH

: Dịch tả heo

EDTA

: Ethylendiaminetetraacid acetic

ELISA

: Enzyme linked immunosorbent assay

dNTP

: Deoxyribonucleoside triphosphate

IRF-3

: IFN regulatory factor 3

IFN

: Interferon

M-MLV

: Moloney murine leukemia virus

MOPS

: [N-morpholino] propanesulfonic acid

3’NTR

: 3’ nontranslated

NSP

: Nonstructural protein

PBS

: Phosphate buffered saline

OD

: Optical density

OIE

: Office International des Epizooties

RNA

: Ribonucleic acid

RT-PCR

: Reverse transcriptase – polymerase chain reaction

SP

: Structural protein

Taq

: Thermus aquaticus

UV

: Ultra violet

UI

: Unit

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3. 1: Thành phần phản ứng RT-PCR ..............................................................25
Bảng 4. 1: Tỉ số OD và hàm lượng RNA ở các nồng độ LiCl .................................27
Bảng 4. 2: Kết quả RT-PCR ở 2 nồng độ Taq. ........................................................29
Bảng 4. 3: Tỉ số OD của ELISA và kết quả RT-PCR ..............................................30
Bảng 4. 4: So sánh các mức OD của ELISA và RT-PCR ........................................31
Bảng 4. 5: Đặc điểm bệnh tích các mẫu RT-PCR dương tính và âm tính ...............32

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
Hình 2. 1: Cấu trúc bộ gen Pestivirus ........................................................................7
Hình 2. 2: Phản ứng RT-PCR ..................................................................................12
Hình 4. 1: Sản phẩm RT-PCR của mẫu kết tủa ở các nồng độ LiCl........................28
Hình 4. 2: Sản phẩm RT-PCR ở 2 nồng độ Taq ......................................................29
Hình 4. 3: Kết quả sản phẩm RT-PCR các mẫu bệnh phẩm . ..................................33
Biểu đồ 4. 1: Tỉ số OD và hàm lượng RNA ở các nồng độ LiCl. ............................27

x


1

Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Dịch tả heo (DTH) là một trong những bệnh gây thiệt hại kinh tế lớn nhất
cho ngành chăn ni heo ở nước ta nói riêng và các nước trên thế giới nói chung.
Năm 1997, bệnh đã quay trở lại ngay trên các nước thành viên của Liên hiệp châu
Âu mà họ nghĩ bệnh đã được thanh tốn triệt để trước đó (Nguyễn Tiến Dũng,
1999)
DTH là bệnh rất dễ lây, sự lây lan chủ yếu là do sự tiếp xúc giữa những heo
sống với nhau hoặc với những sản phẩm của heo bệnh, hoặc những nguyên nhân
khác…Tác nhân gây bệnh là một virus thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae. Virus
này có tính kháng ngun chung với virus gây bệnh tiêu chảy ở bò (BVDV- Bovine
viral diarrhoea virus) và virus bệnh biên giới ở cừu (BDV- border disease virus).
Trong cơng tác chẩn đốn hay phịng và trị bệnh, các phương pháp truyền
thống dựa trên dịch tễ lâm sàng hiện ngày càng bộc lộ nhiều khiếm khuyết không
thể khắc phục và khơng thể theo kịp tình hình hiện nay nhất là mầm bệnh càng ngày
càng khó kiểm sốt. Mặt khác, sinh học phân tử tuy mới đặt nền móng khoảng vài
thập kỷ nhưng đã có những bước phát triển vượt bậc với nhiều thành tựu to lớn, đã,
đang và sẽ đóng góp vào mọi mặt của đời sống. Trong thú y, sinh học phân tử với
trọng tâm là công nghệ di truyền đã được ứng dụng khá sớm trong chẩn đốn,
phịng và trị bệnh trên nhiều đối tượng gây bệnh, trong đó có dịch tả - một trong 4
bệnh “đỏ” của ngành chăn ni Việt Nam.
Để phân biệt chính xác virus gây bệnh DTH với những virus cùng chi
Pestivirus như BVDV, BDV…, kĩ thuật RT-PCR trở nên hữu ích dựa trên các đoạn
gen như E2 (Wirz, 1993; Harding, 1994; Rugg Li, 1996; Knepp, 2003; Risatt, 2002,

2004; Pereda, 2005). Paton và cộng sự (2000) phân tích ba đoạn gen (E2, 5’NTR,


2
NS5B) trong việc phân biệt chủng virus DTH và tổng kết sự phân biệt chủng virus
DTH ở nhiều nơi trên thế giới kể cả châu Á; kết quả cho thấy mối quan hệ giữa các
chủng ở một số nước.
Trong những năm gần đây, ở Việt Nam cũng có rất nhiều nghiên cứu về
virus DTH của các tác giả như Bùi Nghĩa Vượng và ctv (2003), Nguyễn Thị
Phương Duyên và ctv (2001), Kim Văn Phúc và ctv (2004), Nguyễn Thế Vinh và
ctv (2004), Hồ Thu Hương và ctv (2004)… tuy nhiên chưa có nghiên cứu xác định
trình tự nucleotide của nhiều đoạn gen khác như NS5B, 5’NTR của những virus
phân lập được từ các ổ dịch. Gen NS5B là một trong những gen của bộ gen virus
DTH được sử dụng nhiều trong những nghiên cứu xác định chủng, phân loại di
truyền virus. Vì vậy việc thực hiện đề tài “Phát hiện virus DTH dựa trên đoạn gen
NS5B” nhằm ứng dụng vào cơng tác chẩn đốn bệnh và tạo tiền đề cho những
nghiên cứu xác định chủng, phân loại di truyền virus DTH sau này.

1.2. MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU
1.2.1. Mục tiêu
Xác định quy trình RT-PCR phát hiện virus DTH dựa trên đoạn gen NS5B.
1.2.2. Yêu cầu
Xác định triệu chứng và bệnh tích của heo bệnh, thu nhận mẫu bệnh phẩm.
Ly trích RNA tổng số.
Chạy RT-PCR theo dẫn liệu của Paton và cộng sự (2000) để nhân vùng gen NS5B.
So sánh kết quả RT-PCR với kết quả ELISA của mẫu bệnh phẩm.


3

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. BỆNH DTH
2.1.1. Giới thiệu
DTH là một bệnh quan trọng nằm trong danh sách loại A của OIE. Những
bệnh thuộc trong danh sách A được định nghĩa như là những bệnh truyền nhiễm có
khả năng lây lan rất nguy hiểm và nhanh chóng, bất chấp biên giới quốc gia, trở
thành hậu quả nghiêm trọng đối với kinh tế xã hội và sức khoẻ cộng đồng, trở nên
quan trọng chính trong việc kinh doanh thú và những sản phẩm từ chúng (OIE,
2001).
 Tình hình nhiễm bệnh DTH trên thế giới
DTH được mô tả đầu tiên vào năm 1833 ở Ohio – Hoa Kỳ. Những năm sau
đó, một bệnh trên heo ở Châu Âu biết như là chứng sốt trên heo giống y hệt như
bệnh mô tả ở Hoa Kỳ. Cuối thế kỷ 19, DTH phân tán khắp nơi trên thế giới.
Với sự gia tăng hiểu biết về nguyên nhân và dịch tễ học bệnh DTH, nhiều
quốc gia thành công trong việc tiệt trừ virus bằng cách đưa ra những biện pháp
tương đối đơn giản như luật vận chuyển thú và sự ngăn cấm cho thú ăn thức ăn
chưa xử lý như Đan Mạch (1933), Phần Lan (1956), Úc (1963), Canada (1964),
Thụy Sỹ (1974) và Mỹ (1977).
Năm 1997 đã in dấu đậm nét trong tâm trí các nhà dịch tễ học, virus học,
những cán bộ thú y và những người hoạt động trong ngành chăn nuôi heo: bệnh
DTH, một bệnh mà Liên hiệp châu Âu từng nghĩ là đã được thanh toán đã quay trở
lại ngay trên các nước thành viên của Liên hiệp (tính đến ngày 31/12/1997 có 424 ổ
dịch tại Hà Lan). Năm nước khối EU (Đức, Hà Lan, Italia, Tây Ban Nha và Bỉ) trở
thành nạn nhân của bệnh DTH với hơn 10 triệu heo phải giết bỏ.


4
Năm 2000, dịch bệnh xảy ra ở Anh. Năm 2001, dịch bệnh nổ ra ở Đức,
Slovakia. Vào cuối năm 2003, dịch xuất hiện tại Nhật, Albania và Slovakia. Hiện

nay, bệnh đã được ghi nhận khắp thế giới: Châu Âu, Trung Phi, Mexico, các nuớc
Trung mỹ, Ấn Độ, Trung Quốc, Đông Á và Đông Nam Á: Hàn quốc, Indonesia,
Philippine, Thái Lan, Việt Nam.
 Tình hình bệnh DTH tại Việt Nam
Tại Việt Nam, bệnh DTH được Houdemer phát hiện đầu tiên vào năm 19231924. Từ đó, bệnh trở thành mối đe doạ nghiêm trọng đối với ngành chăn nuôi heo
nước ta.
Năm 1949-1950, dịch bệnh lớn xảy ra ở Việt Bắc rồi lan sang các tỉnh Phú
Yên, Yên Bái, Thái Nguyên, Hà Nội và Hải Phòng. Năm 1968-1969, dịch phát ra
hơn 20 tỉnh miền Bắc, theo thống kê có 481 ổ dịch nổ ra.
Theo báo cáo của Cục thú y (1986), tại các tỉnh Nam Bộ bệnh DTH thường
bị bội nhiễm với bệnh phó thuơng hàn: An Giang, Long An (1984), Tiền Giang và
Hậu Giang (1985). Năm 1985, tại Đồng Nai và TP. Hồ Chí Minh xuất hiện DTH
bội nhiễm với bệnh tụ huyết trùng.
Năm 2000, có 18106 trường hợp bệnh DTH được báo cáo tại Việt Nam.
Hiện nay, bệnh DTH vẫn còn tồn tại ở các dạng bệnh khơng điển hình gây
trở ngại cho việc chuẩn đoán.
2.1.2. Dạng bệnh
DTH là một bệnh truyền nhiễm riêng của heo. Nguyên nhân gây ra bởi virus
thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae. Virus này có quan hệ mật thiết với virus gây
bệnh tiêu chảy ở bò (bovine viral diarrhoea-BVD) và virus gây bệnh biên giới ở cừu
(Boder disease-BD).
Bệnh DTH có thể xuất hiện ở nhiều dạng khác nhau. Tuy nhiên, người ta
chia bệnh DTH ra làm 4 dạng (Nguyễn Tiến Dũng, 1999):


5
 Dạng siêu cấp tính: xuất hiện đột ngột khơng có triệu chứng ban đầu, sốt
cao kết hợp với trạng thái thương hàn. Heo bệnh tử vong trong vòng 24 đến 48 giờ,
chưa kịp xuất hiện triệu chứng trên da nên gọi là DTH trắng.
 Dạng cấp tính: gây sốt cao từ 41 - 420C, heo bệnh biểu hiện mệt điển hình

như heo con nằm chất đống. Sau 24 - 48 giờ mắt sưng húp và viêm kết mạc với các
triệu chứng ngồi da (như vết chàm tím, xuất huyết, tụ huyết màu đỏ tại các vùng da
mỏng, tai, chân, bụng, bao dương vật…), viêm dạ dày ruột (tiêu chảy, nôn mửa…),
triệu chứng hô hấp (ho, tụ huyết phổi) và có thể xuất hiện triệu chứng thần kinh
(loạng choạng, liệt, liệt nhẹ các chi sau…), tử vong trong thời gian 6 đến 20 ngày
sau khi phát bệnh.
 Dạng á cấp tính hoặc mãn tính diễn ra trong 3 giai đoạn:
Giai đoạn đầu: kéo dài 10 - 15 ngày, toàn bộ đàn heo phát bệnh, các
triệu chứng cục bộ giống như dạng cấp tính nhưng ở mức độ nhẹ.
Giai đoạn hai là giai đoạn thuyên giảm.
Giai đoạn ba: xuất hiện mầm bệnh bội nhiễm phát bệnh toàn thân với
các triệu chứng cục bộ về hơ hấp hoặc tiêu hố hoặc cả hai (viêm phổi và ruột thông
thường do Salmonella). Heo bệnh gầy mòn và tử vong trong vòng 1 đến 3 tháng.
 Dạng khơng điển hình: biểu hiện dưới các dạng rất khác nhau như rối loạn
sinh sản hoặc bệnh lý sinh sản (sảy thai, thai chết, thai gỗ, dị dạng gây run rẩy bẩm
sinh, rối loạn vận động, chết yểu…), chậm lớn, chết rải rác. Dưới dạng này, virus
DTH có thể lưu hành một cách không rõ ràng, nhất là heo sinh sản với các trường
hợp lâm sàng lẻ tẻ nổ ra khi có các điều kiện thuận lợi (như stress, chuyên chở…).

2.2. MỘT SỐ BỆNH TÍCH ĐẶC TRƢNG CỦA BỆNH DTH
2.2.1. DTH điển hình (cấp tính, á cấp tính hoặc mãn tính)
Biểu hiện bệnh tích sung huyết hay xuất huyết của một hay nhiều bệnh đỏ,
biến đổi huyết học.


6
Trên da: xuất huyết lấm chấm hoặc từng đám, chàm xanh nhất là da tứ chi
(tai, chân), xuất huyết vùng bụng và bao quy đầu ở heo đực.
Hạch bạch huyết: dải hạch vùng xương chậu và hạch ruột sưng to, màu đá
hoa văn, tụ huyết hoặc xuất huyết vùng vỏ hoặc tồn bộ.

Thận: khơng sưng nhưng xuất huyết lấm chấm sau khi lột màng bao thận
(thận trứng gà tây).
Lách: không sưng, nhồi huyết bên rìa lách.
Bàng quang: niêm mạc xuất huyết lấm chấm.
Amiđan: sưng to và xuất huyết.
Tim: xuất huyết cơ tim và trên vành tim.
Hệ hô hấp: tụ huyết, xuất huyết phổi, tiểu thiệt xuất huyết lấm chấm.
Hệ tiêu hố: tụ huyết và xuất huyết.
Giảm bạch cầu.
2.2.2. DTH khơng điển hình
Bệnh tích thay đổi khơng đặc hiệu: xuất huyết, viêm, dị dạng.
Da: xuất huyết.
Các hạch lâm ba: viêm hạch lâm ba có thể có xuất huyết lấm chấm.
Trên não: xuất huyết.

2.3. CẤU TRÖC BỘ GEN VIRUS DTH
Virus DTH thuộc chi Pestivirus, họ Flaviviridae. Virus này có chung tính
kháng ngun với virus bệnh tiêu chảy ở bò và bệnh biên giới ở cừu. Virus DTH là
một loại virus RNA chuỗi đơn dương có vỏ bọc đường kính 40 - 50 nm. RNA virus
mã hoá 4 protein cấu trúc và 7 protein khơng cấu trúc. Chỉ có một týp huyết thanh
xác định. So với virus gây bệnh biên giới, những dòng virus DTH hình thành một
nhóm kháng ngun đồng dạng có quan hệ với nhau nhưng có một vài thay đổi tồn
tại giữa những dòng phân lập. Những phản ứng chéo huyết thanh với virus BVD và
BD có thể xảy ra và gây trở ngại trong chẩn đoán huyết thanh.


7
Bộ gen virus có chuỗi đơn RNA dài 12,3 kb. Bộ gen đã được biết trình tự
gen hồn tồn, chứa một khung đọc mở nằm ở bên sườn của 5’-UTR và 3’-UTR mã
hoá một polyprotein lớn với khoảng 3900 amino acid. Polyprotein này được cắt bởi

protease được mã hoá bởi virus và tế bào vật chủ để tạo nên protein trưởng thành
của virus gồm 4 protein cấu trúc (C, Erns, E1 và E2), p7 và 7 protein không cấu trúc
(Npro, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A và NS5B). Trình tự của sản phẩm gen dọc
theo khung đọc mở là:
NH2-(Npro-C-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B)-COOH

Hình 2. 1: Cấu trúc bộ gen Pestivirus (Brett D. L., 2007)
Một polyprotein lớn được dịch mã từ RNA của virus sẽ được xử lý thành
những protein virus riêng biệt. Protein đầu tiên mã hố là Npro một protein khơng
cấu trúc có nhiệm vụ phân cắt vị trí Npro/C. Peptidase ký chủ phân cắt những vị trí
C/Erns, E1/E2, E2/p7 và p7/NS2 với sự phân cắt khơng hồn tồn ở vị trí E2/p7.
NS2-3 được phân cắt bởi autoprotease NS2. Sự phân cắt của polyprotein hình thành
NS4A, NS4B, NS5A và NS5B được thuỷ phân bởi enzyme protease serine NS3-4A.
 Npro là autoprotease không cấu trúc có hoạt tính thuỷ phân protein. Npro
khơng cần thiết đối với sự sao chép virus. Npro cũng hoạt động như một chất đối


8
kháng của sự hoạt hoá IRF-3 và sự sản xuất ra IFN, ức chế sự phiên mã IRF-3 ở
những tế bào nhiễm virus DTH. Những đột biến bỏ đi Npro của virus DTH đã được
đề xuất như những dự tuyển vaccin virus sống.
 Protein cấu trúc
C (mã hoá protein p14): là protein của nucleocapsid. Đầu cuối C (Cterminus) của protein C ở virus DTH đã được xác định và được định vị ở phần kỵ
nước của chuỗi peptide tín hiệu bên trong (internal signal peptide) khởi đầu sự di
chuyển của Erns vào trong khoang mạng lưới nội chất.
Erns (mã hoá protein gp44/48), E1(gp33), E2(gp55): là các protein vỏ. E2 và
Erns có tính kháng ngun mạnh nhất. Erns có tác dụng hỗ trợ thải virus qua một
màng đặc biệt, được tiết ra từ tế bào nhiễm, đặc điểm nổi bật của Erns là hoạt tính
ribonuclease với tính chuyên biệt đối với gốc uridine. Những kháng thể ức chế hoạt
tính ribonuclease có khuynh hướng trung hồ tính nhiễm virus, sự đột biến ở Erns

phá huỷ hoạt tính ribonuclease gây nên gia tăng số lượng virus. Erns tái tổ hợp là một
độc chất đối với tế bào bạch huyết trong ống nghiệm, có thể kết hợp với sự giảm
bạch cầu ở nhiễm tự nhiên. Mặc dù độc tính tế bào là một đặc điểm nổi bật của
những enzyme ribonuclease hoà tan khác nhưng người ta chưa rõ là hoạt tính
ribonuclease của Erns có liên quan đến độc tính của nó hay khơng. Vùng đầu cuối C
(C-terminal) của Erns có thể khởi động sự di chuyển của nó qua màng tế bào, có thể
coi như là mục tiêu hoặc chức năng trong tế bào. Tuy nhiên, Erns tái tổ hợp cũng có
thể nối một cách vững chắc với bề mặt tế bào qua sự tương tác với
glycosaminoglycan và ức chế sự lây nhiễm.
E1 và E2 là những protein màng không thể thiếu. E2 của virus DTH tái tổ
hợp có thể kết hợp với các tế bào và ngăn chặn sự lây nhiễm của virus DTH và
BVD. Mặc dù vai trò quan trọng của những glycoprotein ở virus là lắp rắp và tiếp
nhận nhưng những kháng thể đối với Erns hoặc E2 có thể trung hồ tính lây nhiễm
của virus và cả hai kháng ngun này có thể tạo ra tính sinh miễn dịch bảo vệ.


9
 Protein p7 theo sau những protein cấu trúc, gồm một vùng đảm đương
nhiệm vụ trung tâm đối với việc tách đầu cuối kỵ nước và cần cho sự sản sinh của
virus lây nhiễm nhưng khơng địi hỏi trong q trình sao chép RNA. P7 của
pestivirus được phân cắt một cách không hiệu quả từ E2 qua peptidase đặc biệt. E2p7 không phân cắt không cần thiết đối với sự sao chép trong nuôi cấy tế bào và cả
hai E2-p7 và p7 giúp tế bào kết hợp với nhau. Tuy nhiên, chưa biết rõ p7 là một
protein cấu trúc hay khơng cấu trúc mặc dù nó khơng được phát hiện trong virus
tinh sạch. Pestivirus có p7 thì có thể hình thành những kênh ion tham gia trong sự
lắp ráp và tiếp nhận của virus.
 Protein không cấu trúc
Protein NS2 là một enzyme thuỷ phân protein chứa cysteine đã được nhận
diện. Sự phân cắt NS2-3 thiết yếu đối với sự sao chép RNA của pestivirus và hiệu
quả phân cắt NS2-3 được điều chỉnh bởi một chaperone tế bào và có thể xác định
tính gây bệnh tế bào. Vùng NS2-3 tham gia lắp ráp virus.

NS3 chứa một vùng protease serine ở đầu cuối N và một helicase RNA ở
đầu cuối C. Protease serine NS3 đòi hỏi NS4A như là một yếu tố hỗ trợ. Protease
serine NS3-4A phân cắt giữa leucine và những amino acid khơng phân cực nhỏ.
Hoạt tính protease serine ảnh hưởng đến sự sao chép RNA virus,đóng vai trị thiết
yếu trong khả năng tồn tại của virus.
NS4A hoạt động như một yếu tố hỗ trợ hoạt tính protease serine NS3.
NS4A và NS4B khơng đóng vai trị thiết yếu trong sự sao chép RNA của virus.
NS5A và NS5B hiện diện dưới dạng hai sản phẩm phân cắt hồn tồn cũng
khơng khác gì NS5A-5B khơng phân cắt. Chức năng của NS5A chưa được biết rõ.
NS5B mang đặc điểm enzyme polymerase RNA phụ thuộc RNA (RdRp - RNA
dependent RNA polymerase).


10

2.4. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH DTH TRONG
PHÕNG THÍ NGHIỆM
(1) Phân lập virus
(2) Đánh dấu miễn dịch phát hiện virus trong ni cấy tế bào
(3) Phương pháp hố mô
(4) ELISA phát hiện kháng nguyên hoặc ELISA phát hiện kháng thể
(5) Phản ứng trung hoà
(6) Phương pháp reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR)
RT-PCR là một phương pháp chẩn đoán nhanh và nhạy hơn so với phương
pháp ELISA và phân lập virus, thích hợp trong chuẩn đốn bệnh sớm, tránh được sự
nhiễm khuẩn từ mơi trường bên ngồi
2.4.1. PCR (Polymerase chain reaction)
Khái niệm: PCR là một tiến trình lặp đi lặp lại bao gồm 3 cơng đoạn: biến
tính mẫu bởi nhiệt, bắt cặp những mồi nucleotide với trình tự đích mạch đơn, kéo
dài mồi bắt cặp bởi enzyme DNA polymerase chịu nhiệt.

Biến tính: mẫu DNA mạch đơi biến tính ở nhiệt độ được xác định bởi thành
phần G+C. Thành phần G+C càng cao thì nhiệt độ địi hỏi tách mạch càng cao.
Những phân tử DNA càng dài thì thời gian cần ở nhiệt biến tính để tách hai mạch
một cách hồn tồn càng lớn. Nếu nhiệt độ biến tính q thấp hoặc nếu thời gian
q ngắn thì chỉ có những vùng giàu AT sẽ bị biến tính. Khi nhiệt độ bị giảm trễ
hơn trong chu trình PCR, DNA mẫu sẽ tái bắt cặp thành một tình trạng nguyên gốc.
Trong những phản ứng PCR xúc tác bởi Taq DNA polymerase, sự biến tính
được tiến hành ở 94 - 950C, là nhiệt độ cao nhất mà enzyme có thể chịu được
khoảng 30 chu kỳ hoặc hơn mà không chịu được tác hại quá mức. Trong chu kỳ đầu
của PCR, sự biến tính thỉnh thoảng được tiến hành khoảng 5 phút để gia tăng khả
năng những phân tử DNA mẫu được biến tính đầy đủ. Tuy nhiên, thời gian biến
tính khoảng 45 giây ở nhiệt độ 94 - 950C đối với mẫu DNA mạch thẳng thơng
thường có thành phần G+C là 55% hoặc thấp hơn.


11
Mẫu DNA giàu G+C (> 55%) thì nhiệt độ biến tính càng cao. DNA
polymerase phân lập từ Archaea thì chịu nhiệt hơn Taq do đó nó thích hợp khuếch
đại DNA giàu G+C.
Bắt cặp mồi với DNA mẫu: nếu nhiệt độ bắt cặp quá cao, mồi
oligonucleotide bắt cặp ít với mẫu, như vậy lượng DNA được khuếch đại rất thấp.
Nếu nhiệt độ bắt cặp quá thấp việc bắt cặp của mồi khơng đặc hiệu có thể xảy ra,
kết quả là tạo ra những đoạn DNA không mong muốn. Sự bắt cặp được thực hiện ở
nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy 3 - 50C. Để tối ưu nhất điều kiện bắt cặp, nên
tiến hành một số phản ứng PCR thử nghiệm ở những nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ
nóng chảy trong phạm vi từ 2 - 100C đối với hai mồi oligonucleotide.
Kéo dài mồi: việc kéo dài mồi được tiến hành ở hoặc gần nhiệt độ thích hợp
đối với sự tổng hợp DNA xúc tác bởi polymerase chịu nhiệt, trong trường hợp Taq
polymerase nhiệt độ thích hợp là 72 - 780C.
Số chu kì: phụ thuộc vào lượng DNA đưa vào phản ứng, hiệu quả của việc kéo

dài mồi và sự khuếch đại. Thơng thường sau 30 chu kì tạo được khoảng 105 bản sao.
2.4.2. RT-PCR
Khái niệm: là một phương pháp được sử dụng để khuếch đại RNA thành
cDNA. Nhạy và đa năng, RT-PCR được sử dụng để hồi phục và nhân đầu cuối 5’và
3’ của mRNA và hình thành thư viện cDNA từ một lượng nhỏ mRNA. Thêm vào
đó, RT-PCR dễ dàng xác định đột biến và những đa hình trong những trình tự được
sao lại và đo lường nồng độ biểu hiện gen khi lượng RNA bị hạn chế.
Bước đầu tiên là chuyển RNA thành cDNA. Một mồi oligodeoxynucleotide
được lai với RNA và sau đó kéo dài bởi polymerase DNA phụ thuộc RNA (RNAdependent DNA polimerase) để tạo ra bản sao cDNA. Kết thúc tiến trình tạo cDNA
là chuyển qua tiến trình PCR để nhân lên một lượng lớn cDNA.


12
Khuôn RNA

Sự gắn primer vào RNA để tổng hợp cDNA
(primer có thể là ngẫu nhiên, oligo-dT hay
mồi chuyên biệt cho gene).

cDNA được tổng hợp bắt đầu từ vị trí của primer nhờ
enzyme reverse trascriptase.

Sợi cDNA được tạo thành.

Khuôn RNA được loại bỏ nhờ Rnase H.
cDNA được sử dụng để thực hiện PCR.

Sự gắn của primer với cDNA.

Sợi bổ sung của cDNA được tổng hợp nhờ

Taq polymerase.

cDNA sợi đơi được hình thành.

Ba bước biến tính, bắt cặp, kéo dài được lặp
lại nhiều lần.

Hình 2. 2: Phản ứng RT-PCR
.


13
2.4.3. Các thành phần quan trọng trong phản ứng
 Dung dịch đệm (buffer)
Có tác dụng tạo ra lực ion cần thiết cho phản ứng xảy ra. Thành phần dung
dịch đệm gồm KCl, MgCl2, Tris-HCl (pH 8,5 ở nhiệt độ phòng).
 MgCl2
Tạo thành một phức hợp với dNTP cần thiết cho việc gắn dNTP vào
enzyme, kích thích hoạt tính của enzyme polymerase, tăng Tm (nhiệt độ nóng chảy)
của DNA và tăng sự tác động hổ trợ của mồi và DNA mẫu.
Nồng độ cuối MgCl2 trong phản ứng thường trong khoảng 0,5 – 5 mM với
mức tối ưu là 1 – 2 mM, nhưng nồng độ tối ưu phải được xác định cho từng phản
ứng qua nhiều thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 1998).
 Mồi (primer)
Mồi là một trong những thành phần quan trọng nhất ảnh hưởng trực tiếp đến
hiệu quả cũng như độ chuyên biệt của phản ứng.
Trình tự mồi được chọn sao cho khơng có sự bắt cặp bổ sung giữa hai mồi
và đặc trưng cho trình tự đoạn gen được khuếch đại, khơng trùng với các trình tự
lặp lại trên đoạn gen. Chiều dài mồi không được quá lớn thường trong khoảng 1725 nu, phản ứng PCR thường tối ưu với những đoạn trình tự nhỏ hơn 1kb (Phan Cự
Nhân, 2001). Chiều dài mồi càng lớn sự tách các DNA mẫu để bắt cặp với mồi càng

nhỏ. Chiều dài và thành phần G-C của mồi đều có ảnh hưởng quan trọng đối với
nhiệt độ Tm của mồi.
Tm (0C) = [(số G + C) * 4 + (số A + T) * 2]
Nồng độ của hai mồi cũng ảnh hưởng lớn đến phản ứng. Nồng độ mồi quá
cao hình thành nên cấu trúc dimer (mồi gắn mồi).
 Deoxyribonucleotide triphosphates (dNTPs)
Là nguyên liệu cần thiết cho phản ứng gồm 4 loại: dATP, dTTP, dCTP,
dGTP. Sự mất cân bằng trong thành phần dNTPs làm tăng các lỗi sao chép của


14
enzyme polymerase vì vậy phải giữ cho nồng độ của tất cả các dNTP đều bằng
nhau. Nồng độ dNTPs thường dùng trong khoảng 20 – 200 µM, dung dịch dNTPs
gốc phải giữ trung tính pH7,0.
 Taq polymerase
Là một enzyme polymerase chịu nhiệt, được tách chiết từ vi khuẩn suối
nước nóng có tên là Thermus aquaticus. Taq polymerase khơng bị phá huỷ ở nhiệt
độ biến tính trong phản ứng, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 72 - 780C.
Nồng độ Taq sử dụng được khuyến cáo trong khoảng 1 - 2,5 đơn vị trên
100µl dung dịch phản ứng. Nồng độ Taq quá cao sẽ tạo ra những sản phẩm không
chuyên biệt, nồng độ Taq quá thấp không đủ lượng enzyme xúc tác để tạo ra sản
phẩm theo mong muốn (Bùi Chí Bửu, 1999).
 Số chu kỳ trong phản ứng
Số chu kỳ cho mỗi phản ứng phụ thuộc vào lượng bản sao mẫu ban đầu.
DNA mẫu là 105 tương ứng với 25 - 30 chu kỳ, 102 - 103 tương ứng với 35 - 40 chu
kỳ.
Không nên vượt quá 40 chu kỳ vì hiệu quả khuếch đại sẽ giảm dần do:
Sự phân huỷ và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
Sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau

(Phan Cự Nhân, 2001).
 Mẫu
Nồng độ thường biến động trong khoảng 1 pg – 1 µg trên 25 µl dung dịch
phản ứng. Nồng độ mẫu quá ít dẫn đến phản ứng không đặc hiệu, nồng độ quá cao
tạo ra những sản phẩm phụ không mong muốn.
 RNAsin
Được dùng để ức chế enzyme phân huỷ RNA, giữ cho mẫu khơng bị mất
trong q trình thực hiện phản ứng.


15
 Enzyme reverse transcriptase
Trong phản ứng RT-PCR thành phần không thể thiếu là enzyme phiên mã
ngược, MMLV hoạt động như là một enzyme polymerase giúp tổng hợp sợi cDNA
từ RNA và với hoạt tính của enzyme RNAse H có độ nhạy cao giúp phân cắt sợi
RNA trong mạch đôi RNA-cDNA tạo ra mạch đơn cDNA để tiếp tục cho phản ứng
PCR.

2.5. SƠ LƢỢC CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN
2.5.1. Trong nƣớc
Từ năm 1996-1998, Nguyễn Thị Phương Duyên và ctv khảo sát hội chứng
sốt, táo bón, bỏ ăn đến chết và kháng nguyên virus DTH bằng miễn dịch huỳnh
quang và ELISA ở đàn heo sinh sản và heo con tỉnh Khánh Hoà và Quảng Ngãi cho
thấy virus DTH chiếm tỷ lệ không nhỏ trong các tác nhân gây hội chứng này.
Từ năm 2002-2003, Akemi Kamakawa và ctv tiến hành khảo sát bệnh DTH
giữa các đàn heo và các trại heo tại Cần Thơ bằng kỹ thuật RT-PCR khuếch đại
đoạn gen 5’NTR.
Nguyễn Thế Vinh và ctv, năm 2004 nghiên cứu phân tích di truyền virus
DTH phân lập ở Việt Nam bằng cách phân tích đoạn gen E2 của 20 mẫu virus DTH
và so sánh chúng với một số chủng đã được giới thiệu trên thế giới. Kết quả đưa ra

là các chủng virus DTH thuộc nhóm 2 đang là tác nhân chính gây bệnh DTH ở Việt
Nam.
Hồ Thu Hương và ctv, năm 2004 so sánh 4 phương pháp chẩn đoán virus
DTH (phân lập virus, phản ứng huỳnh quang kháng thể, phản ứng ELISA và RTPCR) từ mẫu được bảo quản ở các điều kiện khác nhau. Theo các tác giả, việc lựa
chọn phương pháp chẩn đoán phải dựa vào chất lượng mẫu.
Bùi Nghĩa Vượng và ctv, năm 2004 chẩn đoán bệnh DTH bằng phương
pháp RT-PCR với mẫu máu lấy bằng giấy thấm chứng tỏ rằng có thể phát hiện được
virus DTH từ các mẫu giấy thấm máu khô giữ ở 370C trong 10 tháng.