Tối ưu sản lượng lipase pichia anomala bằng thiết kế thí nghiệm theo ma trận plackett burman và RSM CCD, nghiên cứu đặc điểm của lipase thu được

Đại học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
-----------------------------

BÙI HỒNG QUÂN

Tối ưu sản lượng lipase
Pichia anomala bằng thiết kế thí nghiệm theo
ma trận Plackett –Burman và RSM-CCD,
nghiên cứu đặc điểm của lipase thu được

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60. 42. 80
LUẬN VĂN THẠC SĨ

Hướng dẫn khoa học: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 11 năm 2008


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.

TS. Nguyễn Đức Lượng

----------------------------------Cán bộ chấm nhận xét 1: .......................................................

----------------------------------Cán bộ chấm nhận xét 2: .......................................................

----------------------------------Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ
LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA,
ngày . . . . . tháng. . . …năm. . . . . .


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
PHÒNG ĐÀO TẠO SĐH
ĐỘC LẬP – TỰ DO – HẠNH PHÚC

Tp. Hồ Chí Minh, ngày………tháng…….năm………

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Bùi Hồng Quân
Ngày, tháng, năm sinh: 14/09/1980

Phái: Nam
Nơi sinh: Nam Định

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

MSHV: 03106680

I- TÊN ĐỀ TÀI: Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala bằng thiết kế thí
nghiệm theo ma trận Plackett –Burman và RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm lipase
thu được.
II- NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: Thực hiện theo mục tiêu nghiên cứu: Thiết lập
thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman và RSM-CCD để thu được sản lượng
lipase có hoạt tính cao nhất và ứng dụng trong sản xuất bột giặt. Nội dung nghiên
cứu bao gồm:

1. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng nấm men P.anomala.
2. Sử dụng thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett – Burman để sàng lọc các
yếu tố lý hoá ảnh hưởng đến sản lượng lipase.
3. Sử dụng thiết kế thí nghiệm cấu trúc có tâm và phương pháp bề mặt đáp
ứng để xác định giá trị tối ưu của ba yếu tố cho sản lượng lipase cực đại.
4. Thu nhận sinh khối nấm men. Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy bằng
kết tủa cồn lạnh.
5. Nghiên cứu một vài đặc điểm của lipase P.anomala.
6. Bổ sung lipase thu được vào một số bột giặt trên thị trường
III- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 01/2008
IV- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 11/2008
V- CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS.TS. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CN BỘ MÔN
QL CHUYÊN NGÀNH

Nội dung và đề cương luận văn thạc sỹ đã được Hội đồng chuyên ngành thông qua.
Tháng 01 năm 2008
TRƯỞNG PHÒNG ĐT-SĐH TRƯỞNG KHOA QL CHUYÊN NGÀNH


Xin gửi lời cảm ơn chân thành và lòng biết ơn sâu sắc đến
Thầy PGS.TS. Nguyễn Đức Lượng người đã đưa ra phương
hướng, mục tiêu cũng như hướng dẫn khoa học cặn kẽ cho em
trong suốt quá trình học tập và thực hiện luận văn này.
Xin gửi lời tri ân đối với Cha mẹ và gia đình đã ni dưỡng
con và là chỗ dựa cho con trong suốt cuộc đời này.
Xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Thầy TS. Nguyễn Tiến
Thắng, Cô TS. Nguyễn Thúy Hương và các thầy cô khác đã truyền

đạt kiến thức, kinh nghiệm và dành cho em sự giúp đỡ quý báu
trong quá trình học tập và nghiên cứu tại bộ môn Công nghệ sinh
học.
Xin gửi lời cảm ơn đến TS. Quyền Đình Thi, TS. Ching Tsing
Hou đã có những trao đổi, góp ý q báu giúp tơi hồn thành tốt
luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn các Cô trong bộ môn Công nghệ sinh
học đã giúp đỡ và tạo điều kiện làm việc tốt nhất cho tơi trong
q trình thực hiện luận văn này.
Xin chân thành cảm ơn Ông Nguyễn Văn Thái, giám đốc
Trung tâm kiểm tra vệ sinh thú y trung ương II cùng các bạn đồng
nghiệp của trung tâm đã tạo điều kiện cho tơi thực hiện một số thí
nghiệm tại trung tâm.
Xin cảm ơn những người bạn đã cùng tôi học tập, trao đổi,
động viên và có những trợ giúp cần thiết, đúng lúc cho tôi.
Bùi Hồng Quân


Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala bằng thiết kế thí nghiệm theo ma trận
Plackett –Burman và RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm của lipase thu được
Tóm tắt
Mục tiêu nghiên cứu là thiết lập thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman
và RSM-CCD để thu được sản lượng lipase có hoạt tính cao nhất và ứng dụng
trong sản xuất bột giặt.
Thực hiện các phương pháp kiểm tra theo Kurtzman và Fell (1999); Dũng
và Lương (2006), chúng tôi đã xác định được đặc điểm sinh lý, sinh hoá của
chủng nấm men P.anomala. Chủng nấm men có khả năng lên men đường
sucrose, glucose, khơng có khả năng lên men lactose, đồng hoá nhiều nguồn
cacbon (sucrose, maltose, tinh bột, glycerol, D-manitol, citrate, lipid) và đồng
hoá nitrate. Nấm men phát triển tối ưu ở pH 9,0; nhiệt độ 25oC; giai đoạn phát

triển cần nhu cầu ôxy cao.
Nấm men Pichia anomala đã được tối ưu hố q trình nuôi cấy nhằm thu
được sản lượng lipase cực đại. P.anomala có khả năng sinh tổng hợp lipase ở pH
tối ưu 9,0. Chúng tơi đã sử dụng thiết kế thí nghiệm Plackett – Burman để kiểm
tra mức độ ảnh hưởng của các yếu tố lý hoá khác nhau lên sản lượng lipase.
Trong đó, chiết nấm men, tỷ lệ giống và dầu ăn là ba yếu tố có tác động mạnh
nhất. Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM)- phương án
cấu trúc có tâm (CCD) đã được thực hiện và tìm ra giá trị tối ưu của ba yếu tố
chiết nấm men (3,0%), tỷ lệ giống (2,37%; 108 tế bào/mL) và dầu ăn (4,19%) cho
sản lượng lipase cực đại theo mơ hình 18,8078 (U/mL). Mơ hình đã được áp
dụng vào thực tế với kết quả 100mL nuôi cấy lắc là 18,95 (U/mL) và 3,0L trong
fermentor tự động là 22,52(U/mL). Đã thu nhận được 9,5g sinh khối nấm men
ướt /100mL dịch nuôi cấy.
Sau khi lên men fermentor, chúng tôi đã thu nhận 4,32g tủa protein thô
(chứa enzym) từ 2L dịch nuôi cấy khi kết tủa bằng cồn lạnh.
Đồng thời, chúng tôi cũng đã nghiên cứu một vài đặc điểm lipase
P.anomala: pH hoạt động thích hợp 9,0; nhiệt độ hoạt động thích hợ 25oC, các
ion kim loại khơng gia tăng hoạt tính mà làm giảm hoạt tính của lipase (Li+ K+
Cu2+ Zn2+ Fe2+ Mg2+ Mn2+ Hg+ Ca2+ Al3+ Fe3+); EDTA và muối mật cũng làm giảm
hoạt tính của lipase này.
Với lipase thô thu được, chúng tôi đã bổ sung vào bột giặt Omo, Surf (Sản
phẩm của Unilever Việt Nam), Only (Cơng ty CP Bột giặt Lix). Kết quả hoạt tính
lipase giảm mạnh ngay sau khi trộn Omo (35%), Surf (41%), Only (62%). Sau 24
giờ hoạt tính bị mất hồn tồn.
Từ khoá: Pichia anomala, Lipase, Plackett –Burman, RSM-CCD, fermentor


The design experiments follow Plackett – Burman matrix and Central
Composite Designs - Response surface methodology to optimal lipase yield
by Pichia anomala and research properties of lipase

Summary
The aim of the present research is design experiments following PlackettBurman matrix and RSM-CCD to highest level lipase yield and apply to
detergent power.
We tested yeast following Kurtzman and Fell (1999); Dung and Luong
(2006) to determined property phisical and biochemical of the strain. The strain
could fermentation sucrose, glucose; couldn’t fermentation lactose; could
assimilate many carbon sources (sucrose, maltose, starch soluble, glycerol, Dmanitol, citrate, lipid) and N source nitrate. The yeast strain could growth at
optimum pH pH 9.0; at 25oC. The growth stage needed oxygen at high level.
Yeast Pichia anomala was optimized culture process for maximum lipase
production. The pH optimum for this secretion is 9.0; this lipase of great promise
can act very well at alkaline pH (pH>9) and be applied in detergent industry. We
use the design of optimum multifactorial experiments Plackett – Burman to
estimate level effect of physical and chemical factors on lipase yield. As the
result, Yeast (%), inoculum’s size (%) and vegetable oil (%) were identified as
significant factors. After screening, these factors were subsequently optimized
using the response surface methodology (RSM) - Central Composite Designs
(CCD). These optimal levels were found out yeast extract (3.0%), inoculum’s
size (2.37%; 108 cells mL-1) and vegetable oil (4.19%) in which the lipase yield is
highest. The regression equations (model) obtained and predicted maximum
lipase yield 18.8078 (U/mL). We also verify model in shake- flasks (100mL) as
well as automatic fermentor (3.0L). Lipase production yields were recorded from
supernatant is 18.95 (U/mL) and 22.52 (U/mL), respectively. We also take in
9.5g yeast biomass from 100mL supernatant culture.
Two liter supernatant culture after fermentation was precipitated by cool
ethanol and result 4.32g crude protein.
Simultaneous, we studied some properties of lipase P.anomala: optimum
acitive pH 9.0; optimum active temperature 25oC, metals ionic not enhance
activity that decrease activity of lipase (Li+ K+ Cu2+ Zn2+ Fe2+ Mg2+ Mn2+ Hg+ Ca2+
Al3+ Fe3+); EDTA and bile salt also decrease lipase activity.
Crude lipase was mix with soap powder as Omo, Surf (Products of Unilever

Viet Nam), Only (Lix Joint stock Company). Result as lipase activity strongly
drop as soon as mixture Omo (35%), Surf (41%), Only (62%). After 24h, activity
lost all.
Key words: Pichia anomala, lipase, Plackett – Burman, Response surface
methodology (RSM)- Central composite designs (CCD), fermentor


Trang 1

Mục lục
Mục lục.............................................................................................................1
Danh mục các hình..........................................................................................4
Danh mục các đồ thị .......................................................................................4
Danh mục các bảng .........................................................................................4
Chương 1..........................................................................................................4
1.

Đặt vấn đề.................................................................................................6

Chương 2..........................................................................................................8
2.

Tổng quan các nghiên cứu liên quan .....................................................8

2.1. Tổng quan nghiên cứu nấm men P.anomala .............................................8
2.2. Tổng quan nghiên cứu lipase nấm men ...................................................12
2.2.1. Nguồn gốc và ứng dụng lipase nấm men.............................................12
2.2.2. Tinh sạch protein và các thuộc tính hố sinh.......................................16
2.2.2.1. Lipase từ nấm men Pichia .................................................................16
2.2.2.2. Lipase từ các nấm men khác..............................................................17

2.2.3. Tạo dòng gen .......................................................................................24
2.2.3.1. Nấm men Pichia.................................................................................24
2.2.3.2. Các nấm men khác.............................................................................24
2.3. Nghiên cứu lipase các vi sinh vật khác....................................................29
2.4. Ứng dụng của lipase vi sinh vật...............................................................33
2.4.1.

Ứng dụng lipase trong công nghiệp thực phẩm.................................34

2.4.2.

Ứng dụng lipase trong công nghiệp tẩy rửa.......................................35

2.4.3.

Ứng dụng lipase trong công nghiệp thuộc da, dệt, giấy ....................35

2.4.4.

Ứng dụng lipase trong quản lý môi trường........................................36

2.4.5.

Ứng dụng lipase trong cơng nghiệp hóa chất ....................................36

2.4.6.

Ứng dụng lipase trong hóa sinh dược và y tế ....................................37

2.4.7.

Ứng dụng lipase trong nông dược .....................................................38

2.4.8.

Ứng dụng lipase trong mỹ phẩm và công nghiệp nước hoa ..............39

2.4.9.

Ứng dụng lipase trong sản xuất biodiesel .........................................39

Chương 3........................................................................................................42
3.

Vật liệu và phương pháp.......................................................................42

3.1. Chủng vi sinh vật ....................................................................................42


Trang 2

3.2. Thiết bị - Hố chất mơi trường................................................................42
3.3. Phương pháp xác định lipase...................................................................42
3.3.1. Cơ sở lý thuyết.....................................................................................42
3.3.2. Định tính lipase P.anomala bằng phương pháp đục lỗ........................45
3.3.3. Định lượng hoạt tính lipase bằng phương pháp chuẩn độ liên tục ......46
3.4. Xác định đặc điểm sinh lý sinh hoá của chủng nấm men P.anomala ....47
3.4.1. Cơ sở lý thuyết.....................................................................................47
3.4.2. Bố trí thí nghiệm..................................................................................48
3.5. Sàng lọc các yếu tố quan trọng theo thiết kế Plackett-Burman...............51

3.5.1. Cơ sở lý thuyết.....................................................................................51
3.5.2. Bố trí thí nghiệm..................................................................................55
3.6. Tối ưu giá trị của ba yếu tố theo thiết kế cấu trúc có tâm theo phương
pháp bề mặt đáp ứng................................................................................57
3.6.1. Cơ sở lý thuyết.....................................................................................57
3.6.2. Bố trí thí nghiệm..................................................................................59
3.7. Thử nghiệm mơ hình tối ưu ở điều kiện ni cấy lắc 100mL và
fermentor 3,0L .........................................................................................61
3.8. Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy bằng kết tủa cồn lạnh. ..................61
3.9. Nghiên cứu một vài đặc điểm của lipase P.anomala. ............................61
3.9.1.

pH hoạt động tối ưu ...........................................................................61

3.9.2.

Nhiệt độ hoạt động tối ưu ..................................................................62

3.9.3.

Khả năng bền với nhiệt của enzym ...................................................63

3.9.4.

Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất kìm hãm ............................63

3.10. Bổ sung lipase vào bột giặt..................................................................64
3.10.1. Cơ sở lý thuyết ....................................................................................64
3.10.2. Bố trí thí nghiệm ................................................................................67
Chương 4........................................................................................................70

4.

Kết quả và bàn luận ..............................................................................70

4.1. Kết quả xác định đặc điểm sinh lý sinh hoá của chúng nấm men
P.anomala và một số yếu tố ảnh hưởng ..................................................70
4.1.1. Kết quả đặc điểm sinh lý, sinh hoá của P.anomala .............................70


Trang 3
4.1.2. Kết quả ảnh hưởng giá trị pH khác nhau lên khả năng phát triển của

P.anomala ..........................................................................................73
4.1.3. Kết quả ảnh hưởng của nhiệt độ lên khảnăng phát triển của
P.anomala................................................................................................74
4.2. Kết quả sàng lọc các yếu tố quan trọng theo thiết kế Plackett-Burman...76
4.3. Kết quả tối ưu giá trị của ba yếu tố theo thiết kế cấu trúc có tâm theo
phương pháp bề mặt đáp ứng ..................................................................78
4.4. Thử nghiệm mô hình tối ưu ở điều kiện ni cấy lắc 100mL và fermentor
3,0L..........................................................................................................80
4.5. Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy bằng kết tủa cồn lạnh....................82
4.6. Nghiên cứu một vài đặc điểm của lipase P.anomala...............................83
4.6.1. Kết quả xác định giá trị pH thích hợp cho hoạt động của enzym .......83
4.6.2. Kết quả xác định nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym................84
4.6.3. Kết quả xác định độ bền của enzym với nhiệt độ................................86
4.6.4. Kết quả xác định sự ảnh hưởng của một số ion kim loại, EDTA, muối
mật lên hoạt tính của enzym ...............................................................87
4.7. Kết quả bổ sung lipase vào bột giặt .........................................................88
Chương 5........................................................................................................90
5.

Kết luận và kiến nghị ............................................................................90

5.1. Kết luận ...................................................................................................90
5.2. Kiến nghị .................................................................................................90
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................91
PHỤ LỤC 1 ................................................................................................pL 1
PHỤ LỤC 2 ................................................................................................pL 4
PHỤ LỤC 3 ................................................................................................pL 5
PHỤ LỤC 4 ................................................................................................pL 6
PHỤ LỤC 5 ................................................................................................pL 7


Trang 4

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 3.1. Mơ hình hố thiết kế có tâm tổng quát cho hai yếu tố và ba
dạng CCD.......................................................................................... 58
Hình 4.1. Hình dạng tế bào, cách thức nảy chồi của P.anomala.......................... 70
Hình

4.2.

Hình

dạng

khuẩn

lạc

P.anomala

trên

mơi

trường

Sabouraund 2% glucose sau 48 giờ ni cấy .................................... 71
Hình 4.3. Khả năng phân giải lipid trên môi trường chiết nấm men –
nhũ tương dầu ăn............................................................................... 72
Hình 4.4. Khả năng phát triển của P.anomala trên Sabouraund 2% glucose ở pH
8,9,10................................................................................................. 74
Hình 4.5. Kết quả nhiệt độ hoạt động tối ưu của enzym trên thạch đĩa................ 85
DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1. Đường cong tăng trưởng của P.anomala trên Sabouraund
2% glucose .................................................................................... 73
Đồ thị 4.2. Kết ảnh hưởng giá trị pH khác nhau lên khả năng phát triển của
P.anomala .................................................................................... 73
Đồ thị 4.3. Mặt đáp ứng sản lượng lipase theo tỷ lệ giống và dầu ăn .................. 80
Đồ thị 4.4. Mặt đáp ứng sản lượng lipase theo tỷ lệ giống và chiết nấm men ..... 80
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Chủng nấm men sinh tổng hợp lipase .................................................. 13
Bảng 2.2. Tính đặc hiệu cơ chất của lipase một số dòng Pichia .......................... 16
Bảng 2.3. Lipase tự do và lipase cố định dùng trong sản xuất biodiesel .............. 41
Bảng 3.1. Tóm tắt một số phương pháp xác định hoạt tính lipase........................ 43
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tween kết hợp với chất nhiễm sắc và các hệ thống cơ
chất khác trong xác định hoạt tính lipase .......................................... 46
Bảng 3.3. Các chỉ tiêu kiểm tra sinh hoá P.anomala............................................ 49

Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm xác định giá trị pH phát triển thích hợp ................... 50
Bảng 3.5. Bố trí thí nghiệm xác định giá trị nhiệt độ phát triển thích hợp ........... 50
Bảng 3.6. Bố trí thí nghiệm xác định giá trị pH phát triển thích hợp ................... 51
Bảng 3.7. Các mức của 11 yếu tố trong thiết kế Plackett-Burman....................... 55
Bảng 3.8. Mã hố thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman.................. 57
Bảng 3.9. Giá trị Các điểm sao α trong thiết kế CCD .......................................... 59


Trang 5

Bảng 3.10. Nồng độ ba yếu tố dùng trong RSM –CCD ....................................... 60
Bảng 3.11. Mã hố thiết kế thí nghiệm theo CCD................................................ 60
Bảng 3.12. Thành phần của chất tẩy có enzym .................................................... 65
Bảng 3.13. Thành phần chất tẩy có chứa enzym lipase và protease
công thức 1........................................................................................ 66
Bảng 3.13. Thành phần chất tẩy có chứa enzym lipase và protease
cơng thức 2........................................................................................ 67
Bảng 3.14. Thành phần bột giặt Surf (một sản phẩm của Unilever Việt nam)..... 67
Bảng 3.15. Thành phần bột giặt Only (Công ty CP Bột giặt Lix) ........................ 68
Bảng 3.16. Thành phần bột giặt Omo (một sản phẩm của Unilever Việt nam).... 69
Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra hình thái và sinh sản của P.anomala ........................ 70
Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra đặc tính sinh hố của nấm men P.anomala .............. 71
Bảng 4.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên khả năng phát triển của P.anomala......... 74
Bảng 4.4. Ảnh hưởng của độ thơng khí lên khả năng phát triển
của P.anomala................................................................................... 75
Bảng 4.5. Kết quả thực nghiệm và suy đoán ma trận thiết kế
thí nghiệm Plackett-Burman ............................................................ 76
Bảng 4.6. Mức độ ảnh hưởng của cá yếu tố lên sản lượng lipase......................... 77
Bảng 4.7. Kết quả thực nghiệm theo RSM-CCD để tối ưu hoá sản lượng lipase.....
........................................................................................................... 78

Bảng 4.8. Sản lượng lipase, sinh khối P.anomala ghi nhận được từ 100mL, 3,0L
môi trường tối ưu .............................................................................. 81
Bảng 4.9. Kết quả thu nhận enzym thơ................................................................. 82
Bảng 4.10. Hoạt tính lipase ở các giá trị pH khác nhau........................................ 84
Bảng 4.11. Kết quả kiểm tra độ bền của enzym ở các nhiệt độ khác nhau........... 86
Bảng 4.12. Kết quả ảnh hưởng của ion kim loại và chất ức chế lên hoạt tính lipase
P.anomala ......................................................................................... 87
Bảng 4.13. Kết quả bổ sung lipase thô vào bột giặt.............................................. 88


Trang 6

1. Đặt vấn đề
Mối quan tâm cũng như việc sử dụng enzym lipase trong các ngành công nghiệp
đã gia tăng trong những năm gần đây. Việc ứng dụng lipase gia tăng đồng thời với
những phát hiện ứng dụng lipase trong các lĩnh vực mới làm gia tăng nhu cầu
lipase. Thị phần enzym lipase trên thị trường thế giới ngày càng gia tăng. Trong đó,
lipase từ các vi sinh vật có một ý nghĩa vơ cùng quan trọng trong các ngành công
nghiệp công nghệ sinh học hiện nay. Lipase vi sinh vật đang được ứng dụng trong
các lĩnh vực như: thực phẩm, hoá học, dược phẩm, mỹ phẩm, thuộc da, công nghiệp
tẩy rửa, sản xuất biodiesel, sản xuất các polymer phân huỷ sinh học, y học ứng
dụng, công nghiệp giấy và chế tạo các biosensor.
Trên thế giới, nghiên cứu về enzym lipase vi sinh vật đã đạt được những thành
tựu đáng kể. Nghiên cứu lipase vi sinh vật tập trung vào vi khuẩn (Pseudomonas
spp., Bacillus spp....); nấm mốc (Aspergillus spp., Rhizopus spp.,...); nấm men
(Candida spp., Geochitrum spp., Yarrowia spp.,…). Ở Việt Nam, sản xuất enzym ở
quy mơ cơng nghiệp cịn hạn chế. Đã có nghiên cứu enzym lipase nhưng cịn hạn
chế, cho đến tháng 11/2008 chỉ dưới 20 công bố chủ yếu của nhóm tác giả Q.Đ. Thi
và cs., việc tìm kiếm nguồn lipase mới có khả năng chịu kiềm, chịu acid, chịu nhiệt
vẫn là một chủ đề thu hút sự chú ý của các nhà khoa học.

Pichia anomala có thể phát triển dưới điều kiện môi trường khắc nghiệt như pH
thấp và pH cao, mơi trường có hoạt tính nước thấp, điều kiện áp suất thẩm thấu cao
và điều kiện yếm khí. Nấm men P.anomala đã được nghiên cứu sâu về sinh tổng
hợp ethyl acetate, độc tố giết, hệ enzym (phytase, amylase, invertase,...), khả năng
kháng nấm và điều khiển sinh học trong quá trình bảo quản ngũ cốc. Lipase
P.anomala chưa được nghiên cứu nhiều như các lipase từ nấm men khác như
Candida rugosa. Ở Việt Nam, đã có một số nghiên cứu phân lập P.anomala từ bánh
men rượu đăng trên các tạp chí quốc tế (Thanh và cs., 2008; Dung và cs., 2007).
Tối ưu hố q trình lên men để xây dựng mơ hình nhằm thu được sản lượng lớn
và gia tăng quy mơ sản xuất có một ý nghĩa quan trọng trong việc ứng dụng những
nghiên cứu cơ bản vào trong cơng nghiệp. Bất cứ một q trình lên men nào cũng bị
ảnh hưởng bởi các yếu tố vật lý cũng như sinh hoá học khác nhau. Bước đầu tiên để
tối ưu hoá là sàng lọc các yếu tố quan trọng sau. Một cách đơn giản và thuận tiện là
tối ưu từng yếu tố trong khi giữ nguyên các yếu tố khác. Cách thực hiện này tốn


Trang 7

thời gian và không xác định được sự tác động qua lại của các yếu tố. Thiết kế thí
nghiệm tối ưu đa yếu tố theo Plackett – Burman đã được áp dụng hiệu quả, chi phí
thấp, cho phép nghiên cứu sự tương tác và đồng thời tiên đoán được phạm vi của
các yếu tố. Sau đó, thí nghiệm tối ưu theo phương pháp RSM–CCD1 được dùng để
xác định giá trị tối ưu các yếu tố đang được nghiên cứu.
Từ chủng P.anomala mua từ Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật Việt Nam IMBT
– VNU có hoạt tính lipase, chúng tôi đã dùng chủng nấm men này để thực hiện đề
tài: Tối ưu sản lượng lipase Pichia anomala bằng thiết kế thí nghiệm theo ma
trận Plackett –Burman và RSM-CCD, nghiên cứu đặc điểm lipase thu được.
Mục tiêu nghiên cứu là thiết lập thí nghiệm theo ma trận Plackett-Burman và RSMCCD để thu được sản lượng lipase có hoạt tính cao nhất và ứng dụng trong sản xuất
bột giặt. Nội dung nghiên cứu bao gồm:
1. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chủng nấm men P.anomala.

2. Sử dụng thiết kế thí nghiệm theo ma trận Plackett – Burman để sàng lọc các
yếu tố lý hoá ảnh hưởng đến sản lượng lipase.
3. Sử dụng thiết kế thí nghiệm cấu trúc có tâm và phương pháp bề mặt đáp
ứng để xác định giá trị tối ưu của ba yếu tố cho sản lượng lipase cực đại.
4. Thu nhận sinh khối nấm men.
5. Thu nhận lipase thô từ dịch nuôi cấy bằng kết tủa cồn lạnh.
6. Nghiên cứu một vài đặc điểm của lipase P.anomala.
7. Bổ sung lipase thu được vào một số bột giặt trên thị trường

1

RSM-CCD: Response surface methodology- Central composite designs: phương pháp bề mặt đáp
ứng – các thiết kế cấu trúc có tâm


Trang 8

2. Tổng quan các nghiên cứu liên quan
2.1.

Tổng quan nghiên cứu nấm men P.anomala

Nấm men P.anomala (E.C. Hansen) Kurtzman đã được phân lập ở ổ khu trú tự
nhiên và nhân tạo (Kurtzman, 1999). Nó thường được tìm thấy trong nước uống và
thực phẩm lên men tự nhiên (Masoud và cs., 2004; Sujaya và cs., 2004) và thuộc về
nhóm non-Saccharomyces trong rượu vang (Rojas và cs., 2003). P.anomala có thể
phát triển dưới điều kiện môi trường khắc nghiệt như pH thấp và pH cao, hoạt tính
nước thấp, điều kiện áp suất thẩm thấu cao và điều kiện yếm khí (Fredlund và cs.,
2002). Nhờ vào các đặc tính này, nấm men này có thể gây hư hỏng những thực
phẩm có độ đường cao (Tokuoka và cs., 1985; Lanciotti và cs., 1998). P.anomala

cũng được tìm thấy trong lâm sàng và được coi như vi sinh vật nhiễm trùng cơ hội
(Hazen, 1995). Mặc dù có thể phát triển trong khoảng pH rộng và áp suất thẩm thấu
cao, nhưng P.anomala lại khơng có khả năng kháng ethanol và acetate (Kalathenos
và cs., 1995; Fredlund và cs., 2002). P.anomala có khả năng ngăn chặn nhiều loại
nấm mốc khác nhau và đem lại khả năng điều khiển sinh học nấm mốc trên cây nho
và quá trình bảo quản sau thu hoạch của táo và ngũ cốc (Jijakli và Lepoivre, 1998;
Petersson và Schnurer, 1998; Masih và cs., 2000; Druvefors và cs., 2002). Sinh lý
học và di truyền của P.anomala cịn ít được nghiên cứu. Báo cáo đầu tiên về các đặc
điểm sinh lý, di truyền, thao tác di truyền của P.anomala, đã được công bố
(Grevesse và cs., 2003; Naumov và cs., 2001; Fredlund và cs., 2004).
P.anomala (tên cũ Hansenula anomala; đồng hình dạng với Candida pelliculosa
Redaelli, một số tên đồng nghĩa và các đặc điểm khác [phụ lục 1]) thuộc nhóm nấm
men bào tử túi, hình thành từ 1 đến 4 bào tử có dạng mũ (Wickerham và Burton,
1954; Dũng và cs., 2006). Nó được phân lập và miêu tả lần đầu tiên bởi Hansen vào
năm 1894; Hansen đặt tên là Saccharomyces anomalusi Hansen. Sau đó, Hansen
phân loại lại và chuyển S.anomalus Hansen cùng với S.saturnus Klocker thành một
giống nấm men Willia mới. Tuy nhiên, năm 1919, Sydow đã xếp toàn bộ các loài
trong giống Willia thành một giống Hansenula mới. Giống Hansenula và Pichia lúc
đầu được chia theo khả năng đồng hóa nitrate như là nguồn nitơ duy nhất. Tuy
nhiên, sự khác nhau về khả năng đồng hố nitrate khơng đủ để sắp xếp vào hai
giống. Các lồi của giống Hansenula tạo bào tử hình mũ được phân loại lại thành
giống Pichia (Kurtzman, 1984). Sự phân loại lại hiện nay đã được chấp nhận rộng


Trang 9

rãi, tuy nhiên, nhiều báo cáo vẫn đề nghị dùng H. anomala và đề nghị phục hồi lại
tên Hansenula (Yamada và cs., 1994; Naumov và cs., 2001). Sự đề nghị này dựa
trên sự nghiên cứu phát sinh loài của 500 nấm men bào tử túi, trong đó hầu hết các
nấm men trong giống Hansenula (bao gồm cả P.anomala) hình thành một nhánh

phát sinh (Kurtzman và Robnett, 1998).
Hiện nay, trên thế giới chỉ có một vài kết quả nghiên cứu về di truyền của
P.anomala. P.anomala phân lập từ tự nhiên thường ở dạng nhị bội (Naumov và cs.,
2001). Naumov và cs. (2001) chỉ ra khả năng hình thành giới tính và bào tử hố
giữa các dịng P.anomala khác nhau. Akira (1970) cho rằng số lượng nhiễm sắc thể
(NST) của H.anomala là 2n=4. Tuy nhiên, Naumov và cs. (2001) đã xác định rằng
số lượng NST của P.anomala khoảng 9–12 NST với kích thước từ 850 đến 3500kb.
Tương tự như các lồi khác (Scherer và Magee, 1990; Passoth và cs., 1992; Bai và
cs., 2000), nhiễm sắc thể của các dòng P.anomala thể hiện tính đồng hình cao
(Aragao và cs., 2001; Naumov và cs., 2001; Zagorc và cs., 2001; Recek và cs.,
2002). Nhiều gen của P.anomala đã được tạo dòng và được phân tích.
Ogata và cs. (1995) lần đầu tiên mơ tả hệ thống biến nạp trên cơ sở của dòng
đơn bội ura3 phân lập từ quá trình xử lý nước thải. Hệ thống biến nạp khác được
phát triển bởi Grevesse và cs. (2003) cũng dựa trên cơ sở tính tương đồng của đột
biến ura3.
Hoạt tính của độc tố giết được thể hiện trong nhiều dòng P.anomala (Fredlund
và cs., 2002). Các độc tố khác nhau sẽ khác nhau đáng kể về hoạt tính, đặc tính
phân tử, trọng lượng phân tử, thành phần acid amin, pH và nhiệt độ tối ưu, mức độ
glycosyl hóa và điểm đẳng điện. Độc tố chịu nhiệt duy trì hoạt tính sau 5 giờ ủ ở
60oC và chỉ mất hoạt tính ở 100oC/25 phút.
P.anomala sản xuất ethanol trong mơi trường hạn chế nguồn ôxy, trong điều
kiện nuôi cấy hiếu khí hồn tồn chỉ một ít ethanol được tạo thành. Acetate đuợc
sản xuất trong q trình hơ hấp nhưng khơng sản xuất dưới điều kiện thiếu ôxy
(Fredlund và cs., 2004). P.anomala sản xuất một lượng nhỏ các hợp chất bay hơi,
trong đó phần lớn là ethyl acetate và các hợp chất khác như: ethyl propanoate,
phenyl ethanol và 2-phenylethyl acetate (Westall, 1999). Các con đường chuyển
hóa này chịu tránh nhiệm tổng hợp các ester ở P.anomala có sự khác biệt so với ở
Saccharomyces cerevisiae. Ở S.cerevisiae, ethyl acetate được tạo ra từ acetyl-

Trang 10

coenzyme A và ethanol bằng phản ứng của enzym alcohol acetyl transferase
(Yoshioka và Hashimoto, 1981). Ngược lại, P.anomala thường tổng hợp ester từ
acetate và ethanol theo phản ứng esterase ngược (Yoshioka và Hashimoto, 1981;
Rojas và cs., 2002). Ethyl acetate được sản xuất bởi P.anomala khi có mặt glucose
và có độ thống khí khác nhau. Sự gia tăng ơxy làm giảm ethyl acetate tạo thành
(Gray, 1949; Tabachnick và Joslyn, 1953; Fredlund và cs., 2004). Khi thay đổi từ
điều kiện hiếu khí đến giảm nguồn ơxy, tỷ lệ các sản phẩm đặc biệt được gia tăng
hơn 10 lần (Fredlund và cs., 2004). Ngược lại, Rojas và cs. (2001) nhận thấy có sự
giảm ethyl acetate trong điều kiện thiếu ôxy khi so sánh với điều kiện hiếu khí.
Ethyl acetate cũng có hiệu quả kháng nấm và có thể góp phần vào hoạt động điều
khiển sinh học của P.anomala trong quá trình bảo quản ngũ cốc (Fredlund và cs.,
2004; Druvefors và cs., 2005). Khi P.anomala phát triển trên hạt lượng ester đáng
kể đã được tạo thành (Fredlund và cs., 2004; Druvefors và cs., 2005).
Do đặc điểm sinh lý của P.anomala mà chúng có thể phát triển trong điều kiện
áp suất thẩm thấu cao và khoảng pH rộng (Kagiyama và cs., 1988; Fredlund và cs.,
2002), nó là sinh vật thơng thường trong sữa và các sản phẩm nướng, bia, mơi
trường có nồng độ muối cao và thức ăn gia súc (Kagiyama và cs., 1988; Kitamoto
và cs., 1999; Frohlich-Wyder, 2003). Mặt khác, nấm men này cũng ứng dụng trong
thực phẩm; tạo hương cho thực phẩm và sản phẩm nhũ hóa sinh học (Shepherd và
cs., 1995; Chen và cs., 1998a). P.anomala thường có mặt trong đồ uống, rượu vang
(Mora và Mulet, 1991; Regueiro và cs., 1993; Manzanares và cs., 1999; Zagorc và
cs., 2001). P.anomala thường làm gia tăng hương vị rượu vang bằng cách tạo ra các
hợp chất bay hơi, chủ yếu là ethyl acetate, nhưng cũng có thể sản xuất ra
glycosidase và xylosidase (Manzanares và cs., 1999, 2000; Rojas và cs., 2001). Tuy
nhiên, nồng độ ethyl acetate quá cao (200mg/L) làm rượu vang có vị khó chịu.
P.anomala có trên trái cây, nước ép trái cây (Deak và Beuchat, 1993; Oyewole,
2001; Las Heras-Vazquez và cs., 2003) và các loại nước từ nho, cam (MingoranceCazorla và cs., 2003). P.anomala thể hiện vai trò quan trọng trong nhiều loại thực
phẩm lên men truyền thống như lên men “brem” (rượu gạo của người Balinese), cà

phê, cacao (Sujaya và cs., 2004), “Hamei” (men sản xuất rượu gạo ở Manipur, Ấn
độ) (Jeyaram và cs., 2008). P.anomala cũng được dùng để sản xuất ribonucleotide
và nucleoside dùng để điều vi trong thực phẩm (Kim và cs., 2002; Lee và cs., 2004).


Trang 11

P.anomala có thể ức chế những vi sinh vật có hại ở những mơi trường khác nhau
như một tác nhân điều khiển sinh học (Bjornberg và Schnurer, 1993; Petersson và
Schnurer, 1995, 1998; Petersson và cs., 1998, 1999; Boysen và cs., 2000; Druvefors
và cs., 2002; Druvefors và Schnurer, 2005). P.anomala ức chế Botrytis cinerea trên
táo và trên nho do tiết enzym ly giải vách tế bào (Jijakli và Lepoivre, 1998; Masih
và cs., 2000; Santos và cs., 2004). Hoạt tính kháng nấm của P.anomala do nhiều
yếu tố, sự đứt gãy gen PaEXG2 mã hóa một enzym exoglucanse ngoại bào khơng
làm giảm hoạt tính kháng nấm của dịng P.anomala tái tổ hợp (Jijakli và Lepoivre,
1998). Druvefors và Schnurer (2005) đã xác định P.anomala là một trong số 60 lồi
khác nhau có khả năng ức chế Penicillium roqueforti. Nhiều nấm men phát triển ở
mức tương tự P.anomala mà khơng có khả năng ức chế nấm mốc. Cơ chế kháng
nấm chính của P.anomala khơng phải do cạnh tranh về không gian và dinh dưỡng.
Tăng dinh dưỡng trong điều kiện thí nghiệm điều khiển sinh học khơng làm suy
giảm hoạt tính kháng nấm của P.anomala. Tăng lượng glucose làm gia tăng hoạt
tính kháng nấm của P.anomala J121 mà không thay đổi sinh khối nấm men.
Glucose khi thêm vào môi trường nuôi cấy không ức chế nấm mốc kiểm chứng
(P.roqueforti). Sản phẩm từ chuyển hóa glucose có hoạt tính kháng nấm (Druvefors
và cs., 2005). Nấm bị ức chế do sự gia tăng nồng độ và hoạt tính kháng nấm của
ethyl acetate (Fredlund và cs., 2004; Druvefors và cs., 2005). Dịng đơn bội
P.anomala CBS 1984 ni cấy ở độ hoạt động của nước aw0,95 sản xuất ít ethyl
acetate hơn aw0,98 và giảm khả năng kháng nấm P.roqueforti (Fredlund và cs.,
2004). Một cơ chế kháng nấm khác trên ngũ cốc có thể do hình thành ethanol, tiêu
thụ ơxy và sản xuất CO2 (Druvefors, 2004; Druvefors và cs., 2002, 2005). Độc tố

giết của P.anomala cũng có một khả năng chống lại các nấm mốc và nấm men
không mong muốn (Walker và cs., 1995). Độc tố giết của P.anomala chống lại các
nấm men gây hư hỏng rượu vang (Comitini và cs., 2004).
Khi phát triển trên hạt ngũ cốc, nó có thể tăng một phần giá trị của hạt do nó là
nguồn pprotein và vitamin (Litchfield, 1983). Với khả năng đồng hóa nhiều loại
hợp chất nitơ, nó có thể chuyển hợp chất nitrate và ammonium thành protein để
dùng trong chăn nuôi (Mo và cs., 2004). P.anomala sinh tổng hợp lượng lớn
phytase (myoinositol hexaphosphate phosphohydrolase, E.C. 3.1.3.8. và 3.1.3.26
phân cắt phytate, hợp chất phosphate dự trữ trong thực vật, tạo nên giá trị dinh


Trang 12

dưỡng cho động vật. Vì vậy, P.anomala có thể cải thiện giá trị dinh dưỡng của thức
ăn và giảm gánh nặng cho môi trường bằng cách giảm lượng phospho chứa trong
phân bón (Vohra và Satyanarayana, 2004).
P.anomala là vi sinh vật nhiễm trong nhiều loại thực phẩm và thức ăn gia súc
khác nhau. Tuy nhiên, nó khơng gây hại đến sức khỏe con người, nấm men này
không sản xuất ra mycotoxin (Fleet, 1992). P.anomala được xác định như là tác
nhân khơng gây bệnh (vi sinh vật an tồn sinh học cấp 1 – ATCC [phụ lục 2]),
khơng có bất cứ sự giới hạn nào trong sản phẩm và khơng có bất cứ mối nguy nào
cho sức khỏe con người (DeHoog, 1996).
Kết quả nghiên cứu lipase sinh tổng hợp bởi P.anomala đã được báo cáo (Hou,
1994; González và cs., 2004) nhưng chưa nhiều. P.anomala cũng có vai trị quan
trọng trong lên men dầu ơ liu (López và cs., 2008)
Tại việt nam, đã có nghiên cứu phân lập P.anomala từ bánh men rượu (Dung và
cs., 2007; Thanh và cs., 2008).
2.2.

Tổng quan nghiên cứu lipase nấm men

Lipase (EC 3.1.1.3) [phụ lục 5] được tổng hợp bởi: vi khuẩn, nấm mốc và các
loại tế bào thực vật và động vật (Sztajer và cs., 1988; Rapp và Backhaus, 1992;
Olson và cs., 1994; Ohnish và cs., 1994). Lipase thực hiện phản ứng thuỷ phân các
liên kết ester giữa glycerol và acid béo. Lipase tác động lên nhiều cơ chất khác
nhau: dầu tự nhiên, các triglyceride và các liên kết ester của acid béo. Lipase tác
động đến nhiều vị trí khác nhau trên các cơ chất, do đó, nó được ứng dụng nhiều
trong cơng nghiệp: thực phẩm, hố học, dược phẩm, mỹ phẩm, thuộc da và cơng
nghiệp tẩy rửa (Starace, 1983; Tatara và cs., 1985; Reetz và Jäeger, 1998;
Yoshikiko Yasohara và cs., 2001).
2.2.1.

Nguồn gốc và ứng dụng lipase nấm men

Các lipase được sản xuất bởi nhiều nấm men khác nhau. Hou (1994) đã nghiên
cứu 143 loài nấm men có khả năng sinh enzym lipase (trong tổng số 479 nấm men
được kiểm tra) về mức độ chịu pH và mức độ chịu nhiệt. Trong nghiên cứu này,
Hou đã xác định. Bốn chủng nấm men sản sinh lipase hoạt động ở pH 7,5 mà không
hoạt động ở pH 5,5. Hai mươi ba (23) chủng nấm men sản sinh lipase hoạt động ở
pH 5,5 mà không hoạt động ở pH 7,5. Chín mươi (90) chủng nấm men sản sinh
lipase hoạt động ở cả pH 5,5 và 7,5. Hai mươi sáu (26) chủng nấm men sản sinh


Trang 13

lipase hoạt động ở pH 9,0 ở 60oC [phụ lục 3]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của
mình, Hou chỉ khẳng định các chủng nấm men không sinh tổng hợp ở pH 9,0 và tại
60oC; ở nhiệt độ khác không có kết luận gì. Năm 1997, Hou đã xác định một số đặc
điểm của một số nấm men này.
Lipase C.rugosa nhanh chóng trở thành một trong những enzym được dùng

nhiều nhất trong cơng nghiệp. Đó là bởi vì sự hoạt động linh hoạt của nó trong cả
thủy phân và sinh tổng hợp (Redondo và cs., 1995). Một công ty Nhật Bản đã dùng
lipase C.rugosa để sản xuất acid béo cuối năm 1985 (Macrae và Hammond, 1985).
Pandey và cs. (1999) đã thử nghiệm sản xuất chất mùi trong sữa đặc và kem bằng
cách dùng lipase vi sinh vật. Lipse cố định Candida antarctica AY30 được dùng để
ester hoá các phenol chức năng để tổng hợp chất chống ơxy hố lipophillic dùng
cho dầu hướng dương (Pandey và cs., 1999).
Bảng 2.1.
Chủng nấm men sinh tổng hợp lipase
Tên nấm men
Arxula adeninivorans
Candida albicans

Candida antarctica
Candida curvata
Candida cylindracea
Candida deformans
CBS 2071
Candida ernobii
Candida entomophila
Candida lipolytica
Candida parapsilosis
CBS 604
Candida paralipolytica
C.rugosa/C.cylindracea
ATCC 14380
DMS 2031
L 1754
Candida rugosa
Candida utilis

Tác giả và năm công bố
Boer và cs., 2005
Hube và cs., 2000; Stehr và cs., 2004; David A. Schofield
và cs., 2005; Attila Gacser và cs., 2007
Svendsen và cs., 1994; Høegh và cs., 1995; Patkar và cs.,
1998; Rotticci và cs., 2001; Jan Pfeffer và cs., 2006;
Larsen và cs., 2008; Suhyun Jung & Seongsoon Park
2008
Montet và cs., 1985
Lee và Choo 1989; Hirofumi Nakano và cs., 1991
Muderhwa và cs., 1985
Bigey và cs., 2003
Pignede và cs., 2000a; Pignede và cs., 2000b
Fujimoto và cs., 1996
Padmini và cs., 1990
Bri và và cs., 1995
Neugnot và cs., 2002
Vecozola và Bekers 1978
Valero và cs., 1988,
Brocca và cs., 1995
Benjamin và Pandey, 2001
Veeraragavan và Gibbs, 1989
Fadiloglu và Erkmen 2002; Shaw và cs., 2006; GuanChiun Lee và cs., 1999;
Fusetti và cs., 1996; Zhao và cs., 2008
Fujino và cs 2006


Trang 14

Bảng 2.1. (tiếp theo)
Chủng nấm men sinh tổng hợp lipase
Tên nấm men
Geotrichum sp. FO401B
Geotrichum asteroids FKMF
144
Geochitrum candidum
ATCC 34614
CMICC 335426
NRCC205002; NRRL Y-552;
NRRL Y-533
ATCC 66592
Geochitrum candidum
Kurtzmanomyces sp. I-11
Kluyveromyces lactis
Pichia burtonii
Pichia anomala
Rhodotorula rubra
Rhodotorula glutinis
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomycopsis fibuligera
Saccharomycopsis lipolytica
Schizosaccharomyces pombe
Trichosporon asteroids
Trichosporon cutaneum
Trichosporon fermentans WUC12

Tác giả và năm công bố
Ota và cs., 2000
Kazanina và cs., 1981;

Selezneva và Kazanina 1986
Tahoun và cs., 1982
Shimada và cs., 1990
Charton và cs.,1992
Bertolini và cs., 1994

Jacobsen và Poulsen 1992
E. Vandamme và cs., 1987
Kakugawa và cs., 2002
Oishi và cs.,1999
Sugihara và cs., 1995
Hou 1994
Rapp và Backhaus 1992
Papaparaskevas và cs., 1992
Oishi và cs.,1999
Pandey và cs.,1999
Ruschen và Winkler 1982
Smerdon và cs., 1998
Dharmsthiti và Ammaranond 1997
Chen và cs.,1993
Chen và cs., 1992; Chen và cs., 1993; Chen và cs., 1994;
Arai và cs., 1997
Hadeball và cs., 1991; Ota và cs., 1982; Destain và cs.,
Yarrowia lipolytica
1997; Pignede và cs., 2000a; Pignede và cs., 2000b
Một số nấm men khác xin xem thêm phụ lục 3

Uppenberg và cs. (1994) đã dùng lipase tái tổ hợp của C.antarctica trong chất
tẩy rửa. Lipase ngoại bào của C.cylindracea ATCC 14830 (CCL/CRL) thuỷ phân
các triglyceride khơng đặc hiệu, tác động cả vào vị trí của phân tử glycerol và cả

trong acid béo tự nhiên được giải phóng. Sự đặc trưng linh động này có quan hệ với
các lipase khác tạo tính hữu dụng đặc biệt của CCL/CRL ứng dụng trong công
nghiệp (Lotti và cs., 1993).
Trong công nghiệp tẩy rửa, lipase C.cylindracea và C.lypolytica (hiện nay gọi là
Y.lipolytica) được dùng để phân cắt vết lipid (Pierce và cs., 1990; Batenburg và cs.,
1991). Polyglycerol và các ester của carbohydrate và acid béo sản xuất bằng xúc tác
lipase được dùng rộng rãi trong công nghiệp tẩy rửa và nhũ hóa trong các thực
phẩm khác nhau (thực phẩm ít béo, kem, mayonaise). Gần đây, Unichem
International đã bắt đầu sản xuất isopropyl myristate, isopropyl palmitate và 2-


Trang 15

ethylpalmitate để làm mềm các sản phẩm chăm sóc cá nhân. Các hợp chất này được
sản xuất bằng xúc tác enzym lipase C.cylindracea trong bioreactor.
Một hứa hẹn trong một lĩnh vực mới là dùng lipase vi sinh vật như các
biosensor. Lipase được dùng để xác định lipid trong lâm sàng (Pandey và cs., 1999).
Nguyên lý cơ bản là dùng lipase để sinh ra glycerol từ triacylglycerol và định lượng
glycerol được giải phóng hoặc acid béo tự do bằng phương pháp hoá học và enzym.
Nguyên tắc này cho phép các bác sỹ chân đốn chính xác các bệnh nhân bị bệnh tim
mạch. Các lipase không đặc hiệu, đặc biệt C.rugosa với hoạt tính đặc hiệu cao đã
được chọn lựa cho phép nhanh chóng phóng thích glycerol.
Sự ứng dụng lipase trong tổng hợp hữu cơ rất to lớn. Chọn lọc lập thể của lipase
để hoà tan hỗn hợp acid racemic trong hệ thống hai pha không trộn lẫn vào nhau đã
được chứng minh. Hiệu qủa động học các q trình hồ tan đang thịnh hành trong
tổng hợp Niknomycin-B, thuốc kháng viêm (không phải steroid Naproxen),
ibuprofen, suprofen và ketoprofen, tác nhân kháng virus lamividine (chống lại
HIV), tổng hợp đặc hiệu đối hình các tác nhân alkaloid kháng ung thư, các kháng
sinh và các vitamin (Pandey và cs., 1999). Hernaiz và cs. (1997) đã phân lập hai
dạng lipase đồng phân chọn lọc lập thể A và B từ C.cylindracea. Sản xuất các amin

có hoạt tính quang học là các chất trung gian trong sản xuất dược chất và chất bảo
vệ thực vật đã được miêu tả bởi Smidt và cs. (1996). Lipase C. antarctica với đặc
hiệu lập thể các N-acylamine là thích hợp nhất. Hoạt tính chọn lọc lập thể của lipase
C.rugosa xúc tác hình thành dạng S các dẫn xuất của acid propionic. Dạng S sau đó
được biến đổi thành dạng R có hiệu quả chống lại cơn trùng Tetramuchus (Pandey
và cs., 1999). Các triglyceride, các ester steryl, các acid resin, các acid béo và các
sterol được chiết tách từ gỗ nhờ phản ứng thuỷ phân lipid (dầu hắc ín hoặc nhựa
thơng) có tác động xấu đến q trình sản xuất và chất lượng của giấy (Nguyen và
cs., 2008). Kontkanen và cs. (2004) trong nghiên cứu của họ đã kiểm tra 19 loại
enzym thương mại làm phá hủy các ester của steryl. Họ đã thấy lipase
Pseudomonas sp., Chromobacterium viscosum và C.rugosa được thể hiện có hoạt
tính esterase steryl cao nhất. Tất cả ba loại enzym trên có thể thuỷ phân ester steryl
hồn tồn khi có mặt chất hoạt động bề mặt. Kontkanen và cs. (2004) cho rằng nhờ
vào đặc tính sơ cấp các lipase nấm men đã biết, lipase C.rugosa (CRL) có tiềm năng
nhất trong công nghiệp.


Trang 16

Lipase đã được dùng để sản xuất và biến đổi polymer (Gubitz và Paulo 2003),
tổng hợp chất kháng khuẩn đường ester (Ferrer và cs., 2005). Để sản xuất polymer
từ các vật chất cellulose, một cách tiếp cận mới đã được phát triển bởi Gustavsson
và cs. (2004). Họ dùng lipase B C.antarctica kết hợp với cellulose để xúc tác
polymer hoá mở vòng của ε-caprolactone ngay trên bề mặt của sợi cellulose. Wang
và cs. (2003) đã chứng minh hiệu quả xúc tác sinh học lipase B của C.antarctica
(CAL B) trong thủy phân 1-hoặc 2-hydroxyalkanephosphonate.
2.2.2.

Tinh sạch protein và các thuộc tính hố sinh

Giống như nhiều lipase vi sinh vật khác, lipase nấm men cũng được tinh sạch
bằng hai kỹ thuật chính i) kỹ thuật kết tủa (dùng muối, cồn, …) và ii) kỹ thuật sắc
ký (ion, tương tác kỵ nước, ái lực và rây phân tử).
Đã có nhiều báo cáo về sự đa dạng lipase được sản xuất từ vi sinh vật (đặc biệt
từ nấm men - eukaryotes). Sự đa dạng này là do sự tồn tại của các gen khác nhau,
quá trình cải biến sau phiên mã, sau dịch mã, sự khử glycosylation hoá, v.v. Các
nấm

men

C.albicans,

C.antarctica,

C.rugosa,

G.asteroids,

C.candidium,

T.fermentans, S.lipolytica, Y.lipolytica, v.v. đã được báo cáo sản xuất ra nhiều dạng
lipase khác nhau.
2.2.2.1.

Lipase từ nấm men Pichia

Lipase từ Pichia burtonii đã được nghiên cứu (Sugihara và cs., 1995). Các loài
Pichia khác cũng đã được phát hiện sinh tổng hợp lipase (Hou, 1994). Đặc biệt,
lipase Pichia có khả năng chịu kiềm và chịu nhiệt tốt [11 dòng chịu nhiệt ở 60oC và
pH 9,0-phụ lục3] (Hou, 1994). Lipase P.anomala vẫn chưa được nghiên cứu nhiều.

Bảng 2.2.
Tính đặc hiệu cơ chất của lipase một số dòng Pichia (Hou, 1997)
Dòng Pichia
P. americana Y-2156
P. bimundalis Y-5343
P. candensis Y-2340
P. lynferdii Y-7723
P. muscicola Y-7005
P. holstii Y-7914
P. muscicola Y-7006
P. petersanii YB-3808
P. sydowiorum Y-7130

Sản phẩm được xác định bằng TLC
Tính đặc
1,2- 1,3 mono
FFA
hiệu
+++
+/++++++
1,3+
+/1,3+++
++
+++
1,3++
+/++
1,3+++
+
+++
+++++

Ngẫu nhiên
++
+
+/+/Ngẫu nhiên
++
+
1,3+++
++
+++++
1,3++
++
++
1,3-


Trang 17

Hou (1994) đã nghiên cứu xác định hai dòng P.anomala Y366 và Y993 có khả
năng tổng hợp lipase hoạt động ở cả pH 5,5; 7,5 và chưa đi sâu nghiên cứu về các
lipase này (trao đổi cá nhân với Hou). Mười năm sau, González và cs., (2004) cũng
đã xác định hai dịng P.anomala có khả năng sinh tổng hợp lipase khi họ xác định
hoạt tính enzym của một số lồi nấm men. Năm 1997, Hou đã xác định tính đặc
hiệu cơ chất của một số dòng Pichia (Bảng 2.2).
2.2.2.2. Lipase từ các nấm men khác
Nhiều dòng C.rugosa/C.cylindracea (L.1754, ATCC 14830, DSMZ 2031) đã
được ứng dụng để sản xuất lipase. Sự tinh sạch và đặc điểm của một số enzym đó
đã được báo cáo. Hai lipase khác nhau từ C.rugosa (C. cylindrcea L.1754) đã được
xác định và tách bằng cột sắc ký trao đổi ion độ phân giải cao (mono Q) sau khi tủa
lipase bằng cồn. Lipase I được rửa giải ở 0,05M NaCl ngược lại lipase II được rửa
giải ở 0,15M NaCl từ cột này. Tính anion tự nhiên kém của lipase I được xác định

khi điện di trên gel polyacryamide tự nhiên và điện di điểm đẳng điện. Các protein
có trọng lượng phân tử 58kDa/SDS-PAGE. Điểm đẳng điện của lipase I và II lần
lượt là 5,8 và 5,6 (Veeraragavan và Gibbs, 1989). Shaw và Chang (1989) đã chứng
minh có ba lipase khác nhau A, B và C trong sản phẩm lipase C.rugosa thương mại
được cung cấp bởi Sigma. Tất cả ba loại này đều thể hiện hoạt tính thủy phân lipid
một cách đáng tin cậy. Tất cả ba lipase này đều gắn với DEAE-Sepharose đã được
cân bằng với đệm phosphate 0,1M ở pH 6,8 nhưng lipase A gắn yếu với cột này và
có thể được rửa giải bằng 0,2M–0,25M NaCl. Lipase B và C cùng được rửa giải
bằng 0,3M–0,6M NaCl. Shaw và Chang (1989) đề nghị rằng lipase A và C tương
ứng với lipase II và I được báo cáo bởi Veeraragavan và Gibbs (1989). Trọng lượng
phân tử của lipase A, B và C đã được xác định là 362, 200 và 143 KDa. Kết quả
SDS-PAGE thể hiện lipase A và C được cấu tạo từ các tiểu phân tử 62KDa (lipase
A-hexamer, B-trimer, C-dimer). Lipase A có nhiệt độ phản ứng tối ưu cao hơn và
bền với nhiệt hơn so với lipase C. pH tối ưu cho lipase A và C lần lượt là 7,0 và 5,0.
Lipase A và C thể hiện hoạt tính thuỷ phân lipid cao trên các ester với chuỗi acyl
trung bình. Hiện tại vẫn chưa có nhiều thơng tin về thuộc tính của lipase B và mối
liên hệ của nó với lipase I đã được báo cáo bởi Veeraragavan và Gibbs (1989).
Chang và cs. (1994) đã công bố bản PAGE của enzym thủy phân lipid thu được từ
ba mẫu lipse C.rugosa thương mại từ ba nhà cung cấp. Họ đã nghiên cứu ảnh hưởng


Trang 18

của điều kiện nuôi cấy trên việc sản xuất lipase từ C.rugosa ATCC 14830 và cho
rằng điều kiện nuôi cấy không chỉ ảnh hưởng đến việc sản sinh lipase mà còn ảnh
hưởng đến sự đa dạng của các lipase. Họ đã dùng tween 20 và 80 trong môi trường
nuôi cấy C.rugosa kết quả sản xuất ra nhiều dạng lipase khác nhau về tính đặc hiệu
cơ chất và khả năng bền với nhiệt. Họ cho rằng tính đặc hiệu và sự ổn định của
lipase có thể được điều chỉnh bằng điều kiện nuôi cấy. Chang và cs. (1994) cho rằng
sự đa dạng là kết quả sự thay đổi sự biểu hiện của gen, tỷ lệ liên kết với

carbohydrate, sự proteolysis một phần và sự cải biến sau phiên mã. Cho đến nay, 5
gen mã hoá cho lipase đã được phân lập từ C.rugosa, điều này thể hiện rằng sự đa
dạng của lipase mà Chang và cs. (1994) đã xác định là kết quả của sự thay đổi về
cách biểu hiện gen.
Lotti và cs. (2001) đã nghiên cứu lipase từ C.rugosa/C.cylindracea. Họ đã thực
hiện nghiên cứu đánh giá quá trình sinh tổng hợp sản phẩm của tế bào C.rugosa trên
các môi trường khác nhau. Nấm men sinh ra một loạt lipase khác nhau do sự hiện
diện của các gen mã hóa đa lipase, sự biểu hiện của các gen này được điều chỉnh
bởi nguồn cacbon. Nguồn C được sử dụng trong lên men có thể hoạt động như một
chất kìm hãm như glucose, sorbitol. Các cơ chất trung tính có thể sử dụng trong hai
bước lên men, trong đó, bước đầu là phát triển sinh khối (cơ chất trung tính) sau đó
cảm ứng gen biểu hiện lipase (cơ chất đặc hiệu).
Các lipase C.rugosa được dùng rộng rãi trong biến đổi sinh học với khả năng
bền với nhiệt và đặc hiệu cơ chất. Tỷ lệ và bản chất của nhóm carbohydrate gắn vào
có vai trị quan trọng trong tương tác cấu trúc của glycoprotein với bề mặt chung
dầu và nước, khả năng bền với nhiệt, tương tác kỵ nước và toàn bộ hoạt tính xúc tác
của lipase. Loại bỏ các nhánh đường làm giảm hoạt tính enzym trong phản ứng thuỷ
phân tributyrin, trong tổng hợp heptyl oleate và giảm độ bền với nhiệt. Trạng thái
cân bằng của enzym này với lactose hoặc với dextran tạo ra sự tái kích hoạt một
phần của xúc tác sinh học. Benjamin và Pandey (2001) đã phân lập và mô tả ba
dạng khác nhau của lipase từ C.rugosa (DM - 2031), được sản xuất bằng lên men
rắn. Ba dạng lipase ngoại bào khác nhau (lipA, lipB và LipC) đã được phân lập
bằng cách tủa với ammonium sulphate, thẩm tích, siêu lọc và lọc gel dùng
Sephadex-200. Sự tinh sạch tăng gấp 43 lần. SDS- PAGE của lipase đã được tinh
sạch có ba dải khác nhau có trọng lượng phân tử 64, 62 và 60kDa. Tất cả ba dạng


Trang 19

này hoạt động tối ưu ở 35-40ºC và pH 7-8. Các ion Ag+ và Hg2+ ức chế mạnh mẽ

hoạt tính của tất cả các dạng đồng phân ngược lại Ca2+ và Mg2+ gia tăng hoạt tính
của lipase. Hoạt tính của ba dạng này hoàn toàn bị ức chế bởi chất ức chế protease
serin gọi là dichloroisocoumarin và pefabloc. Phenylmethanesulphonyl fluoride ức
chế một phần hoạt tính của chúng.
Lopez và cs. (2004) đã so sánh ba loại enzym đồng phân của C.rugosa (CRL:
Lip1, Lip2 và Lip3) về sự chọn lọc và độ phản ứng của chúng trong môi trường
nước và môi trường hữu cơ. Nghiên cứu này chỉ ra rằng Lip1 và Lip3 có độ ổn định
như nhau và thấp hơn Lip2. Tuy nhiên, trong môi trường nước, Lip3 thuỷ phân ester
p-niotrophenyl mạnh nhất và Lip1 thể hiện hoạt tính thuỷ phân triacylglyceride
trong môi trường nước cao nhất. Sự khác nhau rõ rệt của các đồng phân thể hiện khi
thuỷ phân triacylglyceride. Các chuỗi acyl ngắn, trung bình, dài của triacylglyceride
lần lượt là các cơ chất thích hợp cho Lip3, Lip1 và Lip2.
Các đồng phân CRL rất khó tách riêng để mô tả như những protein tinh khiết.
CRL1 được biểu hiện q mức ở P.pastoris, có hoạt tính cao trên các cơ chất có
chuỗi dài trung bình (C8-C10) khi thuỷ phân các ester methy và triglyceride, ngược
lại, CRL4 và CRL2 tái tổ hợp biểu hiện trong P.pastoris hoạt động tốt trên các phân
tử lớn (C16-C18). CRL3, có hoạt tính đáng kể trên cơ chất hồ tan có chuỗi ngắn và
khả năng thuỷ phân các ester của cholesterol có chuỗi acid béo dài. Hoạt tính
esterase cholesterol của CRL2 cũng đã được chứng minh (Brocca và cs., 2003).
Tsujisaka và cs. (1973) đã tinh sạch lipase G.candidum Link bằng phân đoạn
(NH4)2SO4, sắc ký DEAE – Sephadex, lọc gel sephadex G-100 và G-200. Trọng
lượng phân tử của enzym được ước lượng là 55kDa và điểm đẳng điện 4,33. Tinh
thể có chứa khoảng 7% carbohydrate và một lượng nhỏ các lipid. Lipase này hoạt
động trên dầu ôliu ở pH 5,6 và 7,0 ở 40ºC. Enzym này vẫn duy trì hoạt tính ở pH
4,2 – 9,8 trong 24 giờ. Enzym vẫn duy trì hoạt tính ở nhiệt độ thấp hơn 55ºC trong
15 phút.
Hai dạng lipase đã được phân lập từ G.candidum ATCC 34614 kết hợp giữa tủa
cồn và sắc ký trên cột trao đổi ion Sephacryl HR và đa đệm trao đổi 94. Trọng
lượng phân tử của các enzym khoảng 56KDa. Giá trị pH tối ưu và điểm đẳng điện
của các đồng phân lần lượt là 6,8; 6,0 (lipase I) và 4,46; 4,56 (lipase II). Các enzym

có thể bền vững trong pH 6,0 – 8,0. Ion hoá trị 1 có ảnh hưởng yếu đến hoạt tính