Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease từ nấm sợi aspergillus oryzae trong sản xuất nước mắm cá linh nấu truyền thống tại an giang

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA SƯ PHẠM

BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP KHOA

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME
PROTEASE TỪ NẤM SỢI ASPERGILLUS
ORYZAE TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM
CÁ LINH NẤU TRUYỀN THỐNG
TẠI AN GIANG
Chủ nhiệm đề tài: ThS. KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH

AN GIANG, THÁNG 04 NĂM 2020


TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA SƯ PHẠM

BÁO CÁO ĐỀ TÀI NCKH CẤP KHOA

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG ENZYME
PROTEASE TỪ NẤM SỢI ASPERGILLUS
ORYZAE TRONG SẢN XUẤT NƯỚC MẮM
CÁ LINH NẤU TRUYỀN THỐNG
TẠI AN GIANG
Chủ nhiệm đề tài: ThS. KHƯU PHƯƠNG YẾN ANH

AN GIANG, THÁNG 04 NĂM 2020


1

CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG
Đề tài nghiên cứu khoa học “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease từ nấm
sợi Aspergillus oryzae trong sản xuất nước mắm cá linh nấu truyền thống tại An
Giang”, do tác giả Khƣu Phƣơng Yến Anh, công tác tại Khoa Sƣ phạm thực hiện.
Tác giả đã báo cáo kết quả nghiên cứu và đƣợc Hội đồng Khoa học và Đào tạo Khoa
Sƣ phạm Trƣờng Đại học An Giang thông qua ngày 16/04/2020.

Thƣ ký

TS. NGUYỄN VĂN MỆN

Phản biện 1

Phản biện 2

ThS. NGUYỄN THANH ĐÀO

ThS. TRƢƠNG VĂN MỸ THUẬN

Chủ tịch Hội đồng

TS. NGUYỄN PHƢƠNG THẢO

i


LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Chủ nhiệm Khoa Sƣ phạm

trƣờng Đại học An Giang đã phê duyệt, tạo cho tôi cơ hội đƣợc thực hiện đề tài này.
Tôi thành thật biết ơn các bạn chun viên Phịng thí nghiệm - Khu Thí nghiệm
Trung tâm - Phòng Quản trị - Thiết bị trƣờng Đại học An Giang, đã giúp đỡ cho tơi
trong q trình thực hiện đề tài.
Cảm ơn tất cả những đồng nghiệp đã nhiệt tình hỗ trợ tơi trong suốt thời gian
thực hiện đề tài.

Xin chân thành cảm ơn tất cả!

Long Xuyên, ngày 16 tháng 04 năm 2020
Ngƣời thực hiện

Khƣu Phƣơng Yến Anh

ii


TÓM TẮT
Nƣớc mắm cá linh nấu là đặc sản truyền thống tại An Giang, đƣợc ủ trong
thời gian 12 tháng đến 2 năm, có mùi thơm đặc trƣng, giá trị dinh dƣỡng cao. Đề tài
nghiên cứu bổ sung thêm 3% chế phẩm enzyme protease từ nấm sợi Aapergillus
oryzae khi ủ cá linh thì thời gian ủ cá đƣợc rút ngắn cịn 6 tháng, nƣớc mắm có hàm
lƣợng đạm tổng số là 19,80 g/L, đạm amin là 6,16 g/L cao hơn so với khi khơng bổ
sung enzyme, ủ 6 tháng thì hàm lƣợng đạm tổng số là 11,56 g/L, đạm amin là 3,36
g/L. Ngoài ra, nƣớc mắm cá linh sản xuất theo quy trình cải tiến này có chỉ tiêu
Coliforms là 0 CFU/mL, E. coli là 0 CFU/mL đạt chuẩn theo TCVN 5107: 2018 về
chỉ tiêu vi sinh vật trong nƣớc mắm. Kết quả này có thể ứng dụng trong sản xuất
nƣớc mắm cá linh nấu truyền thống nhƣng có cải tiến, đáp ứng đƣợc yêu cầu về giá
trị dinh dƣỡng, vệ sinh an toàn thực phẩm, tạo thƣơng phẩm nƣớc mắm tỉnh nhà.

Từ khóa: Nƣớc mắm cá linh nấu, enzyme protease, nấm sợi Aspergillus
oryzae, đạm tổng số, đạm amin.

iii


ABSTRACT
Ca Linh cooked fish sauce is a traditional specialty in An Giang, was
incubated for 12 months to 2 years, with a characteristic aroma and high nutritional
value. The research project added 3% of protease enzyme from A. oryzae when
incubating Linh fish, the incubation period of fish was shortened to 6 months, fish
sauce had a total protein 19,80 g/L, amino protein 6,16 g/L, higher than without
enzyme, 6 months of incubation total protein 11,56 g/L, amino protein 3,36 g/L. In
addition, Ca Linh cooked fish sauce produced with this improved process had
Coliforms 0 CFU/mL, E. coli 0 CFU/mL, reach the standards of TCVN 5107: 2018
for microbiological criteria in fish sauce. This result can be applied in the production
of traditional Ca Linh cooked fish sauce, had improved to reach the requirements of
nutritional value, food hygiene and safety, creating a trademark fish sauce of the
province.

Keywords: Ca linh cooked fish sauce, protease enzyme, Aspergillus oryzae,
total protein, amino protein.

iv


LỜI CAM KẾT
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi. Các số liệu trong
cơng trình nghiên cứu này có xuất xứ rõ ràng. Những kết luận mới về khoa học của
cơng trình nghiên cứu này chƣa đƣợc cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Long Xuyên, ngày 16 tháng 04 năm 2020
Ngƣời thực hiện

Khƣu Phƣơng Yến Anh

v


MỤC LỤC
Trang

Chƣơng 1: GIỚI THIỆU ........................................................................................ 1
1.1 Tính cần thiết của đề tài ................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu ......................................................................................... 2
1.3 Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................................... 2
1.4 Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 2
1.5 Những đóng góp của đề tài .............................................................................. 2
Chƣơng 2: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ............................................ 3
2.1 Enzyme protease từ nấm sợi Aspergillus oryzae ............................................. 3
2.1.1 Khái quát về enzyme protease ....................................................................... 3
2.1.2 Thu nhận enzyme protease từ nấm sợi Aspergillus oryzae ........................... 4
2.2 Nƣớc mắm cá linh ............................................................................................. 7
2.2.1 Giới thiệu về nƣớc mắm cá linh truyền thống................................................ 7
2.2.2 Tiêu chuẩn của nƣớc mắm thành phẩm …………………………………..8
2.2.3 Bản chất của quá trình sản xuất nƣớc mắm .................................................. 10
2.3 Tình hình nghiên cứu nƣớc mắm trong và ngoài nƣớc ..................................... 12
Chƣơng 3: PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................ 14
3.1 Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 14
3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .................................................................................. 14

3.2.1 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu ............................................................................. 14
3.2.2 Phƣơng pháp ủ và nấu nƣớc nắm cá linh truyền thống .................................. 14
3.2.3 Bố trí thí nghiệm ............................................................................................ 15
3.2.4 Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu nƣớc mắm ............................................. 15
3.2.5 Xử lý thống kê ............................................................................................... 15
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................. 16
4.1 Kết quả ảnh hƣởng enzyme protease từ nấm sợi Aspergillus oryzae
đến hàm lƣợng đạm trong nƣớc mắm cá linh nấu .................................................. 16
4.2 Kết quả xác định chỉ tiêu vi sinh vật trong nƣớc mắm cá linh nấu .................. 18
4.3 Quy trình sản xuất nƣớc mắm cá linh nấu cải tiến so với phƣơng pháp
truyền thống……………………………………………………………………...18
vi


Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ...................................................... 20
5.1 Kết luận ............................................................................................................ 20
5.2 Khuyến nghị ..................................................................................................... 20
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 21
PHỤ LỤC ............................................................................................................... 23

vii


DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1. Thành phần hóa học của cá linh ................................................................. 8
Bảng 2. Yêu cầu cảm quan của nƣớc mắm .............................................................. 9
Bảng 3. Các chỉ tiêu hoá học của nƣớc mắm .......................................................... 10
Bảng 4. Chỉ tiêu vi sinh vật của nƣớc mắm ............................................................ 10
Bảng 5. Mơ hình bố trí thí nghiệm………………………………………………15

Bảng 6. Phƣơng pháp xác định các chỉ tiêu nƣớc mắm………………………..

15

Bảng 7. Kết quả hàm lƣợng đạm tổng số và đạm amin trong nƣớc mắm cá linh nấu
(g/L).. .......................................................................................................... 16
Bảng 8. Kết quả định lƣợng Coliform và E.coli trong nƣớc mắm cá linh nấu
(CFU/mL)………………………………………… .................................. .18
Bảng 9. Công thức tạo chƣợp sản xuất nƣớc mắm cá linh nấu có cải tiến……...18

viii


DANH SÁCH HÌNH

Hình 1. Cấu trúc khơng gian enzyme protease ............................................3
Hình 2. Cơ chế hoạt động của enzyme protease ............................................3
Hình 3. Khuẩn lạc và bào tử nấm Aspergillus oryzae ....................................4
Hình 4. Bộ gen nấm sợi Apergillus oryzae ....................................................5
Hình 5. Sơ đồ quy trình sản xuất protease từ Aspergillus oryzae ..................6
Hình 6. Chế phẩm enzyme protease ...............................................................7
Hình 7. Cá linh ...............................................................................................8
Hình 8. Sơ đồ quy trình chế biến nƣớc mắm bằng phƣơng pháp VSV .........19
Hình 9. Chƣợp mắm cá linh sau khi ủ............................................................23
Hình 10. Nƣớc mắm cá linh thành phẩm .......................................................23

ix


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Nghiệm thức

:

NT

Tiêu chuẩn Việt Nam

:

TCVN

Vi sinh vật

:

VSV

x


CHƢƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Nước mắm là một loại gia vị cũng là một loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng
cao. Nước mắm Việt Nam đã được phát triển lâu đời và mang giá trị bản sắc đặc thù
của dân tộc Việt Nam. Hiện nay, nước mắm công nghiệp với thành phần chủ yếu là
nước muối, phụ gia thực phẩm, vi chất và hóa chất đang chiếm lĩnh thị trường, gây
ảnh hưởng rất xấu đến sức khỏe người tiêu dùng và nước mắm dần mất đi hương vị

thơm ngon truyền thống.
Tại An Giang, nước mắm cá linh nấu được chế biến theo phương pháp cổ truyền
có mùi thơm, vị ngon đặc trưng, tuy nhiên, nhược điểm là độ đạm không cao, độ mặn
cao, thời gian ủ kéo dài từ 12 tháng đến 2 năm hoặc lâu hơn, năng suất không cao,
giá thành sản phẩm cao vì vậy khơng kinh tế. Gần đây, các nghiên cứu bổ sung các
chủng vi sinh vật có khả năng sinh enzyme protease phân giải thịt cá trong quá trình
sản xuất nước mắm nhằm rút ngắn thời gian lên men, nâng cao độ đạm, đảm bảo
hương vị đặc trưng, tăng hiệu quả kinh tế trong sản xuất nước mắm đáp ứng nhu cầu
dùng nước mắm sạch, dinh dưỡng, vệ sinh an toàn thực phẩm của người dân trong và
ngoài nước.
Do vậy, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng enzyme protease từ nấm sợi Aspergillus
oryzae trong sản xuất nước mắm cá linh nấu truyền thống tại An Giang” được thực
hiện, nhằm đưa tiến bộ khoa học công nghệ vào thực tiễn, nâng cao hiệu quả trong
sản xuất nước mắm nấu truyền thống, góp phần nâng cao đời sống xã hội cho người
dân làng nghề, phát huy thế mạnh của tỉnh về khai thác và chế biến nguồn thủy sản
tự nhiên mùa nước lũ, thúc đẩy kinh tế chung của tỉnh An Giang đồng thời tạo
thương phẩm nước mắm riêng của tỉnh nhà.
1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu tìm quy trình sản xuất nước mắm cá linh nấu truyền thống có bổ
sung enzyme protease ly trích từ nấm sợi Aspergillus oryzae trong q trình ủ cá
linh.
1.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
- Đối tượng nghiên cứu: nước mắm cá linh nấu thành phẩm.
- Phạm vi nghiên cứu: thời gian ủ và nồng độ enzyme.
1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Bố trí thí nghiệm các tỉ lệ bổ sung enzyme protease ủ nước mắm cá linh.
- Lấy mẫu nước mắm nấu định lượng Nitơ tổng số và Nitơ amin, định lượng
Coliforms, E.coli.
- Đề xuất quy trình cơng nghệ sản xuất nước mắm cá linh nấu có bổ sung chế
phẩm enzyme protease từ nấm sợi Aspergillus oryzae.

1


1.5 NHỮNG ĐĨNG GĨP CỦA ĐỀ TÀI
Đóng góp về mặt khoa học
Ứng dụng enzyme protease từ nấm sợi Aspergillus oryzae trong sản xuất nước
mắm cá linh nấu truyền thống nhằm đưa tiến bộ khoa học công nghệ vào thực tiễn,
nâng cao hiệu quả trong sản xuất nước mắm nấu truyền thống.
Đóng góp cơng tác đào tạo
Bài báo cáo làm tài liệu tham khảo cho sinh viên ngành Sư phạm Sinh, Công
nghệ Sinh học tham gia nghiên cứu, thực hiện chuyên mơn u thích. Thơng qua hội
thảo khoa học, tăng cường kiến thức về kỹ thuật, công nghệ cho các nhà khoa học,
giảng viên.
Đóng góp phát triển kinh tế xã hội
Góp phần nâng cao đời sống xã hội cho người dân làng nghề, phát huy thế
mạnh của tỉnh về khai thác và chế biến nguồn thủy sản tự nhiên mùa nước lũ, thúc
đẩy kinh tế chung của tỉnh An Giang đồng thời tạo thương phẩm nước mắm riêng
của tỉnh nhà.
Những đóng góp khác
Nước mắm cá linh nấu truyền thống khơng hóa chất đảm bảo an toàn cho sức
khỏe con người, là một thực phẩm sạch, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm là mục
tiêu hướng tới trong thời đại ngày nay.

2


CHƢƠNG 2
TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
2.1 ENZYME PROTEASE TỪ NẤM SỢI ASPERGILLUS ORYZAE
2.1.1 Khái quát về enzyme protease

Enzyme là chất xúc tác sinh học đang được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành
công nghiệp khác nhau. Nhu cầu về enzyme ngày càng tăng, trong đó, các loại
enzyme vi sinh vật (VSV) có nhiều ưu điểm hơn enzyme động vật và thực vật, do
chúng có hoạt tính thủy phân cao hơn và sản lượng lớn hơn. Bên cạnh đó, nguồn
cung cấp enzyme VSV ổn định, không phụ thuộc theo mùa và VSV sinh trưởng
nhanh trên môi trường đơn giản, rẻ tiền. (Lương Đức Phẩm, 2010)
Enzyme protease là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết
peptide (-CO-NH-) của chuỗi polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin
(hình 1). Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức
độ tế bào, cơ quan đến cơ thể, có ý nghĩa cho quá trình sinh trưởng, sinh sản của mọi
sinh vật, đóng vai trị rất quan trọng trong cơng nghệ chế biến thực phẩm, trong y
học, trong công nghệ gen và bảo vệ mơi trường (Quyền Đình Thi, 2005).

Hình 1: Cấu trúc khơng gian enzyme protease và sơ đồ thủy phân phân
tử protein (Nguồn: />Protease được thu nhận từ các nguồn thực vật, động vật, VSV, trong đó,
protease từ VSV (vi khuẩn, nấm sợi, xạ khuẩn…) chiếm khoảng 40% tổng số
enzyme được bán trên toàn thế giới. Nghiên cứu tổng hợp protease từ nấm sợi A.
oryzae đã và đang được tiến hành, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt trong
công nghệ thực phẩm, protease được dùng chế biến phomai từ sữa, sản xuất bánh từ
bột mì, chế biến nước tương, nước mắm ngắn ngày…(Godfrey and West, 1996)
Cơ chế hoạt động: Protease là enzyme xúc tác thủy phân protein, về cơ bản cơ
chế xúc tác sinh học của enzyme người ta đề ra nhiều giả thuyết để giải thích, nhưng
đều thống nhất là quá trình xúc tác bắt đầu bằng sự kết hợp giữa enzyme và cơ chất
thành hợp chất trung gian theo mơ hình ổ khóa – chìa khóa (hình 2)

S+E

(EP)

(ES)

Hình 2: Cơ chế hoạt động của enzyme protease
3

E+P


Với E: enzyme;
S : cơ chất (protein);
cơ chất; P: sản phẩm.

ES: hợp chất trung gian giữa enzyme và

Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), sự tạo thành và chuyển biến hợp chất ES
qua 3 bước:
* Bước 1: Enzyme kết hợp với protein tạo thành phức chất enzyme protein.
* Bước 2: Xảy ra sự chuyển biến của các phân tử protein dẫn đến làm phá vỡ
các mối liên kết đồng hóa trị tham gia vào phản ứng. Phức chất ES đồng thời xảy ra
hai quá trình là sự dịch chuyển thay đổi electron, dẫn đến sự cực hóa của mối liên kết
tham gia vào phản ứng và sự biến dạng hình học của nối liên kết đồng hóa trị trong
phân tử protein cũng như trong trung tâm hoạt động của enzyme, làm cho protein
hoạt động.
* Bước 3: Giai đoạn tạo thành các axit amin và peptid cấp thấp, giải phóng
enzyme.
2.1.2 Thu nhận enzyme protease từ nấm sợi Aspergillus oryzae
2.1.2.1 Phân lập nấm sợi Aspergillus oryzae
Từ nguồn nấm giống cấy truyền sang các bình tam giác chứa môi trường nuôi
nấm đã thanh trùng, nuôi cấy từ 36 – 48 giờ, bảo quản nấm giống.
Nấm Aspergillus oryzae có cấu tạo đa bào, các khuẩn ty có nhiều vách ngăn, khi
khuẩn ty mới mọc có màu trắng xám và khi phát triển có màu xanh lợt có ít vàng.

Khuẩn lạc ban đầu có màu vàng lục sau chuyển thành màu vàng lục nâu (hình 2).
Đính bào tử có dạng hình cầu có tia. Bào tử hình cầu, bề mặt có gai mịn, có kích
thước lớn, màu vàng nâu, khi già gai trở nên xù xì, vách dày (hình 3). (Nguyễn Lân
Dũng, 2012)

Hình 3: Khuẩn lạc và bào tử nấm Aspergillus oryzae
(Nguồn: )
Bộ gen di truyền của Aspergillus oryzae hiện đã được phân tích và biết rất kỹ
vào năm 2001 (hình 4). Nấm này có thể dùng trong công nghiệp để sản xuất nhiều
loại enzyme khác nhau (amylase, protease, lipase, cellulase, oxidoreductase, phytase,
pectinase…), ứng dụng nhiều nhất để sản xuất nước tương. Nấm mốc Aspergillus
oryzae và vi khuẩn (chủ yếu là vi khuẩn Bacillus subtilis) chứa enzyme amylase
chuyển hóa tinh bột của nếp thành đường và enzyme protease chuyển hóa protein
đậu tương thành axit amin, nên tương có vị ngọt của đường, hương thơm đặc trưng.
4


Hình 4: Bộ gen nấm sợi Apergillus oryzae (Nguồn: Machida M, 2005)
2.1.2.2 Quy trình sản xuất protease từ nấm sợi Aspergillus oryzae
Thu nhận protease từ chủng nấm sợi Aspergillus oryzae bằng phương pháp nuôi
cấy bề mặt, nấm sợi phát triển nhanh, mạnh, ít bị tạp nhiễm. Khi ni, nấm sợi phát
triển bao phủ bề mặt hạt chất dinh dưỡng rắn, các khuẩn ty cũng phát triển đậm, sâu
vào lịng mơi trường đã được tiệt trùng, làm ẩm. Thường dùng cám mì, cám gạo, ngơ
mảnh, … có chất phụ gia là trấu, bổ sung thêm nguồn nitơ vô cơ (NH4)2 SO4,
phospho, nitơ hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng như malt, nước chiết ngô,
nước lọc bã rượu. Cám, trấu có bề mặt tiếp xúc lớn, mỏng, tạo được độ xốp nhiều,
khơng có những chất gây ảnh hưởng xấu đến sự phát triển của nấm. Chế phẩm dễ
dàng sấy khô mà khơng làm giảm đáng kể hoạt tính enzyme, chế phẩm khô dễ bảo
quản, vận chuyển, nghiền nhỏ hoặc sử dụng trực tiếp nếu không cần khâu tách và
làm sạch enzyme, tốn ít năng lượng, thiết bị, dụng cụ ni cấy đơn giản Tuy nhiên,

phương pháp bề mặt có năng suất thấp, khó cơ khí hóa, cần diện tích ni lớn, chất
lượng chế phẩm ở các mẻ không đồng đều (Lương Đức Phẩm, 2010).
Thuyết minh quy trình: (hình 5)
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy.
Cám làm ướt, trộn đều đến khi đạt độ ẩm 55% – 60%, đem hấp vô trùng ở 0,7 atm
trong 1 giờ. Sau đó làm nguội đến 40 oC rồi gieo cấy bào tử mốc giống vào.
Lên men tạo enzyme
Sau khi đã trộn giống, môi trường được rải đều ra các khay với chiều dày 2 cm – 3
cm rồi được cho vào phịng ni cấy, có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ và độ ẩm
khơng khí, nhiệt độ thích hợp cho sợi nấm phát triển là từ 28 oC – 32 oC, thời gian 36
- 60 giờ. Quá trình này xảy ra qua ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: kéo dài từ 8 - 10 giờ, nhiệt độ tăng rất chậm, sợi nấm bắt đầu hình thành
có màu trắng hoặc màu sữa, khối mơi trường cịn rời rạc, enzyme mới bắt đầu được
hình thành.
Giai đoạn 2: kéo dài từ 10 - 18 giờ, toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và
phát triển mạnh tạo thành những mạng chằng chịt bao quanh các hạt môi trường, có
5


thể nhìn rõ sợi nấm màu trắng xám bằng mắt thường, môi trường kết lại khá chặt, độ
ẩm môi trường giảm dần, nhiệt độ mơi trường có thể tăng nhanh lên 40 0C - 50 0C,
các chất dinh dưỡng giảm nhanh do sự đồng hóa của sợi nấm, enzyme protease được
tổng hợp mạnh, lượng O2 trong khơng khí giảm và lượng CO2 tăng dần, cần phải
thơng khí mạnh và duy trì mức nhiệt độ từ 29 0C – 30 0C là tốt nhất.
Giai đoạn 3: kéo dài từ 10-20 giờ, quá trình trao đổi chất yếu dần, mức độ tiêu hao
chất dinh dưỡng sẽ giảm lại, nhiệt độ của môi trường giảm, lượng enzyme tạo ra sẽ
giảm xuống. Do đó cần xác định thời gian để thu nhận enzyme hiệu quả nhất.

Hình 5: Sơ đồ quy trình sản xuất protease từ chủng nấm mốc Aspergillus
oryzae (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2002)

Thu chế phẩm enzyme protease thô.
Để đảm bảo enzyme không bị mất hoạt tính, thường sấy enzyme đến một độ ẩm thấp.
Nhiệt độ sấy vào khoảng 38 0C - 40 0C, enzyme protease bị mất hoạt tính ở 60 0C 76 0C, độ ẩm sau khi kết thúc sấy nhỏ hơn 10%. Tùy thuộc vào mục đích sử dụng mà
ta có thể sử dụng ngay enzyme này mà không cần phải tinh sạch.
Trích ly tách enzyme ra khỏi khối mơi trường.

6


Sau khi nghiền mịn cho nước vào để trích ly enzyme theo tỉ lệ 1 chế phẩm thô : 4
phần nước, khuấy nhẹ và lọc lấy dịch, phần bã được loại bỏ để làm thức ăn cho gia
súc.
Kết tủa enzyme.
Trong công nghiệp tinh chế enzyme sử dụng cồn hoặc sunfat amon. Trong quá trình
này cần làm lạnh cả dung dịch thô và các tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính
của enzyme. Cứ phần dung dịch enzyme thơ cho 2 – 2,5 phần cồn hoặc sunfat amon,
cần nhẹ nhàng để tránh hiện tượng biến tính, khuấy nhẹ và để trong điều kiện lạnh từ
4 0C – 7 0C trong một thời gian, các enzyme tạo thành kết tủa và lắng xuống, thu
nhận kết tủa (độ ẩm > 70%), tiếp tục sấy kết tủa ở 40 0C và độ ẩm giảm xuống 5% 8%.
Ly tâm và thu nhận kết tủa: tách sinh khối vi sinh vật và bã của canh trường.
Sấy phun thu nhận chế phẩm enzyme protease.
Tách nước ra khỏi dung dịch mà khơng làm thay đổi tính chất của enzyme nhằm bảo
quản lâu hơn. Nhiệt độ sấy lưu ý đến nhiệt độ biến tính của enzyme để điều chỉnh
nhiệt độ sấy thích hợp. Sau đó đem nghiền và bảo quản chế phẩm enzyme (hình 6).

Hình 6: Chế phẩm enzyme protease
(Nguồn: />2.2 NƢỚC MẮM CÁ LINH
2.2.1 Giới thiệu về nƣớc mắm cá linh truyền thống
Nước mắm là sản phẩm lên men từ các loại cá, là dịch hỗn hợp các axit amin
được thủy phân từ protein cá nhờ hệ enzyme protease có trong thịt cá và ruột cá làm

cho nước mắm có mùi vị đặc trưng. Nước mắm cịn có nhiều vitamin, chất khống,
muối, có nhiều mùi thơm đặc biệt, vị ngọt mặn (Lương Đức Phẩm, 2010)
Cá linh là chi cá thuộc họ Cá chép, là các loài cá trắng chỉ thích hợp mơi trường
nước chảy. Ở đồng bằng sông Cửu Long, cá linh phổ biến vào mùa nước nổi. Cá linh
trưởng thành có mình trịn, cỡ 5-8 cm, vảy ánh bạc (hình 7). Cá linh có thành phần
hóa học thay đổi theo mùa sinh sản, giới tính, độ tuổi, vùng đánh bắt, hàm lượng ẩm
tương đối cao, thuộc loại cá ít béo (bảng 1). Sự khác nhau về thành phần hoá học của
cá và sự biến đổi của chúng có ảnh hưởng đến mùi vị và giá trị dinh dưỡng của sản
phẩm, việc bảo quản tươi nguyên liệu và quy trình chế biến.
7


Phân loại khoa học cá linh:
( />Giới (regnum): Animalia
Ngành (phylum): Chordata
Lớp (class): Actinopterygii
Bộ (ordo): Cypriniformes
Họ (familia): Cyprinidae
Chi (genus): Cirrhinus
Loài (species): C. jullieni

Hình 7: Cá linh
(Nguồn: />Bảng 1. Thành phần hóa học của cá linh (Trần Văn Bền, 2012)

STT

Thành phần

Hàm lƣợng (%)

1

Protein

17,49±0,23

2

Lipid

4,73±0,12

3

Ẩm

76,86±0,46

4

Khoáng

1,11±0,04

Nước mắm cá linh nấu là loại nước mắm đặc sản của người dân miền sông nước
trong mùa lũ, dùng cá linh để ủ theo phương pháp cổ truyền. Cá linh rửa sạch đổ vào
khạp, cho muối hột vào trộn đều cá muối theo tỉ lệ 4 cá : 1 muối, dùng tấm nylon
nhiều lớp bịt kín, trên đậy nắp khạp dằn kín, ủ từ 6 - 12 tháng là có thể đem mắm cá
(chượp) ra nấu, lược qua vải mịn thu được nước mắm. Tuy nhiên, cá ủ càng lâu khi
nấu nước mắm càng ngon. Nước mắm cá linh có hương thơm đặc trưng, không chất

bảo quản, không chất tạo mùi, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm.
2.2.2 Tiêu chuẩn của nƣớc mắm thành phẩm
Giá trị dinh dưỡng của nước mắm
Thành phần nước mắm của nước mắm gồm có: những chất đạm axit amin (đạm
tồn phần), muối khống và vitamin… Đạm trong nước mắm là hàm lượng Nitơ
bằng gram trong một lít nước mắm. Đạm tồn phần chứng tỏ giá trị của nước mắm,
đạm toàn phần cao nhưng đạm hữu cơ trong nước mắm thấp thì giá trị kém. Trong
8


nước mắm những axit hữu cơ khi đưa vào cơ thể được hấp thụ ngay mà khơng phải
qua q trình phân giải ở ruột như khi ta ăn thịt, cá.
Trong nước mắm, có 20 loại axit amin, đặc biệt có 8 loại rất cần thiết cho cơ
thể con người để tạo thành protit cho cơ thể mà không thể tổng hợp được các axit
amin này. Do đó phải lấy thực phẩm từ ngoài vào, nhưng nếu một loại thực phẩm
nào có đủ 8 loại axit amin như vậy thì tác dụng cũng thấp và chậm hơn nước mắm vì
phải qua giai đoạn phân giải trong cơ thể. Tuy hàm lượng axit amin trong nước mắm
khơng có nhiều và hàng ngày lượng nước mắm ăn vào một lúc ít nhưng chúng có khả
năng kích thích sự đồng hóa, giúp cho tiêu hóa tổng hợp đạm được dễ dàng.
Các chất đạm chiếm chủ yếu và quyết định giá trị dinh dưỡng của nước mắm,
gồm 3 loại đạm:
+ Đạm tổng số: là tổng lượng nitơ có trong nước mắm (g/L), quyết định phân
hạng nước mắm.
+ Đạm amin: là tổng lượng đạm nằm dưới dạng axit amin (g/L), quyết định giá
trị dinh dưỡng của nước mắm.
+ Đạm amoniac: càng nhiều nước mắm càng kém chất lượng.
Trong nước mắm các chất bay hơi rất phức tạp và quyết định đến hương vị của
nước mắm. Hàm lượng các chất bay hơi (mg) / 100 g nước mắm:
+ Các chất cacbonyl bay hơi: 407 - 512 (formaldehyde)
+ Các acid bay hơi : 104 - 533 (propionic)

+ Các acid amin bay hơi : 9,5 - 11,3 (izopropylamin)
+ Các chất trung tính bay hơi: 5,1 - 13,2 (acetaldehyde)
Các chất vô cơ trong nước mắm: NaCl chiếm 250 - 280 g/L và một số chất
khoáng như: S, Ca, Mg, P, I, Br. Vitamin : B1 ,B12 , PP.
Mùi trong nước mắm được hình thành chủ yếu do hoạt động của VSV yếm khí
trong q trình sản xuất nước mắm tạo ra.
Theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) 5107: 2018 về Nước mắm do Bộ Khoa học
và Công nghệ ban hành. Các yêu cầu cảm quan của nước mắm được qui định trong
bảng 2. Các chỉ tiêu hoá học của nước mắm, được qui định trong bảng 3. Chỉ tiêu
vi sinh vật của nước mắm, được qui định trong bảng 4.
Bảng 2. Yêu cầu cảm quan của nƣớc mắm

Tên chỉ tiêu

Yêu cầu
Đặc biệt

Thƣợng hạng

Hạng 1

1. Màu sắc

Từ nâu cánh gián đến nâu vàng

2. Độ trong

Trong, không vẩn đục

3. Mùi

4. Vị

Hạng 2

Thơm đặc trưng của nước mắm, khơng có mùi lạ
Ngọt đậm của
đạm, có hậu vị
rõ

Ngọt của đạm, Ngọt của đạm, ít
có hậu vị rõ
có hậu vị

5. Tạp chất nhìn
thấy mắt thường

Khơng được có
9

Ngọt của đạm,
khơng mặn chát


Bảng 3. Các chỉ tiêu hoá học của nƣớc mắm

Mức chất lƣợng
Thƣợng
Đặc biệt
Hạng 1 Hạng 2
hạng

Tên chỉ tiêu

1. Hàm lượng nitơ tồn phần, tính bằng g/L,
30
khơng nhỏ hơn
2. Hàm lượng nitơ axit amin, tính bằng % so
55
với nitơ tồn phần, khơng nhỏ hơn
3. Hàm lượng nitơ amơniac, tính bằng % so
20
với nitơ tồn phần, khơng lớn hơn
4. Hàm lượng axit, tính bằng g/L theo axit
8,0
axetic, khơng nhỏ hơn
5. Hàm lượng muối, tính bằng g/L, trong
245 - 280
khoảng

25

15

10

50

40

35

25

30

35

6,5

4,0

3,0

Bảng 4. Chỉ tiêu vi sinh vật của nƣớc mắm
Tên chỉ tiêu
1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1 mL
2. Coliforms, số khuẩn lạc trong 1 mL
3. E. Coli, số khuẩn lạc trong 1 mL
4. Cl.perfringens, số khuẩn lạc trong 1 mL
5. S. aureus, số khuẩn lạc trong 1 mL
6. Tổng số bào tử nấm men và nấm mốc, số khuẩn lạc trong 1
mL
2.2.3 Bản chất của quá trình sản xuất nƣớc mắm

260 – 295

Mức tối đa cho phép
105
102
0

10
0
10

Bản chất quá trình sản xuất nước mắm gồm 2 giai đoạn cơ bản là thủy phân
protein của thịt cá tới axit amin nhờ hệ enzyme protease, peptidase và giai đoạn tạo
mùi hình thành hương vị đặc trưng của nước mắm từ các sản phẩm phụ của quá trình
lên men (Lương Đức Phẩm, 2010).
Nghề nước mắm của nước ta hiện nay vẫn còn theo phương pháp cổ truyền, ở
mỗi địa phương có sự khác nhau một ít, nhưng quy trình sản xuất vẫn cịn thơ sơ và
thời gian kéo dài, hiệu quả kinh tế còn thấp. Cá linh được ủ với muối, sau 1-2 năm
đem ra nấu, lược, thu được nước mắm ăn. Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu từng
bước cơ giới hóa nghề nước mắm nhưng vẫn cịn nhiều hạn chế do sự ăn mòn của
muối đối với kim loại.
Hiện nay nước ta đang hiện hành một số phương pháp công nghệ sản xuất nước
mắm ở các địa phương như Cát Hải, Bình Thuận, Phú Quốc… nhưng chủ yếu có các
phương pháp chế biến nước mắm cổ truyền chính:
- Phương pháp đánh khuấy:
+ Cho muối nhiều lần.
+ Cho nước lã.
+ Đánh khuấy liên tục.
10


- Phương pháp gài nén:
+ Cho muối một lần hoặc nhiều lần
+ Không cho nước lã
+ Gài nén và không đánh khuấy
- Phương pháp hỗn hợp:
+ Kết hợp giữa 2 phương pháp gài nén và đánh khuấy.

+ Lúc đầu thực hiện phương pháp gài nén.
+ Sau đó thực hiện phương pháp đánh khuấy
Các phương pháp có một số điểm khác nhau về công nghệ nhưng nguyên lý là giống
nhau.
Các hệ enzyme trong sản xuất nƣớc mắm
* Hệ enzyme Metalo-protease (Aminodipeptidase)
Tồn tại trong nội tạng của cá và chịu được nồng độ muối cao nên ngay từ đầu nó đã
hoạt động mạnh, giảm dần từ tháng thứ 3 trở về sau. Loại enzyme này có hoạt tính
khá mạnh, có khả năng thủy phân rộng rãi đối với các loại peptid.
* Hệ enzyme serin-protease
Điển hình là enzym tripsin, tồn tại nhiều trong nội tạng của cá. Ở giai đoạn đầu của
quá trình sản xuất nước mắm hoạt động của nó yếu đến tháng thứ 2 và phát triển dần
đạt giá trị cực đại ở tháng thứ 3 rồi giảm dần đến khi chượp chín. Hệ enzyme này
ln bị ức chế bởi chuỗi axit amin trong cấu trúc của enzyme. Để tháo gỡ chuỗi này
phải nhờ đến hoạt động của men cathepsin B nhưng men cathepsin B dễ bị ức chế
bởi nồng độ muối cao. Vì vậy để men cathepsin B hoạt động được người ta thực hiện
phương pháp cho muối nhiều lần. Enzyme serin-protease hoạt động mạnh ở pH từ 510, mạnh nhất ở pH9.
*Hệ enzyme axit - protease
Có trong thịt và nội tạng cá, điển hình là enzyme cathepsin D. Hệ enzyme này dễ bị
ức chế bởi nồng độ muối khoảng 15% nên thường nó chỉ tồn tại một thời gian ngắn ở
đầu thời kỳ của quá trình thủy phân. Loại men này đóng vai trị thứ yếu trong q
trình sản xuất nước mắm.
Vi sinh vật trong sản xuất nƣớc mắm
- Nguồn gốc: có từ nguyên liệu, dụng cụ, thiết bị, mơi trường (khơng khí, nước). Khi
vi sinh vật xâm nhập vào chượp có các ảnh hưởng sau:
- Tham gia vào quá trình thủy phân protein nhưng rất yếu vì bị ức chế bởi nồng độ
muối cao.
- Tham gia tích cực vào việc hình thành hương vị của nước mắm, chủ yếu là các vi
sinh vật kỵ khí có khả năng sinh hương.
11

Nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình chế biến nƣớc mắm
- Nguyên liệu chuẩn: Cá linh phải đúng loại có độ đạm phù hợp, mau phân hủy, mùi
hương hợp khẩu vị truyền thống.
- Đúng mùa: cá linh khoảng cuối tháng 9 âm lịch sẽ có độ lớn vừa phải, cá béo và
ngon nhất.
- Công thức ướp truyền thống 4 cá : 1 muối, hoặc 3 cá : 1 muối. Nếu ít muối cá sẽ dễ
bị ươn, nhiều muối quá sẽ bị mặn.
- Kiểm soát màu, vị tự nhiên. Theo kinh nghiệm dân gian có thể cho thêm 1 phần trái
khóm gọt vỏ, xắt lát vào chượp, hoặc thêm một ít nước đường, mật ong vào có tác
dụng làm nước mắm có mùi thơm đặc trưng, màu đẹp và cân bằng độ mặn cho nước
mắm.
- Dụng cụ chứa đựng khạp sành, hay hũ thủy tinh phải vệ sinh sạch sẽ.
- Bảo quản và sử dụng. Trong thời gian ủ phải đậy kín tránh ruồi, chuột… Để ngồi
nắng. Nửa tháng khuấy đảo một lần cá sẽ mau phân hủy, chất lượng nước mắm đồng
đều.
2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU NƢỚC MẮM TRONG VÀ NGỒI NƢỚC
Nước mắm là món ăn truyền thống gắn liền với đời sống hàng ngày và mang
một bản sắc văn hóa rất riêng của dân tộc Việt Nam. Đặc biệt, tại mỗi địa phương
đều có những sản phẩm nước mắm mang hương vị đặc trưng cho vùng đó, như ở tỉnh
An Giang thì nước mắm cá linh được ủ, nấu là món đặc sản của địa phương, tuy
nhiên chưa được nhân lên thành thương hiệu ở quy mô công nghiệp do một số khó
khăn như nguồn cá tự nhiên chỉ có ở mùa lũ, thời gian ủ kéo dài từ 12 tháng đến 2
năm, độ đạm không cao, vị hơi mặn do phải ủ muối nhiều vì thời gian phân hủy cá
khá lâu. Một số nghiên cứu gần đây đã nghiên cứu các biện pháp để khắc phục các
nhược điểm của nước mắm truyền thống hiện nay.
Trong nước
Năm 1995, Nguyễn Bài và Nguyễn Thị Dự nghiên cứu “Sản xuất nước mắm
ngắn ngày bằng enzyme protease” đạt được kết quả là rút ngắn thời gian sản xuất còn

2 tháng, độ đạm tăng từ 8,3% lên 20,8% so với mẫu đối chứng và tăng 12% - 21% so
với TCVN. Chi phí sản xuất giảm nên giá thành sản phẩm giảm. Tuy nhiên, cơng
trình chưa được nhà sản xuất áp dụng nhiều do màu sắc kém tự nhiên, khả năng
xuống màu nhanh, hương vị rất kém. (Nguyễn Bài và cs, 1995)
Năm 2006, Lê Văn Việt Mẫn và Trần Thị Ánh Tuyết nghiên cứu đề tài “Khảo
sát một số tính chất của chế phẩm protease từ canh trường nuôi cấy bề mặt
Aspergillus oryzae và ứng dụng enzyme trong sản xuất nước mắm” cho thấy việc bổ
sung muối và chế phẩm protease nhiều lần vào chượp sẽ rút ngắn đáng kể thời gian
thủy phân cá, ức chế lây nhiễm vi sinh vật, duy trì hoạt tính của protease trong cá
trong suốt thời gian ủ, tăng hàm lượng axit amin trong nước mắm. (Lê Văn Việt Mẫn
và cs, 2006)
12