Sự khác biệt về di truyền của các chủng aeromonas hydrophila phân lập trên cá tra pangasianodon hypophthalmus ở đồng bằng sông cửu long

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
..

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

SỰ KHÁC BIỆT VỀ DI TRUYỀN CỦA CÁC CHỦNG
Aeromonas hydrophila PHÂN LẬP TRÊN CÁ TRA
(Pangasianodon hypophthalmus) Ở ĐỒNG BẰNG SƠNG
CỬU LONG

Ngành:

Cơng Nghệ Sinh Học

Chun ngành: Công Nghệ Sinh Học

Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Hiền
Sinh viên thực hiện
MSSV: 1051110078

: Nguyễn Trần Trúc Huân
Lớp: 10DSH01

TP. Hồ Chí Minh, 2014


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu, kết quả
nêu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình
nào khác.
Tơi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được
cảm ơn và các thơng tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Sinh viên thực hiện luận văn

Nguyễn Trần Trúc Huân

i


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cám ơn:
Ba mẹ và gia đình đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để em học tập, nghiên cứu và
hoàn thành tốt luận văn này
Ban Giám Hiệu trường Đại học Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, các thầy cơ
giáo trong khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường đã truyền đạt cho em
những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian qua. Đặc biệt là thầy Phạm
Minh Nhựt đã tạo điều kiện để em thực hiện đề tài này.
ThS. Nguyễn Thị Hiền, chị đã tận tình giúp đỡ, trực tiếp chỉ bảo, hướng dẫn em
trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp. Trong quá trình làm việc với chị, em không
ngừng tiếp thu thêm nhiều kiến thức bổ ích mà cịn học tập được tinh thần làm việc, thái
độ nghiên cứu khoa học nghiêm túc, hiệu quả, đây là những điều cần thiết cho em trong
quá trình học tập và cơng tác sau này.
Các anh chị thuộc Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và
Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ- Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng

Thủy Sản II
Các bạn bè đã giúp đỡ em trong công việc và tinh thần suốt thời gian làm đồ án tại
Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.
Do trình độ lý luận cũng như kinh nghiệm thực tiển còn hạn chế nên bài báo cáo
khơng thể tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy,
cơ và các bạn để em học thêm nhiều kinh nghiệm và sẽ hoàn thành tốt hơn.

ii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- i
LỜI CẢM ƠN --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- ii
MỤC LỤC ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- iii
DANH MỤC CÁC BẢNG ----------------------------------------------------------------------------------------------------- vi
DANH MỤC CÁC HÌNH ----------------------------------------------------------------------------------------------------- vii
LỜI MỞ ĐẦU --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1
1.

Đặt vấn đề ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 1

2.

Mục tiêu nghiên cứu: -------------------------------------------------------------------------------------------------- 1

3.

Nội dung nghiên cứu: -------------------------------------------------------------------------------------------------- 2

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU ------------------------------------------------------------------------------------- 3
1.1.

Giới thiệu về cá tra -------------------------------------------------------------------------------------------------- 3
Phân loại .......................................................................................................................................... 3
1.1.2. Phân bố .................................................................................................................................. 4
1.1.3.Đặc điểm hình thái .................................................................................................................. 4
1.1.4.Tập tính sinh trưởng ............................................................................................................... 4
1.1.5.Đặc điểm sinh sản ................................................................................................................... 5
1.1.6.Tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra ...................................................................................... 5

1.2. Vi khuẩn Aeromonas hydrophila ------------------------------------------------------------------------------------ 6
1.2.1.Tình hình nghiên cứu về A. hydrophila ................................................................................... 6
1.2.3.Đặc điểm phát triển ................................................................................................................ 9
1.2.4. Sự phân bố ........................................................................................................................... 10
1.2.5.Dấu hiệu bệnh lý ................................................................................................................... 11
1.2.6.Các nhân tố gây độc của A. hydrophila ................................................................................ 13
1.2.7.Cấu trúc bộ gen của A. hydrophila ...................................................................................... 13
1.2 8.Các gen gây độc của A. hydrophila ...................................................................................... 14
1.3.Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) --------------------------------------------------------------16
1.3.1.Nguyên lý chung của phương pháp PCR .............................................................................. 16
1.3.2.Kỹ thuật giải trình tự DNA ................................................................................................... 18
1.4.Các nghiên cứu phát sinh lồi ----------------------------------------------------------------------------------------20
1.4.1.Nghiên cứu dựa trên trình tự gen 16S rRNA......................................................................... 21

iii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.4.2.Nghiên cứu dựa trên trình tự “housekeeping” gen............................................................... 22
1.4.3. Nghiên cứu dựa trên kỹ thuật protein profile....................................................................... 23
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ---------------------------------------------------24
2.1. Thời gian và địa điểm làm thí nghiệm: ----------------------------------------------------------------------------24
2.2.Vật liệu---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------24
2.3.1. Thiết bị, dụng cụ .................................................................................................................. 25
2.3.2. Hóa chất ............................................................................................................................... 26
2.4. Phương pháp nghiên cứu ---------------------------------------------------------------------------------------------27
2.4.1. Nuôi cấy vi khuẩn................................................................................................................. 27
2.4.2. Phương pháp ly trích DNA .................................................................................................. 27
2.4.3 Quy trình PCR khảo sát các gen độc .................................................................................... 28
2.4.4. Quy trình PCR 16S rDNA .................................................................................................... 29
2.4.5. Quy trình PCR gen rpoD ..................................................................................................... 30
2.4.6.Phương pháp điện di acid nucleotide trên gel agarose ....................................................... 30
2.4.7.Phương pháp xử lý kết quả giải trình tự ............................................................................... 31
2.4.8.Phương pháp điện di SDS- PAGE ........................................................................................ 31
2.5. Bố trí thí nghiệm --------------------------------------------------------------------------------------------------------33
2.5.1. Khảo sát sự hiện diện của các gen gây độc lực của A. hydrophila ..................................... 34
2.5.2. Giải trình tự đoạn gen 16S rDNA và rpoD .......................................................................... 34
2.5.3. Xác định sự đa dạng protein tổng số của A. hydrophila ...................................................... 34
2.5.4. Thiết lập mối tương đồng về di truyền của các chủng ......................................................... 34
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ----------------------------------------------------------------------------35
3.1.Kết quả khảo sát các gen độc lực ------------------------------------------------------------------------------------35
3.2. Kết quả giải trình tự đoạn gen 16S rDNA và rpoD -------------------------------------------------------------38
3.2.1.Kết quả PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA và rpoD .............................................................. 38
3.2.2 Kết quả phân tích trình tự ..................................................................................................... 39
3.4. Mối tương đồng di truyền của các chủng vi khuẩn khảo sát ----------------------------------------------------45
3.4.1. Mối quan hệ kiểu gen và độc lực ......................................................................................... 45
3.4.2. Mối quan hệ kiểu gen và kết quả giải trình tự ..................................................................... 46

3.4.3. Mối quan hệ kiểu gen và protein tổng số ............................................................................. 46
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐÊ NGHỊ --------------------------------------------------------------------------------47
TÀI LIỆU THAM KHẢO -----------------------------------------------------------------------------------------------------48
PHỤ LỤC -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------55

iv


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APS

Ammonium Persulfate

BA

Blood Agar (thạch máu)

BHIB

Brain Heart Infusion Borth

CFU

Colony Forming Unit (đơn vị tạo thành khuẩn lạc)

Ctv

Cộng tác viên

D_FISH

Tổng cục Thủy sản–Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn.

ĐBSCL

Đồng Bằng Sông Cửu Long.

DNA

Deoxyribonucleic acid.

EDTA

Ethylene Diamine Tetra acetic acid

KDa

Kilo Dalton

LD

Lethal dose (Liều gây chết)

PCR

Polymerase Chain Reaction

rDNA

Ribosome Deoxyribonucleic acid

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid.

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS- PAGE

Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis

TBE

Tris/ Borat/ EDTA ( Ethylenediaminetetraacetic acid).

TEMED

N, N, N’,N’- tetramethylenediamide

UV

Ultra violet

VASEP

Hiệp Hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (Vietnam
Association of Seafood Exporters and Producers).

w/v

Weight for volume

v


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2. 1. Thông tin về nguồn gốc độc lực của các chủng vi khuẩn trên cá tra………24
Bảng 2. 2. Các trình tự mồi xác định loài và các gen độc của A. hydrophila………….26
Bảng 2. 3. Quy trình luân nhiệt khuếch đại gen 16S rRNA……………………….…..30
Bảng 2. 4. Quy trình luân nhiệt khuếch đại gen rpoD………………………………...30
Bảng 3. 1. Nhóm di truyền của các mẫu phân lập A. hydrophila……………………….37
Bảng 3. 2. Độ tương đồng di truyền (%) của các trình tự 16S rDNA và rpoD…….......40

vi


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Cá tra Pangasianodon hypophthalmus ……………………………………......3
Hình 1. 2. Aeromonas hydrophila…………………………………………………………9
Hình 1. 3. Biểu hiện bệnh lý bên trong và bên ngoài của cá tra nhiễm A. hydrophila......12
Hình 1. 4. Kích thước bộ gen A. hydrophila…………………………………………………….13

Hình 1. 5. Sơ đồ kỹ thuật PCR chuẩn ………………………………………………........17
Hình 1. 6. Kỹ thuật giải trình tự…………………………………………………...…......19
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm…………………………………………………………33
Hình 3. 1. Kết quả PCR khảo sát các gen độc của vi khuẩn A. hydrophila………….….36
Hình 3. 2. Vi khuẩn A. hydrophila trên mơi trường BA …………………..…….…….39
Hình 3. 3.Kết quả PCR khuếch đại đoạn 16S rDNA……………….……………….…….39
Hình 3. 4. Kết quả PCR khuếch đại đoạn gen rpoD…………………………………....…39
Hình 3. 5. Cây phát sinh lồi dựa trên trình tự 16S rRNA ………..……………………...39
Hình 3. 6. Cây phát sinh lồi dựa trên trình tự rpoD………………………..…..….....…..41
Hình 3.7. Kết quả điện di SDS-PAGE……………………………………...…………....43
Hình 3. 8. Mối quan hệ giữa kiểu gen và độc lực của vi khuẩn A. hydrophila…….….…45

vii


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

LỜI MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Những năm gần đây, nghề nuôi trồng thủy sản đã không ngừng phát triển và ngày càng
có vị trí quan trọng trong nền kinh tế Việt Nam. Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL)
là vùng đất giàu tiềm năng được thiên nhiên ưu đãi có lợi thế rất lớn để phát triển ni
trồng thủy sản. Ni trồng thủy sản ở ĐBSCL đã có bước phát triển vượt bậc mang lại
hiệu quả kinh tế cao, đặc biệt cá tra đang là đối tượng nuôi chiến lược, thu lại nguồn
ngoại tệ rất lớn, được xem là nguồn xuất khẩu thủy sản quan trọng của nước ta.
Tuy nhiên với sự gia tăng quá mức của phong trào nuôi cá tra ở ĐBSCL, đã tạo
điều kiện cho dịch bệnh thường xuyên bộc phát gây nhiều thiệt hại cho người ni.
Trong đó, vi khuẩn được coi là một trong những tác nhân gây bệnh nghiêm trọng và
gây tỉ lệ hao hụt cao ở cá tra. Đặc biệt là vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh
xuất huyết là tác nhân gây bệnh làm tổn thất lớn cho người nuôi hằng năm.

Vi khuẩn A. hydrophila được xem là rất đa dạng về di truyền nhưng các
nghiên cứu trong nước về di truyền của vi khuẩn này còn khá hạn chế. Sự phân loại về
các chi Aeromonas thường phức tạp, sự khó khăn trong việc nhận biết kiểu hình của
Aeromonas là sử dụng các phương pháp khác nhau, điều kiện test sinh hóa, sự biến đổi
về kiểu hình trong lồi... Ngày nay, cùng với sự phát triển và hiểu biết về sinh học
phân tử, nhiều chỉ thị sinh học phân tử đã được nghiên cứu và ứng dụng như một công
cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác nghiên cứu khả năng gây bệnh của các chủng A.
hydrophila. Để góp phần xác định sự đa dạng di truyền của các chủng gây bệnh của A.
hydrophila, tìm ra mới liên hệ giữa kiểu gen và độc lực của vi khuẩn nhằm có đươc
biện pháp hiệu quả hạn chế thiệt hại do bệnh gây ra, đề tài “Sự khác biệt về di truyền
của các chủng Aeromonas hydrophila phân lập trên cá tra (Pangasianodon
hypophthalmus) ở Đồng Bằng sông Cửu Long” được thực hiện.
2. Mục tiêu nghiên cứu:
Đánh giá sự khác biệt về di truyền của các chủng A. hydrophila phân lập trên cá tra ở
ĐBSCL bằng các phương pháp sinh học phân tử.

1


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

3. Nội dung nghiên cứu:
Khảo sát sự hiện diện của các gen gây độc của A. hydrophila bằng phương pháp PCR
và xác định sự đa dạng protein tổng số của vi khuẩn đối với 18 chủng A. hydrophila
phân lập trên cá tra.
Giải trình tự đoạn gen 16S rRNA và rpoD của 18 chủng vi khuẩn để khẳng định lại
định danh lồi bằng kiểm tra sinh hóa, đồng thời thiết lập cây phát sinh lồi và tìm ra
mối tương đồng về di truyền với kiểu gen.

2

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cá tra
Cá tra (Pangasius hypothalmus) là một trong các lồi cá có giá trị kinh tế phổ
biến khu vực Châu Á, là một trong 30 loài cá thuộc họ Pangassiidae (theo
). Sự đa dạng thành phần loài của họ này tập trung chủ yếu ở
khu vực Đông Nam châu Á.
Tên tiếng anh: Striped Catfish.
Tên La tinh: Pangasianodon hypophthalmus
Phân loại
Ngành: có dây sống– Chordata Bateson, 1885.
Ngành phụ: có xương sống- Vertebrata Cuvier, 1812.
Lớp: cá xương- Osteichthyes Huxley, 1880.
Lớp phụ: cá vây tia- Actinopterygii.
Bộ: cá da trơn- Siluriformes.
Họ: cá tra Pangasiidae.
Giống: Pangasius.
Lồi: Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878).
()

Hình 1. 1. Cá tra Pangasianodon hypophthalmus
()

3


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.1.2. Phân bố
Vùng phân bố tự nhiên của cá Tra giới hạn trong khu vực hạ lưu sông Mê kong,
bao gồm Thái Lan, Lào, Cambodia và Việt Nam, kể cả sông Chao Praya ở Thái Lan
(Roberts và Vidthayanon, 1991). Ở Việt Nam, những năm trước đây chưa có cá sinh
sản nhân tạo, cá bột và cá tra giống được vớt trên sông Hậu và sông Tiền. Do cá có tập
tính di cư ngược sơng Mê Kong để sống và tìm nơi sinh sản tự nhiên, nên cá trưởng
thành chỉ thấy trong ao ni, rất ít gặp trong tự nhiên ở địa phận Việt Nam.
1.1.3.Đặc điểm hình thái
Theo Nguyễn Văn Thường (2007) cá tra được mô tả như sau :
- Đầu rộng dẹp bằng, mõm ngắn, nhìn từ trên xuống chót mõm trịn.
- Miệng trước, rộng ngang, khơng co duỗi được có dạng hình vịng cung và
nằm trên mặt phẳng ngang.
- Răng nhỏ mịn, răng vòm miệng chia thành 4 đám nhỏ, mỏng nằm trên đường
vịng cung, đơi khi bi che lắp bởi nếp da vòm miệng.
- Lỗ mũi sau gần lỗ mũi trước hơn mắt và nằm trên đường thẳng kẻ từ lỗ mũi
trước đên cạnh trên mắt.
- Thân thon dài, phía sau dẹp bên. Đường bên hoàn toàn và phân nhánh, bắt
đầu từ mép trên của lỗ mang đến điểm giữa gốc vi đuôi. Mặt sau của vi lưng, vi ngực
có răng cưa hướng xuống gốc vi. Vi bụng kéo dài chưa chạm đến khởi điểm của gốc vi
hậu mơn.
- Cơ quan tiêu hóa của cá tra gồm miệng, răng hàm, gai mang, dạ dày to hình
chữ U, cơ rất phát triển. Túi mật rất phát triển, ruột ngắn. Cá tra là loài cá ăn tạp, song
có nhiều đặc điểm của lồi cá ăn thịt, nhưng cá tra là lồi cá hiền, chúng khơng đuổi
bắt mồi, mồi ăn chủ yếu là động vật yếu vận động (Dương Tấn Lộc, 2008).
1.1.4.Tập tính sinh trưởng
Cá tra có tốc độ tăng trưởng tương đối cao, là loài tăng trưởng nhanh nhất trong
10 loài giống Pangasius (Lazard, 1998) và Pangasiamodon. Tuy nhiên, tốc độ tăng
trưởng còn tùy thuộc rất lớn vào mật độ nuôi, chất lượng và số lượng thức ăn cung
cấp.

4


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Cá tra có thể sống ở vùng nước hơi lợ ( nồng độ muối 7- 10 ‰) , có thể chịu
đựng được nước phèn pH > 5, dễ chết ở nhiệt độ thấp dưới 15ºC, nhưng chịu nóng tới
39ºC, nhiệt độ thích hợp cho cá tra 26- 30ºC. Cá tra sống được ở môi trường chật hẹp,
nước giàu các chất hữu cơ. Cá tra có số lượng hồng cầu trong máu cao hơn các loài cá
khác. Cá có cơ quan hơ hấp phụ và cịn có thể hơ hấp bằng bóng khí và da nên chịu
đựng được mơi trường nước thiếu oxy hịa tan. Tiêu hao oxy và ngưỡng oxy của cá
thấp hơn cá basa (do cá basa khơng có cơ quan hấp phụ).
1.1.5.Đặc điểm sinh sản
Trong tự nhiên, cá tra thành thục chậm hơn so với các loài cá da trơn khác,
chúng thành thục vào cuối mùa khô và đầu mùa mưa. Trong sinh sản nhân tạo, mùa vụ
sinh sản của cá tra từ tháng 6 đến tháng 8 (Cacot, 1998).
Cá tra thuộc loài di cư sinh sản. Mùa di cư chúng (xảy ra từ tháng 5-6) bơi
ngược dịng đến nơi có điều kiện sinh thái phù hợp cho sự phát triển của tuyến sinh
dục, thường ở miền Nam nước Lào, thượng nguồn sông Mekong (Cacot, 1998). Cá
con theo xi dịng nước xuống vùng hạ lưu sông Mekong và chúng xuất hiện trên các
sông vùng ĐBSCL từ tháng 6 đến tháng 9, khi mực nước sông dâng lên (Lenormand,
1996)
1.1.6.Tình hình sản xuất và tiêu thụ cá tra
Nghề nuôi cá tra đang phát triển mạnh ở Việt Nam, đem lại lợi ích về kinh tế,
an ninh lương thực. Với sản lượng hàng năm đạt khoảng 1,3 triệu tấn, ngành công
nghiệp cá tra ở Việt Nam hiện đã vươn tới 140 thị trường trên toàn cầu với tổng giá trị
xuất khẩu đạt hơn 1,4 tỷ USD, đồng thời tạo công ăn việc làm trực tiếp và gián tiếp
cho hơn 200.000 lao động và diện tích ni trồng khoảng 6000 ha, chủ yếu trải dài trên
các dòng kênh và nhánh sơng nước ngọt ở khu vực ĐBSCL.

Bên cạnh đó nghề nuôi cá tra cũng phải đối mặt với nhiều khó khăn thách thức.
Theo báo cáo của Bộ Nơng Nghiệp và Phát triển nơng thơn tính đến cuối tháng 42014, diện tích, sản lượng cá tra ở nhiều tỉnh ĐBSCL tiếp tục giảm so với cùng kỳ
năm ngoái.

5


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Cụ thể, tại Vĩnh Long, diện tích nuôi đạt 419 ha với sản lượng 30.400 tấn, lần
lượt giảm 3,6% về diện tích và 27,8% về sản lượng so với cùng kì năm ngối, An
Giang diện tích ni giảm 38,9% (đạt 476 hecta), sản lượng thu hoạch giảm 30,8% so
với năm ngối,… ngun nhân khiến diện tích ni giảm sút do nhiều nguyên nhân cụ
thể như tình hình dịch bệnh, kỹ thuật, ni chi phí cao, lợi nhuận thấp, cạnh tranh,
chống bán phá giá,…. Song mặc dù vậy, ngành công nghiệp cá tra vẫn không ngừng
phát triển để vươn tới hướng phát triển bền vững trong nuôi trồng thủy sản.
Theo báo cáo mới nhất của Hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam
(VASEP), kết thúc 1- 2014, kinh ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam đạt 1,65 tỉ đô la
Mỹ, tăng 31% so với cùng kỳ năm ngối, trong đó, xuất khẩu cá tra đạt 409 triệu đô la
Mỹ, tăng 5,2% so với cùng kỳ năm ngối.
Theo VASEP, trong q 1-2014, xuất khẩu thủy sản Việt Nam đã mở rộng thêm
11 thị trường mới, nâng tổng số thị trường xuất khẩu thủy sản của Việt Nam là 146 so
với con số 135 của cùng kỳ năm ngoái. Mỹ, Nhật Bản và EU là ba thị trường nhập
khẩu thủy sản lớn nhất của Việt Nam, chiếm 56% tổng kinh ngạch xuất khẩu trong quí
1.2014.
1.2. Vi khuẩn Aeromonas hydrophila
1.2.1.Tình hình nghiên cứu về A. hydrophila
1.2.1.1.Tình hình trong nước
Các nghiên cứu về bệnh xuất huyết trên đối tượng cá nước ngọt còn hạn chế về
số lượng, tập trung chủ yếu trên các lồi cá ni. Các cơng trình đã công bố gồm: bệnh

xuất huyết do vi khuẩn Aeromonas spp gây ra trên cá trắm cỏ (Ctenopharyngodon
idellus) nuôi lồng ở miền Bắc (Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy Sản I, 1997; Cục
Bảo vệ nguồn lợi– Bộ thủy sản, 1997). Bệnh xuất huyết trên cá ba sa (Pangasius
bocourti) và cá he (Puntiusaltus) nuôi bè tại Châu Đốc (Phan Văn Ninh và ctv, 1993);
cá trê giống ở thành phố Hồ Chí Minh (Vũ Thị Tám và ctv 1994), cá bống tượng
(Oxyeleotris marmoeatus) ở hồ Trị An và Tiền Giang (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1995).
Theo Phạm Văn Ninh và cộng sự (1993) dấu hiệu bệnh lý của cá ba sa bị xuất
huyết: vành môi trên, dưới bị xuất huyết, hầu hết các gốc vi đều bị xuất huyết. Khi

6


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

bệnh nặng, vành mắt cá bị xuất huyết, mắt lồi đục, bụng trướng to. Giải phẫu nội quan:
gan xuất huyết, thành ruột mỏng. Xoang bụng chứa dịch máu.
Bệnh xuất huyết trên cá he (Puntius altus) nuôi bè do vi khuẩn Aeromonas spp
có biểu hiện bệnh lý như sau: các gốc vi xuất huyết, các bệnh nặng gốc vi viêm loét
ngày càng rộng. Quan sát bên trong: ruột bở, gan nhiễm dịch mật (Phan Văn Ninh và
ctv, 1993).
Bệnh xuất huyết trên cá trê (Clarias sp) giống do vi khuẩn A. hydrophila
thường xảy ra ở cá trên 2 tuần tuổi, biểu hiện bệnh lý: cá mất nhớt, các gốc vi đều xuất
huyết, các râu cong và bị cụt, bụng trướng to chứa đầy dịch máu, cá treo trên mặt nước
hay nằm sát đáy bể. Có những trường hợp cá bị u loét nơi đầu gần xương chẩm, nổi
hạch trắng hai bên gốc vi ngực. Cá nhiễm bệnh tách bầy và hoạt động yếu ớt. Bệnh
tiến triển xảy ra nhanh chóng trong tồn bộ bể ươn cá, từ khi phát hiện bệnh xảy ra 2, 3
ngày là gây chết hàng loạt. Cá trê giống được điều trị, dựa vào kháng sinh đồ của vi
khuẩn đã được phân lập.
Theo Võ Thế Dũng và Trần Thị Bạch Dương, báo cáo về kết quả nghiên cứu về
tác nhân gây bệnh trên cá tầm và cá hồi ni trong hệ thống tuần hồn và bán tuần

hồn tại Lâm Đồng, thì trong hệ thống ni bán tuần hồn (hệ thống ni có tái sử
dụng nước 50-60% kết hợp thay nước mới), cá hồi có biểu hiện xuất huyết kèm theo lở
loét, tróc vảy. Ở cá hồi xuất huyết, vi khẩn A. hydrophila và A. salmonocida xuất hiện
ở tần xuất 100% và 41,67%.
Theo nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh (2012), xác định vi khuẩn A.
hydrophila cũng gây bệnh xuất huyết trên lươn đồng (Monopterus albus) và cũng
chính là tác nhân gây bệnh trên cá rơ (Anabas testudineus) (Đặng Thụy Mai Thy và
ctv, 2012).
Từ những ghi nhận trên cho thấy, loài vi khuẩn A. hydrophila đã có sự cảm
nhiễm trên nhiều đối tượng thủy sản.
1.2.1.2.Tình hình thế giới
Bệnh xuất huyết do vi khuẩn gây ra trên nhiều đối tượng cá sống hoang dại
trong sông, hồ, ao, đầm nước ngọt, cá nuôi. Bệnh được khảo sát từ hiện tượng hội

7


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

chứng dịch bệnh lở loét ở cá EUS (Epizootic Ulcerative Syndsome) khu vực Đông
Nam Á (Hứa Thị Phượng Liên, 1998).
Biểu hiện bệnh lý bên ngoài của cá chép (Cyprinus carpio) bị nhiễm là mất vảy,
là những đốm đỏ do xuất huyết trên không đều trên da, những cơ quan bên trong
trướng lên và có màu tái. Các vi khuẩn phân lập được từ cá bệnh là A. salmonicida, A.
hydrophila, Pseudomonas flurescens. Khi tiêm những vi khuẩn này vào cá khỏe, thì có
được những dấu hiệu bệnh lý như cá bệnh được khảo sát ban đầu (Angka S.L, 1983).
Dấu hiệu xuất huyết và hoại tử cũng được ghi nhận ở gan, thận, tụy, ruột cá trê
giống (Clarias batrachus) nhiễm A. hydrophila và liều gây chết LD50 cũng được mô tả
(Angka, 1990).
Sự bộc phát bệnh nhiễm trùng máu xảy ra ở những trại nuôi cá xung quanh

Jakarta và Bogor (Indonesia). Bệnh xuất hiện phổ biến trên cá tai tượng Osphronemus
gouramy, làm xuất huyết, tổn thương trên da. Các vi khuẩn phân lập được là
Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, A. hydrophila,…(Supriyadi, 1988)
Vi khuẩn A. hydrophila gây ra những vết loét trên thân cá chép (Cyprimus
carpio) được nghiên cứu bằng cách gây cảm nhiễm trên 100 con cá, có chiều dài
20cm. Kết quả khoảng 80% cá chết. Khảo sát cá sau khi chết thấy đặc trưng của bệnh
nhiễm trùng máu xuất huyết A. hydrophila đã được tái phân lập từ cơ, gan, máu
(Saitanu và Wongsawang, 1982).
Vi khuẩn A. hydrophila cũng được xác định là tác nhân gây bệnh xuất huyết
cho cá lóc (Ophicephalusn atriatus). Cá basa (Pangasius bocourti) đực và cái thành
thục nuôi trong bè gỗ nhiễm A. hydrophila 50% gây tổn thương trên da (Tanasomwang
và Saitanu, 1979)
1.2.2.3. Phân loại vi khuẩn A. hydrophila
Ngành (phylum): Proteobacteria.
Lớp (class): Grammaproteobacteria.
Bộ (ordo): Aeromonadales.
Họ (famiilia): Aeromonadaceae.
Giống (genus): Aeromonas.

8


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Lồi (species): A. hydrophila.

Hình 1. 1. Aeromonas hydrophila
Theo Bùi Quang Tề (2006) trong nhóm Aeromonas có hai nhóm:
- Nhóm 1: Aeromonas khơng di động (A. salmonicida) thường gây bệnh ở
nước lạnh.

- Nhóm 2: Là các Aeromonas di động, bao gồm A. hydrophila, A. caviae, A.
sobria.
Sự phân loại các chi Aeromonas thường phức tạp và nhiều biến đổi. Năm 1980,
chỉ có 4 lồi Aeromonas, như A. hydrophila, A. caviae, A. salmonicida và A. sobria.
Hiện nay con số là 25 loài (Figueras và ctv, 2011). Số loài đã được cơng bố A.
hydrophila, A. sobria, A. caviae lồi thường được biết đến gây bệnh ở người hoặc
động vật A. veronii, A. jandaei, A. trota, A. schuberrii, A. popoffii, A. bestiarum, A.
salmonicida, A. media và A. eucrenophila hiếm khi tìm thấy gây bệnh ở người (Janda
và About, 2010). Các loài phổ biến thường gặp trong tự nhiên, phổ biến nhất A.
hydrophila, A. veronii, A. caviae, A. salmonicida phân lập từ các ao nuôi, từ cá nhiễm
bệnh, động vật hoặc từ mẫu bệnh lâm sàng ở người.
1.2.3.Đặc điểm phát triển
A. hydrophila là nhóm vi khuẩn gram âm, hình que, có khả năng lên men, kích
thước khoảng 0,8-1 x 1,0- 3,5µm, di động thông qua một cựu roi (Brian Austin, Dawn
9


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

A. Austin). Vi khuẩn yếm khí tùy tiện, Cytochrom oxidase dương tính, khử nitrat,
khơng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129… Tỉ lệ Guanin + Cytozin trong ADN
57- 63 mol%. Sự hoại tử thử trên máu thỏ của hai loài vi khuẩn A. hydrophila khác với
A. sobria. A. hydrophila dung huyết trên thạch máu khi nuôi cấy ở nhiệt độ 10ºC và
30ºC (Bùi Quang Tề, 2006).
Môi trường ni cấy có vai trị rất quan trọng cho sự phát triển và khả năng gây
độc của vi khuẩn, đặc biệt là dinh dưỡng có sẵn, nhiệt độ và pH (Sautour và ctv,
2003), chỉ có nhiệt độ và độ hoạt động của nước ảnh hưởng chính đến sự phát triển của
A. hydrophila, cịn pH ảnh hưởng khơng đáng kể. A. hydrophila phát triển trên môi
trường TSA ở 28ºC trong 18-24h có dạng trịn, màu vàng kem hay vàng sáng, nổi, và
đường kính 2-3 mm (Nguyễn Thanh Tâm, 2013).

1.2.4. Sự phân bố
Vi khuẩn A. hydrophila tồn tại trong những hệ thống ni thủy sản trên tồn
cầu, điều này thể hiện cho sự thích ứng của vi khuẩn trong mơi trường nước (Hanzen
và ctv, 1978; William và LaRock, 1986). Nó là nguyên nhân gây ra hư hỏng thực
phẩm tươi sống, bao gồm cá và hải sản (Rustigan và Stuart, 1943; Amend và Fender,
1976; Daskalow, 2006). A. hydrophila hiện diện trong môi trường nước chảy nhiều
hơn trong môi trường nước tĩnh (Hanzen và ctv, 1978).
Trong điều kiện bình thường, A. hydrophila khơng gâybệnh đối với các sinh
vật sống, nhưng khi môi trường ô nhiễm, cá bị stress, thay đổi sinh lý đột ngột hay
bịnhiễm những mầm bệnh khác thì A. hydrophila là tác nhân gây bệnh tiềm tàng
(Plumb và ctv, 1976; Fang và ctv, 2000). A. hydrophila trởthành một tác nhân gây
bệnh trầm trọng trong nghề nuôi cá thâm canh do tăng sức tải môi trường, sinh lý cá
nuôi bị rối loạn (Shaw và Squires, 1984). Khi điều kiện môi trường thuận lợi A.
hydrophila tăng sinh rất nhanh và sản sinh ra độc tố ECP rất nhiều, đây là nguyên
nhân gây bệnh đột ngột cho cá và thậm chí làm cá chết ngay (Allan và Stevenson,
1981; Yadav và ctv, 1992; Vivas và ctv, 2004).
A. hydrophila là nhóm vi khuẩn có khả năng sống sót trong mơi trường lạnh ngồi
tựnhiên với nhiều nhân tố gây độc lực. Những chủng phân lập được từ cá khỏe thì chỉ

10


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

có một vài chủng có độc lực đủ để gây bệnh trên cá. Có rất nhiều yếu tố liên quan đến
sự lây nhiễm A. hydrophila lên vật chủ.
Vi khuẩn có thể gây bệnh ở basa, cá sấu, bệnh đỏ chân ở ếch, đốm nâu ở tôm
càng xanh. Tỉ lệ tử vong ở động vật thủy sản thường từ 30- 70% riêng ở cá giống
(basa, trê) có thể chết 100%. Bệnh xuất hiện quanh năm nhưng thường tập trung vào
mùa xuân và mùa thu ở miền Bắc, ở miền Nam bệnh phát nhiều vào mùa mưa (Bùi

Quang Tề,2006).
1.2.5.Dấu hiệu bệnh lý
Bệnh nhiễm trùng ở động vật thủy sản thường biểu hiện ở các dạng khác nhau.
Theo Karunasagar và cộng sự, (1989) thì các dấu hiệu lâm sàng do A. hydrophila gây
ra đã được xác định có 4 loại:
- Thứ nhất là dấu hiệu cấp tính (nhiễm trùng huyết gây tử vong nhanh với một
vài triệu chứng tổng quát).
- Thứ hai là cơ thể trương nước cấp tính (da phồng, vẩy xù, áp xe).
- Thứ ba là lở loét sâu vào cơ thể (những khối u nhọt, áp xe).
- Thứ tư là dấu hiệu tiềm tàng (khơng có triệu chứng).
Nhưng theo Bùi Quang Tề (2006), dấu hiệu đầu tiên là cá kém ăn hoặc bỏ ăn,
nổi lờ đờ trên tầng mặt. Da cá thường đổi màu tối khơng có ánh bạc, cá mất nhớt, khô
ráp. Xuất hiện các đốm xuất huyết màu đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, râu
xuất huyết hoặc bạc trắng. Xuất hiện các vết lt ăn sâu vào cơ, có mùi hơi thối, trên
vết loét thường có nấm và ký sinh trùng ký sinh. Mắt lồi đục, hậu mơn viêm xuất
huyết, bụng có thể chướng to, có vây xơ rách, tia vây cụt dần.
Giải phẫu nội tạng : xoang bụng xuất huyết, mô mỡ cá basa xuất huyết nặng.
Gan tái nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột, dạ dày, tuyến sinh dục, bóng hơi đều xuất
huyết. Có trường hợp cá basa 2 đoạn ruột lịng vào nhau. Xoang bụng có chứa nhiều
dịch nhờn mùi hôi thối.
Cá trê giống bị bệnh thường tách đàn và “treo râu” đầu hướng lên trên vuông
gốc với mặt nước. Cá bống tượng có hiện tượng da mất hết nhớt gọi là bệnh “ tuột
nhớt”.

11


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Ở ba ba xuất hiện các vết lt xuất huyết, khơng có hình dạng nhất định ở xung

quanh và trên mai lưng, phần bụng: các chân có thể cụt hết móng. Bệnh nặng cơ thể ba
ba mềm nhũn hoạt động chậm chạp, khi lật ngửa ba ba khơng tự sấp lại được. Ba ba ít
ăn hoặc bỏ ăn, sau 1-2 tuần chúng bò lên cạn và chết, tỉ lệ chết tới 30- 40%. Giải phẫu
phổi gan, thận có màu đen.
Theo Hứa Thị Phượng Liên (1998), cá tra mắc bệnh xuất huyết có triệu chứng kém ăn,
hay bỏ ăn, bơi lội nhào lộn bất thường, mắt lồi đục, hậu môn đỏ lồi, bụng trướng to,
vành môi, xoang miệng và các vi có đốm xuất huyết, biểu hiện rõ nhất thường ở vi hậu
môn và vi đuôi. Trường hợp mãn tính, thịt cá có điểm xuất huyết màu đỏ và bị loại bỏ
hoặc hạ cấp trong quá trình chế biến và xuất khẩu.

B

A

D

C

Hình 1. 2. Biểu hiện bệnh lý bên trong và bên ngoài của cá tra nhiễm A. hydrophila
A: xuất huyết vùng đầu; B: xuất huyết vùng mắt và miệng; C: xuất huyết vùng bụng,
vây bụng và hậu môn; D: xuất huyết ruột, vùng da bên trong bụng

12


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.2.6.Các nhân tố gây độc của A. hydrophila
A. hydrophila có chứacác loại độc tố như heamolysins,aerolysin, cytosine,
enterotoxin, hoạt động phân giải protein, hoạt động thủy phân chất béo, gelatinase, sản

xuất chất nhờn và các peptide kháng khuẩn (Asmat và Gires, 2002; Castro và
ctv,2003). Những nhân tố gây độc lực có vai trị trong sự sống cịn, cơ chế tự bảo vệ và
khả năng gây bệnh của vi khuẩn. Vào năm 1995, các nhà nghiên cứu đã cho rằng, các
nhân tố độc lực chính là yếu tố quyết định khả năng gây bệnh của vi khuẩn (Vadivelu
và ctv, 1995). Theo Subashkumar và cộng sự (2006) , protease, aerolysin, hemolysin,
enterotoxins, lipases, gelatinase và màng sinh học là các nhân tố độc lực của
Aeromonas spp. Một số chất độc sinh ra từ các loài khác nhau, phân lập thường mang
các gen mã hóa cho nhiều độc tố (Wang và ctv,2003).
Ngồi ra dòng A. hydrophila còn sản xuất các enzyme ngoại bào : protease,
DNase, Rnase, elastase, lecithinase, amylase, lipase, galatinase và chitinase (Merino và
ctv, 1999) . Những enzyme này có vai trò cung cấp cho vi khuẩn bằng cách phá vỡ các
tế bào vật chủ thành các phân tử nhỏ và sao đó đi vào q trình hình thành tế bào.
1.2.7.Cấu trúc bộ gen của A. hydrophila
Theo Seshadri và cộng sự (2006), bộ gen hoàn chỉnh của A. hydrophila bao
gồm một NST với 4.744.448 bp , với thành phần GC chiếm 61,5% và có 5195 gen mã
hóa protein, 128 gen tRNA, 128 gen tRNA, 30 gen rRNA. Trình tự bộ gen hoàn chỉnh
của A. hydrophila ATCC 7966T thể hiện cơ chế độc lực và chuyển hóa độc lực cho
phép A. hydrophila phát triển được ở trong nhiều mơi trường khác nhau.

Hình 1. 3. Kích thước bộ gen A. hydrophila
(www.ncbi.nlm.nih.gov)
Với trình tự bộ gen của A. hydrophila cho thấy loài vi khuẩn này rất linh hoạt dễ dàng
tồn tại trong môi trường nước với nhiều khả năng gây bệnh khác nhau.
13


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.2 8.Các gen gây độc của A. hydrophila.
Tất cả các gen mã hóa cho độc lực liên quan đến các yếu tố gây bệnh thiết lập

trong tế bào chủ được định nghĩa là gen độc lực (Zhou và ctv, 2013). Các tác nhân gây
bệnh bao gồm cấu trúc tế bào lipopolysaccharides (LPS), màng ngoài(OMP), tiên mao
và roi, hệ thống bài tiết loại III (T3SS) hoạt động như các cấu trúc kết dính, và các yếu
tố ngoại bào như enzyme và các chất độc.Trong số các ngoại độc tố, aerolysin,độc tố
cytotonic bền nhiệt, cytotonic không bền nhiệt, cytolylic đóng vai trị quan trọng trong
sinh bệnh (Ottaviani và ctv, 2011). Theo Zheng và cộng sự (2012) sự xuất hiện của các
gen mã hóa haemolysin, aerolysin, serine protease, độc tố cytotonic (hlyA, aerA, ahpA,
alt, ast) là yếu tố độc lực của tác nhân gây bệnh Aeromonas.
1.2.8.1.Hemolysin
Hemolysin là ngoại độc tố có khả năng gây tan huyết được tiết ra bởi các vi
khuẩn Staphilococcus, A. hydrophila, Streptococus…khả năng tan huyết của
hemolysin được chứng minh thực nghiệm qua việc gây tan huyết hồng cầu trong ống
nghiệm (Ginsburg và ctv, 1965). Hemolysin gây ly giải tế bào hồng cầu bằng cách tiêu
diệt màng tế bào.
A. hydrophila có khả năng tiết α- haemolysin, chất độc tạo vòng tan huyết mờ
trên thạch máu (Kaina và Tahagi, 1986). Theo Rahim và cộng sự (1984) để xác định
sự hiện diện của hemolysin bằng việc xác định sự hình thành α hoặc β- hemolysin tạo
nên vịng tan huyết trên thạch máu.
1.2.8.2. Enterotosine
Một yếu tố gây độc lực của A. hydrophila, là những cấu trúc khơng có sự gắn
kết rõ ràng, thuộc nhóm Enterotoxin. Có khả năng làm tan huyết, tiêu tế bào và các
hoạt động độc tố trong ruột. Theo Wang và cộng sự(2003), có ba loại độc tố:
enterotoxin gây độc tế bào (sản phẩm gen Act), enterotoxin cytotonic không bền nhiệt
(sản phẩm gen Alt), enterotoxin cytotonic bền nhiệt (sản phẩm gen Ast) tất cả góp phần
A. hydrophila gây ra viêm dạ dày ruột.
Thí nghiệm của Sha và cộng sự (2002) chứng minh vai trò của một enterotoxin
gây độc tế bào trong việc gây ra nhiễm trùng hệ thống ở chuột. Kết quả làm giảm đáng

14

ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

kể khả năng tiết ra độc tố của A. hydrophila, chứng minh được A. hydrophila gây độc
tế bào nhờ sự có mặt của các gen gây độc (act), (ast) và (alt).
1.2.8.3.Aerolysin
Aerolysin là độc tố ngoại bào tiết ra bởi vi khuẩn A. hydrophila, giống như độc
tố alpha của Staphylococcus aureus, nó vào bên màng vi khuẩn như một preprotoxin.
Aerolysin xâm nhập vào màng và hình thành nên những cái lỗ có đường kính 3nm, sẽ
tiêu diệt sự bảo vệ của màng thấm và sao đó làm chết tế bào (S.Peter Howard và ctv
1987).
Theo Uma và cộng sự (2010), Aerolysin có khả năng tan huyết và tiêu tế bào.
Aerolysin liên kết với thụ thể glycoprotein trên bề mặt của tế bào eukaryotic trước khi
chèn vào màng lipid và hình thành lỗ.
1.2.8.4.Lipase
Lipase là sản phẩm ngoại bào của A. hydrophila (sản phẩm gen lip). Lipase vi
sinh vật nhận được sự quan tâm ngày càng tăng vì ứng dụng cơng nghệ sinh học tiềm
năng như chất xúc tác, enzyme, hoặc chất phụ gia tẩy rửa nhưng vai trị của nó trong
sự trao đổi chất của vi khuẩn thì khơng rõ ràng. Lipase là enzyme ngoại bào quan
trọng đối với vi khuẩn, ảnh hưởng đến yếu tố độc lực, một số chức năng miễn dịch
thông qua các acid béo tự do được tạo ra bởi hoạt động lipolytic (Cascón và ctv, 1996).
Enzyme này cung cấp dinh dưỡng cho vi khuẩn bằng cách phá vỡ tế bào vật chủ thành
các phân tử nhỏ và sau đó đi vào q trình hình thành tế bào vi khuẩn.
Theo Guerra và cộng sự (2007) nghiên cứu lipase và gen acyltransferase
glycerophospholipid cholesterol (lip và SATA ) gây ra các bệnh đường ruột và và
tương tác với bạch cầu ở người.
1.2.8.5.Protease serine
Protease serine (ahpA) đã được phân lập từ các mẫu bệnh. Protease serine có
liên quan đến sự kích hoạt aerolysin và các enzyme ngoại bào khác, làm ảnh hưởng
đến độc tính tổng thể của chủng Aeromonas.

15


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

1.3.Phương pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction)
Theo Khuất Hữu Thanh (1956- 2006) phương pháp PCR do Kary Mullis và
cộng sự phát minh, công bố tháng 10 năm 1985, tạo bước nhảy vọt của sinh học phân
tử và kỹ thuật gen. Phương pháp PCR cho phép khuếch đại, tạo một số lượng lớn bản
sao của gen (trong một thời gian ngắn). Nguyên tắc PCR dựa trên cơ sở tính chất biến
tính, hồi tính của DNA và nguyên lý tổng hợp DNA. Trên cơ sở trình tự của đoạn
DNA khuôn, đoạn mồi (primer), các nucleotid tự do (dNTP) và enzyme DNA
polymerase có thể tổng hợp được đoạn DNA giới hạn bởi các đoạn mồi. Lặp đi lặp lại
nhiều lần của chu kì nhân gen, trong một thời gian ngắn số lượng bản sao DNA tạo
thành tăng theo cấp số nhân.
1.3.1.Nguyên lý chung của phương pháp PCR
Theo Nguyễn Hoàng Lộc và cộng sự (2007), kỹ thuật PCR dựa trên cơ sở phản ứng
mở rộng mồi nhờ enzyme Taq polymerase để khuếch đại invitro và các nucleic acid
đặc trưng. PCR cho phép khuếch đại theo hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn
DNA có chiều dài khoảng từ 200- 3000 bp. Đoạn DNA được khuếch đại (DNA đích )
được nhận diện nhờ cặp mồi đặc trưng (oligonucleotid) thường có chiều dài khoảng 20
nucleotid.
Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi khuẩn chịu
nhiệt độ cao Thermus aquaticus được dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới trong 4
loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP và dTTP) và hai mồi, trên cơ sở khuôn
mẫu của một đoạn DNA nhất định đã biết hoặc chưa biết trình tự.Các đoạn DNA mới
hình thành lại được sử dụng làm khn mẫu. Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn DNA
nói trên được nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng tách ra, phân tích
trình tự hoặc tạo dịng… Mồi ở bên trái tác động sợi DNA 3’- 5’ được gọi là mồi thuận

(ký hiệu là F). Mồi ở bên phải tác động sợi DNA 5’- 3’ được gọi là mồi ngược (ký
hiệu là R).
Nguyên tắc của PCR, bắt đầu từ chu kỳ thứ hai taq polymerase bắt đầu tạo ra các đoạn
DNA có chiều dài xác định. Các mồi thường là một oligonucleotide tổng hợp có
khoảng 10- 20 nucleotide hoặc dài hơn. Nếu biết trình tự đoạn gen cần khuếch đại thì

16


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

có thể tổng hợp nhân tạo các mồi tương ứng để thực hiện PCR và tách chúng ra bằng
kỹ thuật điện di. PCR thường tiến hành khoảng 25- 35 chu kỳ, qua đó 10-6 µg DNA
ban đầu có thể khuếch đại lên tới trên 1 µg (khoảng 2kb). Mỗi chu kỳ PCR gồm ba
giai đoạn với các nhiệt độ khác nhau:
.

Hình 1. 4. Sơ đồ PCR chuẩn ( />Gây biến tính (denaturation) ở 90- 95ºC. Trong giai đoạn biến tính phân tử DNA
khn mẫu ở dạng xoắn kép được tách thành hai sợi đơn.
Gắn mồi (annealing) ở 40- 65ºC. Trong giai đoạn này các mồi gắn vào các vị trí có
trình tự tương đồng ở DNA khn mẫu. Các liên kết ion tạo thành đoạn nhỏ (các mồi

17