Khảo sát quá trình lên men bởi corynebacterium glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng dụng lên men thu nhận l lysine

Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
------------------------------------------------------------

TRẦN THỊ MINH TÂM

Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium
glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng
dụng lên men thu nhận L-lysine.

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60. 42. 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THUÝ HƯƠNG

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2009


TĨM TẮT
Đề tài: “Khảo sát q trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự
do và chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine”.
Đề tài thu được các kết quả như sau:
1. Điều kiện tối ưu thu nhận L-lysine là: môi trường lên men: dịch bắp 20%,
glucose 8,35%, biotine 1,57mg/L, urease 0,74%, KH2PO4 0,1%, MgSO4 0,025%,
thiamine 4mg/L; điều kiện lên men: giống bổ sung 3% (chất lượng giống 2.108 tế
bào/mL), pH 7.0, nhiệt độ 300C, lắc 200 vòng/phút; sản lượng L-lysine đạt được là:
28 g/L tăng 5,5 lần so với khảo sát ban đầu ở cùng thời gian lên men (72 giờ).
2. Cũng với điều kiện như trên, khi lên men trong fermentor tự động (khuấy đảo
300 vòng/phút, dO2 = 100%) thì sản lượng L-lysine đạt được là: 32,6 g/L tăng gấp
1,25 lần so với điều kiện lên men theo mẻ và tăng gấp 6,4 lần so với khảo sát ban

đầu trong cùng thời gian lên men.
3. Trong 3 loại chất mang khảo sát (Alginate, Bacterial Cellulose và phức Alginate
– Bacterial Cellulose), phức chất mang Alginate – Bacterial Cellulose (A-BC) có ưu
thế nhất. Điều kiện cố định trên chất mang A-BC là: dịch alginate 3% và tế bào
C.glutamicum đồng nhất với mật độ 1010 tế bào/mL; BC hấp phụ dịch giống bằng
máy lắc 200 vòng/phút trong 30 phút; bổ sung chất hỗ trợ gel CaCl2 2%; thời gian ủ
3 ngày, nhiệt độ ủ 300C; thì lượng vi khuẩn cố định trên phức chất mang đạt được
là: mật độ trung bình: 8,7.109 tế bào/g; mật độ vi khuẩn trên bề mặt ngoài chất
mang: 4,8.104 tế bào/cm2; mật độ vi khuẩn bên trong chất mang: 4,2.104 tế bào/cm2.
4. Ứng dụng chế phẩm cố định trên chất mang A-BC trong lên men thu nhận Llysine theo mẻ: số lần tái sử dụng: 12 lần, và sản lượng lysine trong 12 lần tái sử
dụng đạt 27,77 g/L không khác biệt lớn so với lên men tế bào tự do (kết quả được
so sánh với phương pháp định lượng lysine bằng đo mật độ quang, sản lượng mẫu
đối chứng là 28 g/L).
Một phần các kết quả trên được công bố qua bài báo:
Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị Minh Tâm (2009), “Ứng dụng vi khuẩn
Corynebacterium sp. cố định trong lên men thu nhận L-lysine”, Tạp chí khoa học và
công nghệ các trường đại học kỹ thuật, Số 70, trang 96 -100.


SUMMARY
My thesis: “The survey of fermentation process by free and immobilized
Corynebacterium glutamicum to uptaking L-lysine”.
The results are given as follows:
1. Optimal conditions for producing L-lysine in batch: medium: maize juice 20%,
glucose 8,35%, biotine 1,57mg/L, urease 0,74%, KH2PO4 0,1%, MgSO4 0,025%,
thiamine 4mg/L; cultural conditions: cultural rate 3% (cultural quality

2.108

CFU/mL), pH 7.0, 300C, round - shake 200 rpm; the yield is 28 g/L raise 5,5 folds

than the first survey in the same fermenting time.
2. However, the L-lysine yield, when we fermented it in automatic fermentor
(agitate

300 rpm, dO2 = 100%), is 32,6 g/L raise 1,25 folds than the batch

fermentation in the same fermenting time.
3. In 3 carriers (A, BC, A-BC), the A-BC is the most advanteged carrier. The
optimal conditions of immobilized C. glutamicum in A-BC carrier are: Alginate
solution 3% and C.glutamicum cells with colony density 1010CFU/mL; BC absorbs
C.glutamicum cells by round – shake 200 rpm in 30 minutes; adding CaCl2 2%;
expand conditions:3 days in 300C. With these conditions, the immobilized cell in
the A-BC carrier is given:
Medium cells density: 8,7.109 CFU/g.
Cells density in the surface of the carrier: 4,8.104 CFU/cm2.
Cells density in the internal carrier: 4,2.104 CFU/cm2.
4. The effect of using C.glutamicum immobilized in A-BC for producing L-lysine
was high; it could be reused about 12 times and lysine yield is 27,77 g/L, the quality
of L-lyine remained rather good against control experiments.
Some results are presented in the Journal: Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị
Minh Tâm (2009), “Immobilizing Corynebacterium sp. cell and application for
producing L-lysine”, Journal of Science & Technology, No. 70, pages 96 -100.


Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2009
Đầu tiên, tơi xin gởi lời cảm ơn đến Trường Đại học Bách
khoa, Khoa Cơng nghệ Hóa học và Bộ mơn Cơng nghệ Sinh học đã
tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn này.
Con xin gởi lời tri ân đến Ba, Má đã nuôi dưỡng, dạy bảo
con từ những điều nhỏ nhất và ba, má luôn luôn là chỗ dựa vững

chắc cho con đi suốt cuộc đời này.
Con xin chân thành cảm ơn dì Út đã ln ln động viên,
chia sẽ và sẵn sàng giúp đỡ con vượt qua những khó khăn trong
cuộc sống. Hai cảm ơn các em (Bé ba, bốn, năm, Ý, Linh) đã tạo
động lực giúp Hai hoàn thành tốt nhiệm vụ to lớn này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Thầy TS. Trần Viết Mỹ,
người đã động viên, khuyến khích em theo đuổi ước mơ và ln ln
chỉ bảo em mỗi khi em gặp khó khăn trong học tập và trong cuộc
sống.
Xin gởi lời cảm ơn đến Thầy TS. Nguyễn Quốc Bình và các
Thầy cơ khác đã dạy dỗ, truyền đạt những kiến thức quý báu trong
suốt quá trình học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Bách khoa.
Xin cảm ơn các Thầy cô trong bộ môn Công nghệ sinh học
đã tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành luận văn này.
Tơi xin cảm ơn bạn Lê Thị Chi đã luôn luôn bên cạnh tơi
trong suốt q trình học tập và nghiên cứu tại trường Đại học bách
khoa. Bạn Chi đã giúp đỡ tôi rất nhiều cả về học tập, lẫn tinh thần.
Xin cảm ơn những người bạn đã cùng tôi học tập, cùng trao đổi,
động viên và sẵn sàng giúp đỡ tôi khi cần thiết.
Cuối cùng, tơi xin cảm ơn anh “Rịm” luôn đặt niềm tin ở
tôi, luôn động viên, giúp đỡ và điểm tựa cho tôi trong suốt thời gian
qua.

Trần Thị Minh Tâm


Tp. Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2009
Tơi xin gởi lời cảm ơn chân thành và sự biết ơn sâu sắc đến
cô TS. Nguyễn Thúy Hương. Người đã giúp đỡ tôi rất nhiều từ
những ngày mới bước chân vào trường. Cô đã giúp tôi tự tin để bắt

đầu bước vào lĩnh vực mới, một chuyên ngành mới và dấu ngoặc
mới về chuyên môn đã thay đổi từ những ngày đầu tiên gặp cơ.
Trong suốt q trình học tập tại trường, cô luôn tạo cho tôi
nhiều cơ hội để phát huy khả năng của mình, và khắc phục những
điểm yếu của bản thân.
Cô đã giúp tôi xây dựng phương hướng, mục tiêu cũng như
hướng dẫn khoa học cặn kẽ cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu
tại trường. Từ những khái niệm sơ khai có được, cơ đã giúp tơi nắm
bắt kịp cùng bạn bè.
Cô đã giành rất nhiều thời gian cho tôi, giúp tôi viết báo,
đăng báo và giúp tôi hồn thành luận văn này.
Khơng những về chun mơn, cơ cịn là người mẹ, người bạn
của tơi. Cơ ln động viên, chia sẽ, giúp tơi vượt qua và hồn thành
nhiệm vụ tốt nhất.
Tôi không biết phải viết như thế nào để bày tỏ lịng biết ơn
xứng đáng cho những gì cô dành cho tôi. Tất cả tôi khắc ghi trong
trái tim bé nhỏ của mình. Khắc ghi mãi mãi.
Tơi xin hứa sẽ chăm lo học tập và xây dựng cho riêng mình
một hướng đi như mong ước của cơ. Tơi sẽ cố gắng hồn thiện
mình, hồn thiện trong cách học tập, cách sống và cách để sẽ chia.
Một lần nữa, tôi xin chân thành biết ơn cô – TS. Nguyễn
Thúy Hương.

Trần Thị Minh Tâm


TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM
KHOA CƠNG NGHỆ HĨA HỌC
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
------------------oOo--Tp. HCM, ngày . . . . . tháng . . . . . năm . . . . .

.

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: TRẦN THỊ MINH TÂM

Giới tính : Nữ

Ngày, tháng, năm sinh :

Nơi sinh : Quảng nam

30/ 08/ 1983

Chuyên ngành : Cơng nghệ sinh học

MSHV: 0310.7771

Khố (Năm trúng tuyển) : 2007
1- TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium glutamicum tự
do và chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine.
2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN: Thực hiện theo mục tiêu nghiên cứu, thiết lập các thí
nghiệm tối ưu để thu được sản lượng lysine cao nhất, ứng dụng lên men trên
fermentor bởi tế bào tự do và chế phẩm cố định. Nội dung nghiên cứu bao gồm:
Khảo sát các điều kiện tối ưu lên men thu nhận lysine.
Ứng dụng điều kiện tối ưu lên men trên fermentor.
Khảo sát điều kiện cố định tế bào trên một số chất mang.
Ứng dụng chế phẩm cố định lên men trong điều kiện tối ưu theo mẻ.
3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : tháng 6/2008
4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : tháng 8/2009
5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông
qua.
CB HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CN. BỘ MÔN
QL CHUYÊN NGÀNH

(Họ tên và chữ ký)

KHOA QL CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh
------------------------------------------------------------

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THUÝ HƯƠNG

-----------------------------------------------

Cán bộ chấm nhận xét 1: ----------------------------------------------------

-----------------------------------------------

Cán bộ chấm nhận xét 2: ---------------------------------------------------

------------------------------------------------

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ
LUẬN VĂN THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA,
ngày …… tháng …… năm …….


Đại học Quốc gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
------------------------------------------------------------

TRẦN THỊ MINH TÂM

Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium
glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng
dụng lên men thu nhận L-lysine.

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60. 42. 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THUÝ HƯƠNG

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 8 năm 2009


MỤC LỤC

MỞ ĐẦU ................................................................................................................1
CHƯƠNG 1

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. VI KHUẨN CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM ....................................2
1.1.1. Lịch sử và phân loại......................................................................................2
1.1.2. Đặc điểm vi khuẩn C. glutamicum ................................................................2
1.1.3. Đặc điểm di truyền của vi khuẩn C. glutamicum ...........................................3
1.1.4. Sự chuyển hóa vật chất trong C. glutamicum ................................................3
1.2. AMINO ACID LYSINE.................................................................................6
1.2.1. Giới thiệu......................................................................................................6
1.2.2. Đặc điểm ......................................................................................................7
1.2.3. Sinh tổng hợp L-lysine..................................................................................7
1.2.3.1. Cụm gen sinh tổng hợp L-lysine ........................................................7
1.2.3.2. Q trình tổng hợp và điều hịa sinh amino acid lysine.......................8
1.2.4. Lên men thu nhận L-lysine ......................................................................... 10
1.2.4.1. Ảnh hưởng của chủng sản xuất ........................................................ 10
1.2.4.2. Ảnh hưởng của thành phần dinh dưỡng............................................ 12
1.2.4.3. Ảnh hưởng của một số điều kiện ngoại cảnh .................................... 12
1.2.4.4. Kỹ thuật lên men thu nhận amino acid lysine ................................... 13
1.3. CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT .............................................................. 14
1.3.1. Định nghĩa cố định tế bào vi sinh vật .......................................................... 14
1.3.2. Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật....................................................... 14
1.3.2.1. Phân loại phương pháp cố định tế bào.............................................. 14
1.3.2.2. Chất mang cố định tế bào vi sinh vật................................................ 15
1.3.3. Những chất mang sử dụng liên quan đến đề tài ........................................... 16
1.3.3.1. Chất mang Alginate ......................................................................... 16
1.3.3.2. Chất mang Bacterial Cellulose (BC) ................................................ 17


1.4. BẢO QUẢN VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ ........... 18
1.4.1. Khái niệm và phương pháp ......................................................................... 18
1.4.2. Yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sống sót của vi sinh vật trong q trình sấy

khơ ................................................................................................................... 20
1.5. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC VỀ HƯỚNG CỦA ĐỀ
TÀI ..................................................................................................................... 21
1.5.1. Những nghiên cứu trong nước .................................................................... 21
1.5.2. Những nghiên cứu ngoài nước .................................................................... 22
CHƯƠNG 2

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. NGUN VẬT LIỆU, HĨA CHẤT, MƠI TRƯỜNG ................................. 27
2.1.1. Giống vi sinh vật ........................................................................................ 27
2.1.2. Môi trường nuôi cấy ................................................................................... 27
2.1.3. Vật liệu, hóa chất........................................................................................ 28
2.1.4. Thiết bị, dụng cụ......................................................................................... 28
2.2. NỘI DUNG THÍ NGHIỆM .......................................................................... 28
2.3. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM................................................................................. 30
2.3.1. Kiểm tra và chọn giống............................................................................... 30
2.3.2. Tối ưu các điều kiện lên men ...................................................................... 31
2.3.2.1. Khảo sát các điều kiện lên men ........................................................ 31
2.3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các nguồn cacbon ...................................... 32
2.3.2.3. Tối ưu các thành phần môi trường bằng phương pháp quy hoạch thực
nghiệm ......................................................................................................... 33
2.3.3. Khảo sát các điều kiện lên men trên fermentor............................................ 35
2.3.4. Tăng hiệu suất lên men bằng phương pháp cố định tế bào........................... 36
2.3.4.1. Cố định tế bào trên chất mang Alginate : phương pháp nhốt ............ 36
2.3.4.2. Cố định tế bào trên chất mang Bacterial Cellulose (BC): phương pháp
bẫy – bẫy hấp phụ .......................................................................................... 37
2.3.4.3. Cố định trên phức chất mang A - BC ............................................... 38

2.4. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÍ NGHIỆM............................................. 39
2.4.1. Phương pháp vi sinh ................................................................................... 39
2.4.1.1. Kiểm tra hình thái vi sinh vật [10].................................................... 39
2.4.1.2. Kiểm tra mật độ tế bào ..................................................................... 39
2.4.1.3. Định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo mật độ quang ............. 40
2.4.2. Phương pháp hóa sinh................................................................................. 40
2.4.2.1. Kiểm tra giống bằng phương pháp sinh hóa ..................................... 40
2.4.2.2. Phân tích định tính amino acid trong dịch lên men bằng phương pháp
sắc ký giấy: phương pháp Lumir Macholan và cs. (1962)............................... 40
2.4.2.3. Phân tích định lượng sơ bộ amino acid trong dịch lên men bằng
phương pháp đo mật độ quang: phương pháp của Vogel và Shimura (1968) .. 41
2.4.2.4. Phân tích định lượng lysine bằng phương pháp GC EZ faast:........... 42
CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN

3.1. GIỐNG VI SINH VẬT................................................................................. 43
3.1.1. Nguồn giống vi sinh vật.............................................................................. 43
3.1.2. Đặc điểm sinh học của chủng Corynebacterium glutamicum ...................... 43
3.2. TỐI ƯU CÁC ĐIỀU KIỆN LÊN MEN THU NHẬN L-LYSINE ................. 46
3.2.1. Khảo sát các các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men........................... 46
3.2.2. Ảnh hưởng các nguồn cacbon đến quá trình lên men .................................. 50
3.2.3. Tối ưu thành phần môi trường bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm . 51
3.3. LÊN MEN TRÊN FERMENTOR ................................................................ 56
3.3.1. Ảnh hưởng của chế độ khuấy đảo đến khả năng sinh tổng hợp L-lysine...... 56
3.3.2. Ảnh hưởng của lượng oxy cung cấp đến khả năng sinh tổng hợp L-lysine .. 57
3.4. CỐ ĐỊNH TẾ BÀO C.GLUTAMICUM TRÊN CÁC CHẤT MANG ............ 58
3.4.1. Cố định tế bào C.glutamicum trên chất mang Na-Alginate bằng phương pháp
nhốt tạo gel ........................................................................................................ 58
3.4.1.1. Khảo sát nồng độ Na-Alginate ảnh hưởng đến quá trình cố định...... 58

3.4.1.2. Khảo sát nồng độ CaCl2 ảnh hưởng đến khả năng tạo hạt Alginate .. 59


3.4.1.3. Khảo sát mật độ tế bào ảnh hưởng đến quá trình cố định.................. 60
3.4.2. Cố định trên chất mang Bacterial Cellulose (BC) bằng phương pháp bẫy –
bẫy hấp phụ ....................................................................................................... 61
3.4.2.1. Khảo sát chế độ khuấy đảo ảnh hưởng đến quá trình cố định ........... 61
3.4.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình cố định................ 62
3.4.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình cố định.................... 62
3.4.3. Cố định trên phức chất mang A - BC bằng phương pháp kết hợp nhốt và bẫy
bẫy hấp phụ ....................................................................................................... 63
3.4.4. Năng suất L-lysine sau những lần tái sử dụng và tỷ lệ rửa trôi của các chế
phẩm so sánh với sản lượng lysine được định lượng bằng phương pháp đo mật độ
quang (mục 3.2). ................................................................................................ 65
CHƯƠNG 4

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

4.1. KẾT LUẬN.................................................................................................. 68
4.2. KIẾN NGHỊ ................................................................................................. 69
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các chủng đã nghiên cứu lên men thu nhận lysine. ................................ 11
Bảng 1.2. Các chủng C.glutamicum tái tổ hợp đã nghiên cứu lên men để thu nhận
lysine..................................................................................................................... 11
Bảng 2.1. Thành phần môi trường ......................................................................... 27

Bảng 2.2. Thống kê các thiết bị và dụng cụ sử dụng trong đề tài............................ 28
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm xây dựng đường cong tăng trưởng và tăng lysine của
C.glutamicum theo thời gian. ................................................................................ 31
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm khảo sát điều kiện lên men ......................................... 32
Bảng 2.5. Bố trí thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng các nồng độ cacbon ................ 33
Bảng 2.6. Bố trí các mức thí nghiệm tối ưu............................................................ 34
Bảng 2.7. Bố trí ma trận thí nghiệm tối ưu............................................................. 34
Bảng 2.8. Bố trí thí nghiệm khảo sát lượng oxy hịa tan......................................... 35
Bảng 2.9. Bố trí thí nghiệm tối ưu cố định tế bào trên chất mang Alginate. ........... 36
Bảng 2.9 (tiếp theo). Bố trí thí nghiệm tối ưu cố định tế bào trên chất mang
Alginate................................................................................................................. 37
Bảng 2.10. Bố trí thí nghiệm tối ưu cố định tế bào trên chất mang BC................... 38
Bảng 3.1. Đặc điểm sinh học của chủng C. glutamicum VTCC-B-656 .................. 43
Bảng 3.2. Ma trận tối ưu toàn phần và chỉ tiêu theo dõi là lượng lysine sinh ra sau
72 giờ lên men....................................................................................................... 52
Bảng 3.3. Phân tích thí nghiệm ở tâm phương án................................................... 52
Bảng 3.4. So sánh tính ý nghĩa của các hằng số hồi quy theo tiêu chuẩn Student ... 53
Bảng 3.5. Số liệu kiểm định sự tương thích với thực nghiệm ................................. 54
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của chế độ khuấy đảo đến khả năng sinh tổng hợp L-lysine
của chủng C. glutamicum VTCC-B-656 với dO2 = 100% theo thời gian lên men. . 56
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của oxy cung cấp đến khả năng sinh tổng hợp L-lysine của
chủng C.glutamicum VTCC-B-656 theo thời gian lên men. ................................... 57
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ Na-Alginate đến quá trình cố định................... 59


Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ CaCl2 đến khả năng tạo hạt Alginate ............... 60
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ tế bào đến quá trình cố định........................... 60
Bảng 3.11. Tỷ lệ rửa trôi tế bào sau mỗi lần tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố
định (%) ................................................................................................................ 66

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Hệ thống phân loại vi khuẩn C.glutamicum [54].......................................2
Hình 1.2. Bộ gen C.glutamicum ATCC 13032 (DSM 20300, IMET 10482, NCBI
10025) [43, 64]. .......................................................................................................3
Hình 1.3. Sơ đồ tóm lược q trình chuyển hóa các chất ở C.glutamicum [18]. .......4
Hình 1.4. Động học phản ứng xảy ra bên ngồi mơi trường ni cấy và bên trong
Cytosol [18].............................................................................................................4
Hình 1.5. Quy trình chuyển hóa các chất trong C.glutamicum sinh amino acid lysine
bắt đầu từ trung tâm phản ứng Phosphoenolpyruvate [18]………………………….5
Hình 1.6 Cơng thức cấu tạo amino acid L-lysine [65]. .............................................7
Hình 1.7. Cụm gen sinh tổng hợp lysine [43]...........................................................8
Hình 1.8. Sơ đồ điều hịa ngược từng chặng trong quá trình sinh tổng hợp amino
acid ở chủng C.glutamicum [8]................................................................................9
Hình 1.9. Sơ đồ các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật [26]........................... 15
Hình 1.10. Cấu tạo Alginate và các mạch polymer MM, MG, GG [20]................. 16
Hình 1.11. Cấu trúc gel hình “hộp trứng” [20]. ...................................................... 17
Hình 2.1. Sơ đồ nội dung thực hiện đề tài ………………………………………...29
Hình 2.2. Hệ thống lên men fermentor Bioflo 110 sử dụng trong luận văn ............ 35
Hình 3.1. Hình dạng, màu sắc và kích thước khuẩn lạc C. glutamicum …………..44
Hình 3.2: Hình dạng tế bào Corynebacterium glutamicum VTCC B-656............... 44
Hình 3.3.Các chế phẩm C.glutamicum cố định. A: chế phẩm cố định trên chất mang
Na-Alginate; B: chế phẩm cố định trên chất mang BC; C: chế phẩm cố định trên
phức chất mang A - BC. ........................................................................................ 64
Đồ thị 1. Đường cong tăng trưởng, biến động pH môi trường, sản lượng L-lysine
của chủng Corynebacterium glutamicum VTCC-B-656 theo thời gian …………. 45


DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của tốc độ lắc vòng đến năng suất lysine ......................... 46

Biểu đồ 3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường lên men đến năng suất
lysine..................................................................................................................... 47
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của tỷ lệ giống bổ sung vào canh trường đến năng suất
lysine..................................................................................................................... 48
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến năng suất lysine....................... 49
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của hai nguồn cacbon glucose và sucrose đến năng suất
lysine..................................................................................................................... 50
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của chế độ khuấy đảo đến quá trình bẫy – hấp phụ tế bào
C.glutamicum trên giá thể BC................................................................................ 61
Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến quá trình bẫy tăng sinh tế bào
C.glutamicum ở nhiệt độ ủ 300C. ........................................................................... 62
Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến quá trình bẫy – bẫy hấp phụ tế bào
C.glutamicum trên giá thể BC trong thời gian ủ 3 ngày.......................................... 63
Biểu đồ 3.9. Sản lượng L-lysine của các lần tái sử dụng lên men bằng chế phẩm vi
khuẩn cố định (ĐC: đối chứng lên men bằng tế bào tự do) .................................... 65


Trang 1
MỞ ĐẦU
L-lysine là một trong 9 amino acid cần thiết mà cơ thể người và động vật
không tự tổng hợp được. L-lysine được ứng dụng bổ sung vào thức ăn gia súc, gia
cầm và cho người dưới dạng thực phẩm, dược phẩm. L-lysine được tổng hợp bằng
hóa học và phương pháp sinh học như tách chiết từ dịch thủy phân protein động vật,
thực vật và lên men vi sinh vật, nhưng ưu thế thuộc về phương pháp lên men. Kỹ
thuật lên men tuy phức tạp, nhưng có nhiều ưu điểm nổi trội như có thể điều khiển
q trình theo ý muốn, hiệu suất thu hồi cao. Giống vi sinh vật chuyên dùng để lên
men sản xuất L-lysine thuộc về dòng Gram (+) Corynebacteria, đặc biệt là
Corynebacterium glutamicum đã được sử dụng trong công nghiệp sản xuất amino
acid [8].
Trên thế giới lysine đã được đưa vào sản xuất công nghiệp, nhu cầu lysine

càng ngày càng lớn. Tại Việt nam, nhu cầu sử dụng lysine trong thức ăn chăn nuôi
và thực phẩm cho người ngày càng cao song lượng lysine hoàn toàn được nhập
khẩu từ nước ngoài. Một số nghiên cứu trong nước như Hồ Sưởng (1980), Nguyễn
Thuỳ Châu và cs. (2007); Nguyễn Duy Lâm và cs. (2008) cũng nghiên cứu lên men
thu lysine với sản lượng từ 15 -30 g/L [12]. Tuy nhiên, quy trình lên men vẫn chưa
được nghiên cứu hồn chỉnh và cũng chưa có cơ sở nào triển khai sản xuất lysine ở
quy mô công nghiệp. Nhằm tiến tới q trình sản xuất lysine ở quy mơ lớn, chúng
tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “Khảo sát quá trình lên men bởi Corynebacterium
glutamicum tự do và chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine”.
Nội dung chính của đề tài:
1. Khảo sát các điều kiện tối ưu lên men thu nhận lysine.
2. Ứng dụng điều kiện tối ưu lên men trên fermentor.
3. Khảo sát điều kiện cố định tế bào trên một số chất mang.
4. Ứng dụng chế phẩm cố định lên men trong điều kiện tối ưu theo mẻ.
Giới hạn đề tài:
Các thí nghiệm khảo sát ở quy mơ phịng thí nghiệm.
Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771


Trang 2
1.1. VI KHUẨN CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM
1.1.1. Lịch sử và phân loại
Cuối thế kỷ XIX, năm 1896 Lehmann và Neumann đã tìm ra giống (genus)
Corynebacterium. Mãi đến giữa thế kỷ XX, Kinoshita và cộng sự (1957) mới tìm ra
chính danh lồi (species) Glutamicum với tên gọi trước đây là Micrococus
glutamicus – một loài vi khuẩn sinh lượng lớn aminoacid [43]. Nhưng Stackebrandt
E và cs. (1997) đưa ra hệ thống phân loại C. glutamicum dựa trên taxa của
Actinomycetables [43, 54, 55] (hình 1.1). Năm 2002, Oberreuter và cộng sự cho
biết, trước khi định danh chính xác chủng C.glutamicum, tiến hành phân tích yếu tố
vật lý dựa trên các bộ Kit như: hệ thống API CORYNE (BioMerieux), hệ thống

định danh BIOLOG (Biolog) và hệ thống RapIDCB Plus (Remel). Sau đó, phân tích
số lượng amino acid tạo thành bằng FT-IR Spectroscopy và phân tích trình tự 16S
rDNA trên các lồi C. glutamicum [43, 48, 49].
Bacteria
Actinobacteria
Actinobacteridae
Atinomycetables
Corynebacterineae
Corynebacteriaceae
Corynebacterium
Glutamicum

Hình 1.1. Hệ thống phân loại vi khuẩn C.glutamicum [54].
1.1.2. Đặc điểm vi khuẩn C. glutamicum
Hầu hết loài Corynebacteria được tìm thấy từ những triệu chứng lâm sàng
khác nhau của người và một số nguồn khác như môi trường đất, cây trồng, nước
thải, chất thải hằng ngày [41, 43].
C. glutamicum là vi khuẩn Gram biến đổi, khi về già thì Gram (+), hiếu khí
hoặc yếm khí tùy ý, khơng di động, khơng có bào tử, tế bào hình que trịn hay gọi
trực cầu khuẩn, có hoạt tính glucose hydrogenaza cao [54]. Trong quá trình sinh
trưởng Corynebacteria cần bổ sung nguồn dinh dưỡng cơ bản như cacbon, nitơ, các
khoáng chất cần thiết, là vi khuẩn phát triển trên môi trường cần biotine (vitamin H)
Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771


Trang 3
(Kanzaki và cs., 1969) [43]. Corynebacteria có giới hạn nhiệt rộng từ 200C đến
400C, đa số sinh trưởng tốt ở 28 - 300C trên môi trường chuẩn (DSMZ, Deutsche
Sammmlung von Mikioorganismen und Zellkulturen GmbH) bao gồm: 1% peptone,
0,5% yeast extract, 2% glucose, 0,5% NaCl ở pH 7.2-7.4 [43]. Corynebacterium

glutamicum là vi khuẩn quan trọng trong công nghiệp rộng lớn [17, 18] chuyên sử
dụng lên men thu nhận acid glutamic và amino acid lysine. Trong quá trình lên men,
chúng ta cần chú ý bổ sung lượng biotine, thiamine hoặc acid p-amino benzoic sự
tích lũy sản phẩm bậc hai được cải thiện [43].
1.1.3. Đặc điểm di truyền của vi khuẩn C. glutamicum
Bộ gen di truyền C.glutamicum được xác minh vào giữa thập niên 80 thế kỷ
XIX. Các nhà khoa học đã tìm thấy rất nhiều gen tham gia trong chu trình sản xuất
amino acid và đã nhân dịng, phân tích vai trò các gen liên quan đến năng suất thu
nhận amino acid [43]. Vi khuẩn C. glutamicum mang vật chất di truyền cấp độ phân
tử là DNA, dạng vòng, chiều dài sợi DNA khoảng 3,3 Mb, tỷ lệ GC là 53%, có
3138 gen khác nhau và có đến 3057 mã protein [36]. Nhiều plasmid dạng vòng hay
thẳng được tạo ra từ chủng này như pCG2, pCG4, pCGR1, pAG1, pAG2, pAG3,
pBIl (dạng ds DNA), pXZ10142, pXZ10145.1, pAM330, pSR1, pTET3 [43].

Hình 1.2. Bộ gen C.glutamicum ATCC 13032 (DSM 20300, IMET 10482, NCBI
10025) [43, 64].
1.1.4. Sự chuyển hóa vật chất trong C. glutamicum
Vi khuẩn C.glutamicum sinh trưởng trên mơi trường thích hợp, chúng hấp thụ
các chất dinh dưỡng và khoáng chất qua các kênh xuyên màng (kênh Porin). Hàng
Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771


Trang 4
loạt các phản ứng xảy ra bên trong màng (cytosol) nhờ chuỗi gen hoạt động, gen
điều hòa biểu hiện (ppc, asp, lys, ddh ...) sản sinh ra một số sản phẩm bậc hai quan
trọng. Một trong những sản phẩm đó là amino acid lysine [18, 36, 41, 43].
lysine
Cytosol

glutamate

Isolcucine

Màng Cytoplasma
Lớp Peptidoglycan
Lớp Arabinogalactan
Lớp Mycolic acid
kênh Porin
Mơi trường

Hình 1.3. Sơ đồ tóm lược q trình chuyển hóa các chất ở C.glutamicum [18].

Hình 1.4. Động học phản ứng xảy ra bên ngồi mơi trường nuôi cấy và bên trong
Cytosol [18].
Các phản ứng xảy ra trong Cytosol được Eggeling minh họa dưới dạng sơ đồ
hình 1.5.

Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771


Trang 5
Phosphoenolpyruvate
ppc
Oxalacetale
aspB
L-Aspartate
lysC và operon asd
L-β-Aspartyl phosphate
asd và operon lysC
Homoserine

L-Aspartate β-semialdehyde
hom
dapA, operon dapB
L-2,3-Dihydrodipicolinate
(dapB, operon dapA
L-∆1 - Plperideine-2,6-dicarboxylate
ddh
meso-2,6-Diaminopimelate
lysA và operon args
L-lysine

Hình 1.5. Quy trình chuyển hóa các chất trong C.glutamicum sinh amino acid lysine
bắt đầu từ trung tâm phản ứng Phosphoenolpyruvate [18].
Dựa trên quy trình này, nhiều nhà khoa học như Burkovski (2002), Eggeling
(2005), Kramer R. (1994), Cremer (1991) ... đã nhân dịng, phân tích các gen asp,
Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771


Trang 6
lys (lysC, lysE, lysA), asd, hom, dap (dapA, dapB) và nhiều gen khác nhằm mục
đích tạo chủng vi khuẩn siêu sản xuất amino acid ở quy mô công nghiệp [18, 41].
1.2. AMINO ACID LYSINE
1.2.1. Giới thiệu
Amino acid lysine thuộc lớp aspartate nằm trong họ oxaloacetate. Codon mã
hóa là AAA và AAG. Lysine là một trong số amino acid mà cơ thể người, động vật
không tự tổng hợp được mà phải nhận từ nguồn bổ sung bên ngồi. Hoạt tính sinh
học chỉ biểu hiện ở dạng đồng phân L-lysine mới có giá trị dinh dưỡng với người và
động vật. L-lysine được ứng dụng khá rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Bổ sung vào
thức ăn gia súc làm tăng chất lượng và sản lượng thịt của động vật nuôi. Trong
dược phẩm, L-lysine sử dụng như một chất dinh dưỡng kích thích sự ngon miệng,

chống nhiễm trùng máu, giảm stress. Trong thực phẩm, L-lysine là chất bổ sung làm
giàu thực phẩm, nâng cao chất lượng hạt (lúa mì, bắp, gạo). Trong cơng nghiệp, Llysine được sản sinh từ quá trình lên men vi sinh vật chủ yếu là nhóm
Corynebacteria (+) hoặc thu nhận từ dịch thuỷ phân protein động vật, thực vật [30].
Trên thế giới, L-lysine được sản xuất từ đầu thế kỷ 20. Nhật Bản đã có 50
năm sản xuất L-lysine và áp dụng ở quy mô công nghiệp, chủ yếu hai nhà máy lớn
Kiowa Hakko và Ajinamoto. Ở Pháp, có nhà máy Eurolysin cơng suất 20 000
tấn/năm. Cịn nhiều nhà máy sản xuất L-lysine được đặt ở các nước Mỹ, Tây Ban
Nha, Nga ...Ở Việt nam, nhu cầu sử dụng lysine cho thực phẩm con người và thức
ăn chăn nuôi tăng nhanh chóng, nhưng hồn tồn nhập khẩu từ nước ngồi, có một
số nghiên cứu ở quy mơ phịng thí nghiệm về lysine từ vi khuẩn như Hồ Sưởng
(1980), Vũ Kim Thoa (2003), Nguyễn Thuỳ Châu và cs. (2007), Trần Thị Mai và
cs. (2008), sản lượng lysine đạt được nằm trong khoảng 15 – 30 g/L. Tuy nhiên, rất
ít nghiên cứu hồn chỉnh về quy trình sản xuất lysine và chưa có cơ sở sản xuất
lysine ở quy mơ lớn.
Xu hướng chung các nước sử dụng các chủng có hoạt tính cao và ứng dụng
để sản xuất amino acid đều là các chủng đột biến. Đặc biệt, các chủng
Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771


Trang 7
C.glutamicum có khả năng phát triển tốt trong mơi trường giàu nguồn cacbon, ít
nguồn nitơ. Do mất cân bằng giữa q trình trao đổi chất cacbon và đồng hố nitơ
dẫn đến sự hình thành amino acid với số lượng lớn so với nhu cầu của tế bào và tích
luỹ ở tế bào hay thốt ra ngồi mơi trường. Hiện tượng này gọi là siêu tổng hợp
(overproducing) amino acid của vi sinh vật và thường do tác động của con người
bằng phương pháp đột biến gen.
1.2.2. Đặc điểm
Hợp chất 2,6- điaminohexanoic (C6H14N2O2), khối lượng phân tử trung bình
146,9 g/mol) hay thường gọi là lysine; viết tắt: K hay Lys thuộc nhóm amino acid
có gốc R kiềm, ở dạng dung dịch lysine làm quỳ tím hóa xanh, phenoltalein hóa

hồng. Đặc điểm này, có thể dùng định tính lysine có trong mẫu.
Lysine tạo màu xanh tím khi gặp thuốc thử Ninhydrin và hấp phụ mạnh ở bước
sóng 515 nm – 570nm [14].

Hình 1.6 Công thức cấu tạo amino acid L-lysine [65].
1.2.3. Sinh tổng hợp L-lysine
1.2.3.1. Cụm gen sinh tổng hợp L-lysine
Lysine được thu từ những chủng vi khuẩn có khả năng sản sinh acid aspatate
và chuỗi gen như hình 1.7. Gen lysC sản sinh enzyme aspatatokinase, gen asd sản
sinh aspartate semi – dehyde dehydrogenase. Hai enzyme này gây ức chế ngược
phản ứng tạo thành lysine. Một chuỗi gen dapA, dapB, ddh sản sinh các enzyme
tham gia chu trình Dihydrodipicolinate xảy ra bên trong tế bào. Nhờ gen lysA sinh
Diaminopimelate decarboxylase thủy phân D, L – Diaminopimelate tạo lysine bên
Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771


Trang 8
trong tế bào. Cuối cùng lysine bên trong tế bào được giải phóng ra ngồi nhờ gen
lysE tiết enzyme permease [43].
lysC asd

dapA
dapB

ddh (dapC, dapD,
dapE, dap F)

lysA

Lysine

cellular

lysE

Lysine
external

Hình 1.7. Cụm gen sinh tổng hợp lysine [43].
1.2.3.2. Quá trình tổng hợp và điều hịa sinh amino acid lysine
Q trình điều hịa tổng hợp amino acid được điều hòa theo cơ chế feedback.
Sản phẩm cuối cùng của quá trình ức chế lại enzyme xúc tác cho phản ứng đầu tiên;
các enzyme này thường là enzyme dị lập thể và sản phẩm của quá trình ở nồng độ
cao đóng vai trị là các chất ức chế dị lập thể. Trong các tế bào phát triển thì sự tổng
hợp amino acid khơng chỉ là tổng hợp các amino acid đơn lẻ mà nó cịn tổng hợp
amino acid cho tổng hợp protein. Sự phối hợp nhịp nhàng giữa quá trình sinh tổng
hợp amino acid và quá trình sinh tổng hợp protein là yếu tố làm cho các tế bào vi
khuẩn phát triển nhanh. Quá trình sinh tổng hợp amino acid có thể qua nhiều bước
trung gian. Các chất trung gian này đóng vai trị ức chế ngược theo từng chặng và
điều hòa này gọi là điều hòa theo cơ chế feedback kế tiếp nhau [8].
L-lysine chỉ điều chỉnh ngược enzyme aspactokinaza mà không ức chế ngược
enzyme dehydropicolinatsyntetaza. Enzyme aspactokinaza chịu ức chế ngược của
L-lysine và threonine. Enzyme homoserindehydrogenaza chịu ức chế ngược của
threonine. Ở chủng hoang dại L-lysine và threoine cùng gây ra một sự ức chế phối
hợp đối với aspactokinaza. Do khuyết homoserin dehydrogenaza mà khơng có sự
tạo thành threonine. Dihydropicolinatsythase khơng mẫn cảm dị lập thể. Hậu quả là
sự ức chế bởi sản phẩm cuối cùng bị triệt tiêu và có sự tổng hợp L-lysine [8]. Hình
1.8 tóm lược sơ đồ sự điều hồ ngược từng chặng trong quá trình sinh tổng hợp
amino acid ở vi khuẩn C. glutamicum, dựa trên quy trình này chúng ta xác định sản
phẩm mục tiêu và điều khiển quá trình theo ý muốn.
Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771

Trang 9
Glucose

Pyruvate

Oxalaxetate

Aspatate

β-Aspatat-phosphat

Aspatat- β- semialdehyt

L-lysine

Homoserin

Methionine

Threonine

Isoleucine

Hình 1.8. Sơ đồ điều hịa ngược từng chặng trong quá trình sinh tổng hợp amino
acid ở chủng C.glutamicum [8].
Những phương pháp được dùng để loại sự điều chỉnh ngược:
 Sử dụng chủng đột biến trợ dưỡng cần homoserin. Chủng này phát triển khi
trong mơi trường có threonine và L-methionine. Với nồng độ amino acid này thấp

thì aspatokinaza sẽ không bị ức chế và L-lysine sẽ tạo thành nhiều hơn.
 Sử dụng các chủng đột biến có khả năng kháng một chất tương đồng của
enzyme. Chủng này có enzyme aspatokinaza khơng bị ức chế ngược bởi L-lysine và
threonine. Sử dụng các chủng đột biến mẫn cảm cao với threonine. Enzyme

Trần Thị Minh Tâm – 0310 7771