Khảo sát quá trình lên men malolactic rượu vang chanh dây

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC




LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN
MALOLACTIC RƯỢU VANG CHANH DÂY





CBHD: PGS. TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG
SVTH : HOÀNG THỊ KIM THOA MSSV:60604391
ĐẶNG MAI HUYỀN ANH MSSV:60604008


TP HỒ CHÍ MINH, 01/2011

i
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên chúng em xin chân thành cám ơn các thầy cô trong Bộ môn Công
nghệ sinh học đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp chúng em hoàn
thành tốt luận văn này.
Chúng em xin cảm ơn cô Nguyễn Thúy Hương – người đã tận tình theo sát, chỉ
bảo, giúp đỡ, tạo cho chúng em sự say mê trong học tập và nghiên cứu.
Xin cảm ơn các anh chị lớp cao học CH2008, CH2009 đã nhiệt tình giúp đỡ.

Xin cảm ơn tất cả các thành viên của lớp HC06BSH, những người bạn đã đồng
hành cùng chúng mình trong suốt những năm tháng đại học, đã quan tâm, chia sẻ,
động viên, đặc biệt là luôn tạo một không khí vui vẻ để thời gian làm luận văn thật
đáng nhớ.
Chúng con xin cám ơn gia đình đã luôn theo sát, ủng hộ, khích lệ và động viên
trong suốt quãng đường mà chúng con đã đi.
Cám ơn các thành viên của nhóm A&T – những người bạn thân thiết nhất đã
cùng nhau trải qua mọi niềm vui, nỗi buồn để đạt được kết quả như ngày hôm nay.
Cuối cùng, xin gửi những lời thân thương nhất đến tất cả những người đã sát
cánh cùng chúng tôi trong thời gian qua.
TP. Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2010
Hoàng Thị Kim Thoa
Đặng Mai Huyền Anh


ii
TÓM TẮT
Rượu vang chanh dây sau quá trình lên men rượu vẫn còn một lượng lớn acid
malic làm cho rượu có vị chua gắt. Lên men malolactic là quá trình chuyển hóa acid
malic thành acid lactic nhằm cải thiện chất lượng cảm quan của rượu. Do đó, chúng tôi
tiến hành nghiên cứu quá trình lên men malolactic ở rượu vang chanh dây bằng tế bào
vi khuẩn Oenococcus oeni tự do và cố định trên chất mang cellulose vi khuẩn (BC),
kết quả thu được như sau:
- Xác định được tỉ lệ giống vi khuẩn Oenococcus oeni thích hợp bổ sung cho quá
trình lên men malolactic là 7%, thời điểm bổ sung giống thích hợp nhất là ngay
sau khi kết thúc quá trình lên men rượu (ngày thứ 7 của quá trình lên men
rượu), thời gian lên men malolactic thích hợp đối với rượu chanh dây là 4 ngày.
- Cố định được tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni trên chất mang BC bằng hai
phương pháp: bẫy – hấp phụ và nhốt chủ động. Sử dụng chế phẩm vi khuẩn cố
định bằng phương pháp bẫy – hấp phụ sau 5 ngày ủ với mật độ là 7.1 x 10

9
CFU/cm
3
để tiến hành lên men. Kết quả thu được cho thấy khi sử dụng chế
phẩm vi khuẩn Oenococcus oeni cố định trên chất mang BC để lên men
malolactic đối với rượu vang chanh dây thì hiệu quả lên men vẫn đảm bảo sau 8
lần tái sử dụng.
Đồng thời chúng tôi cũng khảo sát hiệu quả của quá trình lên men khi sử dụng
đồng thời 2 chế phẩm cố định trên chất mang BC: nấm men Saccharomyces
cerevisiae ứng dụng trong lên men rượu và vi khuẩn Oenococcus oeni ứng dụng
trong lên men malolactic thì nhận thấy hiệu quả của quá trình lên men vẫn ổn
định. Điều này được thể hiện thông qua độ cồn và nồng độ acid malic chuyển
hóa được.
- Sau khi tối ưu các điều kiện, tiến hành lên men rượu, malolactic và tàng trữ.
Chúng tôi tiến hành đánh giá cảm quan và nhận thấy: chất lượng cảm quan của
rượu đã được cải thiện, đặc biệt là về mùi vị. Rượu sau quá trình lên men
malolactic có vị chua hài hòa hơn mà vẫn giữ được hương vị đặc trưng của
rượu chanh dây.

iii
MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH viii
DANH MỤC SƠ ĐỒ ix
DANH MỤC ĐỒ THỊ ix
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu về chanh dây 3
2.1.1 Nguồn gốc 3
2.1.2 Đặc điểm sinh học 3

2.1.3 Thành phần hóa học 4
2.1.4 Ứng dụng 5
2.2 Lên men rượu vang 6
2.2.1 Giới thiệu sơ lược về rượu vang 6
2.2.2 Tác nhân vi sinh vật 7
2.2.3 Cơ sở hóa sinh 8
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 9
2.2.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu 10
2.3 Lên men malolactic 11
2.3.1 Định nghĩa lên men malolactic 11
2.3.2 Vị trí của lên men malolactic trong sản xuất rượu vang 14
2.3.3 Phân loại vi khuẩn lên men malolactic 14
2.3.4 Vai trò của quá trình lên men malolactic 18
2.3.5 Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men malolactic 18
2.4 Kỹ thuật cố định 42

iv
2.4.1 Lịch sử phát triển 42
2.4.2 Định nghĩa 43
2.4.3 Chất mang 43
2.4.4 Phương pháp cố định 58
2.4.5 Ưu nhược điểm của cố định tế bào 66
2.4.6 Yêu cầu đối với vi sinh vật cố định 67
2.4.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến cố định vi sinh vật 68
2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài 69
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 72
3.1 Vật liệu 72
3.1.1 Chanh dây 72
3.1.2 Giống vi sinh vật 72
3.1.3 Môi trường nuôi cấy 72

3.1.4 Vật liệu, hóa chất 74
3.1.5 Thiết bị và dụng cụ 74
3.2 Phương pháp thí nghiệm 74
3.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 74
3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 76
3.2.3 Phương pháp phân tích thí nghiệm 82
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 86
4.1 Kiểm tra đặc điểm giống vi sinh vật: 86
4.1.1 Saccharomyces cerevisiae 86
4.1.2 Oenococcus oeni 88
4.1.3 Acetobacter xylinum 90
4.2 Lên men tạo BC 91

v
4.2.1 Lên men thu nhận BC 91
4.2.2 Xử lý chế phẩm BC thô 91
4.3 Khảo sát quá trình lên men malolactic bằng chủng Oenococcus oeni tự do 91
4.3.1 Khảo sát tỉ lệ giống Oenococcus oeni thích hợp để lên men malolactic 91
4.3.2 Khảo sát thời điểm thích hợp để bổ sung giống Oenococcus oeni trong lên men
malolactic. 95
4.3.3 Khảo sát thời gian lên men malolactic 101
4.4 Khảo sát các phương pháp cố định Oenococcus oeni trên chất mang BC 104
4.4.1 Phương pháp bẫy- hấp phụ: 104
4.4.2 Phương pháp nhốt chủ động 108
4.5 Lên men malolactic sử dụng chế phẩm Oenococcus oeni cố định trên chất mang
BC… 111
4.5.1 Lên men rượu sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae tự do và lên men
malolactic sử dụng vi khuẩn Oenococcus oeni cố định 111
4.5.2 Lên men rượu sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae cố định và lên men
malolactic sử dụng vi khuẩn Oenococcus oeni cố định 113

4.6 Kết quả cảm quan 115
4.7 Kết quả kiểm tra vi sinh 116
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 117
5.1 Kết luận 117
5.2 Kiến nghị 118
TÀI LIỆU THAM KHẢO 119
PHỤ LỤC 124

vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2. 1: Một số nước sản xuất rượu vang hàng đầu thế giới 6
Bảng 2. 2 Phân loại vi khuẩn Lactobacillus 16
Bảng 2. 3 Tốc độ phát triển của vi khuẩn malolactic theo nhiệt độ 28
Bảng 2. 4: Thành phần của vang trước và sau khi lên men malolactic 31
Bảng 2. 5: Sự thay đổi hàm lượng các acid amin có trong dịch lên men vang Shiraz
trước và sau khi lên men malolactic với pH ban đầu là 3.7. 34
Bảng 2. 6: Hàm lượng acid dễ bay hơi (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi
lên men malolactic 35
Bảng 2. 7: Hàm lượng rượu bậc cao (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên
men malolactic. 37
Bảng 2. 8: Hàm lượng các ester (µg/L) có trong dịch lên men trước và sau khi lên men
malolactic. 39
Bảng 2. 9: Hàm lượng các hợp chất chứa lưu huỳnh và nitơ (µg/L) có trong dịch lên
men trước và sau khi lên men malolactic 40
Bảng 2. 10 Ưu nhược điểm của từng loại chất mang 46
Bảng 2. 11Cấu trúc BC của một số loài vi sinh vật 47
Bảng 2. 12 Bảng so sánh ưu nhược điểm của các phương pháp cố định tế bào thông
dụng 65
Bảng 2. 13 So sánh một số tính chất của việc lên men sử dụng nấm men cố định trên
gel alginate và nấm men cố định trên BC 66

Bảng 3. 1 Thành phần môi trường Hansen 72
Bảng 3. 2 Thành phần môi trường MLA 73
Bảng 3. 3 Thành phần môi trường MT5 73
Bảng 3. 4 Thành phần môi trường MT6 74
Bảng 3. 5 Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian lên men malolactic 77
Bảng 4. 1 Kết quả lập đường chuẩn Saccharomyces cerevisiae 87
Bảng 4. 2 Sự thay đổi các yếu tố sau quá trình lên men malolactic ứng với các tỉ lệ
giống khác nhau 92

vii
Bảng 4. 3 Sự biến đổi pH khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước và
sau quá trình lên men malolactic. 95
Bảng 4. 4 Sự thay đổi nồng độ chất khô khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác
nhau trước và sau quá trình lên men malolactic. 96
Bảng 4. 5 Sự thay đổi nồng độ acid tổng khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác
nhau trước và sau quá trình lên men malolactic. 97
Bảng 4. 6 Sự thay đổi độ rượu khi bổ sung vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau trước
và sau quá trình lên men malolactic. 98
Bảng 4. 7 Sự thay đổi hàm lượng acid malic và acid lactic khi bổ sung vi khuẩn tại các
thời điểm khác nhau trước và sau quá trình lên men malolactic. 100
Bảng 4. 8 Sự thay đổi các yếu tố theo thời gian lên men malolactic 101
Bảng 4. 9 Mật độ tế bào vi khuẩn cố định trên các chất mang BC1, BC2 và BC3 105
Bảng 4. 10 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào vi khuẩn được cố định trên
chất mang BC. 107
Bảng 4. 11 Kết quả cố định bằng phương pháp nhốt 109
Bảng 4. 12 So sánh 2 phương pháp cố định 110
Bảng 4. 13 Các thông số của dịch chanh dây thí nghiệm 111
Bảng 4. 14 Sự biến động acid malic và acid lactic sau mỗi chu kì lên men malolactic
112
Bảng 4. 15 Các thông số của chế phẩm cố định Saccharomyces cerevisiae trên BC: 114

Bảng 4. 16 Sự biến động acid malic và acid lactic sau mỗi chu kì lên men malolactic
……………………………………………………………………………………….114
Bảng 4. 17: Kết quả kiểm tra vi sinh 116



viii
DANH MỤC HÌNH
Hình 2. 1 Trái chanh dây 4
Hình 2. 2 Hình thái nấm men Saccharomyces cerevisiae 7
Hình 2. 3 Hình thái vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus, Leuconosto 14
Hình 2. 4 Hình thái vi khuẩn Oenococcus oeni 18
Hình 2. 5 Một số nhân tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men malolactic. 29
Hình 2. 6: Quá trình tạo diaceryl 35
Hình 2. 7: Phản ứng giữa SO
2
và các hợp chất carbonyl 38
Hình 2. 8 Acetobacter xylinum 47
Hình 2. 9 A-BC được tạo ra từ môi trường lắc (a) và S-BC được tạo ra từ môi trường
tĩnh (b) 50
Hình 2. 10 Cấu trúc của cellulose (a) Cellulose vi khuẩn (x 20000) và (b) cellulose của
thực vật (x200) 51
Hình 2. 11 Vị trí – quá trình biến dưỡng carbon và tổng hợp cellulose ở A. xylinum 54
Hình 2. 12 Con đường dự đoán của quá trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose khi
glucose được tế bào A. xylinum hấp thụ từ bên ngoài 54
Hình 2. 13 Sự tổng hợp vi sợi bởi Acetobacter xylinum 55
Hình 2. 14 Con đường chuyển hóa carbon của Acetobacter xylinum 57
Hình 2. 15 Các phương pháp cố định vi sinh vật 59
Hình 2. 16 Cố định tế bào trên bề mặt chất mang 59
Hình 2. 17 Cố định tế bào trong lòng chất mang 61

Hình 2. 18 Liên kết giữa các tế bào 62
Hình 2. 19 Cố định tế bào bằng màng membrane 62
Hình 4. 1 Hình ảnh đại thể Saccharomyces cerevisiae trên môi trường đặc 86
Hình 4. 2 Hình ảnh vi thể Saccharomyces cerevisiae dưới kính hiển vi 86
Hình 4. 3: Hình ảnh vi thể Oenococcus oeni dưới kính hiển vi 88
Hình 4. 4 Hình thái khuẩn lạc Acetobacter xylinum trên thạch đĩa và lớp váng vi khuẩn
Acetobacter xylinum trên môi trường lỏng. 90
Hình 4. 5 Hình thái vi khuẩn Acetobacter xylinum dưới kính hiển vi 90
Hình 4. 6 BC tươi sau khi lên men 91
Hình 4. 7 BC sau 30 phút đầu của quá trình hấp phụ 105

ix
DANH MỤC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 2. 1 Cơ chế lên men ethanol . 8
Sơ đồ 2. 2 Con đường chuyển hóa vật chất của quá trình lên men glucose nhờ vi khuẩn
malolactic (Wood và Holzapfel 1995) 13
Sơ đồ 2. 3: Phân loại vi khuẩn malolactic (Boulton et al 1996) 15
Sơ đồ 2. 4: Sơ đồ chuyển hóa p-coumaric acid thành 4-ethylphenol 41
Sơ đồ 2. 5 Phân loại chất mang 45
Sơ đồ 3. 1 Sơ đồ thu nhận BC 78
Sơ đồ 3. 2 Xử lí BC thô 78

DANH MỤC ĐỒ THỊ
Đồ thị 4. 1 Đường cong sinh trưởng của nấm men Saccharomyces cerevisiae 87
Đồ thị 4. 2 Đường chuẩn của nấm men Saccharomyces cerevisiae 88
Đồ thị 4. 3 Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Oenococcus oeni 89
Đồ thị 4. 4 Đường chuẩn của vi khuẩn Oenococcus oeni 89
Đồ thị 4. 5 Sự thay đổi pH sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ giống
khác nhau 92
Đồ thị 4. 6 Sự thay đổi nồng độ chất khô sau lên men malolactic của các mẫu ứng với

các tỉ lệ giống khác nhau. 93
Đồ thị 4. 7 Sự thay đổi nồng độ acid tổng sau lên men malolactic của các mẫu ứng với
các tỉ lệ giống khác nhau 93
Đồ thị 4. 8 Sự thay đổi độ rượu sau lên men malolactic của các mẫu ứng với các tỉ lệ
giống khác nhau 94
Đồ thị 4. 9 Sự thay đổi nồng độ acid malic và acid lactic sau lên men malolactic của
các mẫu ứng với các tỉ lệ giống khác nhau. 94
Đồ thị 4. 10 Sự thay đổi pH trước và sau quá trình lên men malolactic 96
Đồ thị 4. 11 Sự thay đổi nồng độ chất khô trước và sau quá trình lên men malolactic 97
Đồ thị 4. 12 Sự thay đổi nồng độ acid tổng trước và sau quá trình lên men malolactic 98
Đồ thị 4. 13 Sự thay đổi độ rượu trước và sau quá trình lên men malolactic 99
Đồ thị 4. 14 Sự thay đổi hàm lượng acid malic và acid lactic trước và sau quá trình lên
men malolactic. 100

x
Đồ thị 4. 15 Sự thay đổi pH theo thời gian lên men malolactic 102
Đồ thị 4. 16 Sự thay đổi nồng độ chất khô theo thời gian lên men malolactic 102
Đồ thị 4. 17 Sự thay đổi nồng độ acid tổng theo thời gian lên men malolactic 103
Đồ thị 4. 18 Sự thay đổi độ rượu theo thời gian lên men malolactic 103
Đồ thị 4. 19 Sự thay đổi acid malic và acid lactic theo thời gian lên men malolactic 104
Đồ thị 4. 20 Mật độ vi khuẩn sau cố định với các kích thước khác nhau và qua các chế
độ khuấy đảo khác nhau. 106
Đồ thị 4. 21 Ảnh hưởng của thời gian ủ lên mật độ tế bào vi khuẩn. 108
Đồ thị 4. 22 Biến đổi hàm lượng acid malic và acid lactic trong mỗi chu kì khảo sát 113
Đồ thị 4. 23 Biến đổi hàm lượng acid malic và acid lactic trong mỗi chu kì khảo sát 115
Chương 1: Mở đầu
1
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
Rượu vang là một loại thức uống có cồn thu được từ quá trình lên men nước ép
nho hoặc một số loại trái cây khác. Lên men rượu là một hình thức rất cổ xưa trong

công nghệ thực phẩm trên thế giới, nó đã có cách đây hàng ngàn năm. Việc sản xuất
rượu vang đã trở thành một hình thức kinh doanh toàn cầu, nó đã và đang ảnh hưởng
đáng kể đến nền kinh tế của nhiều nước trên thế giới (Walker, 2000). Việc lên men
rượu vang (lên men chính) được thực hiện bằng cách bổ sung thêm giống nấm men
vào nước trái cây. Giống vi sinh vật tốt nhất dùng cho quá trình này là Saccharomyces
cerevisiae, được sử dụng rộng rãi để chuyển hóa ethanol từ đường glucose và fructose
trong nước ép nho (Klingshirn, 2002) [37].
Một nhóm vi sinh vật khác liên quan đến quá trình lên men rượu vang đó chính
là vi khuẩn acid lactic, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượu lần
hai hay còn gọi là lên men malolactic. Hiệu suất của quá trình lên men malolactic phụ
thuộc vào đặc điểm của từng loại quả (Bozoğlu và Yurdugül, 2000), đặc biệt là lượng
acid malic có trong quả. Nếu hàm lượng acid malic quá cao thì việc lên men
malolactic là cần thiết để chuyển acid L-malic thành acid L-lactic, kết quả là làm giảm
lượng acid trong rượu, giảm được vị chua gắt, cải thiện được hương vị của rượu vang
(Steinkraus, 1992) [37].
Lên men malolactic là một quá trình quan trọng trong sản xuất rượu vang hay ít
nhất là những loại rượu vang có hàm lượng acid cao ở những vùng có khí hậu mát mẻ.
Lợi ích của quá trình lên men malolactic bao gồm: giảm lượng acid trong những loại
rượu vang có nồng độ acid cao, cải thiện hương vị đặc trưng của rượu vang nhờ sự
hoạt động của vi khuẩn và ổn định hệ vi sinh vật có trong rượu vang (Bozoğlu và
Yurdugül, 2000). Vi khuẩn acid lactic tham gia vào quá trình lên men malolactic được
gọi là vi khuẩn malolactic, thuộc chi Leuconostoc,Pediococcus và Lactobacillus
(Lonvaud-Funel, 2000; Văn Vuuren và Dicks, 1993; Versari, Parpinello, và Cattaneo,
1999), chúng có khả năng chuyển hóa trực tiếp acid malic thành acid lactic và CO
2

nhờ malate carboxylase hay còn gọi là malolactic enzyme (MLE) (Bozoğlu and
Yurdugül, 2000; Fugelsang, 1997; Renault et al., 1988;Salema et al., 1996). Quá trình
Chương 1: Mở đầu
2

này có thể xảy ra tự phát trong thời gian lưu trữ rượu hoặc được điều khiển bởi các tác
nhân vi sinh vật [37].
Ở Việt Nam, hầu hết các sản phẩm rượu vang đều chỉ trải qua 2 giai đoạn, đó là
giai đoạn lên men rượu và lên men phụ nhằm lắng trong cũng như ổn định chất lượng
rượu vang mà không có quá trình lên men malolactic. Chính điều này cũng đã góp
phần làm hạn chế chất lượng cũng như mùi vị của sản phẩm, đặc biệt là đối với những
loại quả có hàm lượng acid malic cao.
Để cải tiến kỹ thuật sản xuất rượu thì một trong những kỹ thuật đang được quan
tâm nhiều đó là kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật trên chất mang. Ưu điểm lớn nhất
của tế bào cố định là có thể chủ động điều khiển được quá trình lên men, đồng thời tế
bào sau khi cố định cũng có thể tái sử dụng nhiều lần và không lẫn vào sản phẩm.
Chương 2: Tổng quan tài liệu
3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về chanh dây
2.1.1 Nguồn gốc
Có khoảng 400 loại chanh dây được trồng ở các nước nhiệt đới, nhưng chỉ có
30 loại ăn được. Chanh dây là loại trái cây có hình quả trứng, mọc chủ yếu ở vùng
nhiệt đới và cận nhiệt.
Loài cây này có nguồn gốc ở Brazil, được nhập vào Việt Nam khoảng đầu thế
kỷ 20, được trồng ở Lâm Đồng, Kontum, Gia Lai, Đắk Lắk… để lấy quả làm nước
giải khát, làm cảnh và che bóng mát. Đến nay, một số tỉnh đồng bằng sông Cửu Long
như: Hậu Giang, Cần Thơ, An Giang, Kiên Giang…cũng bắt đầu phát triển trồng
chanh dây để lấy quả cung ứng cho nhu cầu thị trường.
2.1.2 Đặc điểm sinh học
Cây chanh dây còn gọi là dây mát, mát mát, dây lạc tiên trứng, dây chùm bao
trứng, tên khoa học Passiflora edulis Sims, thuộc họ Lạc tiên (Passifloraceae). Chanh
dây là một loại dây leo, thân nhỏ, hình trụ có rãnh dọc, nhiều lông thưa. Cây mọc leo
có khi dài tới hàng chục mét.
Hoa mọc ở kẽ lá, màu trắng hồng, đài 5 cánh màu xanh lục, cánh hoa dài 2 –

2.5 cm; tràng 5 cánh rời nhau, xếp xen kẽ với các lá đài; tràng phụ do 4 – 5 hàng sợi
trắng, gốc tím; cuống nhụy dài 1.5cm. Quả mọng, hình cầu hoặc hình trứng, da trơn
hoặc nhăn nhăn nhẹ, rộng 4 – 6 cm, vỏ màu tím đỏ hoặc màu vàng. Bên ngoài trái cây
chứa nhiều nước vị chua chua ngọt ngọt, thơm nhẹ nhàng, với vô số hạt nhỏ.

Chương 2: Tổng quan tài liệu
4

Hình 2. 1 Trái chanh dây [47].
Người ta thường chỉ trồng chanh dây cho trái màu nâu tím, hoặc loại trái màu
vàng, chịu được nóng. Có thể trồng cây bằng cách gieo hạt, giâm cành hoặc chiết
ghép. Cây chanh dây rất dễ trồng, ưa đất khô ráo, cần ít nước, thậm chí sống được cả
nơi sỏi đá hoặc đất cát. Cây đạt độ trưởng thành ở 12 tháng tuổi, có thể vươn dài tới 15
m, cho thu hoạch tốt trong vòng 5 – 6 năm, mỗi năm từ tháng 10 đến tháng 4, nhưng
thường sau 4 năm người ta lại thay cây mới.
2.1.3 Thành phần hóa học
Chanh dây có hàm lượng đường vừa phải (8.5g glucide/100g), thấp hơn một số
loại trái cây thông thường khác (trung bình là 9 – 12g/100g), nhưng phần lớn lượng
đường này là fructose có độ ngọt cao (so với đường saccharose), vì vậy chanh dây vẫn
có vị ngọt, mặc dù nó còn chứa các loại axit hữu cơ, chủ yếu là axit citrique
(3.9g/100g, ít chua hơn trái chanh). Ngoài ra, trong chanh dây còn có một tỉ lệ chất
nhất định proteine, lipide, các chất khoáng và chất vi lượng như sắt, phốtpho, kẽm,
magnesium,… nhiều loại vitamin, đặc biệt là vitamin C và nhất là chất xơ (fibre); về
Chương 2: Tổng quan tài liệu
5
năng lượng cung cấp, chanh dây tương đương với xoài, sơri; về magnesium, tương
đương với chuối…
Các acid amin gồm có: prolin, valin, tyrosin, treonin, glycin, leucin, arginin.
Hạt có chứa nhiều dầu béo ăn được.
Thành phần dinh dưỡng trong 100g “thịt” quả:

Ca
(mg)

P
(mg)
Fe
(mg)
Vitamin
A (IU)
Vitamin
C (mg)
Chất xơ
(g)
Protein
(g)
Glucid
(g)
Lipid
(g)
Hàm
lượng

4-17 35-64 0.4-2.1 700-2410

30-70 0.6-0.8 1.2-2.4

8.5-10 0.2-0.3
[35]
Tỷ lệ đường trong chanh dây:
Loại chanh dây

Thành phần (%)
Fructose Glucose Saccharose
Đỏ tía 33.5 37.1 29.4
Vàng 29.4 38.1 32.4
[35]
Hàm lượng acid có trong chanh dây:
Loại chanh
dây
Acid (%)
citric malic lactic malonic succinic ascorbic
Đỏ tía 13.1 3.86 7.49 4.95 2.42 0.05
Vàng 55 10.55 0.58 0.13 Rất ít 0.06
[35]
2.1.4 Ứng dụng
Nhờ hương vị phong phú, chanh dây thường đựơc ép lấy nước để làm sirô giải
khát hoặc chế biến các loại thực phẩm, thức uống… Ngoài ra, chanh dây còn có tác
dụng an thần, gây ngủ nhẹ, giảm sự lo âu hồi hộp, hạ huyết áp (nhẹ), dịu các cơn co
giật (trong cơn động kinh), giảm cơn đau bụng cơ năng và đau bụng kinh [52].
Chương 2: Tổng quan tài liệu
6
2.2 Lên men rượu vang
2.2.1 Giới thiệu sơ lược về rượu vang
Rượu vang là loại đồ uống có cồn, tạo ra từ quá trình lên men dịch nho tươi.
Khi quá trình lên men kết thúc, người ta không chưng cất mà để lắng trong tự nhiên,
gạn lọc và hoàn thành sản phẩm. Đây là một thức uống có giá trị dinh dưỡng cao,
hương vị thơm ngon và có lợi cho sức khỏe con người khi dùng một cách điều độ.
Ngoài thành phần chủ yếu là nước (chiếm từ 65% đến 85%), rượu nho còn chứa
nhiều hợp chất khác: các hợp chất vô cơ, hợp chất hữu cơ gồm rượu (chủ yếu là rượu
etylic, rượu glycerol), acid hữu cơ, polyphenol (gồm anthocyane (chất màu thực vật:
xanh da trời, tím hoa cà), và chất chát), enzyme, vitamin. Hàm lượng đường của rượu

biến đổi từ 4.5% đến 16%.
Việc làm rượu vang bắt đầu ngay từ khi con người sống gần các cây nho hoang
dã, vào khoảng 4000 năm trước công nguyên, bắt đầu ở Caucase rồi sau đó là
Mésopotamie. Ngày nay rượu vang được ưa chuộng trên khắp thế giới, đặc biệt là ở
các nước Châu Âu.
Bảng 2. 1: Một số nước sản xuất rượu vang hàng đầu thế giới












[58]

Thứ tự

Nước Sản

lượng


(
(tấn
)

)

1 France
5
5
,
,329
,
,449
2 Italy
5
5,056
,
,648
3 Spain
3
3
,
,934
,
,140
4 USA
2
2
,
,232
,
,
0
0

0
0
0
0
5 Argentina
1
1
,
,564
,
,
0
0
0
0
0
0
6 China
1
1
,
,300
,
,
0
0
0
0
0
0

7 Australia
1
1
,
,274
,
,
0
0
0
0
0
0
8 South

Africa

1
1
,
,157
,
,895
9 Germany
1
1
,
,014
,
,

7
7
0
0
0
0
10 Chile 788
,
,
5
5
5
5
1
1
Chương 2: Tổng quan tài liệu
7
2.2.2 Tác nhân vi sinh vật
Lên men rượu thường được chia thành 2 giai đoạn: Lên men chính ở nhiệt độ
20-30
o
C khoảng 10 ngày hoặc dài hơn, quá trình lên men chính hoạt động nhờ các loại
nấm men Saccharomyces và lên men phụ ở nhiệt độ 15 – 18
o
C, quá trình lên men
malolactic được tiến hành sau quá trình lên men chính.
Cấu tạo của tế bào nấm men: nấm men là vi sinh vật đơn bào thuộc nhóm
Eukaryote, tế bào có dạng hình ovan, dạng bụi hoặc dạng bông, sinh sản bằng cách
nảy mầm hoặc sinh sản tách đôi, phát triển tốt ở nhiệt độ 18 – 25
o

C, ức chế sinh sản ở
nhiệt độ 35
o
C và ở 40
o
C

thì ngưng sinh sản. pH tối thích là 4 – 6, do đó trong sản xuất
rượu vang người ta thường chuẩn bị dịch quả có pH từ 3 – 3.5. Tế bào có cấu tạo rất
phức tạp gồm có màng tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, nhân không bào, các hạt
dự trữ như glycogen, voluten, Trong tế bào còn có ribosome nơi tổng hợp protein và
ty thể nơi xảy ra quá trình oxy hóa khử cung cấp nguồn năng lượng cho tế bào.

Hình 2. 2 Hình thái nấm men Saccharomyces cerevisiae [55][57].
Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men:
Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men phụ thuộc chủng giống, môi
trường, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy. Men ép chứa trung bình 75%
nước, 25% chất khô. Các chất khô của nấm men bao gồm những thành phần sau:
protid 30 – 50%, glucid 24 – 40%, lipid 2 – 5%, khoáng 5 – 11% [36].
Yêu cầu của chủng nấm men trong quá trình lên men này là: phát triển nhanh
trong dịch đường lên men, có thể lên men ở môi trường có nồng độ acid cao và độ cồn
cao.

Chương 2: Tổng quan tài liệu
8
2.2.3 Cơ sở hóa sinh
Lên men rượu là một quá trình sinh học, dựa trên cơ sở hóa sinh xảy ra trong
quá trình lên men các loại nước quả dưới tác dụng của các enzyme của nấm men,
trong đó từ cơ chất ban đầu là các dạng đường lên men được sẽ chuyển hóa thành
ethanol và khí CO

2
thông qua hoạt động trao đổi chất của một số vi sinh vật đặc biệt
(nấm men, trực khuẩn) ở điều kiện kị khí. Cơ chế của quá trình này có thể được tóm
tắt theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2. 1 Cơ chế lên men ethanol [58].

Chương 2: Tổng quan tài liệu
9
2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men
Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nấm men Saccharomyces cerevisiae thích hợp lên men ở nhiệt độ tối ưu là 28 –
32
0
C. Nếu lên men ở nhiệt độ thấp 20 – 22
0
C, thời gian lên men sẽ kéo dài. Tuy nhiên,
nhiệt độ này sẽ hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn. Ở nhiệt độ 33 – 35
0
C, hoạt tính
của nấm men sẽ giảm và điều kiện thuận lợi để vi khuẩn, nấm men hoang dại phát
triển mạnh. Ở nhiệt độ 30
0
C, nấm men hoang dại phát triển mạnh hơn nấm men
S.cerevisiae 2 – 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 – 38
0
C chúng phát triển nhanh gấp 6 – 8 lần.
Mặt khác, khi lên men rượu ở nhiệt độ cao sản phẩm sẽ tạo ra nhiều este, aldehyt,
CO
2

…Ở 40
0
C, phần lớn nấm men sẽ ngừng sinh trưởng [40].
Ảnh hưởng của pH
Nồng độ ion H
+
trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm
men. Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất tham gia cấu tạo màng tế bào,
làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của
quá trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ hoạt động trong một trạng thái ion nhất định,
trạng thái này phụ thuộc vào pH của môi trường.
Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo thành ethanol là 4.5 – 5.0. Nếu
tăng pH thì rất dễ bị nhiễm khuẩn, glycerin sẽ tạo ra nhiều hơn, do đó sẽ làm giảm
hiệu suất lên men. Khi pH < 4.2 nấm men tuy phát triển chậm hơn so với pH ở 4.5 –
5.0 nhưng tạp khuẩn hầu như không phát triển [40].
Khi nấm men đã phát triển nhanh và đủ mạnh, ta tăng pH đến giá trị tối ưu cho
nấm men phát triển về điều kiện tối ưu. Lúc này, điều kiện cũng tốt hơn cho các tạp
khuẩn phát triển nhưng vì nấm men có lợi thế về số lượng nên lấn át được hơn so với
các vi sinh vật tạp khuẩn khác nên không gây hại gì cho quá trình lên men.
Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô ban đầu trong dịch lên men
Thông thường khi hàm lượng chất khô ban đầu quá cao, hiệu suất lên men
không cao. Khi nồng độ đường trong dịch lên men đạt 30 – 35% thì quá trình lên men
dường như bị ngừng lại, còn ở nồng độ 25 – 30% thì nấm men phát triển rất chậm.
Nồng độ tối thích cho nấm men phát triển là 10 – 18% đường. Dung dịch có nồng độ
đường cao sẽ gây ra một áp suất thẩm thấu lớn, làm mất cân bằng trạng thái sinh lí
bình thường của nấm men, thời gian lên men sẽ kéo dài nấm men sẽ không sử dụng
Chương 2: Tổng quan tài liệu
10
hết đường, đồng thời lượng rượu tạo thành nhiều sẽ ức chế hoạt động của nấm men.
Nhưng nếu lượng đường thấp thì nấm men sẽ phát triển rất chậm vì chúng hoạt động

trong môi trường bị thiếu dinh dưỡng.
Ảnh hưởng của nồng độ rượu ethanol
Rượu được tích tụ dần trong quá trình lên men và chính nó lại là chất độc, kìm
hãm sự sinh sản cũng như khả năng lên men của nấm men. Ở nồng độ 2 – 5% rượu đã
có khả năng ức chế nấm men, ở 5 – 6% rượu làm nấm men đình chỉ sinh sản, mặc dù
quá trình lên
men vẫn tiếp tục diễn ra. Mặt khác, khi lên men rượu sản phẩm tạo thành còn có CO
2
.
Khí CO
2
có thể ức chế lên men, nhưng cũng kích thích quá trình lên men vì chúng làm
môi trường lên men được khuấy động liên tục, nấm men luôn ở trạng thái lơ lửng, giúp
rút ngắn quá trình lên men [40].
2.2.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men
rượu
Ngoài sản phẩm chính là rượu và CO
2
, quá trình lên men còn tạo ra nhiều sản
phẩm phụ khác. Bằng cách phân tích sắc kí khí, các nhà phân tích đã phát hiện trên 50
chất khác nhau, nhưng có thể xếp thành 4 nhóm chính: acid, este, aldehyd, rượu cao
phân tử.
Sự tạo thành acid
Trong quá trình lên men rượu luôn tạo ra các acid hữu cơ bao gồm: acid acetic,
acid lactic, acid citric, acid pyruvic, acid succinic và hai loại acid thường có mặt chính
trong rượu vang là acid tartaric, acid malic. Hàm lượng của hai acid này có thể lên đến
90% hàm lượng của acid có trong rượu vang và chúng tạo nên vị chua đặc trưng cho
dịch rượu vang. Hàm lượng acid malic trong dịch khoảng 3 – 4.5 g/l. Hầu hết nấm
men đều có thể sử dụng acid malic làm cơ chất và mức độ chuyển hóa acid malic còn
tùy thuộc vào từng loài. Ví dụ, Saccharomyces cerevisiae chỉ phân giải được 3 – 4.5%

lượng acid malic có trong dịch nuôi cấy, trong khi Schizosaccharomyces pombe và
Schizosaccharomyces malidevorans có thể chuyển hóa hoàn toàn acid này thành
ethanol và CO
2
.

Chương 2: Tổng quan tài liệu
11
Rượu cao phân tử
Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên
men rượu là các rượu cao phân tử. Chúng tuy ít nhưng gây ảnh hưởng xấu đến chất
lượng sản phẩm rượu. Đó là: propylic, izo butylic, izo amylic, amylic,… Hàm lượng
của chúng chỉ khoảng 0.4 – 0.5% so với ethanol nhưng gây cho sản phẩm có mùi khét
nên gọi là dầu khét. Nguyên nhân là do nấm men sử dụng nitơ của acid amin. Phương
trình tổng quát quá trình này là:
RCH(NH
2
)COOH + H
2
O RCH
2
OH + NH
3
+ CO
2


Sự tạo thành ester
Song song với việc tạo ra acid và rượu, dưới tác dụng của enzyme esterase của
nấm men, các acid và alcol sẽ tác dụng lẫn nhau tạo ra những ester tương ứng. Có thể

viết phương trình phản ứng tổng quát sau:
R
1
CH
2
OH + R
2
COOH R
2
COO-CH
2
R
1
+ H
2
O
2.3 Lên men malolactic
2.3.1 Định nghĩa lên men malolactic
Lên men malolactic là một quá trình chuyển hóa L-malic acid (chứa 2 nhóm
carboxyl trong phân tử) thành L- hoặc D- lactic acid (chỉ chứa 1 nhóm carboxyl) và
carbon dioxide được thực hiện bởi các giống vi khuẩn lactic bao gồm Lactobacillus,
Oenococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Thực chất đây là một quá trình dị hóa acid
malic, trong đó L-malic được decarboxyl hóa thành L-lactic acid bởi xúc tác là
enzyme malate carboxylase. Quá trình này xảy ra bên trong tế bào theo phản ứng sau:
Chương 2: Tổng quan tài liệu
12

Margalit cho rằng đây thực chất chỉ là một phản ứng sinh hóa vì quá trình này
đơn giản chỉ có sự tham gia của một enzyme - xúc tác cho phản ứng tách nhóm CO
2

của cơ chất là acid malic thành acid lactic. Kết quả của phản ứng này là với mỗi gam
acid malic sẽ tạo thành được 0.67g acid lactic và 0.33gam CO
2
nhưng lại không sinh ra
năng lượng dưới dạng ATP mà tế bào có thể sử dụng được.
Tuy nhiên, nếu xét về ý nghĩa của biến đổi trên đối với sự trao đổi chất của vi
khuẩn lactic thì chúng ta có thể xem đây là một quá trình lên men bởi vì nguyên nhân
sau: cũng giống như quá trình lên men thông thường, mục đích của vi sinh vật thực
hiện các chuyển hóa cơ chất cũng chỉ phục vụ cho nhu cầu về mặt năng lượng để
chúng có thể sinh trưởng và phát triển. Quá trình lên men malolactic xảy ra bên trong
tế bào cũng có ý nghĩa tương tự. Khi thực hiện phản ứng trên, chất cho điện tử chính là
acid malic, còn chất nhận điện tử cũng chính là NAD
+
để chuyển thành NADH
+
H
+
và
chất này sẽ tham gia vào các chu trình sinh hóa trong cơ thể sinh vật để sản sinh ra
năng lượng cung cấp cho tế bào.
Ngoài ra, cũng theo Margalit, trong quá trình lên men malolactic, vi khuẩn
lactic có thể sử dụng 3 con đường khác nhau để chuyển hóa acid malic. Một là con
đường chuyển hóa trực tiếp L-acid malic thành L-acid lactic và carbon dioxide nhờ
enzyme malate carboxylase. Cơ chế này có mặt ở hầu hết vi khuẩn malolactic. Con
đường thứ hai liên quan đến việc phân giải acid malic nhờ xúc tác của hệ “enzyme
malic” thành oxaloacetate và tiếp tục thành acid pyruvic và CO
2
. L-lactate
dehydrogenase, sau đó, sẽ xúc tác cho phản ứng khử acid pyruvic thành L-acid lactic.
Cơ chế này được tìm thấy ở Lactobacillus casei và Lactobacillus faecalis.

Acid malic Acid oxaloacetic Acid pyruvic Acid lactic
Chương 2: Tổng quan tài liệu
13
Con đường thứ ba là được tìm thấy ở Lactobacillus fermentum. Vi khuẩn này
có khả năng chuyển hóa L-acid malic thành acid lactic ở cả hai dạng đồng phân L- và
D Ngoài ra còn có một số sản phẩm trao đổi chất trung gian như acetate, succunate
và carbon dioxide.


Sơ đồ 2. 2 Con đường chuyển hóa vật chất của quá trình lên men glucose nhờ vi khuẩn
malolactic (Wood và Holzapfel 1995) [37].

Lên men lactic đồng hình
Con đường phosphoketolase
Lên men lactic dị hình
Đư
ờ
ng phân

Con đường Bifidus
Con đường 6-P-Gluconate
Chương 2: Tổng quan tài liệu
14
2.3.2 Vị trí của lên men malolactic trong sản xuất rượu vang
Trong sản xuất rượu vang, quá trình lên men malolactic được tiến hành sau khi
lên men chính. Dịch sau lên men rượu được gọi là “vang non” được tiến hành lắng cặn
và được chuyển sang bồn lên men tiếp theo. Quá trình này diễn ra rất chậm nhằm phân
giải lượng đường cuối cùng, song song với qúa trình này là vi khuẩn lactic sẽ phân giải
acid malic thành acid lactic làm cho vang được chuyển từ vị chua gắt sang vị chua nhẹ
dễ chịu, CO

2
còn được tiếp tục giải phóng nhưng có xu hướng giảm dần, hương vị
rượu vang cũng được hoàn thiện. Dung dịch lên men ở trạng thái tĩnh, xác nấm men
lắng xuống đáy bồn hay nồi lên men. Tiếp theo, dịch vang được tiến hành lắng gạn
tiếp vài lần, mỗi lần từ 20 đến 30 ngày rồi tiếp tục đến quá trình ủ chín.
2.3.3 Phân loại vi khuẩn lên men malolactic
2.3.3.1 Phân loại và hình thái vi khuẩn malolactic
Thuật ngữ “vi khuẩn malolactic” thường được dùng để chỉ những giống vi
khuẩn có khả năng chuyển hóa acid malic trong rượu vang thành acid lactic. Tất cả vi
khuẩn malolactic đều là vi khuẩn Gram dương, có hình cầu hoặc hình que, không có
catalase, thuộc nhóm vi hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện. Có 4 giống vi khuẩn lactic rất
quan trọng trong sản xuất rượu vang: Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc,
Oenococcus [31][37].

Hình 2. 3 Hình thái vi khuẩn Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc [45][53].