xây dựng quy trình phát hiện thịt trong thực phẩm chay bằng phương pháp pcr gen 16s ty thể

BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM






XÂY DỰNG QUY TRÌNH
PHÁT HIỆN THỊT TRONG THỰC PHẨM
CHAY BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR GEN
16S TY THỂ


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC



CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. VŨ NGỌC BỘI
ThS. HỒ THỊ THANH THỦY

Nha Trang 2011


BỘ GIÁO VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG


NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM






XÂY DỰNG QUY TRÌNH
PHÁT HIỆN THỊT TRONG THỰC PHẨM
CHAY BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR GEN
16S TY THỂ


ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Mã số sinh viên : 4913044007

Lớp : 49SH
Cán bộ hướng dẫn : TS. Vũ Ngọc Bội
ThS. Hồ Thị Thanh Thủy







Nha Trang - 2011


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành Đồ án này
Trước hết tôi xin gửi tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban
Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường, Phòng Đào tạo Đại học và
Sau đại học niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm
qua.
Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được giành cho thầy: TS. Vũ Ngọc Bội - Phó
Giám đốc Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường - Trường Đại học Nha
Trang, ThS. Hồ Thị Thanh Thủy - Phó Giám đốc Công ty CPCN Việt Á và TS.
Lê Huyền Ái Thúy - Khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Mở TP. Hồ
Chí Minh đã tận tình hướng dẫn và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện
đồ án tốt nghiệp này.
Xin cám ơn: ThS. Khúc Thị An - Quyền Trưởng Bộ môn Công nghệ Sinh
học và các thầy cô phản biện đã cho tôi những lời khuyên quí báu để công trình
nghiên cứu được hoàn thành có chất lượng.
Đặc biệt xin được ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong
Bộ môn Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường -

Trường Đại học Nha Trang, Ban lãnh đạo Công ty CPCN Việt Á đã giúp đỡ
nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện đồ
án này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều
kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập
vừa qua.

Người thực hiện
NGUYỄN THỊ MỸ DIỄM


MỤC LỤC
Trang
CÁC CHỮ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG ii
DANH MỤC CÁC HÌNH iii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN I. TỔNG QUAN 3
1. TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHAY 4
1.1. Sơ lược về ăn chay 4
1.2. Tình hình thực phẩm chay nhiễm thịt trong và ngoài nước 4
2. TỔNG QUAN VỀ HỆ GEN TY THỂ 5
2.1. Cấu trúc hệ gen ty thể 5
2.2. Gen 16S rRNA trong phát hiện thịt động vật 8
3. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC LOẠI THỊT KHÁC NHAU TRONG
THỰC PHẨM 10
3.1. Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích protein 10
3.1.1. Phương pháp dựa trên kỹ thuật điện di 11
3.1.2. Phương pháp Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) 11
3.2. Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích DNA 12

3.2.1. Phương pháp lai phân tử (DNA hybridization) 12
3.2.2. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 13
3.2.3. Phương pháp Real time PCR 15
PHẦN II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 17
1. VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 18
1.1. Vật liệu- hóa chất 18
1.1.1. Mẫu thực phẩm 18
1.1.2. Mồi 18
1.1.3. Hóa chất. 18


1.2. Dụng cụ thiết bị 19
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Phương pháp xử lý mẫu 20
2.2. Phương pháp tách chiết DNA 20
2.2.1. Nguyên tắc 20
2.2.2. Tiến hành 21
2.3 .Tiến hành phản ứng PCR 21
2.3.1. Thành phần 21
2.3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng 21
2.3.3. Phương pháp tiến hành thí nghiệm 22
2.4. Điện di trên gel agarose 23
2.4.1. Nguyên tắc 23
2.4.2. Pha hóa chất 23
2.4.3. Tiến hành 23
2.5. Phương pháp thiết kế mồi. 23
2.5.1. Tiêu chuẩn thiết kế mồi 23
2.5.2. Các phần mềm sử dụng 24
2.5.3. Phương pháp tiến hành 24
2.6. Phương pháp đánh giá mồi trên lí thuyết 25

2.7. Phương pháp đánh giá mồi trên thực nghiệm 25
2.7.1. Phương pháp đánh giá khả năng hoạt động của mồi 25
2.7.2. Phương pháp khảo sát nhiệt độ lai tối ưu của mồi 25
2.7.3. Phương pháp khảo sát độ đặc hiệu của mồi 25
2.7.4. Phương pháp khảo sát độ nhạy của phản ứng 26
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 27
1. THIẾT KẾ MỒI 28
2. KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA MỒI TRÊN LÝ THUYẾT 28
2.1. Khảo sát kích thước, %GC, nhiệt độ nóng chảy (T
m
). 28
2.2. Khảo sát cấu trúc thứ cấp của mồi 29


2.3. Khảo sát tính đặc hiệu và sự nhân bản chọn lọc của mồi theo lý thuyết 31
3. KHẢO SÁT MỒI TRÊN THỰC NGHIỆM 35
3.1. Khảo sát sự hoạt động của mồi 35
3.2. Kết quả giải trình tự 36
3.3. Khảo sát nhiệt độ lai 39
3.4. Khảo sát độ đặc hiệu của mồi 40
3.5. Khảo sát độ nhạy của quy trình 41
4. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH TRÊN MẪU THỰC PHẨM CHAY 42
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45
1 KẾT LUẬN 45
2 KIẾN NGHỊ 45
TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

i

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxynucleotide triphotphat
bp base pair
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
EDTA Ethylen Diamine Tetraacetic Acid
ELISA Enzyme Link Immuno Sorbent Assay
FDA Food and Drug Administration
IDT Intergrated DNA Technologies
IEF Isoelectric Focusing
mtDNA mitochondrial DNA
PCR Polymerase Chain Reaction
PAGE Polyacrylamide gel
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
rRNA ribosome ribonucleic acid
tRNA transport ribonucleic acid

ii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang
Bảng 1.1: Ribosome của các loài 9
Bảng 3.1: Trình tự mồi thiết kế 28
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát kích thước, %GC, Tm của mồi 28
Bảng 3.3: Năng lượng tự do ΔG của các cấu trúc thứ cấp 29
Bảng 3.4a: Kết quả BLAST mồi xuôi trên NCBI 33
Bảng 3.4b: Kết quả BLAST mồi ngược trên NCBI 34
Bảng 3.5: Kết quả giải trình tự sản phẩm PCR từ chứng dương 36
Bảng 3.6: Kết quả tìm kiếm trình tự tương đồng với sản phẩm PCR trên
GeneBank bằng phầm mềm BLAST 38
Bảng 3.7: Thống kê kết quả khảo sát 29 mẫu thực phẩm chay trên thị trường 43

iii

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ


Trang
Hình 1.1: Cấu trúc của ty thể 6
Hình 1.2: Cấu trúc hệ gene ty thể 8
Hình 1.3. Nguyên tắc trong phản ứng PCR 15
Hình 3.1: Cấu trúc selt-dimer của hai mồi (a, b: cấu trúc của mồi xuôi, c: cấu trúc
của mồi ngược) 30
Hình 3.2: Dạng cấu trúc hetero-dimer 30
Hình 3.3: Kết quả kiểm tra khả năng bắt cặp của mồi bằng Annhyb 31
Hình 3.4a: Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của mồi xuôi trên ClustalX 32
Hình 3.4b: Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của mồi ngược trên ClustalX 32
Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát sự hoạt động của
mồi 35

Hình 3.6: Kết quả giải trình tự mẫu chứng dương DNA thịt heo 37
Hình 3.7: Kết quả kiểm tra độ tương đồng của sản phẩm PCR trên ClustalX 38
Hình 3.8: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát nhiệt độ lai 39
Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát độ đặc hiệu của mồi 40
Hình 3.10: Kết quả điện di sản phẩm PCR nhằm khảo sát độ nhạy của quy
trình 41
Hình 3.11: Kết quả ứng dụng quy trình phát hiện thịt trong thực phẩm chay 42
Sơ đồ : Quy trình tiến hành thí nghiệm 22


1



ĐẶT VẤN ĐỀ
Thế giới ẩm thực là vô cùng phong phú và đa dạng, đặc biệt phải kể đến là thực
phẩm dành cho những người ăn chay. Khoa học cũng đã chứng minh, ăn chay là một
hình thức ăn uống có lợi cho sức khỏe như giúp giảm cân, giảm huyết áp, giảm bệnh
động mạch vành tim, giảm nguy cơ bị sỏi thận, bị ung thư, giảm triệu chứng bệnh về
xương và khớp… Do đó, xu hướng ăn chay ngày càng được nhiều người tiêu dùng có
xu thế sử dụng.
Trên thị trường thực phẩm chay, hàng hoá rất đa dạng từ thực phẩm khô đến hàng
đóng hộp, ăn liền, chế biến sẵn với giá thành cao hơn nhiều so với những sản phẩm
mặn thông thường. Thế nhưng, mức độ đáp ứng “đúng” tiêu chí của một loại thực
phẩm ăn chay theo nghĩa: nguyên liệu dùng để sản xuất phải có nguồn gốc từ thực vật.
Hiện tại, chỉ có một vài cơ sở lớn, chuyên sản xuất và kinh doanh thực phẩm chay như
Âu Lạc, Kim Chi có ghi rõ đầy đủ thành phần nguyên liệu trên sản phẩm, trong khi đó
sản phẩm của các cơ sở chế biến nhỏ, lẻ lại chưa được kiểm soát và rất thiếu thông tin
về thành phần nguyên liệu
[30]

.
Một số nghiên cứu mới đây cho thấy những thành phần hương liệu mà các nhà
sản xuất đưa vào sản xuất thực phẩm chay có chứa thịt hoặc nước xương hầm thịt vì
vậy khiến cho những người ăn chay vô tình phá giới và làm cho thực phẩm ăn chay
chưa đúng với tên gọi của nó. Vấn đề đặt ra là làm sao để xác định được thành phần
của sản phẩm chay có chứa thịt động vật hay hay không là một yêu cầu bức thiết.
Trên thế giới cũng như ở Việt Nam, một số nhà khoa học đã đưa ra một số
phương pháp để nhận biết các loại thịt và xác định nguồn gốc của thịt nhưng vẫn chưa
được các cấp quản lý thực phẩm quan tâm nhiều. Các phương pháp phát hiện thịt chủ
yếu là dựa vào phát hiện trình tự gen ty thể để phát hiện loài. Bởi DNA ty thể có nhiều
ưu điểm thích hợp làm đối tượng nghiên cứu như: DNA ty thể có đặc điểm đơn bội,
không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ; Số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào; trong
khi tách chiết, DNA ty thể bền vững hơn DNA nhân do có cấu trúc dạng vòng, khó bị
phá vỡ và dễ dàng tách chiết hơn
[2]
. Đặc biệt, gen 16S ty thể là trình tự có những vùng
2



bảo tồn ở hầu hết các loài động vật nên có thể dựa vào đặc điểm này để xây dựng quy
trình phát hiện DNA của động vật khi chúng có mặt trong thực phẩm chay.
Vì những lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Xây dựng quy trình phát hiện thịt
trong thực phẩm chay bằng phương pháp PCR gen 16S ty thể”.
Mục đích của đồ án: đánh giá chính xác và nhận biết nhanh chóng sự có mặt của
thịt trong các sản phẩm chay.
Nội dung:
1) Thiết kế mồi cho phản ứng PCR.
2) Khảo sát các đặc tính của mồi đã thiết kế về mặt lý thuyết.
3) Khảo sát khả năng hoạt động của mồi khi thực hiện phản ứng PCR.

4) Thử nghiệm phát hiện thịt trong thực phẩm chay bằng phản ứng PCR gen 16S
ty thể.
Về phương diện khoa học, đây là quy trình mới có thể nhận biết được sự có mặt
của DNA các loài động vật nói chung. Về mặt thực tiễn, phương pháp sẽ giúp cơ quan
quản lý chất lượng thực phẩm kiểm soát được các mặt hàng thực phẩm chay trên thị
trường, giúp người tiêu dùng an tâm hơn khi sử dụng các sản phẩm chay.





3







PHẦN I.
TỔNG QUAN

4



1. TỔNG QUAN VỀ THỰC PHẨM CHAY
1.1. Giới thiệu về thực phẩm chay
Thực phẩm chay là thực phẩm không chứa các thành phần động vật và những
chất có nguồn gốc động vật.
Thực phẩm chay giả mặn là những thực phẩm được chế biến chủ yếu từ tinh bột
được tạo hình mô phỏng thành các món ăn mặn như tôm, mực, thịt heo, bò, cá
Thuật ngữ “ăn chay” được biết đến ở đạo Phật và một vài tôn giáo khác. Ngày
nay, ăn chay đang trở thành một trào lưu trên thế giới, nhất là trong giới tri thức và các
chuyên gia. Ở các nước phương Tây, theo thống kê chưa đầy đủ, có khoảng 5% dân số
Anh và Mỹ cho biết họ ăn chay trường hay ăn chay thường xuyên
[26]
. Rất nhiều nghiên
cứu khoa học trong hơn 20 năm qua đã cho thấy ăn chay còn được xem như một liệu
pháp để giảm bớt nguy cơ xảy ra nhiều loại bệnh tật nguy hiểm như tim mạch, cao
huyết áp, đái tháo đường, ung thư, Trong một nghiên cứu trên 47.000 người Mỹ cho
thấy nhóm người ăn chay có nguy cơ mắc bệnh tim mạch thấp hơn nhóm ăn mặn
khoảng 20%. Ăn chay và ăn nhiều rau quả còn giảm nguy cơ tai biến mạch máu não
đến 22%. Ngoài ra, ăn chay còn giảm nguy cơ mắc bệnh ung thư vú, ruột và phổi so
với ăn mặn. Một nghiên cứu khác trên 26.000 người Mỹ cho thấy người ăn chay có tỉ
lệ mắc bệnh đái tháo đường thấp hơn người ăn mặn khoảng 25%
[28]
. Hơn nữa, ăn chay
được xem như một biện pháp bảo vệ môi trường. Do đó, nhu cầu về thực phẩm chay
trên thị trường hiện nay là rất lớn.
1.2. Tình hình thực phẩm chay nhiễm thịt trong và ngoài nước.

Cơ quan tiêu chuẩn chất lượng thực phẩm (FDA) tại Đài Bắc đã khám phá ra rằng
15 loại trong 21 loại thực phẩm chay giả thịt lấy từ các khu chợ có chứa DNA động
vật, chiếm hơn 70%.
[30]
Theo các nghiên cứu này, DNA của các loài động vật thường
được phát hiện trong thực phẩm chay như: động vật nuôi có sừng (trâu, bò,…), gia cầm
(gà, vịt, đà điểu,…), heo và cá. Ngày 1 tháng 7 năm 2009, Đài Loan đã ban hành các
đạo luật về việc dán nhãn các thực phẩm chay với mục đích đảm bảo các thực phẩm
5



này là chay
[31]
. Như vậy, trên thế giới, số sản phẩm chay bị nhiễm thịt tăng cao đến
mức báo động.
Ở Việt Nam, các sản phẩm chay giả mặn đang ngày càng thịnh hành trên thị
trường từ các siêu thị, nhà hàng, quán ăn cho đến các chợ, quán tạp hoá lớn nhỏ trên
khắp cả nước như: thịt bò chay, thịt heo chay, sườn non chay, bóng cá chay, tôm chay,
cánh gà chay, đùi gà chay, cá thu chay, mực chay… Giá thành của các sản phẩm chay
giả mặn thường cao hơn so với các sản phẩm mặn. Theo khảo sát thị trường giá một số
loại như sau: tôm chay 120.000đ/kg, mực chay cắt lát 50.000đ/kg, cá viên chay
30.000đ/kg, Sườn non chay: 65.000 đồng/kg, Chả lụa chay: 13.000 đồng/cây 400gr,
Chà bông chay các loại: 112.000 đồng/kg, Thịt gà xé /bò xé kim chi: 8.000 đồng/gói
50gr, Bò viên/cá viên chay: 10.500 đồng/gói 180gr…
Thị trường thực phẩm chay tại các chợ lớn tại thành phố Hồ Chí Minh như chợ
An Đông, Bình Tây, Bến Thành…rất đáng ngờ vì các sản phẩm chủ yếu được nhập từ
Đài Loan, Thái Lan, Trung Quốc không ghi rõ thành phần, nguồn gốc, hạn sử dụng
nhưng được bày bán rất phổ biến. Ngoài ra còn có những sản phẩm chay nội địa được
sản xuất tại các cơ sở nhỏ lẻ tại địa phương với hình dáng và mùi vị rất giống với món

mặn
[32]
.
Vấn đề thực phẩm chay bị nhiễm thịt đang được nhiều người quan tâm nên việc
tìm ra phương pháp để phát hiện thịt trong thực phẩm chay là rất cần thiết.
2. GIỚI THIỆU VỀ HỆ GEN TY THỂ
2.1. Cấu trúc của hệ gen ty thể
[2,4,6,7,12,13,16]


Đặc điểm cấu trúc ty thể
Ty thể được Altmann mô tả lần đầu vào năm 1890 và sau đó, cấu trúc siêu hiển vi
của ty thể đã được nghiên cứu chi tiết bởi Palade (1952) và Sjostrand (1953)
[7]
.
Ty thể là bào quan có hình tròn hoặc hình trụ dài, kích thước 2-5 µm. Toàn bộ
cấu trúc ty thể được bao bọc bởi hai lớp màng. Lớp màng ngoài bao trùm tạo nên ranh
giới ngoài của ty thể, lớp màng trong tạo thành nếp gấp hướng vào tâm là nơi khu trú
6



của các enzyme hô hấp. Các lớp màng chia ty thể thành hai khoang riêng biệt: khoang
chứa chất nền nằm bên trong ty thể và khoang gian màng nằm giữa hai lớp màng.
[2]


Hình 1.1. Cấu trúc của ty thể
Ty thể là bào quan quan trọng, có mặt trong tất cả các tế bào hô hấp hiếu khí, giữ
vai trò trung tâm trong việc sản sinh năng lượng, trao đổi amino acid, trao đổi chất béo,

trao đổi steroid và chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Nhờ chứa chuỗi
truyền điện tử, các enzyme của chu trình Krebs và phosphoryl hóa, ty thể thực hiện quá
trình oxy hóa các carbohydrate, các acid béo, các amino acid… giải phóng ra năng
lượng dưới dạng các liên kết phosphate cao năng trong phân tử ATP. Đây là dạng năng
lượng cần thiết cho mọi hoạt động sống của tế bào.

Cấu trúc hệ gen ty thể
Hệ gen ty thể là phân tử DNA trần, kép, mạch vòng, gồm hai chuỗi: chuỗi nặng
(H strand) giàu guanine và chuỗi nhẹ (L strand) giàu cytosine. Khác với DNA nhân,
DNA ty thể không liên kết với protein histon do đó DNA ty thể rất giống với DNA vi
khuẩn
[4][16]
.
Ở động vật, ngoài hệ gen trong nhân còn có hệ gen tế bào chất nằm trong ty thể
chiếm tỉ lệ từ 1 – 5% DNA của tế bào. Kích thước của hệ gen ty thể (mtDNA) ở động
vật vào khoảng 15 - 17kb
[13]
.
7



DNA ty thể có các đặc điểm cơ bản sau:
- Tốc độ đột biến lớn gấp 5 - 10 lần so với hệ gen nhân.
- Số lượng bản sao lớn.
- Đơn bội, hầu như không có sự tái tổ hợp.
- Di truyền theo dòng mẹ ở phần lớn các loài.
MtDNA có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, điều đó
có nghĩa là mỗi phân tử cũng như toàn bộ mtDNA thường chỉ có một lịch sử phả hệ
theo dòng mẹ. Thêm vào đó mtDNA tồn tại với số lượng bản sao lớn trong mỗi tế bào.

Các đặc điểm trên cùng với việc mtDNA bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết
do có cấu trúc dạng vòng, nên mtDNA được sử dụng như là một công cụ phân tử trong
việc phân tích các mối quan hệ tiến hóa và biến đổi di truyền trong loài và giữa các loài
có nhiều thuận lợi.
Tất cả genome ty thể động vật có chứa 37 gen, 2 rRNA, 22 tRNA và 13 mRNA.
Gen rRNA mã hóa cho các RNA ribosome
[13]
.
8




Hình 1.2. Cấu trúc hệ gen ty thể
2.2. Gen 16S rRNA trong phát hiện thịt động vật
[10,19,20,22]


Đặc điểm cấu trúc và vai trò của ribosome RNA (rRNA)
Ribosome là một bào quan có mặt trong tất cả các tế bào của sinh vật sống,
ribosome của vi khuẩn, sinh vật đơn bào và sinh vật đa bào tuy có sự khác nhau về cấu
trúc nhưng đều có chức năng dịch thông tin di truyền được "mã hóa" bởi các phân tử
DNA sang các phân tử protein (các đơn vị cấu tạo và thực hiện nhiều chức năng khác
nhau của cơ thể sinh vật).
Ribosome được cấu tạo từ vài phân tử rRNA và hơn 50 protein, được tập hợp
thành 2 tiểu phần (tiểu đơn vị) hoàn toàn thích hợp về cấu trúc và hoạt động. Hai tiểu
phần này hoạt động thống nhất để thực hiện quá trình dịch mã từ DNA sang chuỗi
polypeptide gồm các axít amin trong quá trình tổng hợp protein. Theo quy ước các tiểu
đơn vị được đặt tên theo tốc độ lắng của chúng dưới lực ly tâm. Đơn vị đo tốc độ lắng
là Svedberg và được viết tắt là “S”. Ở các ribosome khác nhau có các rRNA khác nhau,

9



chúng cũng đặc trưng bởi hằng số lắng S, rRNA chiếm tỷ lệ cao trong tế bào có thể đến
75 % của tổng RNA.
Ở vi khuẩn thực và vi khuẩn cổ không có ty thể. Ở nấm chia thành 2 nhóm, nhóm
1 có ribosome ty thể 70S, tiểu phần lớn 24S, tiêu phần nhỏ 17S; nhóm 2 có ribosome ty
thể 72S, tiểu phần lớn 21S và tiểu phần nhỏ 15S. Ở thực vật, có ribosome ty thể 75S,
tiểu phần lớn gồm 5S và 26S, tiểu phần nhỏ 18S. Ở động vật, ribosome ty thể 55S, tiểu
phần lớn 16S, tiểu phần nhỏ 12S. (Bảng 1.1)
Bảng 1.1. Ribosome của các loài (R. Kumar, The molecular biology of plant
mitochondria)
rRNA
Loài

Ribosome
Tiểu phần lớn Tiểu phần nhỏ

Vi khuẩn thực 70S 5S, 23S 16S
Vi khuẩn cổ 70S 5S, 23S 16S
Nấm (Fungi)
+ Nấm sợi
- Tế bào chất
- Ty thể


80S
70S

5S, 5.8S, 26S
24S


17S
17S
+ Nấm men
- Tế bào chất
- Ty thể

80S
72S

5S, 5.8S, 25S
21S

18S
15S
Thực vật
- Tế bào chất
- Lục lạp
- Ty thể

80S
70S
75S

5S, 5.8S, 25S
5S,(4.5S), 23S

(5S), 26S

17S
16S
18S
Động vật
- Tế bào chất
- Ty thể

80S
55S

5S, 5.8S, 28S
16S

18S
12S


Cơ sở sử dụng gen 16S trong phát hiện thịt động vật
Trong hệ gen ty thể động vật chứa hai gen rRNA là 12S và 16S rRNA. Gen 16S
rRNA mã hóa cho phân tử rRNA trong tiểu phần lớn của ribosome ty thể, được sử
dụng trong một số nghiên cứu phát hiện các loài động vật khác nhau như Gregory C.
10



Booton, Jennifer R. Carmichael, (2003); Scott Reaney, Trevor Conrad Martin, Jason
Paul Sawyer, (2009). Trung bình mỗi tế bào động vật có khoảng 800- 1000 ty thể, mỗi
ty thể có chứa ít nhất 2- 6 phân tử DNA dạng vòng có kích thước 16.500 bp, mỗi phân

tử DNA có chứa 22 tRNA, 2 rRNA và 13 gen mã hóa protein (Garder & Snustad,
1984). Như vậy ít nhất trong mỗi tế bào có chứa 800x2 = 1.600 copies gen 16S rRNA.
Vì vậy, sử dụng trình tự gen này nhạy hơn khi sử dụng các gen khác chỉ có một bản
copy trong một tế bào.
Theo Johanson (1993) có 5 đặc điểm quan trọng trong việc sử dụng gen rRNA
làm phân tử đích trong việc chẩn đoán, đó là:
- Trong tế bào sinh vật số lượng ribosome là rất lớn. Việc chẩn đoán sử dụng mẫu
dò rRNA sẽ có độ nhạy cao hơn so với các đoạn gen khác chỉ có 1 đoạn copy.
- Sự có mặt của các vùng có sự biến đổi khác nhau trên rRNA cho phép xác định
được mức độ đặc trưng cho loài, cho giống và cho lớp. Khi xác định đoạn DNA ở vùng
S (vùng bán bảo tồn) thì cho phép xác định sự đặc hiệu theo nhóm.
- Số lượng trình tự 16S rRNA được nghiên cứu khá chi tiết và khá nhiều trình tự
của các loài, giống được giải mã và được công bố trên ngân hàng gen.
- Các thủ tục tiêu chuẩn đã được xác lập để giải trình tự gen rRNA.
- Sự tiến hoá và biến đổi của ribosome và cấu tạo của nó được xác định là rất thấp
và vì vậy sự ổn định trong chẩn đoán dựa trên rRNA là rất cao và có thể xác định được
cả những loài có quan hệ họ hàng gần gũi.
3. PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN CÁC LOẠI THỊT KHÁC NHAU TRONG
THỰC PHẨM
3.1. Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích protein
Có nhiều phương pháp dựa trên phân tích protein đã được ứng dụng để xác định
các loại thịt và các thành phần từ động vật trong thực phẩm, bao gồm: sắc ký khí, điện
di SDS, các phương pháp miễn dịch, ELISA, phân tích hóa học. Tuy nhiên, phần lớn
các phương pháp này chỉ được ứng dụng để phát hiện thịt tươi hoặc thịt chưa bị thoái
hóa (biến tính) và độ đặc hiệu của các phương pháp này tương đối thấp.
11



3.1.1. Phương pháp dựa trên kỹ thuật điện di

[14][25]

Phương pháp này dựa trên sự di chuyển của protein trong điện trường. Sự di
chuyển nhanh hay chậm tùy thuộc vào hình dạng và tỉ số điện tích/khối lượng, nhờ đó
các chất khác nhau sẽ được tách ra thành những vết riêng và được phát hiện bằng nhiều
cách khác nhau. Quá trình điện di có thể thực hiện trên gel polyacrylamide, gel
polyacrylamide có chứa yếu tố gây biến tính (sodium dodecyl sulfate) (SDS-PAGE)
hoặc điện di tập trung điểm đẳng điện (isoelectric focusing-IEF).
Nghiên cứu của Parisi và Aguiari (1985) đã cho thấy rằng phương pháp SDS-
PAGE có thể được sử dụng để xác định các loại thịt như: động vật có sừng, cừu, dê,
nai, thỏ. Trong phương pháp IEF, myoglobin được sử dụng như một chất chỉ thị cho
loài. Năm 1997, Hofmann đã nghiên cứu myoglobin của các loài động vật như: động
vật có sừng, ngựa, lợn, cừu, nai, kang-ku-ru, lạc đà, gấu, thỏ, gà, vịt, đà điểu bằng
phương pháp IEF. Kết quả cho thấy tập hợp các băng myoglobin có những đặc tính
riêng cho từng loài, và có thể xác định được loài động vật dựa vào dữ liệu myoglobin
mẫu cho từng loài động vật khác nhau.
Ưu điểm của các phương pháp này là đặc hiệu cho từng loài và có thể phát hiện
chính xác nguồn gốc các loại thịt. Tuy nhiên, phương pháp này không được dùng để
phân tích các mẫu thực tế do giá thành cao, tốn nhiều thời gian, kỹ thuật rất phức tạp,
cần xây dựng cơ sở dữ liệu lớn (phương pháp IEF).
3.1.2. Phương pháp Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)
[8][23][24]

Đây là kỹ thuật miễn dịch dựa trên liên kết kết đặc hiệu kháng nguyên-kháng thể.
Kỹ thuật này bao gồm một enzyme (có bản chất protein có khả năng xúc tác phản ứng
sinh hóa) để phát hiện sự có mặt của kháng nguyên (antigen) hay kháng thể (antibody)
trong mẫu phân tích. Có hai phương pháp ELISA thường được ứng dụng trong phát
hiện các loại thịt khác nhau trong thực phẩm: ELISA gián tiếp (indirect ELISA) và
Sandwich ELISA. Phương pháp ELISA gián tiếp sử dụng hai kháng thể, kháng thể thứ
nhất gắn đặc hiệu với kháng nguyên, kháng thể thứ hai gắn đặc hiệu với kháng thể thứ

nhất và có gắn enzyme. Do đó khi thêm cơ chất, enzyme sẽ biến đổi cơ chất để phát tín
hiệu huỳnh quang hoặc tín hiệu hóa học. Phương pháp Sandwich ELISA, kháng
12



nguyên có trong mẫu bị gắn giữa hai kháng thể: kháng thể thứ nhất đã được cố định
trên giếng và kháng thể thứ hai có gắn enzyme để phát hiện sự có mặt của kháng
nguyên trong mẫu.
Ưu điểm của phương pháp này là: đặc hiệu cho loài, thao tác đơn giản, độ nhạy
tương đối cao. Do đó nó được sử dụng rộng rãi trong giám định các mẫu thịt tươi
(Ayaz và các cộng sự, 2006; Kang’ethe và các cộng sự,1982; Patterson và Jones, 1985;
Kang’ethe và Lindqvist, 1987). Tuy nhiên các kháng nguyên dễ bị biến tính bởi nhiệt
độ trong quá trình chế biến thực phẩm, làm phá vỡ cấu trúc bậc ba và làm thay đổi tính
tan của chúng trong dung dịch, kết quả là không xảy ra phản ứng kháng nguyên-kháng
thể. Vì vậy, phương pháp này không có hiệu quả cao trong phân tích các mẫu đã qua
quá trình chế biến ở nhiệt độ cao. Ngoài ra, phương pháp này còn giới hạn về thời gian
và chỉ phát hiện được một đối tượng trong một lần thực hiện phản ứng.
3.2. Phương pháp phát hiện thịt dựa trên phân tích DNA
3.2.1. Phương pháp lai phân tử (DNA hybridization)
[15][26][28]

Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên vượt quá “nhiệt độ nóng chảy”
(T
m
) thì hai mạch sẽ tách rời nhau, sự bắt cặp trở lại sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản
ứng hạ xuống đột ngột, lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch
đơn. Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ cộng với
điều kiện thí nghiệm thích hợp hai mạch sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này gọi là sự lai
phân tử (molecular hybridization).

Hiện tượng liên kết như vậy cũng có thể xảy ra giữa hai mạch DNA với nhau,
giữa hai mạch RNA hoặc giữa DNA và RNA. Phân tử acid nucleic mới hình thành
được gọi là phân tử lai và quá trình kết cặp giữa các bazơ thuộc hai mạch đơn acid
nucleic có nguồn gốc khác nhau theo nguyên tắc bổ xung như vậy gọi là quá trình lai
phân tử.
Kỹ thuật lai phân tử được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu các sản phẩm từ
thịt sống hoặc đã qua chế biến. Các đoạn dò (probes) DNA đã được thiết kế để phát
hiện các loại thịt: heo (Buntjer, Lamine, Haagsma, & Lenstra, 1999; Buntjer, Lenstra,
& Haagsma, 1995; Ebbehøj & Thomsen, 1991b; Hunt, Parkes, & Lumley, 1997), cừu
13



(Hunt và các cộng sự, 1997), gà, bò, ngựa (Buntjer và các cộng sự, 1999). Tuy nhiên
phương pháp này cũng có một số hạn chế là kỹ thuật phức tạp, giá thành cao và độ
nhạy thấp hợn so với phương pháp PCR.
3.2.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
[5][18]

Phương pháp PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Trong phương pháp PCR để
xác định các loại thịt khác nhau trong thực phẩm, DNA đích làm khuôn để nhân bản có
thể là đoạn DNA thuộc gen cytochrome b, gen 12S rRNA, gen 16S rRNA.
 Nguyên tắc: Các enzyme DNA polymerase có khả năng tổng hợp một mạch
mới từ khuôn (đoạn DNA đích ) nhờ một mồi (là trình tự nucleotic ngắn) bắt cặp bổ
sung với trình tự trên DNA đích. Độ dài của đoạn DNA mới tổng hợp được giới hạn
giữa hai đoạn mồi xuôi (sens primer) và mồi ngược (antisens primer).
 Các thành phần trong phản ứng PCR
- Enzyme Taq polymerase – là một DNA chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn
sống ở các suối nước nóng (Thermus aquaticus). Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt
độ biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng.

- Dung dịch đệm (PCR buffer): có tác dụng cung cấp lực ion cần thiết cho phản
ứng xảy ra, tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR. Nồng độ, pH của dung dịch đệm
cũng như nồng độ KCl tối ưu thường tùy thuộc vào nguồn DNA polymerase sử dụng.
- MgCl
2
: đây là yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng. Mg
2+
rất cần cho quá trình
liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng T
m
của DNA mạch
kép. Mg
2+
là cofactor của Taq polymerase, nếu lượng Mg
2+
quá thấp thì Taq
polymerase sẽ không hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu và
Nguyễn Thị Lang, 1999), hạn chế quá trình kéo dài. Ngược lại, nếu lượng Mg
2+
quá
cao dễ gây khuếch đại ký sinh. Do đó, nồng độ MgCl
2
sử dụng cần được tối ưu hóa cho
từng phản ứng PCR. Thông thường, MgCl
2
được sử dụng ở nồng độ từ 1.5mM-4mM.
- Nồng độ dNTPs : bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20 –
200 µM/ mỗi loại nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại ký sinh, làm
giảm hiệu quả phản ứng PCR, sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide làm
tăng lỗi sao chép của DNA polymerase.

14



- Mồi (primer): nồng độ mồi sử dụng trong phản ứng PCR phải được tính toán
và tối ưu qua thực nghiệm. Nếu nồng độ mồi quá cao dễ gây khuếch đại ký sinh, nếu
quá thấp thì làm giảm hiệu quả khuếch đại của phản ứng. Thông thường, nồng độ mồi
sử dụng nằm trong giới hạn từ 0.1 - 1.0 µM.
- DNA mạch khuôn: được tách chiết từ tế bào động vật, thực vật, nấm hoặc vi
khuẩn, virus. Phản ứng PCR cần lượng DNA ban đầu đưa vào thường không quá cao.
Thông thường, nồng độ DNA sử dụng tốt nhất ở khoảng 10
5
/ phản ứng.
- Các chất tăng cường: ngoài những thành phần cơ bản, đôi khi người ta còn bổ
sung thêm chất tăng cường với mong muốn phản ứng xảy ra hiệu quả hơn. Các chất
thường sử dụng như: betaine, DMSO (dimethylsulfoxide), glycerol… Tuy nhiên cần
thận trọng khi sử dụng những chất này vì chúng có thể gây ức chế phản ứng PCR nếu
nồng độ không thích hợp.
 Các bước của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm
3 bước:
– Bước 1 (giai đoạn biến tính- denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao
gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ
cao hơn T
m
của phân tử, thường là 92- 96
o
C. Thời gian cho giai đoạn này phụ thuộc
vào cấu trúc và độ phức tạp của phân tử DNA. Ngoài ra nó còn phụ thuộc thể tích phản
ứng và bản chất hóa học của type dùng đặt phản ứng.

– Bước 2 (giai đoạn bắt cặp- annealing): nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn T
m
của
các mồi) cho phép mồi bắt cặp với khuôn. Nhiệt độ này giao động từ 55- 65
o
C tùy
thuộc vào độ tương đồng của mồi với trình tự mục tiêu và cách thiết kế mồi.
– Bước 3 (giai đoạn kéo dài- elongation): nhiệt độ được tăng lên 72
o
C giúp cho
DNA polymerase sử dụng vốn là polymerase chịu nhiệt hoạt động tổng hợp tốt nhất.
Thời gian kéo dài tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ
30 giây đến nhiều phút.
15



Một chu kỳ gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng
gấp đôi lượng mẫu lần trước. Do đó phản ứng PCR có khả năng làm tăng số lượng bản
mẫu theo 2
n
(n là số chu kỳ của phản ứng).


Hình 1.3. Nguyên tắc trong phản ứng PCR
3.2.3 Phương pháp Real time PCR
[5][9]

Nguyên tắc Real-time PCR cũng dựa trên PCR thường, nhưng phương pháp này
có thể định lượng được hàm lượng DNA/RNA có trong mẫu nhờ các chất nhuộm phát

huỳnh quang (fluorescent dye).
Phương pháp này sử dụng một thiết bị quang học để theo dõi quá trình khuếch đại
bằng cách đo lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra. Những tín hiệu này được tạo ra từ
những chất phát huỳnh quang gắn trên những mẫu dò được thiết kế để bắt cặp với
những trình tự mục tiêu cần khuếch đại. Tuỳ từng loại mẫu dò mà cơ chế phát huỳnh
16



quang có sự khác nhau. Một số mẫu dò thường được sử dụng để phát hiện đột biến là
Taqman probe, Beacon probe, FRET probe.
Nhược điểm của phương pháp là phức tạp, chi phí cao do đó giá thành cho việc
thực hiện một phản ứng là rất lớn.