Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây đại hồng môn anthurium andreanum l bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY
ĐẠI HỒNG MƠN (Anthurium andreanum L.)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LỚP
MỎNG TẾ BÀO

Chủ nhiệm đề tài: Th.S. NGUYỄN THỊ THÚY DIỄM

An Giang, tháng 6 năm 2013


TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG
KHOA NÔNG NGHIỆP TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY
ĐẠI HỒNG MƠN (Anthurium andreanum L.)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LỚP
MỎNG TẾ BÀO

BAN GIÁM HIỆU

LÃNH ĐẠO ĐƠN VỊ
THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

Th.s. Nguyễn Thị Thúy Diễm

An Giang, tháng 6 năm 2013


NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG CÂY
ĐẠI HỒNG MƠN (Anthurium andreanum L.)
BẰNG PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LỚP
MỎNG TẾ BÀO


TĨM LƯỢC
Đề tài: “Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây Đại Hồng Môn (Anthurium andreanum
L.) bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào” được tiến hành nhằm mục đích xác
định qui trình vi nhân giống cây Đại Hồng Mơn. Các thí nghiệm bao gồm: (1) Kỹ thuật
cắt lớp mỏng ở các bộ phân khác nhau trên sự phát sinh cấu trúc (2) Sự phát sinh
cụm tiền chồi của cây Đại Hồng Mơn; (3) Quan sát hình thái cấu trúc giải phẩu của sự
phát sinh cụm tiền chồi và chồi; (4) Khảo sát quá trình nhân chồi; (5) Khảo sát quá
trình tạo rễ in vitro; (6) Khảo sát quá trình thuần dưỡng cây Đại Hồng Mơn in vitro
trong điều kiện nhà lưới. Kết quả cho thấy rằng môi trường thích hợp tạo mơ sẹo từ lá:
MS + 0,5 mg/l BA + 0,1 mg/l 2,4- D; mơi trường thích hợp tạo mô sẹo từ cuống lá là
MS + TDZ 0,5 mg/l + 2,4-D 0,5 mg/l; hoặc MS + TDZ 1 mg/l + 2,4-D 0,5 mg/l hoặc
MS + TDZ 1,5 mg/l + 2,4-D 0,5 mg/l và mơi trường thích hợp tạo mô sẹo từ đoạn thân
là MS + 1,0 mg/l TDZ + 0,5 mg/l 2,4-D hoặc môi trường nuôi cấy chứa MS + 1,5 mg/l
TDZ + 0,5 mg/l 2,4-D. Môi trường thích hợp tạo cụm tiền chồi từ mơ sẹo là: MS +
0,5 mg/l 2,4- D + 0,5 mg/l TDZ và mơi trường thích hợp nhân nhanh cụm tiền chồi: MS
+ 0,5 mg/l 2,4- D + 1,0 mg/l TDZ hoặc MS + 0,5 mg/l 2,4- D + 1,5 mg/l TDZ. Môi
trường thích hợp tạo chồi từ cụm mơ sẹo đoạn thân: MS + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l
TDZ hoặc MS + 0,5 mg/l NAA + 1,0 mg/l TDZ đạt 7 -9 chồi/cụm, mơi trường thích

hợp để nhân chồi: MS + 0,5 mg/l 2,4 – D + 0,2 mg/l TDZ cho hệ số nhân chồi cao nhất
đạt 17,44,3 chồi. Kết quả tạo cây hồn chỉnh trên mơi trường MS + 1g/l than hoạt tính +
15 mg/l Putrescine. Trong q trình thuần dưỡng cây Đại Hồng Môn in vitro, giá thể
mụn dừa kết hợp với tro trấu (1:1) cho tỷ lệ sống cao nhất (88,75%).
Từ các kết quả thí nghiệm, xây dựng được qui trình vi nhân giống cây Đại Hồng Mơn.
Từ khóa: Anthurium andreanum, vi nhân giống, nhân chồi, cắt lớp mỏng, mô
sẹo

i


MỤC LỤC
Trang
Tóm lược

i

Mục lục

ii

Danh sách bảng

iv

Danh sách hình

v

Danh sách chữ viết tắt

vi

CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU

1

A. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2

I. MỤC TIÊU

2

II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2

B. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2

I. ĐỐI TƯỢNG

2

II. PHẠM VI NGHIÊN CỨU

2

C. CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
I. CƠ SỞ LÝ LUẬN
1. Đặc điểm thực vật của cây Đại Hồng Môn

2
2
2

1.1. Nguồn gốc và sự phân bố

2

1.2. Đặc điểm thực vật

3

2. Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (thin cell layer)

3

2.1. Định nghĩa

3

2.2. Đặc điểm của hệ thống lớp mỏng tế bào

4

2. 3. Ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào

5

3. Cơ sở lý luận của sự nhân giống vơ tính

5

3.1. Tính tồn năng của tế bào thực vật

5

3.2 Khả năng tạo mô sẹo của tế bào trong nuôi cấy mô

5

4. Các phương pháp nhân giống cây Đại Hồng Môn

7

4.1. Phương pháp nhân giống bằng hạt

7

4.2. Phương pháp nhân giống bằng tách cây hoặc giâm cành

7

4.3. Phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống)

7

5. Phương pháp vi nhân giống

8

5.1. Các giai đoạn của vi nhân giống

8

5.2. Ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng thực vât

10
ii


5.3. Các điều kiện khác trong mơi trường có ảnh hưởng lên mơ cấy

12

5.4. Hiện tượng hố nâu ở mẫu cấy

14

5.5. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Đại Hồng Môn

14

II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

15

1. Phương tiện nghiên cứu

15

1.1. Vật liệu thí nghiệm

15

1.2. Điều kiện thí nghiệm

15

1.3. Địa điểm và thời gian thí nghiệm

15

2. Phương pháp nghiên cứu

16

2.1. Mơi trường ni cấy

16

2.2. Bố trí thí nghiệm

17

2.2.1. Sự phát sinh hình thái ở các bộ phận khác nhau của

cây Đại Hồng Môn bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng
2.2.2. Sự phát sinh cụm tiền chồi của cây Đại Hồng Môn

17
19

2.2.3. Quan sát hình thái cấu trúc giải phẩu của sự phát sinh
cụm tiền chồi và chồi

20

2.2.4. Nhân chồi

20

2.2.5. Tạo rễ in vitro

21

2.2.6. Thuần dưỡng cây Đại Hồng Môn in vitro trong điều kiện nhà lưới 22
2.3 Xử lý số liệu
CHƯƠNG 2: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ PHÂN TÍCH KẾT QUẢ

23
24

I. Sự phát sinh hình thái ở các bộ phận khác nhau của
cây Đại Hồng Môn bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng

24

II. Sự phát sinh cụm tiền chồi của cây Đại Hồng Mơn

33

III. Quan sát hình thái cấu trúc giải phẩu của cụm tiền chồi và chồi

36

IV. Nhân chồi

38

V. Tạo rễ in vitro

42

VI. Thuần dưỡng cây Đại Hồng Môn in vitro trong điều kiện nhà lưới

44

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

47

A. KẾT LUẬN

47

B. ĐẾ NGHỊ

47

TÀI LIỆU THAM KHẢO

49

PHỤ CHƯƠNG

55

iii


DANH SÁCH BẢNG
Bảng

Tựa bảng

1.1 Thành phần môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)

Trang
16

2.1 Tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lát cắt của lá non
ở thời điểm 8 TSKC

25

2.2 Tỷ lệ mẫu sống và tỷ lệ mẫu tao mô sẹo từ lát cắt của cuống lá

ở thời điểm 8 TSKC

27

2.3 Tỷ lệ sống và tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo của lát cắt đoạn thân
ở thời điểm 8 TSKC

29

2.4 Sự phát sinh chồi của lát cắt đoạn thân ở thời điểm 8 TSKC

31

2.5 Tỷ lệ tạo cụm tiền chồi ở thời điểm 4 tuần sau khi cấy

33

2.6 Đường kính của cụm tiền chồi ở thời điểm 4 tuần sau khi cấy

34

2.7 Sự gia tăng kích thước của cụm tiền chồi ở thời điểm 8 TSKC

35

2.8 Sự gia tăng số chồi bên ở thời điểm 4 TSKC

38

2.9 Sự gia tăng số chồi và chiều cao chồi ở thời điểm 8 tuần sau khi cấy

40

2.10 Sự gia tăng chiều cao, số lá và số rễ của chồi cây Đại Hồng Môn in vitro
ở thời điểm 8 tuần sau khi cấy
2.11 Tỷ lệ sống của cây Đại Hồng Môn (%) sau 4 tuần thuần dưỡng

42
45

iv 
 


DANH SÁCH HÌNH
Hình

Tựa hình

Trang

1.1. Cây Đại Hồng Mơn (Anthurium andreanum L.)

3

1.2. Con đường tổng hợp polyamine ở thực vật

12

2.1. Mô sẹo được tạo ra từ lát cắt lá non trên mơi trường MS có bổ sung

0,5mg/l BA và 0,1 mg/l 2,4 - D ở 8 tuần sau khi cấy

25

2.2. (A) Chồi hình thành từ mơ sẹo trên mơi trường MS có bổ sung 0,1
mg/l 2,4 – D và 1,0 mg/l BA ở 12 TSKC; (B) Lát cắt ngang của
khối mô sẹo phát sinh từ lá.

26

2.3. Mô sẹo được tạo ra từ cuống lá cây Đại Hồng Môn ở 8 TSKC trên
môi trường nuôi cấy MS bổ sung l,0 mg/l TDZ và 0,5 mg/l 2,4 – D.

28

2.4. (A) Chồi hình thành từ mơ sẹo trên mơi trường MS có bổ sung 0,5
mg/l 2,4 – D và 0,5 mg/l TDZ ở 12 TSKC; (B) Rễ xuất hiện trên
môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4 – D và 1,0 mg/l TDZ ở 12
TSKC

28

2.5. Mô sẹo tạo ra cùng với sự phát triển của chồi bên trên môi trường
MS bổ sung 0,5 mg/l 2,4 – D và 1,5 mg/l TDZ ở 8 TSKC

30

2.6. (A) Chồi được tạo ra từ lớp mỏng của đoạn thân ở 8 TSKC trên môi
trường nuôi cấy chứa MS + 0,1mg/l 2,4-D + 0,5mg/l BA;
(B) MS + 0,5 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l TDZ

32

2.7. Cụm tiền chồi và chồi bên được tạo ra từ mô sẹo trên môi trường MS
kết hợp với 0,5 mg/l 2,4 – D và 0,5 mg/l TDZ ở 4 TSKC

34

2.8. Cụm tiền chồi được nhân lên trên môi trường môi trường MS + 0,5
mg/l 2,4 – D + 1,0 mg/l TDZ ở 8 TSKC

36

2.9. Cấu trúc giải phẩu của lát cắt ngang của chồi.

37

2.10. (A, B). Cấu trúc giải phẩu của lát cắt ngang của cụm tiền chồi; (a)
lá mầm; (b) vùng mô phân sinh chồi, thanh ngang 1mm

37

2.11. Cụm chồi hình thành từ mơ sẹo trên môi trường MS + 0,5 mg/l
NAA + TDZ (A) MS + NAA 0,5 mg/l ; (B) MS + NAA 0,5 mg/l +
TDZ 0,5 mg/l; (C) MS + NAA 0,5 mg/l + TDZ 1,5 mg/l; (D) MS +
NAA 0,5 mg/l + TDZ 1,0 mg/l, thanh ngang 1 cm.

39

2.12. Chồi cây Đại Hồng Môn được nhân lên trên môi trường MS có bổ

sung 2,4- D 0,5 mg/l kết hợp với 0,2 mg/l TDZ sau 8 tuần nuôi cấy,
thanh ngang 1 cm

41

2.13. Sự hình thành rễ của cây Đại Hồng Mơn ở 8 TSKC

43

2.14. Hiệu quả của các loại giá thể lên sự phát triển của cây Đại Hồng
Môn ở 4 TSKT

45

3.1.

Quy trình vi nhân giống cây Đại Hồng Mơn
(Anthurium andreanum L.)

48
v 

 


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
2,4 – D : Acid 2,4 Diclorophenoxy acetic
BA

: Benzyl Adenin

CĐHSTTV : Chất điều hoà sinh trưởng thực vật
MS
NAA

: Murashige & skoog (1962)
: Naphthalene acetic acid

NSKC : Ngày sau khi cấy
TCL

: Thin cell layer

lTCL

: longitudinal TCL

tTCL

: transverse TCL

TDZ

: Thidiazuron

TSKC : Tuần sau khi cấy

vi 
 

CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU
Ngày nay, cuộc sống của con người ngày càng được nâng cao, nhu cầu chơi hoa cắt
cành và hoa chậu ngày càng tăng, trong đó hoa cắt cành có vị trí quan trọng vì nhu cầu
về hoa chưng trong gia đình cũng như trang trí ở các nhà hàng, khách sạn, công sở và
các nơi công cộng khác là rất lớn. Nguồn cung cấp hoa cắt cành cho thị trường trong
nước hiện nay chủ yếu từ Đà Lạt và một số vùng khác như Hà Nội, Hải Phòng, TP Hồ
Chí Minh… Tại ĐBSCL, những vùng trồng hoa nổi tiếng như Sa Đéc (Đồng Tháp), Cái
Mơn (Bến Tre), làng hoa Bà Bộ quận Ninh Kiều (Cần Thơ), vùng trồng hoa ở phường 9
và Mỹ Phong (Mỹ Tho)…thường trồng hoa bán trong các dịp cúng kiếng và nhất là vào
dịp tết hàng năm đã cung cấp cho thi trường nhiều loại hoa hồng, cúc, vạn thọ…Sản
phẩm hoa kiểng ở miền tây chưa có hoa cắt cành như hồng mơn, layơn, hồng…mà vẫn
lấy từ Đà Lạt, mặc dù vẫn có thể trồng được các loại hoa này.
Hồng Mơn là một lồi hoa đẹp, sang trọng và đa dạng về màu sắc. Ngồi ra, do cây có
dáng đẹp, hoa lâu tàn (2 - 3 tháng), cây chịu rợp nên dùng để trang trí trong nội thất và
sân vườn thiếu ánh sáng rất thích hợp. Hiện nay, cây Đại Hồng Mơn được nhiều nước
trên thế giới trồng với diện tích lớn để cắt hoa bán như: Hà Lan, Ðức, Philippine, Ðài
Loan ...(Nguyễn Xuân Linh và Nguyễn Thị Kim Lý, 2005). Nguồn lợi đem lại từ cây
Hồng Môn là khá lớn so với cây hoa cắt cành khác. Tại Maurititus người ta có thể thu
được 225.000 bông hoa thương phẩm/ha/năm. Lãi suất đạt được trên một bông là 11,25 Rs (Ruspi). Một năm lợi nhuận thu được tối thiểu 225.000Rs tương đương 500 700 triệu/năm (Amon, 1989). Ở Đà Lạt, mơ hình trồng hoa hồng môn, phong lan, cà
phê, rau má, rau dấp cá của người dân đang là một trong những mơ hình rất hiệu quả
một năm thu khỏang 150 - 200 triệu đồng/ ha, tạo công ăn việc làm cho người lao động
thường xun với mức lương 700.000 đ/tháng. Mơ hình này đã được nhân rộng và rất
thành công (Long dinh, 2006).
Ở Việt Nam, cây Hồng Mơn có hai loại. Loại cây nhỏ gọi là Tiểu Hồng Môn và loại cây
lớn gọi là Đại Hồng Môn. Cây Đại Hồng Môn (Anthurium andreanum L.) được trồng
nhiều ở Đà Lạt như loại cây trồng để thu hoạch hoa cắt cành. Cây Đại Hồng Môn có
thể nhân giống bằng các phương pháp truyền thống như cắt đoạn, tách mầm, gieo bằng
hạt nhưng các phương pháp nhân giống như thế cho số lượng cây con rất hạn chế và cần

nhiều thời gian mới đáp ứng được nhu cầu của người tiêu dùng (1 năm chỉ cho 1-3
mầm/cây). Phương pháp nhân giống thông thường không cho kết quả tốt và để tạo được
lượng lớn sản phẩm chất lượng cao, cây Đại Hồng Môn cần được nhân giống in vitro.
Nhiều nghiên cứu về nhân giống hồng môn in vitro đã thực hiện như phương pháp nhân
giống thông qua tạo callus từ hạt (Pierik et al., 1974; Teresa et al., 2004), phương pháp
nuôi cấy chồi (Kunisaki, 1980; George, 1996), nghiên cứu tạo chồi nách và chồi bất
định (Geier, 1987), nghiên cứu tạo phơi vơ tính (Đồn Duy Thanh et al., 2003), tái sinh
cây Anthurium sp. thông qua tạo callus từ lá (Dương Tấn Nhựt et al., 2004; Nguyễn Thị
Lý Anh et al., 2005).
Trong vi nhân giống, phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào (Thin cell layer – TCL) là
kỹ thuật cho phép kiểm sốt điều kiện ni cấy một cách dễ dàng do nồng độ hormone
nội sinh của mẫu thấp. Sự phân cực của các tế bào trong lớp mỏng tế bào giảm, tạo
được nhiều chồi hơn, do đó hệ số nhân chồi cao. Ngồi ra, mức độ biến dị thấp và tạo
điều kiện nhân nhanh các giống cây trồng. Những nghiên cứu nhân giống cây Đại Hồng
Môn ở nước ta bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào còn rất hạn chế. Xuất phát
1


từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu quy trình vi nhân giống cây Đại Hồng
Mơn (Anthurium andreanum L.) bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào” nhằm
mục đích xây dựng quy trình vi nhân giống cây Đại Hồng Môn.
A. MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
I. MỤC TIÊU
Xác định quy trình thích hợp để vi nhân giống cây Đại Hồng Môn (Anthurium
andreanum L.) bằng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào.
II. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Thực hiện nuôi cấy và nhân giống cây Đại Hồng Môn trong điều kiện in vitro, gồm các
bước sau:
- Xác định hiệu quả của sự kết hợp nồng độ auxin và cytokinin lên sự phát sinh hình
thái từ kỹ thuật cắt lớp mỏng ở các bộ phận khác nhau của cây Đại Hồng Môn.

- Xác định hiệu quả của sự kết hợp auxin và cytokinin lên sự tạo cụm tiền chồi và
nhân nhanh cụm tiền chồi.
- Ảnh hưởng của sự kết hợp auxin và cytokinin lên sự tạo chồi từ mô sẹo
- Hiệu quả của auxin và cytokinin lên sự nhân chồi của cây Đại Hồng Môn.
- Xác định nồng độ thích hợp của Putrescine lên sự tạo rễ của cây Đại Hồng Môn.
- Hiệu quả của các loại giá thể lên sức sống của cây con Đại Hồng Môn
B. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
I. ĐỐI TƯỢNG
Đề tài được thực hiện trên đối tượng cây Đại Hồng Môn (Anthurium andreanum L.).
Vật liệu dùng để nuôi cấy là các bộ phận của cây Đại Hồng Môn in vitro được duy trì
tại Phịng Thí nghiệm ni cấy mơ Bộ nơn Sinh lý Sinh hố, Khoa Nơng nghiệp Và
Sinh học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
II. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Vi nhân giống cây Đại Hồng Môn bằng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào trong điều
kiện in vitro và thuần dưỡng cây con trong nhà lưới.
Thí nghiệm được thực hiện tại phịng ni cấy mơ và nhà lưới thực nghiệm của tổ Sinh
Lý Thực Vật, Bộ môn Sinh Lý Sinh Hố, khoa Nơng nghiệp và Sinh học Ứng Dụng,
Trường Đại học Cần Thơ, từ tháng 3-2011 đến tháng 3-2012.
C. CƠ SỞ LÝ LUẬN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
I. CƠ SỞ LÝ LUẬN
1. Đặc điểm thực vật của cây Đại Hồng Môn
1.1. Nguồn gốc và sự phân bố
Cây Hồng Môn (Anthurium sp.) là giống cây lớn thuộc họ mơn (Araceae), có hơn 100
giống với khoảng 1.500 loài, bao gồm các loài nổi tiếng được trồng như Anthurium
scherzerianum và Anthurium andreanum. Hồng Mơn có nguồn gốc từ Trung và Nam
Mỹ, cụ thể là từ Columbia, Peru, Brazil và Venezula (Suryanarayana, 2005). Hiện nay,
Anthurium andreanum đã được trồng ở nhiều nước như Mỹ, Hà Lan, Nhật, Đài Loan,
2

Philippin (Nguyễn Xuân Linh & Nguyễn Thị Kim Lý, 2005). Ở Việt Nam, Hồng Môn
được gọi với nhiều tên gọi khác nhau: buồm đỏ, vĩ hoa, hoa chúc,…
1.2. Đặc điểm thực vật
Thân: Cây Đại Hồng Môn là cây thân cỏ sống nhiều năm, cao 50 – 70 cm. Thân có thể
đứng hay leo, có khả năng phân nhánh. Thân có nhiều đốt, càng già thân càng cứng
(Jiang Qing Hai & Trần Văn Mão, 2004).
Rễ: thuộc loại rễ chùm ít ăn sâu, phát triển theo chiều ngang. Thường cây có nhiều rễ
phụ mọc ra từ các đốt thân (Nguyễn Xuân Linh & Nguyễn Thị Kim Lý, 2005).
Lá: có hình bầu dục dài dạng quả tim, mặt trên lá màu xanh khá trơn láng, mặt dưới
nhạt màu hơn. Lá có cuống dài, mọc từ gốc cây và sắp xếp theo kiểu xoắn ốc (Nguyễn
Xuân Linh & Nguyễn Thị Kim Lý, 2005).
Hoa: Cuống hoa mọc từ giữa cây. Hoa được mang trên một cọng dài khoảng từ 40 cm
đến 1 m tùy theo cây lớn hay nhỏ, trên đầu cọng hoa có một cọng hoa gần giống trái tiêu
lốt (bông mo), dài khoảng 3 - 4 cm. Ðặc biệt, hoa này có một bao gọi là mo, mo có dạng
bầu dục, đường kính khoảng từ 8 - 15 cm có màu đỏ sặc sỡ, khi cịn non nó cuộn trịn
lại (Suryanarayana, 2005). Hoa tập trung dày đặc thành cụm. Hoa tươi lâu 2-3 tháng
(Hình 1.1).

1 cm
Hình 1.1. Cây Đại Hồng Mơn (Anthurium andreanum L.)
Theo Suryanarayana (2005) cây Đại Hồng Mơn có nguồn gốc từ các vùng nhiệt đới nên
nó có tập tính ưa nhiệt độ cao. Nhiệt độ sinh trưởng thích hợp nhất từ 25 - 320C. Ở nhiệt
độ trên 320C cây vẫn sinh trưởng và phát triển được nhưng lá có thể bị cháy, màu sắc
hoa và tuổi thọ hoa giảm.
Mặc dù là cây nhiệt đới nhưng Đại Hồng Môn sinh trưởng và phát triển tốt nhất trong
mơi trường nửa râm. Vì vậy, nơi trồng Hồng Môn phải được che sáng (khoảng 60 – 70
% ánh sáng tự nhiên), tránh thừa ánh sáng. Nhiều ánh sáng sẽ làm phai màu hoa và lá, lá
có thể bị cháy và làm chậm sự phát triển của cây. Ẩm độ thích hợp để cây sinh trưởng
và phát triển khoảng 70 – 80% (Suryanarayana, 2005).

3


2. Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (thin cell layer)
2.1. Định nghĩa
Hệ thống lớp mỏng tế bào (TCL) bao gồm các mẫu mơ có kích thước nhỏ được thu thập
từ các cơ quan khác nhau của thực vật (thân, lá, rễ, cụm hoa), chồi hoa, các cơ quan của
hoa, mô phân sinh, đỉnh sinh trưởng hoặc phôi…).
Tran Thanh Van (1973), đã sử dụng kỹ thuật cắt lát mỏng để cắt mẫu trong nuôi cấy
mô, kết quả cho thấy: mẫu cắt theo chiều dọc (lTCL - longitudinal TCL) mô lá non thu
được một loại mô như là một lớp mơ chứa tế bào biểu bì, cắt mẫu theo chiều ngang (
tTCL - transverse TCL) thu được một số ít tế bào từ các mơ khác nhau như: biểu bì, vỏ,
tầng phát sinh gỗ và lõi, các tế bào nhu mơ. Ngun tắc sử dụng kích cỡ mẫu lTCL và
tTCL như sau: các mẫu lTCL có kích cỡ 0,5x1x10 mm, trong khi các mẫu tTCL có thể
0,2-0,5 mm hay dày vài mm.
Ngồi ra, cịn có hệ thống TCL chỉ dày vài micromete (µTCL) phải sử dụng máy vi
phẫu để cắt, nhưng ở kích cỡ này mẫu dễ dàng bị chết hoặc bị nhiễm khuẩn.
2.2. Đặc điểm của hệ thống lớp mỏng tế bào
Đặc điểm chung của lTCL và tTCL là chúng rất mỏng, nghĩa là một mẫu cấy có càng ít
tế bào càng tốt. Đặc điểm “mỏng” này là một trong những điều quan trọng vì các phân
tử maker của các q trình biệt hóa có thể định vi in situ trong các tế bào mục tiêu hay
trong các tế bào cảm ứng. Quá trình định vị này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng
không mong muốn.
Trong quá trình cắt mẫu làm mơ thực vật bị tổn thương, nhiều enzyme hoặc
polysaccharide sinh ra rất cần cho quá trình cảm ứng sự sinh trưởng và phát triển của
thực vật. Việc ứng dụng vài tế bào trong hệ thống TCL là do chúng có quan hệ với các
tế bào bị thương (nơi xảy ra tổng hợp cấu tạo vách tế bào mới và nơi phóng thích của
oligosacharide) và chất dinh dưỡng cùng với các yếu tố khác ở bên trong mơi trường để
kiểm sốt sự phát sinh hình thái. Do đó, phương pháp này cho thấy mẫu cấy khá phụ
thuộc vào môi trường. Ngược lại, việc sử dụng các mẫu cấy lớn hơn (thân và các mảnh

lá) cho thấy sự phân cực mạnh trong phản ứng với mơi trường, có thể do chúng chứa
các hợp chất nội sinh cao, bao gồm các chất điều hòa sinh trưởng thực vật nên chúng
không phụ thuộc nhiều vào môi trường.
Sử dụng một tế bào hay tế bào trần, sau khi được tách ra chúng tạo nên vách tế bào và
hình thành nên cụm tế bào mới với tổ chức không gian và thời gian khác biệt với tổ
chức trước khi tiến hành quá trình tách ra từ mơ hay các cơ quan. Mặt khác, trong quá
trình phát triển của các tế bào đơn hay tế bào trần có sự hình thành một số lượng nhỏ
mô sẹo, phôi soma trộn lẫn tế bào. Ngược lại, hệ thống TCL có sự hình thành những
thành phần đó với số lượng lớn hơn. Các mẫu được tạo ra trong hệ thống TCL có cùng
chức năng, mang thong tin di truyền giống nhau, cảm ứng như nhau trong điều kiện
nuôi cấy (ánh sáng, nhiệt độ, pH, môi trường ni cấy và các chất bổ sung như chất điều
hịa sinh trưởng, nước dừa, .. (Tran Thanh Van, 1973; Tran Thanh Van et al., 1974;
Tran Thanh Van, 1980; Tran Thanh Van, 1985; Tran Thanh Van, 2000). Bên cạnh đó,
việc sử dụng hệ thống TCL rút ngắn được thời gian phát sinh hình thái (trung bình
khoảng 14 ngày sau khi cấy). Tần suất cũng khá cao, gần 100% mẫu có phản ứng. Mật
độ của các cơ quan được thiết lập trước, do đó tỉ số giữa số lượng tế bào cảm ứng và tế
bào hiện diện trên mẫu TCL là rất cao.

4


Tần suất cao kết hợp với thời gian phát sinh hình thái ngắn và sự trực tiếp trong quá
trình hình thành cơ quan và phôi đã được khẳng định trên các lồi như: sử dụng mẫu
tTCL của Garcinia mangostana có 3mm cho hiệu quả cao hơn 50 lần so với mẫu nữa
lá) (Goh et al., 1990), Lilium longiflorum (Dương Tấn Nhựt et al., 2006), Begonia
tuberous (Dương Tấn Nhựt et al., 2005; Dương Tan Nhut et al., 2006; Mai Xuân Phán
et al., 2005),…
2. 3. Ứng dụng phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào
Cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) là đối tượng được nghiên cứu đầu tiên trong in vitro
thông qua kỹ thuật cắt lớp mỏng tế bào (Tran Thanh Van, 1973). Bốn chương trình phát

sinh hình thái thành lập hoa trực tiếp, thành lập chồi trực tiếp, thành lập rễ trực tiếp và
callus không phát sinh cơ quan được cảm ứng từ mẫu lTCL có kích cỡ 1mm x 10 mm
thu từ cánh hoa, sau đó ni cấy trên mơi trường rắn MS (Murasshige Skoog, 1962) có
bổ sung đường và các chất điều hòa sinh trưởng ở nồng độ khác nhau trong cùng điều
kiện (Tran Thanh Van, 1980).
Cây hoa Lily (Lilium longiflorum) là một trong những loài hoa cắt cành đẹp, giá trị kinh
tế cao. Tuy nhiên, phương pháp nhân giống Lily bằng vảy củ (Stimart & Ascher, 1978)
cũng như hệ thống vi nhân giống truyền thống đã không mang lại hiệu quả cao, ngay cả
các loài khác trong giống Lilium (Priyadarshi & Sen, 1992). Điều này đã thúc đẩy mạnh
các nghiên cứu sâu hơn về hệ thống TCL trên cây hoa Lily nhằm khắc phục các nhược
điểm trên.
Cây hoa Cúc (Dendranthema grandiflora): Hệ thống TCL cũng được sử dụng trong các
nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiều thành phần bổ sung thêm vào mơi trường như
đường, chất điều hịa sinh trưởng, chất kháng sinh và các điều kiện ảnh hưởng đến khả
năng tái sinh và phát sinh hình thái trên cây hoa Cúc. Teixeira da Silva & Fukai (2003),
đã tái sinh rễ, chồi và phôi soma khi nuôi cấy các tTCL của đốt thân cây hoa Cúc trên
các môi trường khác nhau.
African violet (Saintpaulia ionantha) là lồi hoa đẹp, có giá trị kinh tế cao. Hệ thống
TCL áp dụng trên hoa African violet nhằm làm phát sinh trực tiếp các cơ quan như chồi
sinh dưỡng, callus, rễ, phôi soma,…Ohki (1994), thay đổi tỷ lệ auxin/cytokinin (NAA /
BA hoặc TDZ) trên môi trường nuôi cấy thông qua hệ thống TCL, cho thấy mẫu tTCL
thu nhận từ cuống lá đến gân lá có kích thước 0,3 – 0,5 mm hoặc các phiến lát mỏng có
kích thước 3 x 3 mm cho từ 100 – 200 chồi/mẫu trong 4 tuần nuôi cấy. Hơn 70000 cây
được tái sinh từ lá trong khoảng 3- 4 tháng.
3. Cơ sở lý luận của sự nhân giống vô tính
3.1. Tính tồn năng của tế bào thực vật
Thực vật được nhân giống bằng cả hai hình thức hữu tính và vơ tính. Sinh sản vơ tính
(vegetative reproduction) như giâm cành, chiết cây…do không qua phân bào giảm
nhiễm nên giữ nguyên đặc tính di truyền của cây mẹ, tương đối thơng dụng ở nhiều loại
cây và là q trình chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố nội bào cũng như các yếu tố bên

ngồi.
Sự nhân giống vơ tính (vegetative propagation) dựa trên lý thuyết về tính tồn thế
(totipotency) của tế bào, do hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden & Schwann phát biểu
năm 1838 với nội dung: tế bào có cấu trúc bao gồm các cơ quan thực hiện tất cả các
chức năng sống và mang toàn bộ mật mã di truyền của cơ thể, đây là những đơn vị độc
lập, có thể xây dựng lại tồn bộ cơ thể từ những thơng tin di truyền mà nó đã mang
5


(Nguyễn Văn Uyển et al.,1993). Như vậy, mỗi tế bào bất kỳ đều có khả năng tiềm tàng
để phát triển thành cơ thể hồn chỉnh.
3.2 Khả năng tạo mơ sẹo của tế bào trong nuôi cấy mô
Các nghiên cứu về nhân vơ tính thực vật bằng ni cấy mơ (ni cấy in vitro) được xem
như khởi đầu từ năm 1902, khi Haberlandt tin rằng có thể tạo thành cơng các phôi nhân
tạo từ các tế bào sinh dưỡng đã phân hóa bằng con đường nhân tạo và cấy thử các tế bào
tách từ lá một vài loại cây đơn tử diệp (Nguyễn Văn Uyển et al.,1993; Lê Trần Bình et
al., 1997; Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002). Thí nghiệm khơng thành
cơng vì ngày nay người ta biết các cây đơn tử diệp đa số rất khó ni cấy.
Năm 1922, Robbins lặp lại thí nghiệm ni cấy trên đối tượng là mơ phân sinh đầu rễ
cây hịa thảo và đã đạt kết quả khả quan hơn: các rễ sinh trưởng mạnh trong một thời
gian (Nguyễn Văn Uyển et al.,1993). Sau đó, nhiều thành cơng liên tiếp được ghi nhận
và nhất là từ sau khi có sự phát hiện vai trị của các chất điều hồ sinh trưởng cùng với
sự hỗ trợ của các thiết bị khoa học ngày càng tiến bộ đã giúp cho kỹ thuật nuôi cấy mơ
có điều kiện gặt hái nhiều thành cơng. Từ thập niên 1980 trở đi, người ta đã nuôi cấy
thành công nhiều loại cây từ những bộ phận khác nhau như mô lấy từ thân, chồi, rễ, hoa,
lá, hạt phấn..., và ni cấy tách rời các tế bào để sau đó tái sinh thành cây hoàn chỉnh.
Phạm Hoàng Hộ (1966), quá trình phân hóa này chính là sự biệt hóa (chun hóa) của tế
bào, muốn tái sinh cây từ mơ hay tế bào đã biệt hóa cần phải trải qua hai giai đoạn phản
biệt hóa và tái biệt hóa, quan trọng nhất là phải tạo điều kiện cho mô đã phân hóa thực
hiện sự phản biệt hóa để trở lại trạng thái chưa phân hóa là tế bào phơi, giống như trạng

thái của tế bài trứng lúc mới thụ tinh, sau đó là sự hình thành các phơi vơ tính. Sự xáo
trộn trong quá trình tạo cơ quan là cơ sở để hình thành mơ sẹo.
Trong tự nhiên, sự phản biệt hóa thường khơng xảy ra ở các tế bào đã phân hóa như
mạch gỗ, cương mơ. Tế bào nhu mơ đã chuyên hóa nửa chừng cũng khó phản biệt hóa,
chỉ có ở tượng tầng có thể xảy ra hiện tượng này, nhưng khi bị thương hay có tế bào bị
chết, cây có phản ứng tự vệ tiết “hormon bị thương” - các enzim do glyoxysom tạo ra
làm tăng sự phân giải chất dự trữ tạo nguyên liệu cho qúa trình hô hấp giúp tế bào tăng
sinh nhanh ( Hall et al., 1984). Những tế bào đã phản biệt hóa xong trong điều kiện ni
cấy thích hợp sẽ tái biệt hóa trở lại để phát triển thành cơ thể mới với trình tự giống như
sự phát triển từ tế bào phơi thành cây con.
Theo Phạm Hồng Hộ (1966), có thể tạo ra một thực vật mới bằng cách cấy tế bào của
nhiều loại mơ đã biệt hóa như biểu bì, nhu mơ. Như vậy, vẫn có thể tái sinh các tế bào
đã biệt hóa thành cây trong những điều kiện nhất định. Nhiều kết quả nghiên cứu trong
nuôi cấy mô cho thấy có thể kích thích mơ sẹo phát triển và tạo phơi vơ tính đã được
báo cáo trong các thí nghiệm của Nguyễn Thị Quỳnh et al. (1993) khi nghiên cứu cấy
tái sinh cây cà phê từ mô lá, Tanaka & Hasegawa (1975) cấy tái sinh cây lan
Phalaenopsis từ các mảnh lá không chứa mầm. Trên khoai lang, Nguyễn Tiến Thịnh et
al. (1993) đã sử dụng đỉnh sinh trưởng và các mầm lá (meristem, leaf primordia) để tạo
phơi vơ tính.
Tuy mang cùng một lượng thông tin di truyền như nhau nhưng các loại mơ trên cùng
cây có thể cho phản ứng khác nhau trên cùng môi trương nuôi cấy, cụ thể là khả năng
hình thành mơ sẹo, sự tái sinh của các bộ phận được cấy thành chồi, rễ...cũng rất khác
nhau. Do đó, việc chọn đúng loại mơ để cấy là rất quan trọng, vì chọn được mơ thích
hợp sẽ dễ tác động cho sự phát triển của mô khi được đưa vào môi trường. Theo
Nguyễn Văn Uyển et al. (1993), các mô đang phát triển mạnh như mô phân sinh ngọn,
6


mô tượng tầng, mô phân sinh đầu rễ, phôi đang phát triển, thịt quả non, lá non, đế hoa,
mô phân sinh đốt,...khi đặt vào mơi trường có chứa một lượng chất điều hồ sinh trưởng

thích hợp đều có khả năng tái tạo thành mô sẹo. Như vậy , mô sẹo có thể hình thành từ
nhiều bộ phận trong cây.
Mơ sẹo có khả năng tái sinh phơi rất biến động và tùy thuộc vào nhiều yếu tố: do đặc
tính của lồi và do ảnh hưởng mơi trường bên ngồi, chủ yếu là do thành phần các
hormone thực vật. Nguyễn Văn Uyển et al. (1993), hình dáng và cấu trúc của mơ sẹo là
những tế bào nhu mơ khơng có tổ chức hay là một khối vơ định hình cuả các tế bào nhu
mơ có vách mỏng, được sắp xếp lỏng lẻo (Nguyễn Bảo Tồn, 2004). Cịn xét về mặt
chức năng thì mô sẹo là một tổ chức tế bào không phân hóa (Nguyễn Đức Thành, 2000).
Mơ sẹo khi hình thành sẽ gồm hai loại: (1) Loại xốp: chứa nhiều tế bào xốp với nhân
nhỏ, tế bào chất lỗng và khơng bào to, khó tái sinh. (2) Loại cứng: có màu xanh nâu,
cấu trúc chặt, nhân to, tế bào chất đậm đặc và khơng bào nhỏ có thể tái sinh phơi.
4. Các phương pháp nhân giống cây Đại Hồng Môn
4.1. Phương pháp nhân giống bằng hạt
Suryanarayana (2005), nhân giống bằng hạt cần có thời gian dài và phải tiến hành thụ
phấn nhân tạo mới cho hạt. Quả được hình thành trên bơng mo khoảng vài tháng sau khi
thụ phấn và 8 – 9 tháng sau mới chín, trong mỗi quả mọng có chứa một hoặc hai hạt.
Hái hạt xong gieo ngay, sau khi gieo phải tưới nước và che ẩm, sau 8 – 10 ngày hạt nẩy
mầm. Cây con trồng khoảng 3- 4 năm mới ra hoa. Mặt khác, số lượng cây con gieo từ
hạt được tạo ra ít và thường có kiểu gen khơng đồng nhất nên trong sản xuất ít sử dụng.
Và phương pháp này thường được sử dụng trong chọn tạo giống hoa (Nguyễn Xuân
Linh & Nguyễn Thị Kim Lý, 2005).
4.2. Phương pháp nhân giống bằng tách cây hoặc giâm cành
Nguyễn Xuân Linh & Nguyễn Thị Kim Lý (2005), cây Đại Hồng Mơn cũng có thể nhân
giống bằng cách tách các nhánh hoặc cắt các đoạn cành, đoạn thân, nhân lên thành cây
mới.
Nhằm gia tăng số lượng cây con tạo ra trong nhân giống, chất điều hòa sinh trưởng cũng
được sử dụng để kích thích sự hình thành cây con. Suryanarayana (2005), nhân giống
bằng tách cây đã sử dụng gibberellic acid ở nồng độ 100 đến 250 mg/l để kích thích tạo
rễ hình thành cây con. Trong tự nhiên, cây Đại Hồng Môn sinh sản bằng cách nẩy chồi,
mỗi cây tách ra phải đảm bảo 3- 4 chồi, nhưng 1 năm cây chỉ cho từ 1-3 chồi/cây. Vì

vậy, với các phương pháp nhân giống trên, cây con vẫn giữ được tính chất của cây mẹ
và dễ thực hiện, nhưng dễ lây lan bệnh virus và cho hệ số nhân thấp, thời gian nhân
giống chậm. Ngoài ra, việc tạo cây con trên cây mẹ làm cho cây mẹ sinh trưởng và phát
triển khơng bình thường.
4.3. Phương pháp nhân giống in vitro (vi nhân giống)
Nhân giống Đại Hồng Môn bằng phương pháp in vitro đã được sử dụng phổ biến và rất
hiệu quả (Suryanarayana, 2005). Nhân giống vơ tính in vitro được sử dụng vào mục
đích nhân nhanh và nhân đúng kiểu cây của một kiểu gen đã được tuyển chọn
Theo Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thuỷ Tiên (2002), nhân giống vơ tính in vitro có
nhiều ưu điểm:
- Tạo ra các cây con đồng nhất và giữ được đặc tính di truyền của cây mẹ.

7


- Hệ số nhân giống cao có thể nhân một số lượng cây con rất lớn từ một cá thể
ban đầu trong một thời gian ngắn.
- Một giống cây quý có thể nhân nhanh để đưa vào sản xuất.
- Có thể tạo ra các cây con sạch bệnh do có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh
trước khi đưa vào mơi trường ni cấy.
Nhìn chung, nhân giống vơ tính in vitro được ứng dụng thành công và dễ dàng trên các
cây hai lá mầm hơn các cây một lá mầm, các cây thân thảo dễ hơn cây thân gỗ (Nguyễn
Đức Lượng & Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002). Phương pháp phổ biến nhất là cấy chồi, cấy nốt
đơn. Các phương pháp tái sinh từ các bộ phân không chứa đỉnh sinh trưởng như lá, rễ,
cuống lá, thân non…cũng được áp dụng trên nhiều cây (Nguyễn Văn Uyển et al., 1993).
5. Phương pháp vi nhân giống
Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây của một kiểu gen được tuyển chọn bằng cách
sử dụng các bộ phận trên cây giống dùng làm mẫu cấy dựa trên cơ sở tính tồn năng của
tế bào và bằng kỹ thuật in vitro (Nguyễn Bảo Toàn, 2004). Nguyễn Đức Thành (2000),
vi nhân giống được bắt đầu bằng tách đỉnh chồi hoặc mô phân sinh từ các cây định nhân

sau đó khử trùng và đưa vào ni cấy trên mơi trường thích hợp. Ngồi ra, vi nhân
giống có thể được thực hiện thơng qua tạo phơi hoặc tái sinh cây trực tiếp từ mô sẹo.
5.1. Các giai đoạn của vi nhân giống
Theo Debegh & Zimmerman (1991), sự thành công của vi nhân giống chỉ đạt được khi
hồn thành 4 giai đoạn. Việc khơng thể thực hiện một giai đoạn cũng có nghĩa là cơng
việc vi nhân giống không thành công.
Các giai đoạn thực hiện:
+ Giai đoạn 0: Sự chuẩn bị cây mẹ
Giai đoạn này góp phần rất lớn vào sự thành công của các giai đoạn sau. Do đó, Cây mẹ
cần phải sạch bệnh và đang ở trong giai đoạn tăng trưởng mạnh thì khi nhân giống sẽ
đạt hiệu quả cao.
+ Giai đoạn 1: Khử trùng, tạo chồi mơ ni cấy
Mục đích mẫu cấy sống và khơng bị nhiễm. Thơng thường tỷ lệ mẫu sạch cịn sống sau
mỗi đợt khử trùng rất biến động, rất khó đạt mức cao. Trong sản xuất để sớm có hàng
loạt cây giống đưa ra cần rất nhiều vật liệu đưa vào khử trùng.
+ Giai đoạn 2: Nhân chồi
Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân cao nhất, chính
vì thế đây là giai đoạn then chốt của quá trình.
Để tăng hệ số nhân, ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các
chất điều hòa sinh trưởng (Auxin, Cytokinin, Gibberellin…) các chất bổ sung khác như:
nước dừa, nước chiết nấm men, dịch thủy phân Casein… kết hợp với các yếu tố nhiệt
độ, ánh sáng, thích hợp. Tùy thuộc đối tượng ni cấy người ta có thể nhân nhanh số
lượng từ sự kích thích các trung tâm mơ phân sinh như đỉnh sinh trưởng, chồi chính,
chồi bên hoặc tái sinh phơi vơ tính từ các bộ phân khơng chứa đỉnh sinh trưởng. Phương
pháp để gia tăng số chồi ở giai đoạn hai là cấy chồi đỉnh hoặc chồi bên (cấy đoạn thân).
+ Giai đoạn 3:Được chia làm 2 giai đoạn phụ:
- Giai đoạn 3a: kéo dài.
8

- Giai đoạn 3b: kích thích rễ và tiền thuần dưỡng.
Mục đích của giai đoạn này là giúp cho cây con gia tăng chiều cao và tạo rễ đầy đủ, sẵn
sàng cho sự chuyển ra ngồi.
Khi cây đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển sang môi trường tạo rễ.
Thường sau 2- 3 tuần, từ những chồi riêng biệt sẽ hình thành rễ và trở thành cây hồn
chỉnh. Giai đoạn này sử dụng chủ yếu các Auxin là nhóm hormone thực vật quan trọng
có chức năng tạo rễ phụ từ mơ ni cấy. Trong nhóm này các chất IAA, IBA, NAA
được sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi in vitro. Các auxin thường được sử dụng với
hàm lượng khống thấp (như mơi trường MS/2). Ngồi việc kích thích rễ, giai đoạn này
cũng thuận lợi cho sự thuần dưỡng.
+ Giai đoạn 4: Thuần dưỡng
Mục đích của giai đoạn này là làm giảm tối thiểu sự chết cây con, khi chuyển từ in vitro
sang nhà lưới hoặc điều kiện ngoài đồng. Chất lượng cuối cùng của in vitro tuỳ thuộc
một phần vào việc thuần dưỡng. Để tăng khả năng sống của cây con ngồi nhà lưới thì
cây con nhất thiết phải trãi qua thời gian tập quen dần với điều kiện gần giống như bên
ngoài như tăng dần ánh sáng, nhiệt độ. Sự thất bại trong giai đoạn này là do:
• Cây con in vitro sinh trưởng trong điều kiện ẩm độ cao, ánh sáng yếu, do
đó khi đem ra bên ngồi mơi trường bị thay đổi đột ngột cây con chết rất nhanh.
• Cây cấy mơ ni trong điều kiện môi trường được cung cấp đầy đủ chất
khống và đường để hình thành sự dị dưỡng. Do đó, khi ở điều kiện bên ngồi ống
nghiệm cây phải chuyển từ dị dưỡng sang tự dưỡng, làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng
và phát triển của cây.
Cây con tạo được bằng phương pháp cấy mơ khi đã hồn chỉnh với đầy đủ rễ và thân lá
sẽ được chuyển ra vườn ươm, trồng trực tiếp ra đất cho cây tiếp tục sinh trưởng trong
điều kiện trồng trọt bình thường. Đây là giai đoạn có sự thay đổi rất lớn về điều kiện
sống, cây hay bị stress do chưa quen với tiểu khí hậu như ẩm độ, nhiệt độ và dinh dưỡng
trong vườn uơm. Các ảnh hưởng cụ thể:
+ Nhiệt độ và ẩm độ
Do chai cấy được đậy nắp kín nên độ ẩm khơng khí quanh cây rất cao, cây khơng bị mất
nước. Về nhiệt độ, trong phịng sáng thường có gắn máy lạnh nên cây mô luôn sống

trong điều kiện nhiệt độ mát, thích hợp cho sinh trưởng. Ở điều kiện vườn ươm, nhiệt
độ cao và bộ rễ lúc lấy ra khỏi chai cấy bị tổn thương chưa thể thực hiện chức năng hút
nước để điều tiết nhiệt sẽ khiến cây bị mất nước, cây con sẽ có tỉ lệ chết rất cao. Vì vậy,
cần có giai đoạn thuần dưỡng cho cây con cấy mơ thích nghi dần với điều kiện mơi
trường mới.
Các biện pháp khắc phục q trình thuần dưỡng có thể bắt đầu ở giai đoạn cuối của các
cây cấy mơ, khi chúng cịn trong bình ni cấy và giai đoạn sau khi chuyển cây con ra
môi trường tự nhiên. Phải từng bước giúp cây con in vitro thích nghi dần với mơi trường
bên ngồi nhà lưới bằng cách tạo ra môi trường gần giống với môi trường trong điều
kiện cấy mơ (Capellades, 1989). Đối với bình ni cấy: nới lỏng nắp bình để tăng sự
trao đổi khí với môi trường xung quan, giúp cây quen với sự thiếu hụt ẩm độ. Tuy
nhiên, theo cách này mẫu cấy dễ bị nhiễm. Có thể giảm ẩm độ của khoảng trống bên
trên nắp bình bằng cách làm lạnh đáy bình (Maene & Debergh, 1987). Trong môi
trường tự nhiên hoặc nhà lưới, khi chuyển sang môi trường tự nhiên cây dễ bị mất nước
do ẩm độ thấp. Phương pháp để khắc phục tình trạng này được nhiều tác giả đưa ra như
9


phun sương tạo ẩm độ, trùm cây lại bằng plastic và đặt trong điều kiện ánh sáng thấp
(Scoot, 1987). Trong các khuyến cáo, người ta đề nghị không nên sử dụng phương pháp
tạo ẩm độ bằng cách phun sương, vì một mặt độ ẩm quá cao dễ gây úng, mặt khác cây
con rất dễ bị mất khoáng do bị rửa trôi (McCown, 1986; Miller, 1983). Phương pháp
được nhiều tác giả đề nghị là trùm kín plastic trong để tạo ẩm độ cao và đặt trong điều
kiện ánh sáng thấp. Ngoài ra, che nilon và tưới phun sương 15 – 30 phút một lần/ngày
giúp cho cây đạt tỷ lệ sống cao (Vũ Ngọc Phương et al., 2001).
+ Ánh sáng
Cây cấy mô có cấu trúc lá mỏng thích nghi với mơi trường chiếu sáng nhẹ, khi bị đặt
dưới ánh sáng mạnh dễ bị cháy lá. Thuần dưỡng ánh sáng bằng cách chuyển cây ra nơi
có cường độ ánh sáng bằng hoặc lớn hơn một ít, rồi tăng dần cường độ ánh sáng lên.
Thời gian thích nghi này cần khoảng 4 tuần (Miller, 1983; Pocock, 1983).

+ Đất và phân bón
Về mặt tự dưỡng, trong môi trường nuôi cấy mô, cây được cung cấp đường thay vì phải
tự quang hợp, nhưng ra vườn ươm cây phải tự quang hợp để có hydrate carbon, trong
thời gian đầu khi bộ rễ chưa hồi phục sẽ không thể hút dinh dưỡng từ đất để nuôi cây, rễ
cần có thời gian hồn thiện cấu trúc. Các vườn ươm cây cấy mô thường dùng xơ dừa
vụn và tro trấu (tỷ lệ 1:1) để ươm cây cấy mô trong thời gian đầu. Phân bón cho cây con
trong giai đoạn đầu chưa quan trọng lắm, có thể phun phân lỗng qua lá trong lúc bổ
sung ẩm độ mặt lá cho cây con (Preece & Sutter, 1991).
+ Bệnh và côn trùng
Cây cấy mơ cịn non rất mềm, mơi trường thuần dưỡng có ẩm độ cao là điều kiện tốt để
cho nấm bệnh phát triển, ngồi ra cũng là thức ăn ưa thích của cơn trùng. Vì vậy, vườn
ươm và mơi trường ra cây cấy mô được giữ vệ sinh sạch (Preece & Sutter, 1991). Một
số trường hợp, cây con trước khi cấy vào đất cần được ngâm vào thuốc diệt mầm bệnh,
có thể sử dụng thêm thuốc trừ sâu nếu cần (Miller, 1983; Pocock, 1983). Ngồi ra, có
thể dùng plastic để che phủ (Preece & Sutter, 1991).
5.2. Ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng thực vât
Các yếu tố bên ngoài bao gồm môi trường nuôi cây, điều kiện ngoại cảnh như ánh sáng,
nhiệt độ, lượng oxy trao đổi,...trong đó tác động của các chất điều hòa sinh trưởng thực
vật (ĐHSTTV) trong môi trường là rất quan trọng đối với mô cấy, có thể quyết định kết
qủa trong từng giai đoạn.
Chất điều hịa sinh trưởng bao gồm chất kích thích sinh trưởng (Auxin, Gibberillin,
Cytokinin) và chất ức chế sinh trưởng (ABA, Ethylen); chất điều hòa sinh trưởng là yếu
tố quan trọng nhất trong sự phát sinh hình thái và tái sinh cây nguyên vẹn từ tế bào và
mô thực vật tách rời trong nuôi cấy in vitro. Auxin và cytokinin được bổ sung vào mơi
trường ni cấy để kích thích sự phát sinh hình thái và tỉ lệ hormone sử dụng để kích
thích sự tạo chồi hay tạo rễ khơng giống nhau. Tùy theo giống, loài thực vật mà nhu cầu
về dạng và nồng độ của auxin và cytokinin khác nhau trong sự phát sinh hình thái (Vũ
Văn Vụ, 1999).
* Auxin
Auxin rất thơng dụng trong thục vật, có vai trị kích thích sự tăng trưởng của tế bào, cụ

thể là nới lỏng vách tế bào thơng qua sự hoạt hóa các enzim tổng hợp vách , khởi động
cho sự giãn nở tế bào. Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử cần
10


cho qúa trình tăng trưởng như protein, cenlulo, pectin và ngăn cản không cho chúng bị
thủy phân (Grodzinxki & Grodzinxki, 1981). Auxin kết hợp chặt chẽ các thành phần
dinh dưỡng trong mơi trường ni cấy để kích thích sự tăng trưởng của mô sẹo. Để tạo
mô sẹo, 2,4 – D thường sử dụng riêng rẽ hoặc phối hợp với cytokinin và nó được thay
thế bởi IBA hay NAA để kích thích sự phát sinh hình thái (Nguyễn Đức Lượng & Lê
Thị Thủy Tiên, 2002). Pence et al. (1979) quan sát trên mơi trường ni cấy phơi non
cacao có chứa NAA ở nồng độ 8 - 48 mg/l thêm 10% nước dừa thấy có sự phát sinh cơ
quan phơi, nhưng nếu dùng 8 mg/l 2,4- D kết hợp với 80 mg/l IAA thì kết quả cịn tăng
nhanh hơn, nhất là trên mơi trường lỏng. Ở giai đoạn tái biệt hóa, lượng auxin cần được
giảm xuống dần cho đến bỏ hẳn khi cây đã hồn tồn định hình (Pence et al., 1979;
Nguyễn Văn Uyển et al., 1993).
* Cytokinin
Cytokinin là chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) có khả năng kích thích sự
phân chia tế bào ở thực vật. Chúng đóng vai trị chính trong sự thành lập chồi và cơ
quan ni cấy mơ (Nguyễn Bảo Tồn, 2004). Các cytokinin thường được sử dụng trong
cấy mơ như: zeatine (Z) trích từ hạt bắp nảy mầm, 2-isopentenyladenine (iP), Kinetin,
benzyladenine (BA), Thidiazuron (TDZ),…(Pierik, 1987).
Theo Wililam (1996) cytokinin ảnh hưởng lên sự phát sinh chồi, nhân chồi và trẻ hố
mơ cấy cũng như kích thích sự phân chia tế bào và định hướng phân hóa tế bào. Việc bổ
sung cytokinin vào môi trường nuôi cấy có thể cảm ứng được sự tăng trưởng của vài
chồi nhỏ từ các mẫu cấy sau khoảng 4 – 6 tuần ni cấy, nếu nồng độ cytokinin q cao
sẽ kích thích sự hình thành của nhiều chồi nhưng các chồi này không thể kéo dài hoặc lá
bị biến dạng hay chồi có hiện tượng mọng nước (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thuỷ
Tiên, 2002). Vì vậy, cytokinin thường khơng được sử dụng trong mơi trường kích thích
sự ra rễ của chồi để tạo cây con.

* Tương tác giữa auxin và cytokinin
Theo các nghiên cứu của nhiều tác giả đã cho thấy tỉ lệ auxin và cytokinin trong môi
trường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự thành lập chồi và rễ. Một tỉ lệ cytokinin cao và auxin
thấp thích hợp cho sự tạo chồi. Trong khi tỉ lệ cytokinin thấp và auxin cao thích hợp cho
sự tạo rễ, mức độ trung gian giữa hai tỉ lệ thích hợp cho sự tạo mơ sẹo (callus)
(Debergh, 2003). Hiện tương này được xác nhận trên nhiều cây khác và là cơ sở cho lý
thuyết điều khiển sinh trưởng, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy (Nguyễn
Văn Uyển et al., 1993).
* Polyamines
De Kler (2001), Polyamine là các hợp chất căn bản tìm thấy với hàm lượng cao trong
thực vật và được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy với nồng độ cao (10-1000
µM). Những polyamine phổ biến nhất là putrescine, spermidine, spermine,…Chúng có
thể giúp tăng cường tái sinh rễ, chồi và phơi, trì hỗn hoặc ngăn cản lão hóa và điều hòa
sự ra hoa. Chúng hoạt động bằng việc ổn định màng tế bào, nucleic acid hoặc protein
hoặc có thể gắn vào các protein điều hòa.
- Putrescine:
Putrescine là polyamine được tổng hợp từ arginine. Putrescine qua q trình trao đổi
chất có thể hình thành nên spermidine, và từ spermidine tạo thành spermine. Sự kết hợp
giữa glycerol với polyamine putrescine, spermidine và spermine cho một lượng lớn sinh

11


G
a doryphor (Garciajimeenez et al.,,
khối tế bàào trong điềều kiện in vitro của Grateloupia
1998)

P
Putrescine

Puutrescine cóó thể được sản xuất trực
t
tiếp từ
ừ Ornithin bới
b sự hoạạt động củaa
Ornithinne decarboxyylase (ODC
C) hoặc trựcc tiếp từ Arg
ginine bởi Arginine
A
deccarboxylasee
(ADC). S- adenosyllmethioninee là tiền chấất trong sinh
h tổng hợp ethylen; vì vậy, sự giaa
h
tính S-- adenosyl methioninee
tăng tronng sinh tổnng hợp polyyamine, đặcc biệt qua hoạt
decarbox
xylase (SAM
MDC), có khả năng ảnh
ả hưởng của ảnh hư
ưởng đến sự
ự tổng hợpp
ethylen.

Hình
h 1.2. Con đường
đ
tổngg hợp polya
amine ở thự
ực vật
5.33. Các điều kiện khác trong môi trường có ảnh hưởngg lên mơ cấấy

* Khống
K
đa lượng
l
và vi lượng
Mơi trườnng nuôi cấy in vitro cầnn đảm bảo m
mọi thành phhần dinh dư
ưỡng tương tự như môii
trường câyy sống bênn ngoài đất. Cần phải cung
c
cấp chho cây các nguyên tố khoáng đaa
lượng cơ bản
b như nittơ, phốt phoo, kali, can xi, magiê, sắt và vi lư
ượng như mangan,
m
bo,,
kẽm, đồngg, molypdenn, coban iot...Mơ cấy cần được đặtt trong mơi trường có sự
s đối xứngg
các ion nh
hư K+, NO33-, NH4+, Ca++, Mg++. Khống đa lượng rất cần
c cho câyy do các vaii
trị của cáác nguyên tốố đa lượng về phươngg diện sinh lý dinh dưỡ
ỡng và cả do
d tỷ lệ củaa
chúng tronng cấu trúc thành sinh khối của thhực vật (Jaccob, 1993). Do đó, cầnn phải đượcc
cung cấp đầy
đ đủ các nguyên
n
tố đa
đ lượng troong môi trườ

ờng nuôi cấyy.
122


Khoáng vi lượng tham gia vào enzim trong những hoạt động thuộc q trình chuyển
hóa cơ bản và có vai trị khơng thể thay thế ở nhiều trường hợp, nhưng do thành phần
khoáng vi lượng chỉ chiếm một tỷ lệ rất nhỏ nên một số chất có thể đã có trong các
thành phần tạp của chất khác. Vi lượng sắt sử dụng cho nuôi cấy mô dưới dạng chelate
(Fe-EDTA) khoảng 20 - 40 mg/l. Chelate giữ cho sắt phóng thích từ từ vào môi trường
trong thời gian mô tăng trưởng (Nguyễn Văn Uyển et al.,1993).
Độ pH trong môi trường là yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình thu nhận
các chất dinh dưỡng từ mơi trường vào tế bào. Murashige & Skoog (1962) nhận thấy pH
khoảng 5,7 – 5,8 thích hợp cho sự duy trì hịa tan các chất khống trong mơi trường MS.
Cho đến nay hầu như các nghiên cứu về nuôi cấy mô dùng thành phần khống do
Murashige & Skoog (1962) đề nghị, vì cơng thức môi trường đảm bảo được cân bằng
ion, và là môi trường giàu, đáp ứng rộng với nhiều loại mô cấy của nhiều loài.
* Vitamin và các thành phần hữu cơ
Các vitamin có tác dụng kích thích sinh trưởng của mơ cấy, nhất là khi sử dụng kết hợp
với kích thích tố (Nguyễn Văn Uyển et al., 1993). Theo Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị
Thuỷ Tiên (2002), vitamin cần cho mơ cấy bao gồm một số vitamin nhóm B, với lượng
từ 1 đến 10 mg/l. Myo - Inositol có tác dụng cải thiện sự sinh trưởng của mô cấy và
được dùng trong khoảng 50 - 5000 mg/l, mặc dù không phải là yếu tố quyết định.
Nguồn cacbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ giúp tế bào phân
chia tăng sinh khối. Nguồn cacbon này khơng do q trình quang hợp cung cấp mà nó
được bổ sung vào môi trường dưới dạng đường. Hai dạng đường thường gặp nhất trong
nuôi cấy in vitro là glucose và saccharose, nhưng saccharose được sử dụng phổ biến
hơn (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Nồng độ đường saccharose dùng
trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là 20 - 30 g/l (Bùi Bá Bổng, 1995).
Trong nuôi cấy mô, nước dừa được sử dụng nhiều với thể tích từ 10 - 30 hoặc 40 % thể
tích mơi trường. Trong nước dừa có các loại muối khống, các axit amin, các chât sinh

trưởng như cytokinin và Myo-Inositol có lợi cho sự phát triển cây có nguồn gốc từ
protocorm (Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
* Agar
Agar là một loại polysaccarite của tảo biển. Nồng độ sử dụng thường là 6-8 g/l, có tác
dụng đơng cứng mơi trường, điều này đạt được nhờ các polysaccarite kết hợp với các
phân tử H2O tạo thành polime, ở 800C thạch ngậm nước chuyển sang trạng thái lỏng
cịn ở 400C thì trở về trạng thái rắn. Agar chủ yếu sử dụng làm giá thể cho mô và tế bào
thực vật phát triển.
* Than hoạt tính
Theo Nguyễn Đức Lượng & Lê Thị Thủy Tiên (2002), than hoạt tính có tác dụng khử
độc, hút các hợp chất cản, hút các hợp chất điều hịa sinh trưởng thực vật trong mơi
trường ni cấy hoặc các chất làm đen môi trường. Khi bổ sung than hoạt tính vào trong
mơi trường ni cấy sẽ kích thích tăng trưởng và biệt hóa phong lan, hành, cà rốt, cà
chua, cây trường xuân nhưng lại có tác dụng cản đối với thuốc lá, đậu nành, trà mi. Khả
năng kích thích sự tăng trưởng của tế bào mơ thực vật là do than hoạt tính kết hợp với
các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian ni cấy. Một số trường hợp,
than hoạt tính thúc đẩy phát sinh phơi vơ tính, kích thích sinh trưởng và phát sinh cơ
quan ở các loài thân gỗ. Than hoạt tính thường được bổ sung vào mơi trường ni cấy
với nồng độ 0,5 - 3 g/l.
13


* Ảnh hưởng các điều kiện vật lý của môi trường lên mô cấy
Các điều kiện vật lý của môi trường ảnh hưởng lên mô cấy chủ yếu là: ánh sáng, nhiệt
độ, cấu trúc (lỏng, đặc…) và độ thơng thống.
Khác với cây sống trong tự nhiên, mô cấy được cung cấp năng lượng phần lớn từ
đường, nhưng ánh sáng lại là cần thiết cho sự phát sinh hình thái như sự công bố của
nhiều nghiên cứu. Toyoki Kozai (1995) thấy rằng chất luợng ánh sáng cũng như độ
thơng khí trong mơi trường có ảnh hưởng lớn đến khả năng tăng trưởng của cây bao
gồm sự tăng trưởng, hình thành rễ, lá..., trong nuôi cấy tăng sinh (proliferante culture),

kết quả tốt nhất là dùng môi trường lỏng để trên máy lắc tạo đầy đủ độ thống trong
mơi trường ngồi mục đích phá ảnh hưởng phân cực của nước.
Mô cấy trong điều kiện in vitro thường ít có sự trao đổi khí với bên ngồi do bình cấy
được đậy kín để đảm bảo vô trùng. Độ ẩm cao và thiếu trao đổi khí có thể làm cho mơ
phát triển theo chiều hướng mọng nước (hiện tượng thuỷ tinh thể- hyperhydricity). Các
mô hoặc cây mọng nước đa số phát triển hình thái rất kém, không sử dụng cho việc
nhân giống tiếp tục, khi chuyển ra mơi trường bên ngồi cây cũng khơng thể tự dưỡng
và sớm tàn lụi.
5.4. Hiện tượng hoá nâu ở mẫu cấy
Mẫu cấy có thể gặp hiện tượng hoại tử, hóa nâu hay chuyển sang màu đen khi đem cấy
do các phenol như cinnamic, coumarin, salicilic aid…tồn tại trong cây dưới dạng
glycozit. Theo Mai Trần Ngọc Tiếng (1994) thì phenol hiện diện trong mẫu cấy ít hay
nhiều phụ thuộc nhiều yếu tố như giống, lồi, vị trí mơ, tình trạng sinh lý, sinh hóa của
mơ,… Phenol ức chế sự phát triển của mô theo cơ chế liên kết với protein và ức chế
hoạt động của enzim. Để khắc phục hiện tượng này người ta có thể sử dụng các cách
thức sau:
- Loại bỏ các hợp chất phenol do mẫu cấy tiết ra môi trường nuôi cấy.
- Bổ sung các chất khử phenol vào môi trường nuôi cấy.
- Ngăn chặn hoạt động của enzim phenolase.
- Giảm lượng phenol có sẵn trong mẫu bằng cách lắc mẫu trong mơi trường lỏng
có thành phần tương tự như mơi trường đặc.
- Giảm diện tích vết cắt trên mẫu.
Trong đó phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất là dùng than hoạt tính để hấp
thụ bớt các hợp chất phenol được tiết ra. Tuy nhiên than hoạt tính có thể hấp thu một
phần chất điều hịa sinh trưởng thực vật trong mơi trường ni cấy. Một chất khác cũng
được sử dụng là polyvinyl pyrolidone (PVP) có thể hấp thụ phenol và làm giảm hiện
tượng hố nâu (Johansson, 1983). Bên cạnh đó người ta cịn dùng acid ascorbic, acid
citric,… để ngăn cản sự hoá nâu này (Pierik,1987).
5.5. Các nghiên cứu về nuôi cấy mô cây Đại Hồng Môn
Pierik et al. (1974) đầu tiên phát triển một phương pháp vi nhân giống Anthurium từ mô

sẹo. Mô sẹo được tạo ra từ phôi hạt và được nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung 1-5
mg/l BAP + 1 mg/l 2,4 - D. Sau đó Pierik & Steegmans (1976) sử dụng lá cây trưởng
thành để làm vật liệu vi nhân giống.
Kunisaki (1980) đã sử dụng chồi Anthurium adreanamum để làm vật liệu nuôi cấy ban
đầu trong môi trường MS có bổ sung 15% thể tích nước dừa để tạo cây trong ống
14


nghiệm. Thí nghiệm này đã cho kết quả thấp do tỷ lệ mẫu khơng sạch cao. Kunisaki cịn
thử nghiệm ni cấy cây Anthurium trong điều kiện thiếu sáng.
Geier & Reuther (1981) và Geier (1982) sử dụng chồi, cuống lá, bông mo, lát cắt mỏng
của cuống lá và lá non của Anthurium tạo mơ sẹo. Mơ sẹo khi tạo ra có thể tái sinh chồi
bất định. Mặc dù chồi được tạo ra từ chồi bất định nhưng sự thay đổi về di truyền trong
vi nhân giống khơng cao. Cây con có sự đồng dạng nằm trong giới hạn cho phép.
Geier (1987) đã tiến hành thí nghiệm tạo chồi từ chồi ni cấy là chồi nách và chồi bất
định. Chồi được cấy vào môi trường MS lỏng bổ sung thiamine HCl 0,4mg/l, acid
nicotinic và pyridoxine HCl mỗi loại 0,5mg/l, nước dừa 15% và sucrose 2%. Môi
trường nhân chồi được sử dụng là mơi trường thạch thành phần tương tự có bổ sung
thêm 0,2 mg/l BAP nhưng khơng có nước dừa (George, 1996). Tuy nhiên, việc nhân
này gặp bất lợi là lượng chồi tạo ra không nhiều.
Ở Việt Nam, việc nhân giống in vitro cây Hồng Môn cũng đã được thực hiện như
nghiên cứu tạo phơi vơ tính (Đồn Duy Thanh et al., 2003), tái sinh cây Anthurium sp.
thông qua tạo callus từ lá (Dương Tấn Nhựt et al., 2004; Nguyễn Thị Lý Anh et al.,
2005). Dương Tấn Nhựt et al. (2004), cho rằng phương pháp nhân giống này đã tạo ra
một lượng lớn cây giống đồng nhất trong một thời gian ngắn với giá thành thấp chỉ bằng
khoảng 1/10 giá thành nhập nội.
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Phương tiện nghiên cứu
1.1. Vật liệu thí nghiệm
Đối tượng nghiên cứu là cây con Đại Hồng Mơn (Anthurium andreanum L) từ các thí

nghiệm trước và được duy trì tại Phịng Thí nghiệm Ni cấy mơ Bộ Mơn Sinh lý Sinh
hố, Khoa Nơng nghiệp Và Sinh học Ứng Dụng, Trường Đại học Cần Thơ.
Vật liệu thí nghiệm là các bộ phận (lá, cuống lá và đoạn thân) của cây Đại Hồng Môn
(Anthurium andreanum L) in vitro.
1.2. Điều kiện thí nghiệm
Phịng ni cấy mơ có trang bị máy điều hoà nhiệt độ 24 ± 20C, đèn neon (thời gian
chiếu sáng 16 giờ/ngày), tủ cấy vô trùng, nồi khử trùng nhiệt ướt, dụng cụ và trang thiết
bị khác dùng trong phịng thí nghiệm ni cấy mơ.
Hố chất: Hố chất được sử dụng trong môi trường nuôi cấy bao gồm: khoáng đa lượng
- vi lượng (MS) (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung vitamin như Thiamin,
pyridoxin, nicotinic acid, myo-inositol; đường sucrose; agar; nước dừa; các chất điều
hoà sinh trưởng như: Thidiazuron (TDZ), Benzyl adenin (BA), 2,4dichlorophenoxyacetic acid (2,4 - D), Naphthalene acetic acid (NAA), Putrescine.
Vườn ươm: Cây mô được ươm trong điều kiện không quá 320C, ẩm độ trung bình 80%,
lưới đen che sáng, mụn dừa, tro trấu, trấu sống và các vật dụng cần thiết khác trong
vườn ươm.
1.3. Địa điểm và thời gian thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện tại phịng ni cấy mơ và nhà lưới thực nghiệm của tổ Sinh
Lý Thực Vật, Bộ môn Sinh Lý Sinh Hố, khoa Nơng nghiệp và Sinh học Ứng Dụng,
Trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện thí nghiệm từ tháng 3/2011 đến tháng 3/2012
15


2. Phương pháp nghiên cứu
2.1. Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy là môi trường cơ bản MS (Murashige & Skoog, 1962) gồm khoáng
đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin theo MS,. Thành phần đa vi lượng của môi trường
này như sau:
Bảng 1.1: Thành phần môi trường cơ bản MS (Murashige và Skoog, 1962)
Thành phần mơi trường

Đa lượng MS

FeEDTA

Vi lượng MS

Vitamin

Hóa chất

(mg/l)

NH4NO3

1650

KNO3

1900

MgSO4 .7H2O

370

CaCl2

440

KH2PO4

170

FeSO4 .7H2O

2,78

Na2EDTA. 2H2O

37,3

H3BO3

6,2

MnSO4

22,3

ZnSO4 7H2O

11,5

Na2MoO4 2H2O

0,25

CuSO4 5H2O

0,025

KI

0,83

CoCl2

0,025

Pyridoxine- HCl

0,5

Nicotinic acid

0,5

Thiamine – HCl

0,1

Glycine

2,0

Mơi trường cơ bản MS có bổ sung thêm các chất như: đường sucrose (30 g/l), agar (7
g/l), nước dừa tươi (150 ml/l), Myo - Inositol (0,1 g/l). Tuỳ theo từng thí nghiệm mà bổ
16