Tài liệu BÁO CÁO " SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG " pdf

Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ

250
SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN
Edwardsiella ictaluri VÀ Aeromonas hydrophila
GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon
hypophthalmus) Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
Phạm Thanh Hương
1
, Nguyễn Thiện Nam
2
, Từ Thanh Dung
2

và Nguyễn Anh Tuấn
2

ABSTRACT
All isolates were screened against 16 antimicrobial agents by disk diffusion
method and were also tested for determination of minimal inhibitory
concentration (MIC) of 64 isolates (43 E. ictaluri isolates and 21 A. hydrophila
isolates) to 5 antibiotics with broth dilution method. The results showed that
majority of E. ictaluri isolates susceptibility to beta-lactam antimicrobial
group such as ampicillin, amoxicillin and cefalexin. Highly resistance was
detected to streptomycin (84.1%), chloramphenicol (74.5%), enrofloxacin
(74.5%). E. ictaluri isolates showed fully resistance to flumequin,
trimethoprim+sulfamethoxazol. Whereas, A. hydrophila were highly
susceptive with fenicol, tetracyclines, quinolones antimicrobial groups, Highly
resistance to streptomycin (55.7%) and trimethoprim + sulfamethoxazol
(32.8%). Remarkably, in this study detected 96% and 23% A. hydrophila
isolates had multi-resistance. The lowest MIC values of E. ictaluri isolates

was ampicillin (MIC
90
= 48.5 µg/mL) and A. hydrophila was enrofloxacin
(MIC
90
= 6.1 µg/mL). The confugation experiments showed that E. ictaluri
isolates can transfer of antimicrobial resistant genes to E. coli RC85. Likely,
transconjugants (Ei-R) can transfer this genes to A. hydrophila isolates. Both
E. ictaluri isolates and transconjugants (Ei-R) also were extracted plasmid.
Keywords: antimicrobial susceptibility testing, conjugation, resistance
plasmid
Title: Study on antimicrobial resistance of Edwardsiella ictaluri and
Aeromonas hydrophila isolates caused diseases on striped catfish
(Pangasianodon hypophthalmus) in the Mekong River Delta
TÓM TẮT
Nghiên cứu tiến hành làm kháng sinh đồ với 16 loại kháng sinh và xác định giá
trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của 64 chủng vi khuẩn (43 chủng E. ictaluri

1
Chi cục Thủy sản Cần Thơ
2
Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ

251
và 21 chủng A. hydrophila) trên với 5 loại kháng sinh bằng phương pháp pha
loãng trong môi trường lỏng. Kết quả cho thấy đa số vi khuẩn E. ictaluri nhạy
cao với kháng sinh: ampicillin, amoxicillin và cefalexin, trong khi đó kháng
cao với kháng sinh: streptomycin (84,1%), enrofloxacin (74,5%) và
chloramphenicol (74,5%). Kháng hoàn toàn với flumequin, trimethoprim

+sulfamethoxazol. Ngược lại, vi khuẩn A. hydrophila nhạy cao với nhóm
fenicol, tetracyclines, quinolones, kháng cao với kháng sinh streptomycin
(55,7%) và trimethoprim+sulfamethoxazol (32,8%). Nghiên cứu phát hiện có
96% chủng vi khuẩn E. ictaluri và 23% chủng vi khuẩn A. hydrophila biểu
hiện sự đa kháng. Kết quả xác định giá trị MIC đối với vi khuẩn E. ictaluri
thì ampicillin cho giá trị MIC thấp nhất (MIC
90
= 48,5 µg/mL), đối với vi
khuẩn A. hydrophila thì enrofloxacin có giá trị MIC thấp nhất (MIC
90
= 6,1
µg/mL). Thí nghiệm tiếp hợp, vi khuẩn E. ictaluri có khả năng truyền gen
kháng thuốc sang vi khuẩn E.coli, cũng như vi khuẩn sau khi tiếp hợp
(transconjugants) Ei-R có khả năng chuyển gen kháng thuốc này sang vi khuẩn
A. hydrophila. Nghiên cứu bước đầu ly trích plasmid của các chủng vi khuẩn
E. ictaluri và chủng lai Ei-R kháng thuốc từ thí nghiệm tiếp hợp.
Từ khóa: Kháng thuốc kháng sinh, tiếp hợp vi khuẩn, plasmid kháng kháng
sinh.
1 GIỚI THIỆU
Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá nước ngọt được nuôi phổ
biến nhất ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL). Cá tra có giá trị xuất khẩu
cao nên trong những năm gần đây nghề nuôi cá tra ở ĐBSCL phát triển rất
mạnh đã đưa năng suất nuôi tăng lên đáng kể. Tuy nhiên, để đạt được sản
lượng và lợi nhuận cao nhất, người nuôi không ngừng thâm canh hóa, do đó
vấn đề dịch bệnh trên cá tra xảy ra thường xuyên hơn và thiệt hại nhiều hơn.
Trong số các bệnh trên cá tra nuôi ở ĐBSCL phổ biến và gây thiệt hại nhiều
nhất là bệnh gan thận mủ do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri và bệnh xuất huyết
do vi khuẩn Aeromonas hydrophila (Dung et al., 2004).
Hiện nay người nuôi cá sử dụng thuốc kháng sinh một cách phổ biến để phòng
trị bệnh vi khuẩn trong nuôi thủy sản ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới

(Dung et al., 2008; Cabello, 2006). Do người nuôi thủy sản sử dụng thuốc
kháng sinh không đúng cách và không đúng quy định nên gây ra hiện tượng vi
khuẩn kháng thuốc kháng sinh. Vì thế, các nhà khoa học đã nghiên cứu tìm
thấy sự kháng thuốc kháng sinh trên nhiều loài vi khuẩn gây bệnh trên tôm, cá
(Sarter et al., 2007; Akinbowale et al., 2007). Sự kháng thuốc kháng sinh gián
tiếp trong vi sinh vật có thể được hình thành thông qua các gen trên nhiễm sắc
thể hoặc thông qua plasmid, cấu trúc tự sao chép mang gen trong tế bào chất
(Prescott et al., 2000). Trong đó, sự kháng thuốc kháng sinh thông qua plasmid
là rất nguy hiểm, bởi vì các loài vi khuẩn kháng thuốc có thể truyền các gen
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ

252
kháng thuốc không chỉ trong cùng 1 loài mà cả các loài vi khuẩn khác, ngay cả
vi khuẩn gây bệnh cho người và các động vật trên cạn (Aoki, 1988). Chính vì
thế, việc phát hiện các vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh là rất cấp thiết, nhằm
cung cấp thông tin cho việc sử dụng thuốc kháng sinh có hiệu quả và đảm bảo
an toàn sức khỏe của con người.
2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Chủng vi khuẩn
Nghiên cứu được thực hiện trên 126 chủng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá
tra bị bệnh gan thận mủ và 61 chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila từ cá tra
bị bệnh xuất huyết ở các tỉnh ĐBSCL từ năm 2008 – 2009 (Bảng 1).
Tất cả các chủng vi khuẩn được định danh theo phương pháp của Frerichs và
Millar (1993) dựa trên dòng chuẩn E. ictaluri (CCUG 18764), thông qua các
các chỉ tiêu cơ bản (nhuộm gram, oxidase, catalase, O/F) và bộ kít API 20E.
Bảng 1: Địa điểm thu mẫu và số lượng chủng vi khuẩn E. ictaluri và A.
hydrophila
Tỉnh thu mẫu Năm E. ictaluri A. hydrophila
Cần Thơ 2008 - 2009 51 20
Trà Vinh 2008 - 2009 17 7

An Giang 2008 - 2009 8 6
Bến Tre 2009 15 3
Vĩnh Long 2009 20 14
Đồng Tháp 2009 10 9
Sóc Trăng 2009 5 2
Tổng số chủng vi khuẩn 126 61
2.2 Phương pháp lập kháng sinh đồ
Phương pháp làm kháng sinh đồ được thực hiện theo tiêu chuẩn: The Clinical
và Laboratory Standards Institute (CLSI) của Anonymous (2006), sử dụng môi
trường Mueller-Hinton Agar (MHA, Merck, Darmstadt, Germany), với 16 loại
kháng sinh: ampicillin (AM/10 µg), amoxcillin (AMX/25 μg), cefalexin
(CN/30 μg), florfenicol (FFC/30 µg), chloramphenicol (CHL/30 µg),
streptomycin (SM/10 µg), gentamicin (GM/30 µg), tetracycline (TE/30 µg),
doxycycline (DO/30 μg), enrofloxacin (ENR/5 μg), norfloxacin (NOR/5 μg),
ciprofloxacin (CIP/5 μg), flumequin (FM/30 µg), trimethoprim +
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ

253
sulfamethoxazol (SXT/1,25/23,75 µg), rifampin (RA/30 μg), colistin (CS/50
μg) (Bio-rad, Marnes-la-Coquettle, France).
2.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu
Nồng độ ức chế tối thiểu (Minimal Inhibitory Concentration – MIC) xác định
bằng phương pháp pha loãng thuốc kháng sinh trong môi trường lỏng, theo tiêu
chuẩn của Clinical và Laboratory Standards Institute, 2006 (CLSI M49-A) với
5 loại kháng sinh có tính kháng và nhạy cao, đại diện cho các nhóm kháng sinh
trong nghiên cứu này: ampicillin, chloramphenicol, enrofloxacin,
oxytetracycline, streptomycin. Dòng vi khuẩn chuẩn E. coli ATCC 25922 được
sử dụng như chủng đối chứng trong phương pháp này. Thí nghiệm thực hiện
trên 43 chủng vi khuẩn E. ictaluri và 21 chủng vi khuẩn Aeromonas
hydrophila đã được lập kháng sinh đồ ở trên.

2.4 Phương pháp xác định khả năng tiếp hợp của vi khuẩn
Khảo sát khả năng tiếp hợp của vi khuẩn được thực hiện theo phương pháp của
Sorum et al., (2003). Các dòng vi khuẩn mang gen kháng tetracycline (vi
khuẩn cho gen kháng thuốc) được trộn với dòng vi khuẩn E. coli RC85 (vi
khuẩn nhận gen kháng thuốc) nhạy với kháng sinh tetracycline với thể tích
bằng nhau trong môi trường Luria-Bertani (LB) lắc ở nhiệt độ 37
o
C trong thời
gian thích hợp. Sau đó cho hỗn hợp vi khuẩn lên đĩa MHA có pha kháng sinh
tetracycline (16 µg/ml) và ủ qua đêm ở nhiệt độ 37
o
C. Tần số chuyển gen
kháng thuốc được đánh giá dựa trên mật độ của vi khuẩn cho gen kháng thuốc
và mật độ của vi khuẩn E. coli sau khi đã tiếp hợp (thu được trên đĩa MHA có
kháng sinh).
2.5 Phương pháp ly trích plasmid của vi khuẩn
Plasmid của các chủng vi khuẩn được ly trích bằng bộ ly trích plasmid của
Promega - TB225 (Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System).
Điện di plasmid bằng gel agarose 0,7%, ở dòng điện 140V, trong 3 giờ. Gel
được nhuộm trong dung dịch ethidium bromide (2 mg/ml) và chụp ảnh gel
dưới ánh sáng UV 254 nm.
Đọc kích thước phân tử của plasmid thông qua
markers chuẩn 15 kb (Biorad).
3 KẾT QUẢ
3.1 Kết quả kháng sinh đồ
Kiểm tra kháng sinh đồ được thực hiện trên 126 chủng vi khuẩn E. ictaluri, cho
thấy các chủng vi khuẩn E. ictaluri đã giảm tính nhạy đối với 3 kháng sinh
nhóm beta-lactam: ampicillin, amoxicillin và cefalexin. Kháng cao với các loại
kháng sinh như: streptomycin, enrofloxacin, chloramphenicol, florfenicol,
tetracycline và doxycycline. Đặc biệt, các chủng vi khuẩn này đã kháng hoàn

toàn với flumequin, trimethoprim+sulfamethoxazol.
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ

254
Bảng 2: Tỉ lệ phần trăm chủng vi khuẩn kháng, nhạy và nhạy trung bình (TB)
Nhạy (%) Nhạy TB (%) Kháng (%)
TT
Thuốc
kháng sinh
E ictaluri A.hydrophila E.ictaluri A. hydrophila E.ictaluri A.hydrophila

Beta-lactam

1 Ampicillin 85,7 0 7,94 0 6,35 100
2 Amoxicillin 84,1 0 11,1 0 4,76 100
3 Cefalexin 86,5 0 11,1 1,64 2,38 98,4

Fenicol

4 Florfenicol 19,1 91,8 7,94 3,28 73 4,92
5 Chloramfenicol 14,3 91,8 10,3 4,92 75,4 3,28

Aminoglycosides

6 Streptomycin 9,5 8,2 6,35 36,1 84,1 55,7
7 Gentamicin 37,3 96,72 15,9 3,28 37,3 0

Tetracyclines

8 Tetracycline 19,8 75,4 11,1 9,84 69,1 14,6

9 Doxycycline 23 86,6 10,3 13,1 66,7 3,28

Quinolones

10 Enrofloxacin 9,52 96,7 15,1 3,28 75,4 0
11 Norfloxacin 38,1 90,1 27,8 8,2 34,1 1,64
12 Ciprofloxacin 44,4 88,5 19,1 6,56 36,5 4,92
13 Flumequin 0 80,3 0 14,8 100 4,9

Khác

14 Trimethoprim+
sulfamethoxazol
0 63,9 0 3,28 100 32,8
15 Rifampin 15,1 52,5 31 36,1 54 11,9
16 Colistin 0 1,64 5,56 72,1 94,4 26,2
Kết quả kháng sinh đồ của 61 chủng vi khuẩn A. hydrophila trong nghiên cứu
cho thấy các chủng vi khuẩn A. hydrophila nhạy cao với các sinh trong nhóm
fenicol, tetracyclines, quinolones, kháng cao với kháng sinh streptomycin và
trimethoprim+sulfamethoxazol.
Điểm nổi bật của các chủng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila trong nghiên
cứu này là hiện tượng đa kháng kháng sinh (vi khuẩn kháng ít nhất là 3 kháng
sinh). Với 15 loại thuốc kháng sinh (colistin kháng tự nhiên với vi khuẩn E.
ictaluri nên không tính colistin vào kiểu hình đa kháng của vi khuẩn E.
Ictaluri) vi khuẩn E. ictaluri có kiểu đa kháng vớ
i 10 loại thuốc kháng sinh
chiếm tỷ lệ cao nhất (23,8%). Đối với vi khuẩn A. hydrophila có kiểu đa kháng
với 3 loại thuốc kháng sinh chiếm tỷ lệ cao nhất (13,1%).

Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ

255


Hình 1: Tỷ lệ phần trăm chủng vi khuẩn E. ictaluri và A. hydrophila đa kháng
kháng sinh
3.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu
Tương tự như kết quả thực hiện kháng sinh đồ: 41 chủng vi khuẩn E. ictaluri
kháng với streptomycin chiếm tỷ lệ cao nhất (95,3%) với giá trị MIC
50
và
MIC
90
cao ≥ 256 µg/mL. Tiếp theo là thuốc chloramphenicol và enrofloxacin
có cùng số chủng kháng là 37 chủng (86,1%) nhưng giá trị MIC của chúng
khác nhau, chloramfenicol có giá trị MIC
50
= 52,8 (µg/mL) và MIC
90
= 196,7
(µg/mL) cao hơn giá trị MIC của enrofloxacin là MIC
50
= 5,8 (µg/mL) và
MIC
90
= 48,5 (µg/mL) và thấp nhất là ampicillin với 11 chủng kháng (25,6%).
Bảng 3: Giá trị MIC của 5 loại thuốc kháng sinh đối với 43 chủng vi khuẩn E.
ictaluri
Giá trị MIC (µg/mL) và số chủng vi khuẩn
Thuốc

Kháng
sinh
<0,5 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 >256
Chủng
kháng
(%)
MIC
50%
MIC
90%
AM 2 0 8 6 3 5 8
5 2 3 0 1
11 (25,6) 5,85 48,5
CHL 0 0 1 2 2 0 1
5 21 2 6 3
37 (86,1) 52,8 196,7
ENR 0 0 0 4
7 5 5 11 3 4 4 0
37 (86,1) 18,9 98,9
OXY 1 0 4 5 4 0
1 9 9 4 2 4
29 (67,4) 25,4 192,5
SM 0 0 0 0 0 1 2
0 0 2 0 38
41 (95,3) >256 >256
Theo tiêu chuẩn CLSI 2006, các chủng in đậm thể hiện tính kháng đáp ứng
Giá trị MIC của các chủng vi khuẩn A. hydrophila với streptomycin là 64
(µg/mL), oxytetracycline có MIC
50
= 5,1 (µg/mL) và MIC

90
= 48 (µg/mL);
chloramfenicol với MIC
50
= 4,9 (µg/mL) và MIC
90
= 12,7 (µg/mL). Thấp nhất

E. ictaluri

A. hydrophila
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ

256
là enrofloxacin với giá trị MIC
50
và MIC
90
lần lượt là 1,28 (µg/mL) và 6,1
(µg/mL).
Bảng 4: Giá trị MIC của 4 loại thuốc kháng sinh đối với 21 chủng vi khuẩn A.
hydrophila
Giá trị MIC (µg/mL) và số chủng vi khuẩn
Thuốc
kháng
sinh
<0,5 0,5 1 2 4 8 16 32 64 128 256 >256
Chủng
kháng
(%)

MIC
50%
MIC
90%
CHL 0 0 0 3 6 7 3
0 1 0 1 0
5 (23,8) 4,95 12,7
ENR 2 4 3 6
1 4 1 0 0 0 0 0
6 (28,6) 1,28 6,1
OXY 1 0 0 4 5 4
2 1 3 1 0 0
5 (23,8) 5,1 48
SM 0 0 0 0
0 0 0 0 5 0 0 0
5 (100) 64 64
Theo tiêu chuẩn CLSI 2006, các chủng in đậm thể hiện tính kháng đáp ứng
3.3 Kết quả tiếp hợp vi khuẩn
Kết quả tiếp hợp 10 chủng vi khuẩn E. ictaluri và vi khuẩn E. coli RC85 cho
thấy vi khuẩn E. ictaluri có khả năng tiếp hợp và truyền gen kháng thuốc với
tần số tiếp hợp dao động từ 1,61x10
-6
- 2,45x10
-3
, trung bình là 6,87± 9,79x10
-
4
. Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ 10 chủng vi khuẩn Ei-R đều kháng 4 thuốc
kháng sinh: tetracycline, streptomycin, trimethoprim+sulfamethoxazol và
chloramphenicol giống như vi khuẩn E. ictaluri. Riêng đối với kháng sinh

flumequin thì có 8 chủng Ei-R cho kết quả nhạy trung bình với kháng sinh này,
dù 8 chủng E. ictaluri tiếp hợp với chúng có tính kháng với flumequin.
Kết quả tiếp hợp của 5 chủng vi khuẩn Ei-R với vi khuẩn A. hydrophila thì có 4
vi khuẩn Ei-R tiếp hợp và truyền gen kháng thuốc sang vi khuẩn A. hydrophila.
Tần số tiếp hợp trung bình trong thí nghiệm này là 5,71±7,1x10
-6
. Kiểu đa
kháng thuốc của 4 chủng vi khuẩn sau khi tiếp hợp Ae-R kháng với
tetracycline, streptomycin, flumequin, trimethoprim+sulfamethoxazol và
chloramphenicol giống hoàn toàn với 4 chủng vi khuẩn Ei-R đã tiếp hợp với
chúng.
3.4 Kết quả tách chiết plasmid
Plasmid của vi khuẩn được chạy điện di trên gel agarose 0,7%, nguồn điện
140V, kết quả chạy điện di được quan sát dưới tia UV cho kết quả như Hình 2.
Kết quả chạy điện di 4 chủng vi khuẩn E. ictaluri có xuất hiện 2 vạch plasmid
giống nhau trong khoảng 2-4 kb. Đối với 3 chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng
tetracycline đều có xuất hiện 2 vạch plasmid gần nhau và có kích thước trong
khoảng 63-147 kb (giếng 6,7,8). Riêng chủng vi khuẩn nhạy với tetracycline
(kí hiệu E72, giếng 9) không có xuất hiện 2 vạch plasmid này. Các chủng vi
khuẩn E. coli RC85 trước khi tiếp hợp và các chủng vi khuẩn Ei-R chỉ xuất
hiện 1 vạch plasmid giống nhau, tương đương 15 kb.
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ

257


Hình 2: Kết quả điện di các mẫu plasmid
Giếng 1: vi khuẩn E. coli 39R861. Giếng 2: vi khuẩn E. coli RC85 trước khi tiếp
hợp. Giếng 3-5: vi khuẩn Ei-R sau khi tiếp hợp. Giếng 6-8: vi khuẩn E. ictaluri
kháng tetracycline. Giếng 9: vi khuẩn E. ictaluri nhạy tetracycline. Giếng 10: thang

marker chuẩn 15 kb.
4 THẢO LUẬN
Cùng với sự phát triển của nghề nuôi cá da trơn công nghiệp trong những năm
qua, thì bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá da trơn ngày càng phổ biến và gây thiệt
hại đáng kể, đặc biệt là các nhóm vi khuẩn gây bệnh gram âm. Vì thế, người
nuôi thủy sản sử dụng thuốc kháng sinh một cách tràn lan, không kiểm soát
được để phòng trị bệnh thủy sản. Kết quả cho thấy sự kháng thuốc của các
chủng vi khuẩn trong môi trường nuôi thủy sản ngày càng phổ biến, nguy hiểm
hơn là có sự truyền gen kháng thuốc từ vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy
sản sang vi khuẩn khác trong môi trường đất, nước, và cả các chủng vi khuẩn
gây bệnh ở người, gây ra tác động động xấu cho môi trường và sức khỏe của
cộng đồng.
Với kết quả của nghiên cứu này, dễ nhận thấy nhóm beta-lactam nhạy cao
(>84%) với vi khuẩ
n E. ictaluri, nhưng kháng hoàn toàn (ampicillin,
amxocillin) và kháng cao (cefaxin) với vi khuẩn A. hydrophila. Vi khuẩn E.
ictaluri trong nghiên cứu này có tính nhạy cao với nhóm thuốc beta-lactam do
chúng không có khả năng tiết ra enzyme β-lactamase làm vỡ vòng β-lactam
(Stock và Wiedemann, 2001). Tuy nhiên, trong số 126 mẫu vi khuẩn E. ictaluri
của nghiên cứu này có một tỷ lệ nhỏ (< 7%) số chủng kháng với nhóm beta-
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ

258
lactam. Đây cũng là vấn đề cần phải lưu ý, vì hiện nay theo nghiên cứu này vi
khuẩn E. ictaluri đã kháng cao với nhiều loại thuốc kháng sinh khác, ngoại trừ
nhóm beta-lactam.
Ở Việt Nam, thuốc kháng sinh chloramphenicol hiện đang bị nghiêm cấm sử
dụng trong nuôi trồng thủy sản, do thuốc này có độc tính rất mạnh là nguyên
nhân gây ra hiện tượng thoái hóa tủy xương (Dowling, 2006). Một điểm đáng
chú ý từ kết quả làm kháng sinh đồ trong nghiên cứu này là có trên 70% số

chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng với nhóm fenicol. So với các nghiên cứu
trước đây cho thấy nhóm thuốc fenicol nhạy cao với vi khuẩn Edwardsiella
spp. (Depaola et al., 1995; Shu-Peng et al., 2000) Đối với các chủng vi khuẩn
E. ictaluri phân lập tại Việt Nam từ những năm trước đây, cũng cho kết quả
nhạy cao với florfenicol (Crumlish et al., 2002; Dung et al., 2004). Nguyên
nhân, vi khuẩn tăng tính kháng nhanh với các thuốc kháng sinh nhóm fenicol
do vi khuẩn đề kháng thông qua nhiều cơ chế khác nhau như: vi khuẩn có khả
năng đào thải thuốc kháng sinh ra khỏi tế bào thông qua kênh protein (efflux
protein) có trên thành tế bào vi khuẩn; mã hóa gen liên quan đến integron
(Arcangioli et al., 1999; Cloeckaert et al., 2000) và thông qua plasmid (Keys et
al., 2000). (Trích dẫn bởi Miranda và Zemelan, 2002). Vì thế, cần phải thận
trọng khi sử dụng thuốc này để điều trị bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản.
Tương tự, nhóm kháng sinh tetracyclines trong nghiên cứu này kháng cao đối
với vi khuẩn E. ictaluri do cơ chế kháng đáp ứng đối với nhóm thuốc
tetracyclines, khi thuốc này được sử dụng qua thời gian dài trị bệnh do vi
khuẩn E. ictaluri gây ra sẽ tạo ra các chủng vi khuẩn E. ictaluri kháng
tetracycline. Nhiều nhà khoa học cho rằng các chủng vi khuẩn kháng cao với
nhóm thuốc tetracyclines liên quan đến việc sử dụng thuốc kháng sinh này quá
rộng rãi và phổ biến trong nuôi trồng thủy sản, chúng có khả năng truyền gen
kháng thuốc này sang vi khuẩn khác thông qua R-plasmid (Reimschuessel và
Miller 2006; Alderman và Hasting, 1998; Depaola et al., 1988).
Đối với nhóm quinolones trong nghiên cứu này, vi khuẩn E. ictaluri kháng cao
với 2 loại thuốc flumequin (100%) và enrofloxacin (75,4%). Trong khi đó,
nghiên cứu của Stock và Wiedemann (2001) và Dung et al., (2008) xác định vi
khuẩn E. ictaluri nhạy với các thuốc kháng sinh thuộc nhóm quinolones. Ngoài
ra nghiên cứu của Từ Thanh Dung (2010) chỉ xác định có 8% chủng vi khuẩn
E. ictaluri kháng flumequin với MIC 90% khá thấp (4 µg/mL) và enrofloxacin
cũng rất thấp (5%). Ngoài ra, vi khuẩn E. ictaluri trong nghiên cứu này giảm
tính nhạy đối với norfloxacin (34,1%) và ciprofloxacin (36,5%), Cần lưu ý
rằng ở Việt Nam, thuốc norfloxacin và ciprofloxacin là hai loại kháng sinh nằm

trong danh mục hạn chế sử dụng trong nuôi trồng thủy sản. Do đó, việc dùng
thuốc kháng sinh này trong thủy sản phải hết sức cẩn trọng và cần được kiểm
soát chặt chẽ bởi các cơ quan có thẩm quyền về thuốc và thực phẩm nhằm đảm
bảo an toàn cho sức khỏe của cộng đồng.
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ

259
Đặc biệt, nhóm thuốc aminoglycosides trong nghiên cứu này gồm streptomycin
và gentamicin. Trong đó, streptomycin cho kết quả kháng cao với cả vi khuẩn
E. ictaluri và A. hydrophila, nhưng gentamcin chỉ giảm tính nhạy với vi khuẩn
E. ictaluri và nhạy cao với vi khuẩn A. hydrophila. Theo Prescott et al., (2000)
và Tolmasky (2000) vi khuẩn lờn với một kháng sinh trong nhóm
aminoglycosides này, nhưng có thể nhạy cảm với một thuốc kháng sinh khác
cùng nhóm aminoglycosides. Vi khuẩn kháng nhanh với thuốc streptomycin do
thông qua trung gian các plasmid, nhưng vi khuẩn lờn gentamicin chậm do có
liên quan đến đột biến nhiễm sắc thể.
Nghiên cứu đã phát hiện có đến 96% chủng vi khuẩn E. ictaluri thể hiện sự đa
kháng với kiểu hình đa kháng với 10 loại kháng sinh là cao nhất (23,8%). So
với nghiên cứu của Nguyễn Thiện Nam (2010) phát hiện có đến 97,5% số
chủng E. ictaluri đa kháng thuốc và kiểu hình kháng với 8 loại kháng sinh
chiếm cao nhất. Tuy nhiên nghiên cứu của Từ Thanh Dung (2010) xác định chỉ
có 73% chủng vi khuẩn E. ictaluri là biểu hiện đa kháng. Ngoài ra nghiên cứu
còn ghi nhận có 23% ch
ủng vi khuẩn A. hydrophila biểu hiện đa kháng. Từ
những kết quả trên, có thể khẳng định rằng, hiện tượng kháng thuốc của vi
khuẩn ngày càng diễn biến phức tạp hơn, nhất là sự đa kháng ngày càng tăng
về số chủng và số lượng thuốc kháng sinh.
Hiện tượng kháng thuốc càng trở nên nghiêm trọng hơn, khi trong môi trường
nuôi thủy sản có sự kháng thuốc hình thành gián tiếp thông qua thể R-plasmid.
Các R-plasmid này có thể làm trung gian giúp vi khuẩn kháng một hay nhiều

loại thuốc kháng sinh (Aoki và Takahashi, 1987; Aoki, 1988; Kruse và Sorum,
1994). Plasmid của 3 chủng vi khuẩn E. ictauri kháng với tetracycline trong
nghiên cứu này đều xuất hiện 2 vạch plasmid có kích thước trong khoảng 63-
147 kb.
5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Kết quả kháng sinh đồ cho thấy vi khuẩn E. ictaluri nhạy cao (> 84%) với
nhóm beta-lactam và kháng cao với các kháng sinh còn lại. Vi khuẩn A.
hydrophila nhạy cao (>75%) với nhóm fenicol, tetracyclines và quinolones,
kháng cao với streptomycin (55,7%) và trimethoprim + sulfamethoxazol
(32,8%). Đặc biệt nghiên cứu phát hiện có 96% chủng vi khuẩn E. ictaluri và
23% chủng vi khuẩn A. hydrophila biểu hiện sự đa kháng. Vi khuẩn E.
ictaluri có khả truyền gen kháng thuốc sang vi khuẩn E. coli RC85 với tần suất
tiếp hợ
p là: 6,87±9,79x10
-4
. Đặc biệt, vi khuẩn Ei-R có khả năng truyền gen
kháng thuốc này sang vi khuẩn A. hydrophila với tần suất tiếp hợp trung bình
là 5,71±7,1x10
-6
. Bước đầu xác định được plasmid của vi khuẩn E. ictaluri
kháng thuốc có kích thước trong khoảng 63-147 kb.

Kết quả nghiên cứu cho thấy sự kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng gia tăng.
Chính vì thế, đòi hỏi người nuôi phải thận trọng, tuân thủ đúng quy định trong
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ

260
việc sử dụng, nhà khoa học cần có những nghiên cứu sâu, rộng hơn từ đó đề ra
những biện pháp khắc phục hiệu quả, nhằm bảo vệ sức khỏe cho con người.
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Akinbowale, L.O, H. Peng and D.M. Barton, 2007. Antimicrobial resistance in
bacteria isolated from aquaculture sources in Australia. Journal of Applied
Microbiology. 103: 1364-5072.
Alderman, D.J., and T.S. Hastings, 1998. Antibiotic use in aquaculture:
development of antibiotic resistance - potential for consumer health risks.
International Journal of Food Science and Technology. 33: 139-155.
Aoki, T. and A. Takahashi, 1987. Class D tetracycline resistance determinants of
R-plasmids from fish pathogens Aeromonas hydrophila, Edwardsiella tarda
and Pasteurella piscisida. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 31: 1270-
1280.
Aoki, T., 1988. Drug-resistance plasmids from fish pathogens. Microbiology
Sciences. 5: 219-223.
Cabello, F.C., 2006. Heavy use of prophylactic antibiotics in aquaculture: a
growing problem for human and animal health and for environment.
Environment of Microbiology. 8: 1137-1144.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2006. Methods for broth
dilution susceptibility testing of bacteria isolated from aquatic animals;
informational supplement, M49-A, Clinical and Laboratory Standards
Institute, Wayne, NJ.
Crumlish, M., T.T. Dung, J.F. Turnbull, N.T.N Ngoc, and H.W. Fugerson, 2002.
Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish,
Pangasius hypophthalmus cultured in the Mekong Delta Vietnam. Journal of
fish disease. 25: 733-736.
Depaola, A., A.F. Pauline, R.M. McPhearson and S.B. Levy, 1988. Phenotypic
and genotypic characterization of tetracycline and oxytetraxycline resistance
Aeromonas hydrophila from cultured channel catfish (Ictalurus punctatus)
and their environments. Applied and Environmental Microbiology. 40: 1861-
1863.
Depaola, A., J.T. Peeler and G.E. Rodrick, 1995. Effect of oxytetraxycline-
medicated feed on antibiotic resistance of Gram-Negative bacteria in catfish

ponds. Applied and Environmental Microbiology. 1995: 2335-2340.
Dowling, P.M., 2006. Chloramphenicol, thiamphenicol and florenicol. In:
Giguère, S., J.F. Prescott, D. Baggot, R.D. Walker and P.M. Dowling
(edition.), Antimicrobial Therapy in Veterinary Medicine. Blackwell
Publishing Ltd, Oxford. 241-248.
Dung, T.T., F. Heasebrouck, N.A. Tuan, P. Sorgeloos, M. Baele and A. Decostere,
2008. Antimicrobial susceptibility pattenrn of Edwardsiella ictaluri isolates
from natural outbreaks of Bacillary Necrosis of Pangasianodon
hypophthalmus in Vietnam. Microbial Drug Resistance. 14: 311-316.
Kỷ yếu Hội nghị khoa học thủy sản lần 4: 250-261 Trường Đại học Cần Thơ

261
European Medicines Agency. Veteritary Medicines and Inspections (EMEA),
2006. Refection paper on the use of fluoroquinolones in food-producing
aimals in the European Union: development of resistance and imfact on
human and animal heath.
Kruse, H. and H. Sorum, 1994. Transfer of multiple drug resistance plasmids
between bacterial of diverse origin in natrual microenvironments. Applied and
Environment Microbiology. 60: 4015-4021.
Miranda, C.D. and R. Zemelman, 2002. Antimicrobial multiresistance in bacteria
isolated from freshwater Chilean salmon farms. The Science of the Total
Environment. 293: 207-218.
Nguyễn Thiện Nam, Phạm Thanh Hương, Trần Duy Phương, Từ Thanh Dung,
2010. Nghiên cứu sự đa kháng thuốc của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây
bệnh trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Tạp chí Khoa học, Đại học
Cần Thơ. 2010: 14b 200-210.
Prescott, J.F., J.D. Baggot and R.D. Walker, 2000. Antimicrobial therapy in
veterinary medicine. Lowa State University press/Ame: 796 pp.
Reimschuessel, R. and R.A. Miller, 2006. Antimicrobial drug use in aquaculture.
In: Giguère, S., J.F. Prescott, D. Baggot, R.D. Walker and P.M Dowling

(editors), Antimicrobial Therapy in Veterinary Medicine. Blackwell
Publishing Ltd, Oxford: 241-248.
Sarter, S., N.H. Kha, L.T. Hung, J. Lazard and D. Montet, 2007. Antibiotic
resistance in Gram-negative bacteria isolated from farmed catfish. Food
Control. 18: 1391-1396.
Shu-Peng H., H. Tain-Yao, C. Ming-Hui and W. Way-Shyan, 2000. Antibacterial
effect of chloramphenicol, thiamphenicol and flofenicol against aquatic
animal bacteria. Journal Veterinary Medicine Science. 62: 479-485.
Stock, I. and B. Wiedemann, 2001. Natural antimicrobial susceptibility of
Edwardsiella tarda, E. ictaluri and E. hoshinae. Antimicrobial Agents
Chemotherapy. 45: 2245-2255.
Sorum, H., T.M. L’Abee-Lund, A. Solberg, and W. Anette, 2003. Integron-
Containing IncU R plasmids pRAS1 and pAr-32 from the fish pathogen
Aeromonas salmonicida. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47: 128-
1290.
Tolmasky, M.E., 2000. Bacterial resistance to aminoglycosisedes and beta-
lactames: The Tn1331 transposon paradigm. Frontiers in Biology Science. 5:
20-29.
Từ Thanh Dung, M. Crumlish, Nguyễn Thị Nh
ư Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và
Đặng Thụy Mai Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra
(Pangasius hypophthalmus). Tạp chí Khoa học, Đại học Cần Thơ, 137-142.
Từ Thanh Dung, Freddy Haesebrouck, Nguyễn Anh Tuấn, Partrick Sorgeloos,
Margo Baele và Annemie Decostere, 2010. Hiện trạng kháng thuốc kháng
sinh trên vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan, thận mủ trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus) ở Đồng bằng sông Cửu Long. Tạp chí Khoa
học, Đại học Cần Thơ. 15A: 162-171.