Tìm hiểu quy trình phát hiện vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

..

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ TP. HCM
 
 
 

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP

TÌM HIỂU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN
VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN
ĐÔNG LẠNH

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ VI SINH

Sinh viên thực hiện
MSSV: 0811110055

: Phạm Thị Bích Ngọc
Lớp: 08CSH1

TP. Hồ Chí Minh, 2011


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh

LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan rằng, khóa luận tốt nghiệp “Tìm hiểu quy trình phát hiện
Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh” là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi.

Các số liệu sử dụng trong khóa luận là trung thực và có nguồn gốc cụ thể, rõ
ràng. Nội dung khóa luận có tham khảo và sử dụng các tài liệu, thông tin được đăng
tải trên các sách, tác phẩm, tạp chí và các trang web theo danh mục tài liệu của khóa
luận.

Sinh viên thực hiện
Phạm Thị Bích Ngọc

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 

i


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

MỤC LỤC
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ............................................................................................1 
1.1. Đặt vấn đề .........................................................................................................1
1.2. Mục đích ...........................................................................................................2
1.3. Mục tiêu đề tài ..................................................................................................2
CHƯƠNG II: TỔNG QUAN ....................................................................................3
2.1. Vai trò của thủy hải sản, tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên
thế giới .....................................................................................................................3
2.1.1. Vai trò của thủy hải sản trong đời sống con người....................................3
2.1.2. Tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới.................4
2.2. Giới thiệu về Vibrio spp...................................................................................7
2.2.1. Lịch sử phát hiện Vibrio spp. ...................................................................7
2.2.2. Phân loại Vibrio spp và phân bố...............................................................9
2.2.2.1. Phân loại Vibrio spp ...........................................................................9
2.2.2.2. Phân bố .............................................................................................10

2.2.3. Đặc điểm hình thái Vibrio spp. ...............................................................10
2.2.3.1. Đặc điểm chung ................................................................................10
2.2.3.2 Đặc điểm của từng loài....................................................................11
2.2.4. Cấu trúc Vibrio spp. ................................................................................14
2.2.5. Yếu tố độc lực ...........................................................................................15
2.2.6. Cơ chế gây bệnh ......................................................................................18
2.2.7. Triệu chứng gây bệnh.............................................................................21
2.2.7.1. Trên người.........................................................................................21
2.2.7.2 Trên động vật .....................................................................................23
2.2.8. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh ở
Việt Nam và trên thế giới ...................................................................................24
2.2.8.1. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh
ở Việt Nam.......................................................................................................24

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

ii


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh

2.2.8.2. Tình hình nhiễm Vibrio spp trong thực phẩm thủy hải sản đông lạnh
trên thế giới .....................................................................................................24
CHƯƠNG 3: PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN VIBRIO TRONG THỦY HẢI SẢN
ĐÔNG LẠNH ...........................................................................................................26
3.1. Phương pháp truyền thống.............................................................................26
3.1.1. Phương pháp định tính............................................................................26
3.1.1.1. Nguyên tắc. .......................................................................................26
3.1.1.2. Thiết bị và dụng cụ............................................................................26
3.1.1.3. Môi trường và hóa chất ....................................................................26

3.1.1.4. Quy trình phân tích. ..........................................................................28
3.1.1.5. Thuyết minh quy trình .......................................................................29
3.2. Phương pháp hiện đại ....................................................................................42
3.2.1. Phương pháp miễn dịch học – Elisa (Enzyme Linked mmunosorbent
Assays)................................................................................................................42
3.2.1.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) ......................................................43
3.2.1.2. Sandwich ELISA................................................................................44
3.2.1.3. ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA) ...........................................45
3.2.2. Kỹ thuật PCR chuẩn (Polymerase Chain Reaction) ...............................46
3.2.2.1 Nguyên tắc ........................................................................................47
3.2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR ...................................................47
3.2.3. Kỹ thuật PCR phức ( Multiplex PCR ) ...................................................51
3.2.4. Kỹ thuật DNA microarray ......................................................................52
3.2.4.1. Vật liệu và phương pháp...................................................................53
3.2.4.2. Các bước thực hiện ..........................................................................54
3.2.5. Kỹ thuật RAPD ........................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................59
PHỤ LỤC..................................................................................................................61

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

iii


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ADH: Antidiuretic hormone
APW :Canh pepton kiềm Alkaline Peptone Water
cDNA: Complementary Acid Deoxyribo Nucleic

DNA: Acid Deoxyribo Nucleic
ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assays
EU: Liên minh Châu Âu
FDA: Food and Drug Administration
HACCP: Hazard Analysis and Critical Control Points
HLG :Canh Hugh Leifson Glucose
KCN:Khu công nghiệp
KI:Thạch Kligler Iron
KIA: : Klingler Iron Agar
KL: Khuẩn lạc
KNXK: Kiêm ngạch xuất khẩu
LDC: Linguistic Data Consortium
NAFIQAVED: Tổng cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng
NST: Nhiễm sắc thể
NTTS: Nuôi trồng thủy sản
OPNG: o-nitrophenyl-D-galactoside
ORF: Open reading frame
PCA: Polymerase Chain Reaction
TCBS :Thạch Thiosulphate Citrate Bile salt Sucrose
TSA: Thạch Tryptone Soya
TSI: Triple Sugar Iron agar
WHO: Tổ chức Y tế Thế giới

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

iv


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam qua các thời kỳ ..................... 4
Bảng 2.2: Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam vào thị trường EU............................. 4
Bảng 2.3: So sánh khả năng gây bệnh của các nhóm vi khuẩn tả............................ 19
Bảng 2.4: Các loài Vibrio bị cho là gây bệnh ở người............................................. 20
Bảng 3.1. Các đặc điểm sinh hóa của Vibrio cholerea và
Vibrio parahaemolyticus.......................................................................................... 31
Bảng 3.2. Phân biệt V. cholerae O1 và V. cholerae non - O1 ................................. 41
Bảng 3.3. Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V.choleraeO1 .............................. 41

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

v


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 2.1: Vibrio harvey........................................................................................... 9
Hình 2.2: V.parahaemolyticus.................................................................................. 12
Hình 2.3: V.cholerae ................................................................................................ 13
Hình 2. 4: V. vulnificus............................................................................................. 13
Hình 2.5: Vi Khuẩn tả Vibrio cholerae.................................................................... 19
Hình 2.6: Cơ chế gây bệnh của Vibrio bên trong cơ thể con người......................... 21
Hình 2.7: Bệnh nhân bị dịch tả................................................................................. 22
Hình 2.8: Đi tơm sú bị mịn cụt do nhiễm vi khuẩn Vibrio……………………...23
Hình 2.9: Lớp vỏ kitin của tơm mềm và có màu xanh............................................. 23
Hình 3.1: Phân lập Vibrio trên CHROMagar........................................................... 29
Hình 3.2: Phân lập Vibrio trên mơi trường MacConkey.......................................... 30
Hình 3.3: Khuẩn lạc của vi khuẩn Vibrio spp trên môi trường TCBS……………..30

Hình 3.4: Kết quả thử nghiệm TSI/ KIA.................................................................. 32
Hình 3.5: Vibrio cholerae ........................................................................................ 33
Hình 3.6: Phát hiện vi sinh vật hiếu khí có lên men carbohydrate .......................... 35
Hình 3.7: Phát hiện vi sinh vật kỵ khí có lên men carbohydrate ............................. 35
Hình 3.8: Kết quả thử nghiệm carbohydrate............................................................ 36
Hình 3.9: Kết quả thử nghiệm decarboxylase/dehydrolase ..................................... 37
Hình 3.10:Kết quả thử nghiệm Urea ........................................................................ 38
Hình 3.11: Cơ chế thử nghiệm ONPG……………………………………………..38
Hình 3.12: Hình thử nghiệm ONPG ........................................................................ 39
Hình 3.13: ELISA gián tiếp. .................................................................................... 44
Hình 3.14: Các bước trong Sandwich ELISA.......................................................... 45
Hình 3.15: ELISA cạnh tranh................................................................................... 46
Hình 3.16: Các giai đoạn trong phản ứng PCR........................................................ 48

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

vi


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng, các chất dinh dưỡng cần thiết để con
người sống và phát triển. Thế nhưng thực phẩm cũng là nguồn truyền bệnh nguy
hiểm, nếu như khơng bảo đảm được vệ sinh và an tồn. Vệ sinh an toàn thực phẩm
(VSATTP) là vấn đề xã hội đang được rất nhiều người quan tâm, bởi lẽ VSATTP
tác động trực tiếp đến sức khỏe cũng như chất lượng cuộc sống con người và ảnh
hưởng đến chất lượng phát triển của xã hội và nòi giống.
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), hiện có hơn 400 căn bệnh lây

truyền qua thực phẩm khơng an tồn. VSATTP đã được đặt lên hàng đầu nghị trình
tại nhiều hội nghị y tế và sức khỏe cộng đồng toàn cầu, nhưng tình hình gần như
khơng được cải thiện bao nhiêu, nhất là khi thế giới liên tiếp xảy ra thiên tai và
nguồn nước sạch ngày càng hiếm. Khi người dân khơng có đủ miếng ăn thì việc
kiểm tra chất lượng những gì mà họ ăn đã trở thành điều khá xa vời. Tiến sĩ
Margaret Chan, Tổng Giám đốc Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), cho biết mỗi tháng
Liên hiệp quốc nhận được khoảng 200 báo cáo từ 193 quốc gia về các trường hợp
thực phẩm bị nhiễm độc.
Chất lượng VSATTP hiện nay rất đáng lo ngại, đã được rất nhiều các phương
tiện thông tin đại chúng phản ánh. Việc sử dụng khơng an tồn về phân bón, thuốc
bảo vệ thực vật, thuốc tăng trọng, kháng sinh, hóa chất trong chăn nuôi trồng trọt
nông nghiệp, thủy hải sản hiện nay cịn khá phổ biến.
Có rất nhiều ngun nhân gây ngộ độc thực phẩm, nhưng chủ yếu là người bị
ngộ độc đã hấp thu phải thực phẩm độc hại, ví dụ ăn thức ăn đã bị ôi thiu, thức ăn
chế biến không hợp vệ sinh, không đạt yêu cầu hoặc do bảo quản khơng tốt. Khi đó,
các loại vi sinh vật (vi khuẩn, virus), nấm mốc và ký sinh vật có điều kiện hồnh
hành.
Vi sinh vật là yếu tố cơ bản gây ra ơ nhiễm, mất vệ sinh an tồn thực phẩm và có
tới gần 50% trường hợp bị ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật. Trong nhóm vi sinh

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc 

1


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh

vật nguy hiểm thì các vi khuẩn chủng Salmonella, Staphylococcus aureus,
Clostridium botulinum, Vibrio spp, E. Coli và Listeria là đáng sợ nhất.
Một trong những tác nhân gây ngộ độc thực phẩm đáng lo ngại nhất hiện nay đó

là ngộ độc do nhóm vi khuẩn tả Vibrio spp gây ra trong thực phẩm thủy hải sản
đông lạnh (tôm, cá, mực…). Chúng có thể nhiễm vào thực phẩm thủy hải sản bất
kỳ lúc nào và được xem là nguồn gốc gây ngộ độc nghiêm trọng trên thế giới.
Vibrio spp gây bệnh dịch tả ở người, độc tố của vi khuẩn này gây tiêu chảy nặng và
mất nước. Bệnh tả do vi khuẩn này gây ra có khả năng bùng phát thành đại dịch
trong thời gian rất ngắn và trên phạm vi rất rộng. Dịch tả tấn công vào nước Anh
vào năm 1848 – 1848 làm hơn 70.000 người chết, đại dịch năm 1854 đã cướp đi 1/8
dân số thành phố London. Dịch tả vào Peru vào năm 1991, lan truyền sang Ecuador,
Colombia, Mexico và Nicaragua kết quả hơn 12.000 người chết. Nếu hiểu biết đúng
và kịp thời chúng ta có thể ngăn ngừa nguồn lây nhiễm để bảo vệ mình và cộng
đồng xung quanh.
Xuất phát từ thực trạng trên, được sự chấp nhận của Khoa Môi Trường và Công
Nghệ Sinh Học, Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp Hồ Chí Minh, chúng tơi
xin tiến hành thực hiện khóa luận “Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy
hải sản đơng lạnh”.

1.2. Mục đích
Nghiên cứu, đi sâu tìm hiểu về vi khuẩn Vibrio spp và đưa ra một số phương
pháp xác định vi khuẩn Vibrio spp.

1.3. Mục tiêu đề tài
• Khảo sát về cấu trúc của Vibrio spp.
• Khảo sát về sự phân bố của Vibrio spp.
• Tình hình nhiễm Vibrio spp trong sản phẩm thủy sản trên thế giới và Việt Nam
hiện nay.
• Một số phương pháp xác định Vibrio spp.

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

2

Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh

CHƯƠNG II: TỔNG QUAN
2.1. Vai trị của thủy hải sản, tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt
Nam và trên thế giới
2.1.1. Vai trò của thủy hải sản trong đời sống con người
Trong những năm qua, ngành thủy sản luôn khẳng định là ngành kinh tế mũi
nhọn có những đóng góp quan trọng cho sự phát triển kinh tế - xã hội nước nhà. Tạo
công ăn việc làm cho hàng trăm ngàn lao động, cung cấp thực phẩm thủy sản cho
đời sống người dân, và đang phấn đấu trở thành ngành sản xuất hàng hóa lớn, sản
phẩm thủy sản có sức cạnh tranh cao trên thị trường để tiếp tục phát triển nhanh, ổn
định và bền vững.
Thực phẩm thuỷ hải sản còn giữ vai trò an ninh lương thực quốc gia và góp phần
xố đói giảm nghèo. Thực phẩm thuỷ hải sản được đánh giá là nguồn cung cấp
chính đạm động vật cho người dân Việt Nam. Năm 2001, mức tiêu thụ trung bình
mặt hàng thuỷ sản của mỗi người dân Việt Nam là 19,4 kg, cao hơn mức tiêu thụ
trung bình sản phẩm thịt heo (17,1 kg/người) và thịt gia cầm (3,9 kg/người). Số lao
động của ngành thuỷ sản tăng liên tục từ 3,12 triệu người (năm 1996) lên khoảng
3,8 triệu người năm 2001 (kể cả lao động thời vụ), như vậy, mỗi năm tăng thêm hơn
100 nghìn người.
Xuất khẩu thực phẩm thủy hải sản cũng góp phần giúp các quốc gia khác bù đắp
lượng thiếu hụt về lương thực, thực phẩm.
Kim ngạch xuất khẩu toàn ngành nông nghiệp Việt Nam năm 2008 là 16,237 tỷ
USD (Nông sản: 8,42 tỷ; Thủy sản: 4,502 tỷ; Lâm sản: 2,996 tỷ).
Trong những mặt hàng xuất khẩu của Việt Nam thì thủy sản ln đứng ở vị trí
cao. Trong số các nước có kim ngạch xuất khẩu thủy sản lớn thì Việt Nam là nước
có tốc độ tăng nhanh nhất. Tỷ lệ tăng trưởng trung bình thời kỳ 1992 - 2003 là
20,4%, mức tăng bình quân năm đạt 9,97%. Đến năm 2003, Việt Nam đứng thứ 7

trong số các nước xuất khẩu thủy sản lớn nhất thế giới. Năm 1992 xuất khẩu thủy
sản đạt 308 triệu USD, nhưng tới năm 2003 là 2,2 tỷ USD; năm 2005 vượt mức 2,5
tỷ USD và dự tính đến năm 2006 kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 2,8 tỷ USD.
SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

3


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

Bảng 2.1: Kim ngạch xuất khẩu thủy sản Việt Nam qua các thời kỳ
(đơn vị: triệu USD)
Năm

1992

1996 2000

2001

2002

2003

2005

KNXK

308

697

1479

1778

2023

2200

2500

126,3 112,2

20,2

13,8

8,7

13,6

% tăng so với năm
trước

Nguồn: Trung tâm tin học- Bộ Thuỷ sản.
Bảng 2.2: Xuất khẩu thủy sản của Việt Nam vào thị trường EU
Năm

2000

Kim ngạch 71,8

2001
90,7

2002
73,7

2003
116,7

2004

2005

231,5

367,3

73.459,2

110.911,2

(triệu
USD)
Khối

20.290,8

26.659,1 28.612,8 38.186,8

lượng(tấn)
Nguồn: Trung tâm tin học- Bộ Thuỷ sản
2.1.2. Tình hình chất lượng thủy hải sản ở Việt Nam và trên thế giới
Trong những năm qua, ngành thủy sản đã có những bước chuyển biến hết sức
căn bản về công tác quản lý an toàn vệ sinh trong khu vực chế biến để đáp ứng các
yêu cầu ngày càng cao về chất lượng sản phẩm thủy sản của các thị trường. Số
lượng nhà máy chế biến thuỷ sản được cấp chứng nhận HACCP cũng như số doanh
nghiệp được phép xuất khẩu thuỷ sản sang các thị trường tăng lên. Số lượng các lô
hàng bị nhiễm hoá chất, dư lượng kháng sinh đã giảm đi rất nhiều so với các năm
trước đây.

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

4


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh

• Ở Việt Nam
Trong 3 tháng đầu năm 2006, thuỷ sản xuất khẩu qua kiểm tra chất lượng đạt
84.800 tấn, tăng 15% so với cùng kì năm trước trong đó khối lượng hàng kiểm tra
chứng nhận chất lượng các chỉ tiêu dư lượng kháng sinh, hoá chất là 54.400 tấn,
chiếm 62,27%. Hàng xuất khẩu qua kiểm tra chiếm tỷ trọng lớn vẫn là thị trường
EU (30%), Nhật Bản (17%), Mỹ (12%). Các trung tâm vùng cũng đã cấp 25 giấy
chứng nhận xuất khẩu cho 337,35 tấn tôm xuất khẩu vào Mỹ, 17 giấy chứng nhận
tôm không thu hoạch cho xuất khẩu tôm vào thị trường Oxtraylia. Chất lượng hàng
thuỷ sản qua kiểm tra chất lượng chứng nhận ổn định.
Trong 6 tháng đầu năm 2006, tổng sản lượng đạt 1.697.300 tấn bằng 49,34% kế

hoạch năm 2007 và 108,1% so với cùng kì năm trước, xuất khẩu đạt 1,409 tỷ USD,
bằng 50,32% so với kế hoạch, và tăng 29,03% so với cùng kì năm trước trong đó thị
trường Nhật Bản chiếm 23,31%; EU: 23,26%; Mỹ: 18,21%, hai sản phẩm chính là
tơm và cá trong đó tơm chiếm 38,3% và cá chiếm 37,4% tỷ trọng xuất khẩu thuỷ
sản.
Chất lượng hàng thuỷ sản Việt Nam đã được cải thiện rất nhiều và đang dần
ngang tầm với các nước lớn trên thế giới. Tuy nhiên, bên cạnh những thành tựu đạt
được của ngành thủy sản về sản lượng sản xuất, giá trị thủy sản, kim ngạch xuất
khẩu thì hiện nay ngành thủy sản còn tồn tại những yếu kém chất lượng sản phẩm
thủy sản
Chất lượng và an toàn vệ sinh nguyên liệu thủy sản vẫn chưa đáp ứng được các
yêu cầu ngày càng cao của thị trường, công tác quản lý đối với khu vực sản xuất và
thương mại ở khâu trước chế biến thể hiện nhiều bất cập. Hậu quả là chất lượng sản
phẩm thủy sản của Việt Nam chưa ngang tầm với thế giới, xuất khẩu tuy vẫn tăng
hàng năm nhưng tỷ lệ tăng trưởng không ổn định và tiềm ần nhiều nguy cơ. Hiện
nay vấn đề lớn nhất đối với chất lượng sản phẩm thuỷ sản Việt Nam đó là ngun
liệu thuỷ sản có lẫn tạp chất hố học và việc sử dụng các loại hoá chất, kháng sinh
trong nguyên liệu thuỷ sản.

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

5


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

Về thực trạng thuỷ sản nhiễm tạp chất vào nguyên liệu thuỷ sản. Đã xuất hiện
hoạt động gian lận thương mại nhằm kiếm lời bất chính từ năm 1983- 1995, bắt đầu
từ việc đưa đinh hoặc chì vào thân tơm tại 3 tỉnh Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu. Vào
những năm 1996- 1997 tình trạng bơm các loại chất lỏng vào nguyên liệu tôm bắt

đầu xuất hiện và lan nhanh đến mức trở thành phổ biến ở các tỉnh đồng bằng sông
Cửu Long.
Đầu năm 2005, thị trường EU đã phát hiện 30 lô hàng bị nhiễm malachite green
và leucomalachite green, 2 lô hàng nhiễm fluoroquinolone; thị trường Canada phát
hiện 48 lô hàng nhiễm malachite green và leucomalachite, 5 lơ hàng nhiễm
fluoroquinolone. Tại thị trường Hoa Kì, qua kiểm tra của Cục quản lý Dược phẩm
và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cho thấy hàng thuỷ sản nhập khẩu từ Việt Nam có tỷ
lệ nhiễm hố chất, kháng sinh cấm và hạn chế sử dụng. Đến tháng 11/2005 đã có 9
lô hàng nhiễm chloramphenicol, 7 lô hàng nhiễm malachite green và leuco malachite green, 7 lô hàng nhiễm fluoroquinolone.
Đến cuối năm 2005, chất lượng các lô hàng xuất khẩu đã được cải thiện. Tuy
nhiên, số lô hàng đi EU vẫn được duy trì kiểm sốt dư lượng kháng sinh
chloramphenicol (CAP), nitrfurans (NTRs) và malachite Green (MR), leucomalachite green (LMG). Tại thị trường Hoa Kì, thơng qua hoạt dộng kiểm tra chứng
nhận đối với các lô hàng thuỷ sản xuất khẩu vào Mỹ, NAFIQAVED đã thực hiện
kiểm tra 995 lô hàng (14.473 tấn) phát hiện 12 lô không đảm bảo chất lượng an toàn
thực phẩm xuất khẩu, chủ yếu do bị phát hiện dư lượng MG, LMG, CAP, trong đó
có 3 lô cá basa, 9 lô tôm đông lạnh. Tại thị trường Canada, NAFIQAVED đã thực
hiện kiểm tra và cấp giấy chứng nhận đẻ xuất khẩu vào Canada cho 191 lô hàng
(2,739 tấn) và phát hiện 1 lô tôm đông lạnh có chứa dư lượng CAP.
Qua thực trạng về chất lượng thuỷ sản nói trên có thể thấy chất lượng thuỷ sản
Việt Nam nhìn chung chưa đáp ứng được các tiêu chuẩn về chất lượng của các thị
trường tiêu thụ, thuỷ sản cung cấp chưa đem lại lòng tin với các nhà nhập khẩu. Đó
là cịn tồn tại nhiều lơ hàng cịn dư lượng kháng sinh, hố chất… những chất được
coi là ảnh hưởng tới sức khoẻ người tiêu dùng.

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

6


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh

• Trên thế giới
Theo dự báo của Trung tâm Thuỷ sản Thế giới, đến năm 2020, các nước đang
phát triển sẽ chiếm tới 77% tổng tiêu thụ thuỷ sản toàn cầu và 79% tổng sản lượng
thuỷ sản thế giới. Như vậy là, từ năm 1997 đến năm 2020, tiêu thụ thuỷ sản ở các
nước đang phát triển sẽ tăng từ 62,7 triệu tấn lên 98,6 triệu tấn (57%), trong khi các
nước phát triển sẽ chỉ tăng 4%, từ 28,1 triệu tấn lên 29,2 triệu tấn.
Tại Canada, người dân sống ven sơng và vùng dun hải thường có thú đào vớt
nghêu sị. Tuy nhiên ít người ý thức rằng các loại thủy sản này đôi khi là mối đe
dọa về sức khỏe. Cũng như bất cứ loài thủy sản nào khác, sị ốc cũng có thể bị
nhiễm bởi các loại vi khuẩn như E. coli spp, Salmonella spp, Vibrio vulniculus,
Vibrio parahaemolyticus và các loại virus như virus Norwalk( Norovirus) và virus
bệnh viêm gan A.
Hiện nay, bệnh tả vẩn còn xuất hiện trên thế giới quanh năm với số bệnh nhân
nhỏ hơn. Năm 2005, có 131.943 trường hợp bệnh xãy ra trong 52 quốc gia trên thế
giới được báo cáo với tổ chức Y Tế Quốc Tế. 94% trường hợp bệnh xãy ra ở những
quốc gia Phi Châu nghèo khổ. Năm 1992, một trận dịch hoàn toàn bất ngờ của một
thể bệnh giống như dịch tả, gây bởi Vibrio cholerae nhóm O139. Bệnh khởi phát ở
Madras, Ấn Độ và lan ra theo vịnh Bengal thuộc Bengladesh. Sau đó, dịch lan ra
toàn Á Châu và vài trường hợp xâm nhập vào các quốc gia đã phát triển do người
bệnh mang vào. 75% nguyên do dịch tả do sự yếu kém về vệ sinh phòng dịch liên
quan đến nguồn nước được người dân sử dụng và kiểm soát thực phẩm hải sản tươi
sống, và 25% do thói quen xấu của người dân tại địa phương về cách ăn uống.

2.2. Giới thiệu về Vibrio spp.
2.2.1. Lịch sử phát hiện Vibrio spp.
Người ta cho rằng bệnh tả xuất hiện tại châu Á từ 600 năm trước Công nguyên.
Bệnh tả được ghi nhận lần đầu tiên trong y văn vào năm 1563 tại Ấn Độ. Trận “đại
chiến” đầu tiên của dịch tả với con người vào năm 1817- 1821 nổ ra tại nơi này.

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

7


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

Dịch tả lan rộng ra theo các tuyến vận tải vào nước Nga, tiếp theo là châu Âu và
Bắc Mỹ. Nó trở thành căn bệnh mang tính tồn cầu đầu tiên của nhân loại, hoành
hành khắp nơi chỉ trừ Nam cực.
Trận đại dịch tả tấn công nước Anh vào năm 1848-1849 đã làm 70.000 người tử
vong. Đại dịch năm 1854 đã cướp đi sinh mạng 1/8 dân số thành phố London chỉ
trong một thời gian ngắn.
Cũng trong khoảng thời gian này nước Pháp cũng hứng chịu những tổn thất
nặng nề. Năm 1832, gần 40.000 người dân Paris đã mắc dịch tả và phân nửa trong
số đó đã tử vong. Năm 1848-1849, một số lượng người tương tự cũng đã chết vì
dịch bệnh.
Phải đợi đến năm 1883, người ta mới biết được khuôn mặt của “kẻ giết người”
nhờ công trình nghiên cứu của Robert Koch. Heinrich Hermann Robert Koch (1843
– 1910) là một bác sĩ người Đức. Ông là người đã tìm ra trực khuẩn bệnh than, trực
khuẩn lao và vi khuẩn bệnh tả. Trước đó (1854) nhà khoa học Ý Pacini đã nhắc đến
loại vi khuẩn gây bệnh tả Vibrio chorelae khi đại dịch tả tấn công thành Florence.
Năm 1883 Robert Koch được cử tới Ai Cập làm Chủ tịch Ủy ban về bệnh tả của
Đức, để điều tra về dịch tả đang bùng phát ở đó. Ơng đã phát hiện ra vi khuẩn
Vibrio chorela là nguyên nhân gây bệnh tả, ngồi ra ơng cũng nghiên cứu vụ vi
khuẩn tả ở Ấn Độ. Ơng đã hệ thống hóa ngun tắc để kiểm sốt dịch tả (1893) và
nó đã trở thành nền móng cho việc kiểm sốt dịch tả ngày nay.
Ông đã phát hiện ra vi khuẩn tả gây ra dịch tả ở người có nhiều nhất ở trong
phân của người bệnh, trong nước thải có chứa phân. Ngồi ra cá, các thực phẩm
khác từ nước nhiễm khuẩn nếu khơng được nấu chín cũng là nguồn gây bệnh.

Vibrio parahaemolyticus : được Fujino phát hiện lần đầu tiên vào mùa hè năm
1951 tại vùng ven biển Nhật Bản sau các vụ ngộ độc do ăn cá, hào… Người ta đã
xác định đuợc 21 lồi thuộc giống Vibrio, trong đó có 4 loài thuộc tác nhân gây
bệnh cho người gồm: Vibrio cholera, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio vulnificus,
Vibrio alginolyticus.

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

8


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

2.2.2. Phân loại Vibrio spp và phân bố
2.2.2.1. Phân loại Vibrio spp
a. Phân loại theo khoa học
Vibrio spp thuộc :
• Giới (regnum): Bacteria
• Nghành (phylum): Proteobacteria
• Lớp (class) : Gamma Proteobacteria
• Bộ (order): Vibrionale
• Họ (family): Vibrionaceae
• Chi (genus): Vibrio.
• Lồi (species): Hiện nay có khoảng 28 lồi Vibrio như Vibrio natriegens,
Vibrio harveyi , Vibrio fischeri , Vibrio parahaemolytycus…Trong đó, 3 loại
Vibrio thường gây bệnh cho người nhất là Vibrio parahaemolytycus, Vibrio
cholera, Vibrio vulnificus.
 

Hình 2.1: Vibrio harvey

b. Phân loại theo kháng ngun
• Vibrio cholera nhóm 01 (gọi tắt là V.cholerae 01): gồm các vi khuẩn gây dịch tả.
• Vibrio cholerae non O1/non-O139:

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

9


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh

Gồm các vi khuẩn có tính chất sinh vật hố học giống V.cholerae O1, nhưng
khơng ngưng kết với kháng huyết thanh O1. Có thể gây bệnh lẻ tẻ và nhẹ, không
thành dịch.
Đặc điểm chủ yếu của những chủng này là không sản xuất độc tố tả và không
liên quan tới dịch tiêu chảy. Những chủng này được phân lập tình cờ từ những
trường hợp tiêu chảy do ăn tơm cua hoặc từ những trường hợp nhiễm trùng ngồi
ruột khác như: vết thương, tai, đờm, nước tiểu, dịch não tuỷ. Phẩy khuẩn thuộc
nhóm này được tìm thấy ở cửa sông, các nhiễm trùng do các chủng này thường bắt
nguồn từ ngoại cảnh.
• Vibrio cholerae O139 (chủng Bengal):
Lúc đầu, vi khuẩn gây vụ dịch này liên quan tới vi khuẩn tả non-O1 vì nó khơng
ngưng kết với kháng huyết thanh O1 nhưng triệu chứng lâm sàng rất dữ dội và
giống tả. Chủng Vibrio cholerae O139 được cho là chủng lai của chủng Vibrio
cholerae O1 và chủng non-O1.
• Các Vibrio khác:
Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, các Vibrio nhóm F.

2.2.2.2. Phân bố
Ngoại trừ V.cholerae có thể hiện diện ở vùng nước ngọt, tất cả các loại Vibrio

khác đều cần muối để tăng trưởng và thường phân bố rộng ở các khu vực nước mặn,
vùng nước ven biển, cửa sông và các khu vực nuôi trồng thủy hải sản. Chúng tồn tại
với số lượng lớn trong cả nước và trầm tích của hồ ni tôm, đặc biệt là trong nội
tạng các sinh vật nuôi trồng thủy hải sản.

2.2.3. Đặc điểm hình thái Vibrio spp.
2.2.3.1. Đặc điểm chung
Vibrio có nguồn gốc từ “Vibrae” có nghĩa là dao động, gồm các vi khuẩn có
dạng que uốn cong, có dạng dấu phẩy, có một tiên mao. Phần lớn các lồi Vibrio
sống hoại sinh chỉ một số ít có khả năng lây bệnh cho người. Vibrio cholerae (phẩy
trùng tả) gây bệnh cho người, có khả năng sống trong nước đến 3 tuần.

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

10


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh

Giống Vibrio thuộc họ Vibrionaceae là những lồi vi khuẩn Gram (-), hình que
thẳng hoặc hơi uốn cong, kích thước 0,3 – 0,5 x 1,4 – 2,6μm. Chúng không sinh bào
tử và chuyển động nhờ một hay nhiều tiên mao mảnh nằm ở một đầu vi khuẩn.
Tất cả những loài vi khuẩn thuộc giống Vibrio đều là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi,
vi khuẩn khơng phát triển trong môi trường không muối (NaCl) và không sinh H2S.
Chúng mẫn cảm với thuốc thử Vibriostat 0/129.
Một số chủng Vibrio có khả năng tiết hemolysine làm tan hồng cầu gây ngộ độc.
Chúng sống trong nước ấm và bùn lắng ở đầm hồ và vùng nước lợ ven biển, vi
khuẩn bám vào chitin của cua và các loại thân mềm, tồn tại trong thịt hay nội tạng
của tôm, cua… Đặc trưng của loài Vibrio là khả năng phát triển trong điều kiện pH
rất cao (8,5 – 9,5) và bị tiêu diệt nhanh ở môi trường acid. Vibrio chứa các loại

kháng nguyên O, K, H.

2.2.3.2 Đặc điểm của từng loài
a. V.parahaemolyticus: phát triển được ở mơi trường có 1Ỉ 8% NaCl, tốt nhất
2Ỉ 4% NaCl và không sinh trưởng được trong môi trường khơng có muối (sẽ chết
nếu đưa vào nước cất). Chúng không thể sống dưới 4oC nhưng phát triển tốt nhất ở
5Ỉ 9oC, pH tối ưu sống trong mơi trường 7% NaCl.
- V.parahaemolyticus: có phản ứng oxidase (+), phát triển được trong canh
trypton ở 24oC. Phản ứng ADH (-), LDC (+), có khả năng khử nitrate thành nitrite
nhưng khơng lên men sucrose, sử dụng được một số nguồn carbohydrate khác để
lên men nhưng không sinh hơi, không tăng trưởng được trong mơi trường khơng có
muối, tăng trưởng tốt trong mơi trường có đến 8% muối nhưng bị ức chế trong mơi
trường chứa 10% muối.

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

11


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh

Hình 2.2: V.parahaemolyticus
b. V.cholerae: có phản ứng oxidase (+), tăng trưởng được trong môi trường
canh trypton ở 42oC, arginine dehydrolase (-), lysine decarboxylase (+), lên men
được sucrose (saccharose), khử nitrate thành nitrite, có thể tăng trưởng được trong
mơi trường chứ 0 – 3% NaCl, không phát triển được trong các môi trường chứa 6,
8, 10% muối.
- V.cholerae: là loài vi khuẩn phổ biến trong tự nhiên. Chúng gây bệnh dịch tả ở
người (human cholerae). Bệnh gây ra do nước bẩn và thực phẩm bị nhiễm bệnh.
V.cholerae là những trực khuẩn ngắn mảnh, kích thước khoảng 0,5 x 3.10-6 m. Khi

mới phân lập, chúng có hình phẩy di động rất nhanh. Trong điều kiện phịng thí
nghiệm, chúng dễ dàng phát triển trong mơi trường bình thường mà khơng cần các
yếu tố tăng trưởng. Ở nồng độ 5 - 15 mmol/l sẽ kích thích vi khuẩn mọc tốt hơn. Vi
khuẩn này ưa pH 8 – 9,5 nhiệt độ tối ưu là 37oC. Chúng có thể phát triển được trong
mơi trường có chứa hàm lượng muối cao (trên 6% NaCl).
- V.cholerae dễ chết trong môi trường acid, bị tiêu diệt bới chất tẩy rửa, khơng
chịu được độ ẩm thấp. Chúng có thể tồn tại ở 55oC trong 10 phút. Thậm chí chúng
có thể sống trong mơi trường nước ngọt có hàm lượng Na+ thấp.
- V.chlolerae có kháng nguyên H (trong tiên mao). Kháng nguyên này dễ bị tiêu
hủy. Ngoài ra chúng cịn có kháng ngun O (phần lipopolysaccharide ở màng vi
khuẩn), rất bền nhiệt. Kháng nguyên O (tế bào) là lipopolysaccharit, trong đó phần
polysaccharit quy định tính đặc hiệu của kháng nguyên .

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

12


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đơng lạnh

- V.cholera có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme. Trong đó có enzyme
mucinase. Enzyme này làm tróc vãy biểu bì mơ ruột. Neuraminidase thủy phân
ganglioside. GD1 và GT1 thành GM1. Vì thế số lượng thụ thể độc tố ruột tăng lên .
 
 
 

Hình 2.3: V.cholerae
c. V.vulnificus: khơng tăng trưởng được trong mơi trường có muối và bị ức
chế trong mơi trường có 8 Ỉ 10% NaCl. Chúng được tìm thấy trong nước biển và

hải sản, phần lớn chúng không phát triển được ở nhiệt độ lạnh nên vào mùa đơng rất
khó phát hiện ra chúng. Chúng có khả năng sinh tổng hợp nội độc tố cytotoxin với
trọng lượng phân tử là 56Kda, hemolysin - 36Kda và cytoysin. Nước biển vùng nào
cũng có vi khuẩn này, nhưng có nhiều nhất là vào tháng 5 và tháng 10. Chúng là
nguyên nhân chính gây nhiễm trùng máu. Các bệnh nhân thường mắc phải ở lứa
tuổi 40 (sức đề kháng của cơ thể giảm) và tỉ lệ tử vong là rất cao ( 60% ).

Hình2. 4: V. Vulnificus

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

13


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

2.2.4. Cấu trúc Vibrio spp.
Cấu trúc genome của V. cholerae
Khác với hầu hết các loài thuộc chi Vibrio, genome của V. cholerae gồm 2
nhiễm sắc thể (NST) dạng vịng với kích thước tương ứng là 2961146 bp (NST I) và
1072314 (NST II).
Cả 2 NST này chứa 3885 khung đọc mở (open reading frame, ORF) với hàm
lượng G + C trung bình trên mỗi NST chiếm khoảng 41%. Heidelbeg cho rằng hai
NST này có nguồn gốc tiến hóa khác hẳn nhau. NST lớn (NST I) chứa nhiều gen
cần thiết cho việc thực hiện chức năng tế bào hơn NST nhỏ (NST II). Ví dụ như sự
nhân đơi ADN, sự phân chia tế bào, sự phiên mã, dịch mã và sinh tổng hợp thành tế
bào. NST I cũng mang hầu hết các locus gen liên quan đến tính gây độc, rất nhiều
trong số đó là do thu nhận từ những lồi khác. Ví dụ yếu tố chính quyết định tính
gây độc của tác nhân gây bệnh là độc tố tả (cholerae enterotoxin) được mã hóa bởi
gen của một virut và đã được gắn vào bên trong genome của V. cholerae trên NST

I. Hay một nhân tố cần thiết cho sự xâm lấn ruột non là những vi lơng điều hịa độc
tố (Toxin coregulated pili- TCP) đã được mã hóa bởi những gen nằm trên vùng VPI
(Vibrio Pathogenicity Island) quy định tính gây bệnh của Vibrio thuộc NST I. Vùng
này được tìm thấy ở những chủng V. cholerae có khả năng gây dịch. Sự biểu hiện
của các gen liên quan đến tính gây độc được điều khiển bởi các protein
giống ToxR và ToxT cùng với nhiều chất điều hòa khác được mã hóa bởi những
gen nằm trên NST I.
Trên cơ sở nghiên cứu ở E.coli người ta thấy rằng ở mỗi tế bào vi khuẩn chứa
một NST dạng vòng. Nhưng ở V. cholerae thấy có sự thay đổi về số NST dạng
thẳng hoặc dạng vịng. Sự có mặt của các gen đặc trưng được xem như là một đặc
điểm quan trọng nhận dạng các NST (ví dụ như gen mã hóa cho các protein
riboxom L20 và L35) đã có mặt trên NST II.
Vì vậy các gen này cho phép xác nhận NST II như là một NST thật. Sự tồn tại
của những gen này chỉ ra rằng đây là trạng thái di truyền ổn định chứ không phải là

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

14


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

những chức năng cần thiết nhất thời được thực hiện từ một bản sao không ổn định
trong xu thế tiến hóa.
Mặc dù tất cả các gen nằm trên NST II được xếp vào 16 nhóm theo sự phân chia
nhỏ các chức năng của tế bào, nhưng 8 nhóm trong số đó chứa những gen ít quan
trọng hơn những gen trên NST I. Những gen quan trọng trên NST II là những gen
liên quan đến sự vận chuyển đường và năng lượng, sự truyền tín hiệu và sửa chữa
ADN.

2.2.5. Yếu tố độc lực
Vibrio cholerae sản xuất nhiều loại độc tố tác động với adenylate cyclase trong
tế bào ruột và với nhiều thành phần của hệ thống điều hành ruột, bao gồm những tế
bào thần kinh ruột và những tế bào Enterochromaffin (EC), để tạo ra tình trạng bài
tiết và tiêu chảy với lượng lớn. Bên cạnh độc tố dịch tả (cholera toxin), vi khuẩn tả
còn sản xuất zonula occludens toxin (ZOT), độc tố này làm tăng sự thẫm thấu qua
chỗ nối chặt chẽ giữa 2 tế bào ruột, và độc tố phụ (ACE: assessor cholera
enterotoxin), chưa có rõ phận sự trên những tế bào ruột.
Độc tố cholerae toxin là một phức hợp protein do phẩy khuẩn Vibrio cholerae
tiết ra. Độc tố cholerae toxin được tạo thành từ 6 tiểu đơn vị protein được gọi là
oligomeric.
Độc tố cholerae toxin hoạt hoá enzyme adenylate cyclase trong các tế bào
niêm mạc ruột dẫn hình thành cAMP và tiết nước, các ion Na+, K+, Cl-, HCO3- vào
trong lòng ruột. Ảnh hưởng của độc tố phụ thuộc vào một thụ quan đặc biệt có tên
monosialosyl ganglioside (GM1 ganglioside) có trên bề mặt các tế bào niêm mạc.
Phẩy khuẩn sản xuất men tan nhầy và chất giúp nó xâm nhập vào tế bào đồng thời
tác động làm ganglioside chuyển thành monosialosyl có thể nhận độc tố.
Độc tố cholerae toxin có trọng lượng phân tử 84 kDa, bao gồm tiểu phần A và
B. Hai tiểu đơn vị A và B liên kết với nhau bằng cầu nối disulfide. Tiểu phần B
được kết hợp bởi 5 chuỗi polypeptide giống nhau và liên kết ở điểm thụ quan
Ganglioside GM1 trên bề mặt tế bào eukaryote. Khi xâm nhập được vào tế bào, tiểu
đơn vị A sẽ xúc tác q trình chuyển đường ribose từ NAD đến protein có tên gọi
SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

15


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

Gs hoặc Ns. Protein này sẽ điều khiển hệ thống adenylate cyclase có mặt ở phía

trong màng tế bào. Adenylate cyclase là một enzyme liên kết với màng tế bào và có
khả năng chuyển ATP (adenosine triphosphate) thành dạng AMP vịng (cyclic
adenosine monophosphate). Hình thành cAMP là một trong những bước đầu tiên để
bất cứ một tín hiệu hố học nào tác động kích thích hay ức chế adenylate cyclase.
Độc tố zonula occludens (ZOT) là một enterotoxin do vi khuẩn Vibrio
cholera tiết ra, nó làm tăng tính thấm của tế bào niêm mạc ruột bằng cách gắn vào
các thụ thể nằm trên tế bào cùa thành ruột.
Một yếu tố độc hại chính thứ 2 của vi khuẩn tả giúp chúng sinh sôi nẩy nở trong
ruột của chúng ta là toxin coregulated pilus (TCP). Một mảnh di truyền (operon)
TCP có chứa một số nhân di truyền, gồm tcpA là nhân di truyền mã hóa cơ cấu
chính (main structural gene) liên quan đến việc cấu tạo pilus. TCP không những liên
quan tới khả năng giúp cho vi khuẩn tả sinh sơi nảy nở trong ruột con người nhưng
nó cũng là nơi tiếp nhận (receptor) cho CTXφ.
Độc tố đường ruột của vi khuẩn là sản phẩn của ctx gene. ctxA mã hố cấu phần
A, ctxB mã hố cấu phần B. Thơng tin của các gene này được chuyển về cùng một
mRNA sau khi sao mã (chúng là thành phần của một operon). mRNA này có hai vị
trí kết hợp với ribosome ở phía đầu 5' các đoạn gene tương ứng. Vị trí kết hợp
ribosome của cấu phần B có khả năng hoạt động mạnh hơn ít nhất 7 lần so với vị trí
kết hợp ribosom của A chính vì thế mà lượng sản phẩm của quá trình dịch mã (các
protein) của B sẽ gấp vài lần potein của A. Tỷ lệ protein A và B đảm bảo độc lực
của vi khuẩn là 1A:5B. Sau khi được tổng hợp, protein A và B kết hợp với nhau tại
vị trí giữa màng tế bào và màng ngồi của ribosom. Lượng protein B cịn dư sẽ
được tiết ra khỏi tế bào. Tuy nhiên thành phần A phải được kết hợp với 5B để được
vận chuyển ra ngoài tế bào. Thành phần A nguyên vẹn (chưa kết hợp với B) sẽ ở
trạng thái bất hoạt và được giữ lại bằng cách hình thành hai phần A1 và A2 nối với
nhau bằng liên kết disulfide. Khi độc tố vi khuẩn kết hợp với GM1 receptor của tế
bào vật chủ, thành phần A1 được giải phóng (bằng cách cắt liên kết disulfide) và
xâm nhập vào tế bào. Cơ chế xâm nhập của A1 chưa được biết rõ. Có giả thiết cho

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

16


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

rằng 5 đơn vị cấu phần B (5B) tạo thành một khe trên màng tế bào để giúp A1 xâm
nhập. Quá trình sao mã của ctxAB được điều hồ bởi nhiểu yếu tố bao gồm cả các
tín hiệu mơi trường trong đó vi khuẩn đang tồn tại như nhiệt độ, pH, tính thẩm thấu,
các amino acid. Một số gene khác của phẩy khuẩn cũng được điều hoàtheo cơ chế
tương tự như các gene trong tcp operon. tcp được cho là quyết định q trình tổng
hợp "roi" hay "lơng" của vi khuẩn. Chính vì vậy mà cả ctx và tcp đều chịu ảnh
hưởng của các yếu tố môi trường.
Các protein đã được xác định liên quan đến quá trình điều hồ các gene nói trên
bao gồm ToxR, ToxS và ToxT. ToxR là một protein màng với 2/3 amino acid nằm
trong tế bào chất. Tổ hợp hai protein ToxR (ToxR dimer) kết hợp với vùng khởi sự
của ctxAB và hoạt hố q trình sao mã. ToxS protein được cho là có chức năng
đáp ứng với các tín hiệu mơi trường, làm thay đổi hình thái và có thể thay đổi q
trình bắt cặp của ToxR qua đó xúc tiến sao mã. ToxS đóng vai tró như bộ phận cảm
biến, phosphoryl hoá và chuyển ToxR sang trạng thái kết hợp với DNA. ToxT là
protein trong tế bào chất có chức năng hoạt hoá tcp opeon dẫn đến tổng hợ thành
phần của tcp pili. Biểu hiện của ToxT chịu ảnh hưởng của ToxR.
Vì vậy, ToxR là một protein điều hồ thực hiện chức năng "khơi mào" hệ thống
điều khiển. ToxR cũng được cho là tương tác với ToxS để thực hiện chức năng
nhận biết các thay đổi của yếu tố môi trường và chuyển các tín hiệu (ở mức phân tử)
đến nhiễm sắc thể dẫn đến quá trình sao mã của các gene giúp vi khuẩn gắn kết với
màng tế bào và sản xuất độc tố. Hồn tồn có lý do để cho rằng môi trường dạ dàyruột (nhiệt độ 37 độ, pH thấp, tính thấm cao v.v.) khơng tương tự như các điều kiện
trong môi trường tồn tại tự nhiên của phẩy khuẩn (mơi trường nước) có thể trở
thành yếu tố tác động, kích kích sản sinh độc tố và gây nhiễm.

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

17


Tìm hiểu quy trình phát hiện Vibrio trong thủy hải sản đông lạnh

2.2.6. Cơ chế gây bệnh
Trong điều kiện tự nhiên, vi khuẩn tả chỉ gây bệnh cho người. Vi khuẩn xâm
nhập vào cơ thể bằng đường ăn uống. Để xuống được ruột non, vi khuẩn phải vượt
qua dạ dày, vi khuẩn chịu tác động của dịch dạ dày có độ pH thấp (mơi trường
acid). Bình thường, pH của dạ dày đủ để gây chết cho vi khuẩn. Những vi khuẩn
sống sót sẽ tiếp tục xuống ruột non. Ở ruột non, vi khuẩn có khả năng tồn tại rất lâu.
Phẩy khuẩn có khả năng kháng tác động của muối mật, xâm nhập qua lớp màng
nhầy trên niêm mạc ruột. Tuy nhiên, ở những người giảm tiết dịch vị acid hoặc
uống NaHCO3 (hoặc các chất kiềm tính có khả năng trung hịa dịch vị) thì có thể
mắc tả nếu trong thức ăn, nước uống có vi khuẩn tả.
Q trình xâm nhập được hỗ trợ bởi men tan nhầy và các men phân cắt protein
thành các peptide. Do khả năng “tự bơi”, vi khuẩn có thể chuyển động ngược chiều
với nhu động ruột để tiếp cận với niêm mạc ruột nhờ đặc điểm hoá hướng động của
chúng.
Tại ruột non, chúng tiết ra nội độc tố “choleraetoxin” có trọng lượng phân tử
khoảng 84.000 gồm 2 tiểu đơn vị là A và B (do gen có sẵn nằm trong DNA của vi
khuẩn tổng hợp). Tiểu đơn vị B sẽ gắn vào thụ quan Ganglioside GM1. Việc gắn
kết này sẽ hỗ trợ tiểu đơn vị A xâm nhập vào bên trong tế bào ruột non. Chúng
không xâm nhập vào biểu mô ruột mà bám vào niêm mạc ruột.
Tiểu đơn vị A có chức năng enzyme chuyên biệt và hoạt động khi vào bên trong
tế bào. Khi tiểu đơn vị A xâm nhập vào bên trong tế bào, chúng sẽ kích hoạt
adenylate cyclase liên tục để gia tăng sản sinh hàm lượng cAMP (Adenosine
monophosphate vòng) nội bào bên trong tế bào, khiến cho ruột non khơng cịn chức

năng hấp thu mà chuyển sang chức năng thải tiết dịch – làm phóng thích hàng loạt
ion, chất điện giải từ trong tế bào ra ngồi dịch ruột. Chính vì thế, tế bào sẽ mất rất
nhiều điện giải ( K+, Cl-, Na+. . . ). Ngoài ra, chúng cũng tạo thành mơi trường ưu
trương trong lịng ruột dẫn đến việc nước trong tế bào sẽ ra ồ ạt, gây tiêu chảy trầm trọng.
Phẩy khuẩn cịn có thể sở hữu protein bề mặt gây ngưng kết hồng cầu và nhóm
protein do gen acf mã hố. Nhóm gen này quy định yếu tố hỗ trợ gắn kết của vi

SVTH: Phạm Thị Bích Ngọc

18