BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
..
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
PHƯƠNG PHÁP NHÂN NHIỄM VIRUS
NPV TRÊN SÂU KHOANG ĂN TẠP
(SPODOPTERA LITURE)
Ngành
: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Cán bộ hướng dẫn : Th.S HOÀNG ANH TUẤN
Sinh viên thực hiện: VÕ THỊ HUỲNH MAI
MSSV: 0851110142
Lớp: 08DSH4
TP. Hồ Chí Minh, 2012
Đồ án tốt nghiệp
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đồ án đây là công trình nghiên cứu khoa học do chính bản
thân tôi trực tiếp thực hiện. Được thực hiện trên cơ sở nghiên cứu lý thuyết, vận
dụng kiến thức thực hành và tiến hành thí nghiệm nghiên cứu thực tiễn dưới sự
hướng dẫn của Th. Hoàng Anh Tuấn. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đồ
án là trung thực, không sao chép số liệu người khác.
Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào, tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm
trước Hội đồng, cũng như kết quả đồ án.
Thành Phố Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2011
Sinh viên thực hiện
Võ Thị Huỳnh Mai
Đồ án tốt nghiệp
LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:
Ban giám hiệu trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi giúp đỡ em trong quá trình học tập và hoàn thành đồ án.
Ban chủ nhiệm Khoa Môi Trường – Công Nghệ Sinh Học, cùng quý thầy cô
trong khoa đã truyền đạt những kiến thức quý báu, tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ
cho em trong quá trình học tập.
Thầy Th. Hoàng Anh Tuấn và cô TS Nguyễn Thị Hai đã trực tiếp hướng dẫn
đề tài. Trong suốt quá trình làm đồ án, quý thầy cô đã bỏ ra nhiều thời gian công
sức, tận tình giúp đỡ em hoàn thành đồ án tốt nghiệp đúng định hướng ban đầu.
Thầy Thành và Thầy Dũng đã tạo tạo điều kiện cũng như hỗ trợ trang thiết bị
cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cô Trần Thị Thiên An cùng cô Oanh Trường ĐH Nông Lâm TP.HCM; thầy
Thành và thầy Dũng Trường ĐH Kỹ Thuật Công Nghệ TP.HCM đã tạo điều kiện
cũng như giúp đỡ tận tình trong suốt thời gian em thực hiện đề tài.
Các bạn chung nhóm đề tài, cùng các bạn trong lớp và các bạn ở trường ĐH
Nông Lâm đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài.
Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn, lời chúc sức khỏe đến cha, mẹ cùng hai em là
người luôn bên cạnh ủng hộ và chia sẽ mỗi lúc em gặp khó khăn.
Em xin chân thành cảm ơn!
Võ Thị Huỳnh Mai
Đồ án tốt nghiệp
MỤC LỤC
Danh mục các từ viết tắt................................................................................. iv
Danh mục các bảng, đồ thị .............................................................................. v
Danh mục sơ đồ, hình ảnh.............................................................................. vi
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài .......................................................................2
1.3. Thời gian – địa điểm thực hiện ........................................................................2
1.4. Phương pháp nghiên cứu .................................................................................2
1.5. Kết cấu của đồ án tớt nghiệp ............................................................................3
CHƯƠNG 2: TỞNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về lịch sử phòng trừ sâu hại nông nghiệp ...........................................4
2.1.1. Những nghiên cứu ngoài nước ...................................................................4
2.1.2. Những nghiên cứu trong nước ....................................................................5
2.2. Giới thiệu chung về sâu khoang – Spodoptera litura Fab. ..............................6
2.2.1. Phân loại .....................................................................................................6
2.2.2. Đặc điểm về hình thái – sinh học................................................................7
2.2.2.1. Đặc điểm hình thái.................................................................................7
2.2.2.2. Đặc điểm sinh học .................................................................................8
2.2.3. Phân bố – phạm vi ký chủ...........................................................................9
2.2.4. Các biện pháp phòng trừ ...........................................................................10
2.2.4.1. Biện pháp canh tác ..............................................................................10
2.2.4.2. Biện pháp cơ giới – vật lý....................................................................10
2.2.4.3. Biện pháp hóa học ...............................................................................10
2.2.4.4. Biện pháp sinh học ..............................................................................10
2.3. Tổng quan về virus gây bệnh côn trùng .........................................................11
2.3.1. Virus gây bệnh côn trùng ..........................................................................11
2.3.2. Lịch sử nghiên cứu virus gây bệnh côn trùng...........................................12
2.3.3. Phân loại virus gây bệnh côn trùng chính.................................................13
i
Đồ án tốt nghiệp
2.3.3.1. Nhóm CPV (Reoviridae) .....................................................................13
2.3.3.2. Nhóm EV (Poviridae) ..........................................................................13
2.3.3.3. Nhóm Irido viruses (Iridoviridae) .......................................................13
2.3.3.4. Nhóm Denso virus (Parvoridae) ..........................................................14
2.3.3.5. Nhóm Virus ARN (Picornaviridae) .....................................................14
2.3.3.6. Nhóm Sigma virus (Rhabdoviridae) ....................................................14
2.4. Nuclear polyhedrosis virus (NPV) .................................................................15
2.4.1. Một số đặc điểm hình thái và cấu trúc của NPV ......................................15
2.4.1.1. Hình thái ..............................................................................................15
2.4.1.2. Cấu trúc................................................................................................15
2.4.1.3. Cấu tạo của thể virus ...........................................................................15
2.4.1.4. Cấu tạo khối đa diện (polyhedral) .......................................................16
2.4.2. Cơ chế xâm nhiễm ....................................................................................17
2.4.3. Triệu chứng của côn trùng khi nhiễm NPV ..............................................20
2.4.4. Ưu và nhược điểm của chế phẩm NPV ....................................................20
2.4.4.1. Ưu điểm ...............................................................................................20
2.4.4.2. Nhược điểm .........................................................................................21
2.4.5. Hiệu lực diệt sâu của virus NPV...............................................................21
2.5. Phương pháp sản xuất chế phẩm NPV...........................................................22
2.5.1. Quy trình sản xuất chế phẩm NPV bằng phương pháp in vivo ................23
2.5.2. Phương pháp nhân nhiễm virus ................................................................26
2.5.2.1. Những nghiên cứu ngoài nước ............................................................26
2.5.2.2. Những nghiên cứu trong nước .............................................................27
2.5.3. Thời gian thu nhận virus ...........................................................................28
2.5.3.1. Những nghiên cứu ngoài nước ............................................................28
2.5.3.2. Những nghiên cứu trong nước .............................................................30
2.5.4. Phương pháp tinh sạch ..............................................................................30
2.5.4.1. Những nghiên cứu ngoài nước ............................................................30
2.5.4.2. Những nghiên cứu trong nước .............................................................32
ii
Đồ án tốt nghiệp
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Dụng cụ – Vật liệu thí nghiệm .......................................................................33
3.1.1. Dụng cụ .....................................................................................................33
3.1.2. Vật liệu ......................................................................................................33
3.1.2.1. Nguồn sâu thí nghiệm ..........................................................................33
3.1.2.2. Nguồn virus để nhiễm sâu ...................................................................33
3.1.2.3. Nguồn thức ăn nhân tạo .......................................................................34
3.2. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................34
3.3. Phương pháp nghiên cứu lây nhiễm tạo NPV................................................35
3.3.1. Xác định mật độ nhiễm sâu hợp lý ...........................................................35
3.3.2. Xác định thời gian thu nhận sâu chết phù hợp .........................................36
3.3.3. Xác định phương pháp ly tâm phù hợp để trích ly số PIB .......................37
3.4. Cách kiểm tra số lượng PIB ...........................................................................38
3.5. Phương pháp xử lý số liệu .............................................................................39
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Xác định mật độ sâu nhiễm hợp lý ................................................................40
4.1.1. Tỷ lệ sâu chết của sâu ở các mật độ nuôi nhiễm NPV .............................40
4.1.2. Sản lượng PIB/sâu thu được ở các mật độ................................................41
4.1.3. Chi phí sản xuất ........................................................................................43
4.2. Xác định thời gian thu nhận sâu nhiễm thích hợp .........................................44
4.2.1. Sản lượng PIB/sâu thu được .....................................................................45
4.2.2. Thời gian thu lấy mẫu ...............................................................................45
4.3. Xác định phương pháp ly tâm thích hợp để trích ly các thể PIB ...................46
4.3.1. Mức độ tinh sạch của dịch virus NPV sau khi ly tâm ở các phương pháp ly
tâm ...........................................................................................................................47
4.3.2. Tỷ lệ virus thu nhận từ các phương pháp ly tâm thích hợp ......................50
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận ..........................................................................................................52
5.2. Đề nghị ...........................................................................................................52
iii
Đồ án tốt nghiệp
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
NPV
: Virus đa diện nhân (Nuclear polyhedrosis virus).
GV
: Virus hạt (Granuloviruses).
SlNPV
: Virus đa diện nhân ký sinh trên sâu khoangn (Spodoptera litura
nucleaopolyhedro virus).
CPV
: Virus đa diện tế bào chất (Ctyplasmic Polyhedrosis viruses).
EV
: Entomopox viruses.
PIB
: Hạt thể vùi đa diện (Polyhedra Inclusion Body).
LE
: Larval – equivalent.
DNP
: Deoxyribo nucleoprotein.
HaNPV : Virus đa diện nhân ký sinh trên sâu xanh Helicoverpa armigera Nuclear
polyhedrosis viruses.
BVTV
: Bảo vệ thực vật.
SDS
: Sodium dodecyl sulfate.
CNSH
: Công nghệ sinh học.
Bt
: Vi khuẩn Bacillus thuringiensis.
IPM
: Quản lý dịch hại tổng hợp.
iv
Đờ án tớt nghiệp
DANH MỤC CÁC BẢNG, ĐỜ THỊ
Bảng 4.1. Tỷ lệ sâu chết do NPV thu nhận được ở các công thức..........................40
Bảng 4.2. Ảnh hưởng của mật độ sâu nhiễm đến sản lượng và hiệu suất nhân của
NPV .........................................................................................................................42
Bảng 4.3. Giá thành sản xuất cho 100 sâu chết virus ở các công thức ..................43
Bảng 4.4. Số PIB/sâu ở các công thức ....................................................................45
Bảng 4.5. Thời gian lấy mẫu của 100 sâu ở các công thức .....................................46
Bảng 4.6. Số PIB/sâu ở các công thức ....................................................................49
Đồ thị 4.1. Sản lượng PIB/sâu ở các thời điểm khác nhau .....................................44
Đồ thị 4.2. Sảnlượng PIB/sâu ở các công thức .......................................................49
v
Đờ án tớt nghiệp
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỜ, HÌNH ẢNH
Sơ đồ 2.1 Quy trình công nghệ sản xuất chế phẩm NPV........................................23
Hình 2.1 Sâu khoang .................................................................................................6
Hình 2.2 Vòng đời sâu khoang .................................................................................7
Hình 2.3 Cấu trúc của Baculovirus .........................................................................16
Hình 2.4 Cơ chế xâm nhập của virus NPV .............................................................17
Hình 2.5 Chu trình lây nhiễm virus NPV trên sâu khoang .....................................19
Hình 3.1. Hình thể vùi của virus NPV trên buồng đếm hồng cầu bằng kính hiễn vi
quang học với độ phóng đại 4000 lần, ở độ pha loãng 102 .....................................39
Hình 4.1 Sự thay đổi màu sắc của thức ăn sau 1 ngày nhiễm .................................47
Hình 4.2 Sự thay đổi màu sắc của thức ăn sau 4 ngày nhiễm .................................47
Hình 4.3 Hình minh họa mức độ ôi thiu của thức ăn nhiễm NPV ..........................48
vi
Đờ án tớt nghiệp
PHỤ LỤC
MỢT SỚ HÌNH ẢNH TRONG QUÁ TRÌNH LÀM THÍ NGHIỆM
Hình 1. sâu khoang 7 ngày tuổi bị bỏ đói 2 giờ trước khi nhiễm
Hình 2. Các giai đoạn nhiễm virus NPV trên sâu khoang.
(A): Sâu mới nhiễm virus, hoạt động bình thường
(B) : Sâu có triệu chứng: cơ thể căng phồng, màu thân chuyển sang hồng
nhạt, lờ đờ và ngừng ăn.
(C) : Sâu vừa chết.
(D): Sâu chết và dịch virus chảy ra.
1
Đồ án tốt nghiệp
Hình 2. Một số hình ảnh sâu khoang và nhộng chết do virus NPV
Hình 3. Sâu nuôi tập thể bị nhiễm NPV
2
Đồ án tốt nghiệp
Hình 4. Các lọ đựng mẫu sâu ở thí nghiệm xác định thời gian thu thich hợp.
Hình 5. Lọc virus NPV
3
Đồ án tốt nghiệp
(a)
(b)
Hình 6. Ly tâm mẫu.
(a): dịch virus mới ly tâm có sự phân tách các lớp.
(b): đánh đều mẫu sau khi ly tâm
Hình 7. Các ống COD chứa dịch virus NPV sau khi ly tâm.
4
Đồ án tốt nghiệp
Hình 8. Các PIB của virus NPV quan sát dưới kính hiển vi
MỘT SỐ BẢNG SỐ LIỆU
Bảng 1. Giá thành phần của một mẻ thức ăn và giá trị của 1 sâu khoang
Một mẻ thức ăn nhân tạo
(TANT)
Khối lượng
Đậu xanh
Thành phần
1. Đậu xanh
2. Methyl- paraben
3. Sorbic acid
4. Ascorbic acid
5. Men mì
6. Casein
7. Vitamin tổng hợp (Vitaral)
8. Agar
9. Công
Giá thành của 1 mẻ thức ăn ( Vnđ)
150g
2,5g
1,5g
3g
15g
15g
10ml
13g
5
5.250
7.500
2.000
3.000
3.000
10.000
6.000
4.500
50.000
91.500
Đồ án tốt nghiệp
Bảng 2.Giá thành trung bình của một sâu chết – một mẻ thức ăn.
Tên dụng cụ - hóa chất
STT
Số lượng
Giá/1 đơn vị
(Vnđ)
Tổng giá
(Vnđ)
1
Cốc lớn 500ml
1 cái
30.000
30.000
2
Cốc nhỏ 100ml
4 cái
22.000
88.000
3
Hũ yaourt, V= 30ml
8 lốc
7.000
56.000
4
Hộp nhựa vuông 16x10,5cm
6 cái
15.000
90.000
5
Thùng giấy A4 20,5x29,5cm
3 cái
5.000
15.000
6
Hợp nhựa trịn đường kính 8cm
20 cái
2.000
40.000
7
Hợp nhựa tròn đường kính 32cm
10 cái
2.000
20.000
8
Lọ thủy tinh V= 100ml
20 lọ
1.000
20.000
9
Cọ quét
3 cây
5.000
15.000
10
Dao
1 cây
10.000
10.000
11
Bông thắm
1 bịt
130.000
130.000
12
Bông không thắm
1 bịt
130.000
130.000
13
Đũa thủy tinh
1 cây
7.000
7.000
14
Máy xay sinh tố
1 cái
700.000
700.000
15
Cân kỹ thuật
1 cái
8.000.000
8.000.000
6
Đồ án tốt nghiệp
16
Bếp đun
1 cái
484.000
484.000
17
Giấy thấm
2 bịt
30.000
60.000
18
Bao tay
1 hộp
90.000
90.000
19
Khẫu trang
1 hợp
60.000
60.000
20
Ớng COD
50 ớng
14.000
700.000
21
Eppendor
1 bịt
254.000
254.000
22
Rỗ nhựa lớn
3 cái
58.000
174.000
23
kệ xếp
1 cái
50.000
50.000
24
pipet 1ml
1 cái
9.000
9.000
25
pipet 2ml
2 cái
11.000
22.000
26
pipet 5ml
1 cái
15.000
15.000
27
pipet 10ml
1 cái
18.000
18.000
28
bóp cao su
2 cái
20.000
40.000
29
Phiễu lọc
5 cái
16.000
80.000
30
Kính hiển vi
1 cái
31
Buồn đếm hồng cầu
1 cái
7
29.000.000 29.000.000
1.300.000
1.300.000
Đồ án tốt nghiệp
32
Kẹp
1 cái
22.000
22.000
33
Muỗng múc hóa chất
1 cái
12.000
12.000
34
Tủ lưu mẫu
1 cái
35
Giá đỡ ống nghiệm
1 cái
96.000
96.000
36
Cối - chày xứ
1 cái
32.000
32.000
37
Nồi inox
1 cái
60.000
60.000
55.000.000 55.000.000
TỔNG CỘNG CHI PHÍ (Vnđ)
96.911.000
Ghi chú: Mỗi thí nghiệm tiến hành lặp lại 3 lần với 15 sâu/ lần nhiễm thì cần mợt
mẻ thức ăn nhân tạo.
MỢT SỚ BẢNG XỬ LÝ SỐ LIỆU Ớ CÁC CÔNG THỨC THÍ NGHIỆM
Số PIB/sâu ở các công thức
ANOVA Table for PIB/sâu by MAT DO
Source
Between
groups
Within
groups
Total
(Corr.)
Sum of Squares
Df
Mean Square
F-Ratio
P-Value
3.3818E21
4
8.4545E20
3.08
0.0681
2.74852E21
10
27.7993
6.13033E21
14
2.74852E20
Có p-Value =0,0681>0,05 nên số PIB/sâu ở các công thức không có sự khác
biệt về mặt thống kê với mức ý 5%.
Multiple Range Tests for PIB/sâu by MAT DO
Mat do
Count
Mean
15
30
3
3
1.75123E9
2.66883E9
8
Homogeneouus
Groups
X
X
Đồ án tốt nghiệp
10
3
2.99198E9
X
1
3
3.11667E9
X
5
3
4.01509E10
X
Tỷ lệ sâu chết NPV sau 3 ngày nhiễm ở từng mật độ
ANOVA Table for TY LE SAU CHET by MAT DO
Source
Sum of Squares
Between
2647.38
groups
Within
277.993
groups
Total
2925.37
(Corr.)
Vì p-Value = 0,000 < 0,05 nên
Df
Mean Square
F-Ratio
P-Value
4
661.845
23.81
0.0000
10
27.7993
14
tỷ lệ sâu chết giữa các công thức có sự khác
biệt ý nghĩa 5%.
Multiple Range Tests for TY LE CHET by MAT DO
Mat do
Count
Mean
15
3
64.4433
30
3
66.6633
10
3
66.6667
5
3
77.6667
1
3
100
ANOVA Table for LE by mat do
Sum of
Source
Df
Squares
Between
106.365
4
Groups
Within
15.1817
10
Groups
Total (Corr.)
121.547
14
9
Homogeneouus
Groups
X
X
X
X
X
Mean
Square
F-Ratio
PValue
26.5913
17.52
0.0002
1.51817
Đồ án tốt nghiệp
Vì p-Value = 0,000 < 0,05 nên số LE ở các công thức có sự khác biệt với mức
ý
nghĩa
5%.
Mat do
Count
Mean
Homogeneouus Groups
10
5
3
3
366.588
426.129
X
XX
1
15
30
3
3
3
445.677
500.402
527.066
XXX
XX
X
Multiple Range Tests for LE by mat do
Homogeneouus
Groups
15
3
4.15333
X
30
3
6.38
XX
10
3
8.26667
XX
5
3
10.2667
XX
1
3
11.5933
X
ANOVA Table for chi phi san xuat by mat do
Mat do
Source
Count
Sum of
Squares
Mean
Df
Mean
Square
F-Ratio
P-Value
Between
47926.0
4
11981.5
4.96
0.0183
Groups
Within
24164.7
10
2416.47
Groups
Total (Corr.)
72090.7
14
Có p-Value =0,0183 < 0,05. Vậy chi phí sản xuất ở các công thức co sự khác biệt về
mặt thống kê với mức ý nghĩa 5%.
Multiple Range Tests for chi phi san xuat by mat do
10
Đồ án tốt nghiệp
Sản lượng virus thu được ở các mật độ.
ANOVA Table for san luong virus thu duoc by MAT DO
Sum of
Mean
Source
Df
F-Ratio P-Value
Squares
Square
Between
9.91499E18
4 2.47875E18
12.86
0.0006
Groups
Within
1.93405E18 10 1.93405E17
Groups
Total (Corr.)
1.1849E19
14
Có p-value=0,0006< 0,05, suy ra sản lượng virus thu được có sự khác biệt ở
mức ý nghĩa 5%.
Multiple Range Tests for san luong virus thu duoc by MAT DO
Mat do
Count
Mean
Homogeneouus
Groups
1.66E9
30
3
2.66667E9
10
3
3.04667E9
5
3
3.09E9
1
3
4.19E9
Hiệu suất nhân sinh khối ở các mật độ.
15
3
X
X
X
X
X
ANOVA Table for HSNSK by MAT DO
Sum of
Mean
Source
Df
F-Ratio P-Value
Squares
Square
Between
229.019
4
57.2547
13.96
0.0004
Groups
Within
41.0131
10
4.10131
Groups
Total (Corr.)
270.032
14
P-value = 0,0004<0,05. Hiện suất nhân sinh khối ở các mật độ có sự khác
biệt về mặt thống kê với mức ý nghĩa 5%.
Multiple Range Tests for HSNSK by MAT DO
Homogeneouus
Mat do Count
Mean
Groups
15
3
10.0867
X
30
3
11.3933
X
10
5
1
3
3
3
11.6933
17.9033
19.8167
X
11
X
X
Đồ án tốt nghiệp
Số PIB/SÂU ở các thời điểm khác nhau
ANOVA Table for PIB by THOI GIAN
Source
Sum of
Squares
Mean
Square
Df
F-Ratio
P-Value
Between
0.0000
4.45391E16
4 1.11348E16 281.12
Groups
Within
3.96091E14 10 3.96091E13
Groups
Total (Corr.)
4.49352E16 14
Có p-Value = 0<0,05. Suy ra số PIB/sâu ở các thời điểm khác nhau có mức ý
nghĩa thống kê với mức ý nghĩa 5%.
Multiple Range Tests for PIB by THỜI GIAN
THOI GIAN
Count
Mean
Homogeneouus Groups
5 NGÀY
3
8.05556E7
X
7 NGÀY
3
1.19444E8
X
RỬA
3
1.80556E8
X
VỪA CHẾT
3
2.10185E8
X
NGỪNG ĂN
3
2.23148E8
X
Số PIB/sâu ở các phương pháp ly tâm.
ANOVA Table for PIB by PP LY TAM
Source
Between Groups
Sum of
Squares
Df
Mean
Square
F-Ratio
6.42699E16
4
1.60675E16
35.39
P-Value
0.0000
Within Groups
4.53989E15 10 4.53989E14
Total (Corr.)
6.88098E16 14
Có p_Value=0 <0,05. Suy ra số PIB/sâu ở các phương pháp ly tâm có sự khác
biệt về mặt thống kê với mức ý nghĩa 5%.
Multiple Range Tests for PIB by PP LY TAM
PP LY TAM Count
Mean
Homogeneouus Groups
1.7037E8
CT3
3
X
2.94753E8
CT1
3
X
3.21605E8
CT4
3
XX
3.37963E8
CT2
3
X
3.52778E8
CT5
3
X
12
Đồ án tốt nghiệp
13