Nghiên cứu tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 nhằm đánh giá mối liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa oryza sativa

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Đặng Ngọc Hoa

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN
CỦA GEN OsHKT1;4 NHẰM ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN
ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở LÚA (Oryza sativa)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------------------

Đặng Ngọc Hoa

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH VÀ MỨC ĐỘ BIỂU HIỆN
CỦA GEN OsHKT1;4 NHẰM ĐÁNH GIÁ MỐI LIÊN QUAN
ĐẾN KHẢ NĂNG CHỊU MẶN Ở LÚA (Oryza sativa)
Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số:
60420121

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đỗ Thị Phúc
XÁC NHẬN HỌC VIÊN ĐÃ CHỈNH SỬA THEO GÓP Ý CỦA HỘI ĐỒNG

Giáo viên hƣớng dẫn

Chủ tịch hội đồng chấm luận văn
thạc sĩ khoa học

TS. Đỗ Thị Phúc

PGS.TS. Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội - 2015


LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS. Đỗ Thị Phúc, Bộ môn Di truyền
học, Khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội
đã thu nhận, hƣớng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện cho tơi trong suốt quá trình
thực hiện luận văn thạc sỹ khoa học.
Tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô công tác tại bộ môn
Di truyền học và Khoa Sinh học đã chỉ bảo và tạo điều kiện cho tơi hồn thành
luận văn này.
Trong q trình học tập và nghiên cứu tại phịng thí nghiệm Bộ môn Di
truyền học, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ và chia sẻ tận tình về chun mơn của tập
thể anh chị và các bạn trong phịng thí nghiệm. Tơi xin chân thành cảm ơn sự giúp
đỡ quý báu đó !
Cuối cùng, tôi muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và tất cả các bạn đã
động viên và chia sẻ khó khăn cùng tơi trong thời gian qua !

Đặng Ngọc Hoa

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 7
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................................... 9
1.1.

Cây lúa và khả năng chịu mặn ...................................................................... 9

1.1.1. Giới thiệu về cây lúa (Oryza sativa) .......................................................... 9
1.1.2. Đáp ứng với stress mặn ở thực vật và cây lúa ......................................... 11
1.2.

Protein High-Affinity K+ Transporter (HKT) ở thực vật ............................ 16

1.2.1. Họ protein HKT ở thực vật ...................................................................... 16
1.2.2. Họ protein HKT ở lúa .............................................................................. 17
1.2.3. Gen OsHKT1;4 ......................................................................................... 18
1.3.

Một số phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu đa hình............................. 20

1.3.1. Phƣơng pháp PCR và PCR-RFLP............................................................ 20
1.3.2. Phƣơng pháp giải trình tự......................................................................... 21
1.4.

Một số phƣơng pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen ...................... 24

1.4.1. Lai northern blot và Lai huỳnh quang tại chỗ .......................................... 24
1.4.2. RT-PCR và Real time PCR ...................................................................... 24

1.4.3. Microarray................................................................................................ 25
1.5. Tình hình nghiên cứu liên quan đến họ gen HKT ở lúa ............................... 26
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .......................................................... 27
2.1. Vật liệu, hóa chất và thiết bị ........................................................................... 27
2.1.1. Vật liệu ..................................................................................................... 27
2.1.2. Hóa chất ................................................................................................... 27
2.1.3. Thiết bị ..................................................................................................... 29

1


2.2. Nhóm phƣơng pháp sử dụng trong phân tích đa hình gen ............................. 29
2.2.1. Tách chiết DNA tổng số........................................................................... 29
2.2.2. PCR khuếch đại vùng gen ........................................................................ 29
2.2.3. Điện di trên gel agarose ........................................................................... 30
2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR và giải trình tự DNA ....................................... 30
2.2.5. Phân tích số liệu ....................................................................................... 31
2.3. Nhóm phƣơng pháp sử dụng trong phân tích biểu hiện gen .......................... 31
2.3.1. Trồng lúa trong dung dịch thủy canh và xử lý mặn ................................. 31
2.3.2. Tách chiết RNA tổng số ........................................................................... 31
2.3.3. Xử lý với DNase I .................................................................................... 32
2.3.4. Tổng hợp cDNA ....................................................................................... 32
2.3.5. RT-PCR .................................................................................................... 32
2.3.6. Phân tích số liệu ....................................................................................... 33
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 34
3.1. Phân tích đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;4 ở lúa .......................... 34
3.1.1. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá lúa..................................................... 34
3.1.2. Khuếch đại vùng promoter của gen OsHKT1;4 ....................................... 34
3.1.3. Phân tích đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;4 ở lúa .................... 35
3.1.4. Phân tích các yếu tố cis thuộc vùng promoter của gen OsHKT1;4

bằng cơng cụ tin sinh ........................................................................................... 38
3.2. Phân tích đa hình vùng mã hóa của gen OsHKT1;4 ở lúa ............................. 42
3.2.1. Khuếch đại vùng exon 2 và exon 3 của gen OsHKT1;4 .......................... 42
3.2.2. Phân tích đa hình vùng exon 2 và exon 3 của gen OsHKT1;4 ................ 43

2


3.3. Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 ở lá lúa ............................... 44
3.3.1. Trồng lúa thủy canh và xử lý mặn ........................................................... 45
3.3.2. Tách chiết RNA tổng số từ mơ lá ............................................................ 45
3.3.3. Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 bằng phƣơng pháp
RT-PCR .............................................................................................................. 46
3.3.3.1. Tổng hợp cDNA................................................................................ 46
3.3.3.2. Phân tích mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 bằng phƣơng pháp
RT-PCR .......................................................................................................... 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................................. 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 50
PHỤ LỤC

3


DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1. Các bậc phân loại và phân bố của cây lúa [8] .......................................... 11
Bảng 1.2. Danh pháp, vị trí các locus của các gen thuộc họ HKT ở lúa [37] .......... 18
Bảng 2.1. Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu ......................................................... 27
Bảng 2.2. Trình tự mồi cho phản ứng PCR .............................................................. 28
Bảng 2.3. Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen ............................................. 30

Bảng 2.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR khuếch đại gen........................................ 30
Bảng 2.5. Thành phần và quy trình tổng hợp cDNA ............................................... 32
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng RT-PCR................................................................ 33
Bảng 2.7. Chu trình nhiệt phản ứng RT-PCR .......................................................... 33
Bảng 3.1. Các vị trí đa hình vùng promoter của gen OsHKT1;4 ở 9 giống lúa
thuộc nhóm II so với cơ sở dữ liệu ........................................................................... 38
Bảng 3.2. Kết quả dự đoán các yếu tố cis vùng promoter của gen OsHKT1;4
ở 12 giống lúa nghiên cứu......................................................................................... 40

4


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây lúa và các bộ phận của cây ............................................................................ 9
Hình 1.2. Sơ đồ tiến hóa của cây lúa [13] ........................................................................... 10
Hình 1.3. Mơ hình hóa hệ thống một số kênh vận chuyển Na+ ở thân bẹ và rễ [65] ......... 12
Hình 1.4. Tổng quan về cơ chế vận chuyển Na+ và các thành phần quan trọng trong
hệ thống đáp ứng stress mặn ở các tế bào rễ thực vật.......................................................... 14
Hình 1.5. Sự khác nhau về kích thƣớc intron ở 2 phân họ HKT [37] ................................. 16
Hình 1.6. Vị trí phân bố và kích thƣớc của gen OsHKT1;4 trên NST số 4 ở lúa ............... 18
Hình 1.7. Mơ hình vận chuyển Na+ của gen OsHKT1;4 ở thân bẹ [61] ............................. 19
Hình 1.8. Mơ hình phân tử dạng toàn vẹn (A) và dạng sai khác do cắt nối luân phiên (B)
của protein OsHKT1;4 [61] ................................................................................................. 20
Hình 1.9. Giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger ............................................................... 22
Hình 3.1. DNA tổng số tách từ mẫu lá của 12 giống lúa .................................................... 34
Hình 3.2. Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng promoter của gen OsHKT1;4
ở 12 giống lúa. ..................................................................................................................... 35
Hình 3.3. Kết quả phân tích đa hình trình tự nucleotide vùng promoter của gen OsHKT1;4
ở 12 giống lúa nghiên cứu so với cơ sở dữ liệu bằng phần mềm MUTALIN......................37
Hình 3.4. Trình tự vùng promoter của gen OsHKT1;4 và vị trí của các yếu tố cis

của 9 giống lúa thuộc nhóm II ............................................................................................. 41
Hình 3.5. Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng exon 2 của gen OsHKT1;4 sử dụng mồi
OsHKT1;4-2 của 12 giống lúa. ............................................................................................ 42
Hình 3.6. Sản phẩm phản ứng PCR nhân vùng exon 3 của gen OsHKT1;4 sử dụng mồi
OsHKT1;4-3 của 12 giống lúa. ............................................................................................ 43
Hình 3.7. Kết quả phân tích đa hình trình tự nucleotide exon 2 (A) và exon 3 (B)
của gen OsHKT1;4 ở 12 giống lúa và cơ sở dữ liệu. ........................................................... 44
Hình 3.8. Kết quả điện di sản phẩm tách chiết RNA tổng số của giống Pokkali ............... 46
Hình 3.9. Kết quả phản ứng RT-PCR ở 2 giống lúa Nipponbare (A) và Pokkali (B)
tại các mức độ điều kiện stress mặn khác nhau. .................................................................. 47
Hình 3.10. Kết quả phân tích bán định lƣợng sự biểu hiện của gen OsHKT1;4 ở mức độ
phiên mã của 2 giống lúa Nipponbare (A) và Pokkali (B) .................................................. 48

5


BẢNG CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT

bp

Basepair

cDNA

Complementary DNA

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

dS/m

deci Siemens per meter

EC

Electric Conductivity

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

gDNA

Genomic DNA

Gly

Glycine

HKT

High-Affinity K+ Transporter

mRNA

Messenger RNA

Os

Oryza sativa

PCR

Polymerase Chain Reaction

ppm

part per million

QLT

quantitative trait loci

RFLP

Restriction fragment length polymorphism

RT

Reverse Transcriptase

RT-PCR

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

Ser

Serine

IRRI

International Rice Research Institute

TF

Transcription factor

6


MỞ ĐẦU

Hiện nay, nền nông nghiệp thế giới đang phải đối mặt với thử thách là cung
cấp khoảng 70% nguồn thức ăn cho thêm 2,3 tỷ ngƣời đến năm 2050 [27]. Năng
suất cây trồng nông nghiệp thấp hơn chủ yếu là do các stress phi sinh học khác nhau
nhƣ độ mặn cao, hạn hán, nhiệt độ... đang là mối đe dọa đến an ninh lƣơng thực trên
toàn thế giới [82;53]. Đáng chú ý, diện tích đất nhiễm mặn ngày càng tăng do nhiều
yếu tố bao gồm biến đổi khí hậu, mực nƣớc biển dâng cao, sự tồn tại của mỏ đá
muối… có thể dẫn đến mất 50% diện tích đất canh tác nông nghiệp hiện nay vào
năm 2050 [85].
Việt Nam có đƣờng bờ biển dài 3.260 km, hệ thống sơng chằng chịt đổ ra
biển qua rất nhiều cửa sông. Hai khu vực trồng cây nơng nghiệp chính của cả nƣớc
là đồng bằng sông Hồng và sông Cửu Long hàng năm bị ảnh hƣởng nghiêm trọng
bởi sự xâm lấn của nƣớc biển, là một trong những nguyên nhân chính gây ra nhiễm
mặn đất trồng trọt. Stress mặn dẫn đến ức chế nghiêm trọng sự tăng trƣởng và phát

triển của thực vật, gây mất cân bằng ion do tích lũy Na+ và Cl-, tăng cƣờng peroxide
lipid, tăng sản phẩm của các dạng phản ứng oxy nhƣ các gốc superoxide và
hydroxyl.
Hiện nay có 2 phƣơng pháp khắc phục sự nhiễm mặn. Một là cải tạo môi
trƣờng, tạo điều kiện thuận lợi cho cây trồng phát triển, phƣơng pháp này đòi hỏi
phải thực hiện ở quy mơ lớn, kinh phí tốn kém nên khó áp dụng trong viêc canh
tác trồng trọt của ngƣời dân. Phƣơng pháp thứ 2 là lựa chọn và tạo ra các giống
cây trồng có thể đáp ứng đƣợc với các điều kiện stress: dễ tiếp cận, ứng dụng rộng
rãi hơn, hạn chế kinh phí, hiệu quả cao và lâu dài [91]. Để cải thiện năng suất cây
trồng trong điều kiện stress mặn thì việc cần thiết là hiểu các cơ chế phân tử cơ
bản đằng sau các đáp ứng stress mặn ở thực vật. Khả năng chịu mặn là một tính
trạng số lƣợng đƣợc kiểm sốt bởi nhiều gen [15].

7


Lúa là một trong những cây lƣơng thực quan trọng đối với con ngƣời. Hơn
90% lúa gạo trên thế giới đƣợc trồng và tiêu thụ ở Châu Á (nơi chiếm 60% dân số
thế giới). Ở Việt Nam, việc lai tạo và sử dụng các giống lúa có khả năng chịu mặn
ngày càng đƣợc áp dụng rộng rãi tại nhiều địa phƣơng trên cả nƣớc, đặc biệt là các
vùng lân cận biển. Tuy nhiên, các nghiên cứu phân tử về các gen liên quan đến khả
năng đáp ứng stress mặn vẫn cịn rất hạn chế. Vì vậy, chúng tơi tiến hành “Nghiên
cứu tính đa hình và mức độ biểu hiện của gen OsHKT1;4 nhằm đánh giá mối
liên quan đến khả năng chịu mặn ở lúa (Oryza sativa)”
Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phịng thí nghiệm Di truyền học, Bộ mơn Di
truyền học. Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.

8

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 . Cây lúa và khả năng chịu mặn
1.1.1. Giới thiệu về cây lúa (Oryza sativa)
Lúa là cây nơng nghiệp đƣợc
trồng rộng rãi trên tồn thế giới, cung
cấp nguồn thực phẩm thiết yếu cho
khoảng một nửa dân số thế giới [52].
Đây là loài cây trồng ngũ cốc dinh
dƣỡng, chứa carbohydrate, protein,
lipid, khống sản, …vv. Ngồi ra, rơm
rạ cũng là nguồn thức ăn gia súc quan
trọng ở nhiều nƣớc.

Hình 1.1. Cây lúa và các bộ phận của cây

Với khả năng thích nghi tốt ở các điều kiện phát triển đa dạng, lúa đƣợc canh
tác từ phía bắc bờ sông Amur (53º N) trên biên giới giữa Nga và Trung Quốc đến
phía nam Argentina (40º S) (IRRI, 1985). Cây lúa có thể đƣợc trồng ở vùng khí hậu
mát mẻ hay trong hệ thống tƣới tiêu ở những sa mạc nóng. Nó cũng có thể phát
triển tốt ở những vùng sông nƣớc nhƣ vùng đồng bằng sông Mekong ở Việt Nam,
sông Hằng-Brahmaputra ở Bangladesh và miền đông Ấn Độ, đặc biệt là các khu
vực nƣớc lợ có nồng độ muối cao nhƣ nơi cửa sông.
Cây lúa (Oryza sativa L.) thuộc chi Oryza, phân họ Poaceae, bộ Poales [92].
Có hai loài lúa trồng là O. sativa đƣợc trồng - phát triển trên toàn thế giới, và
O. glaberrima đƣợc trồng ở Tây và Trung Phi. Trong đó, O. sativa có rất nhiều các
kiểu sinh thái (giống) thích nghi với nhiều điều kiện môi trƣờng. Lúa hoang châu Á,
tổ tiên của O. sativa đã trải qua một loạt các biến đổi sau hàng ngàn năm và đƣợc
cho là đã hình thành trong khoảng 15.000 đến 10.000 BC. Sau đó dần dần phát triển
ở đông bắc và miền đông Ấn Độ, Bắc Đông Nam Á và miền nam Trung Quốc [13].
Lúa hoang đƣợc phân biệt với lúa trồng (O. sativa) bởi các đặc điểm về hình thái,

9


sinh lý và đặc điểm sinh thái nhƣ môi trƣờng sống, chiều cao cây, hình dáng, kích
thƣớc và mầu sắc, thời gian sinh trƣởng, khả năng kháng hoặc chống chịu với bệnh,
cơn trùng, nhiệt độ.... Ngồi ra các phân tích isozyme cho thấy lúa hoang sở hữu
nhiều alen ở locus isozyme khác nhau và có mức độ đa hình cao hơn O. sativa [60].
O. sativa đƣợc nhân rộng và phân hóa thành hai nhóm sinh thái là Indica và
Japonica [60]. Japonica đƣợc trồng ở nơi khô ráo, mát mẻ của vùng cận nhiệt đới
và ôn đới trong khi Indica đƣợc tìm thấy ở vùng nhiệt đới Châu Á. Indica có lá bản
rộng và sáng hơn, cây cao và đẻ nhánh tốt, hạt dài - mảnh cịn Japonica có lá hẹp và
xanh đậm hơn, chiều cao cây thấp hơn và đẻ nhánh trung bình, hạt trịn -ngắn.

Hình 1.2. Sơ đồ tiến hóa của cây lúa [13]

10


Về cơ bản O. sativa là cây tự thụ phấn, tuy nhiên thụ phấn chéo tự nhiên có
thể xảy ra giữa các giống khác nhau ở các khu vực kề cận với một tỷ lệ lên đến
0,5%. Thế hệ F1 có khả năng sinh sản kém [60].
Bảng 1.1. Các bậc phân loại và phân bố của cây lúa [8]

1.1.2. Đáp ứng stress mặn ở thực vật và cây lúa
Độ mặn là một trong những stress phi sinh học chính ở thực vật, gây ảnh
hƣởng lớn đến năng suất cây trồng [7]. Độ mặn có nghĩa là sự xuất hiện của muối
(chủ yếu là NaCl, ion Na+) trong nƣớc ngầm hoặc dung dịch đất ở mức độ ức chế sự
tăng trƣởng của thực vật [69]. Đất đƣợc coi là nhiễm mặn khi độ dẫn diện của dung
dịch đất (Ece) vƣợt quá 4 dS/m (40 mM NaCl) [56; 69]. Nồng độ muối thực tế có

11


ảnh hƣởng tiêu cực đến tăng trƣởng của các loại thực vật khác nhau phụ thuộc vào
nhiều yếu tố, bao gồm loài thực vật, loại đất và nƣớc [56]. Độ mặn trung bình vƣợt
q 1,9 dS/m (decisiemens/m) có thể làm giảm sản lƣợng hạt, ở độ mặn vƣợt quá
3.0 dS/m mật độ cây lúa có thể giảm 30 - 40 % [77].

Hình 1.3. Mơ hình hóa hệ thống một số kênh vận chuyển Na+ ở thân bẹ và rễ [65]
Kênh vận chuyển chịu trách nhiệm thu hồi Na+ từ xylem rễ gồm AtHKT1;1 và
OsHKT1;5) và Na+ / H+ antiporter (SOS1). Kênh vận chuyển chịu trách nhiệm thu hồi Na+
từ mô xylem thân bẹ gồm (AtHKT1;1 và OsHKT1;4) và Na+ / H+ antiporter (SOS1). Loại
tế bào miêu tả gồm: biểu bì (EP), nhu mơ vỏ (CO), trung bì (EN), trụ bì (PR), nhu mô
xylem (XP) và metaxylem (MX)

12


Chống chịu mặn ở thực vật là một đặc tính đƣợc điều khiển bởi nhiều yếu tố.
Đối với những loài nhạy cảm với độ mặn nhƣ Arabidopsis thaliana và Oryza sativa
thì bị ức chế sinh trƣởng tại 100 mM NaCl, trong khi, lồi Atriplex amnicola có thể
phát triển ở 600 mM NaCl [69]. Khi thực vật tiếp xúc với điều kiện mơi trƣờng bất
lợi, nó thƣờng biểu hiện kiểu hình già yếu nhƣ cháy xém lá [67]. Các phản ứng này
có thể giúp cây thích ứng với stress mặn theo một số cách khác nhau, bao gồm giảm
sự thoát hơi nƣớc ở các lá bị cháy xém, chuyển hƣớng các nguồn năng lƣợng và
dinh dƣỡng đến cho lá non, đỉnh sinh trƣởng và bảo vệ các cơ quan quan trọng bởi
sự tích lũy các ion gây độc trong các lá già yếu [16].
Khả năng chịu mặn trong nhiều thực vật tỷ lệ nghịch với mức độ tích lũy Na+
trong thân bẹ, đặc biệt là ở các cây lƣơng thực chính nhƣ lúa mì và gạo [79]. Có rất

nhiều cơ chế dẫn đến khả năng chịu mặn khác nhau giữa các lồi, trong đó các
protein vận chuyển chất tan thƣờng rất quan trọng, đặc biệt là các protein vận
chuyển Na+ [56; 65]. Na+ đƣợc tìm thấy là có sự tích lũy khác nhau giữa các loại tế
bào của lá [44]. Sự tích lũy Na+ ở các tế bào biểu bì lá, tránh gây độc cho các mơ
quang hợp, có thể do hoạt động của các kênh cation không chọn lọc [44].
Một số kênh vận chuyển nhƣ NHX, SOS1 và HKT thể hiện vai trò trung tâm
trong vận chuyển Na+ ở điều kiện mặn. NHX và SOS tham gia vào việc duy trì hàm
lƣợng ion Na+ thấp trong tế bào chất [6]. Hai yếu tố chính duy trì lƣợng Na+ thấp
trong tế bào chất ở tế bào thực vật là các kênh trao đổi (exchanger) Na+/H+ hiện
diện trên màng không bào (tonoplast) NHX1 và kênh đối chuyển (antiporter)
Na+/H+ trên màng sinh chất (plasma membrane) SOS1. Hầu hết các kênh NHX cần
thiết cho q trình khử độc Na+ thơng qua sự cơ lập Na+ vào trong không bào thực
vật, trong khi SOS thực hiện xuất Na+ ra khỏi tế bào [3]. Ví dụ, việc chuyển gen và
sự biểu hiện vƣợt mức của gen AtNHX1 trên cà chua làm tăng nồng độ ion K+ trong
không bào cũng nhƣ sự vận chuyển K+ từ rễ lên chồi, quá trình này giúp gia tăng tỷ
lệ K+/Na+ nội bào (giảm Na+) dẫn đến giảm hiệu ứng của stress mặn do Na+ gây ra
[48]. Bất hoạt đồng thời gen NHX 5 và NHX 6 có mặt trên bộ máy Golgi và mạng
lƣới trans-Golgi dẫn đến cây mẫn cảm với stress mặn và giảm tính chống chịu [4].

13


HKT là nhân tố chính trong sự chống chịu mặn ở thực vật. Các thành viên
trong họ gen HKT ở lúa có mặt trong tế bào nhu mơ xylem và bảo vệ lá khỏi stress
mặn bằng cách loại bỏ Na+ khỏi xylem, giảm sự thẩm thấu của các ion theo gradien
nồng độ [68]. Ví dụ gen OsHKT1;5 tham gia vào vận chuyển Na+, có chức năng
quan trọng trong mơ xylem, nhằm giúp thu hồi Na+ từ mạch gỗ, do đó làm giảm tích
lũy Na+ trong thân bẹ của cây [68].

Hình 1.4. Tổng quan về cơ chế vận chuyển Na+ và các thành phần quan trọng trong

hệ thống đáp ứng stress mặn ở các tế bào rễ thực vật.
Na+ (mầu đỏ) đi vào tế bào thông qua các kênh không chọn lọc cation nhƣ NSCCs
và một số kênh khác (màu cam) và hình thành con đƣờng truyền tín hiệu làm biểu hiện
vƣợt mức các gen nhƣ họ HKT và kích hoạt các cơ chế giải độc tế bào (nhƣ hoạt động của
các kênh vận chuyển HKT1, NHX, SOS1) [31]

14


Các yếu tố phiên mã (transcription factor) có mối liên hệ chặt chẽ với các cơ
chế cảm ứng mặn, đóng góp vào tính đề kháng của cây [31]. Các yếu tố phiên mã
chính liên quan trong các đáp ứng với stress mặn nhƣ bZIP [59] (basic leucine
zipper), WRKY [40], AP2/ERF [45] (APETALA2/ETHYLENE RESPONSE
FACTOR), MYB [12], bHLH [41] và NAC [83]. Các yếu tố phiên mã này chịu
trách nhiệm điều hòa sự biểu hiện của các gen ảnh hƣởng đến các mức độ chống
chịu stress mặn ở thực vật (Hình 1.4). Các gen liên quan đến các quá trình đáp ứng
này đƣợc kích hoạt biểu hiện ở mức cao nhƣ các gen liên quan đến hấp thu các ion
vô cơ, sự tổng hợp các osmolyte (các phân tử điều hịa tính thẩm thấu của tế bào)
[30] và quá trình sinh tổng hợp các hormone thực vật (phytohormone) [24].
Trong quá trình cảm ứng stress mặn, các yếu tố phiên mã có thể đƣợc kích
hoạt trực tiếp bởi kênh Ca2+/calmodulin và bao gồm cả các yếu tố kích hoạt phiên
mã gắn kết với calmodulin CAMTA (calmodulin-biding transcription activator)
[63], GTL (GT element-biding like protein) [87] và MYB [90].
Sự thay đổi lƣợng hormone ABA (abscisic acid), jasmonate (JA), GA và BR
(brassinosteroid) xảy ra ở hai giai đoạn ức chế tăng trƣởng và phục hồi sau cảm ứng
stress [24; 30]. Hormone ABA ngăn cản sự kéo dài của hệ thống rễ trong mơi
trƣờng có nồng độ muối cao [20]. Hormone auxin giúp thực vật tránh né mơi trƣờng
có độ muối cao bằng cách thay đổi hƣớng tăng trƣởng của rễ (sự hƣớng động liên
quan đến hiện tƣợng mặn - halotropism) [28]. Ngoài ra, hormone ethylene cũng cho
thấy vai trò quan trọng trong sự chống chịu mặn ở cây Arabidopsis thông qua sự

thay

đổi

tỉ

lệ

Na+/K+

ở

chồi.

Bất

hoạt

gene

ETO1

(ETHYLENE

OVERPRODUCER1) gây ra các thay đổi hàm lƣợng ethylene và qua đó kích thích
q trình sản xuất ROS ở vùng trụ rễ bởi yếu tố RBOHF (respiratory burst oxidase
homolog F). Sự gia tăng ROS ở trụ giữa dẫn đến giảm dòng ion Na+ vào rễ, giảm
thu nhận Na+ ở mạch gỗ (xylem) và duy trì ion K+ ở rễ giúp tăng cƣờng khả năng
chống chịu mặn [39] .

15


1.2.

Protein High-Affinity K+ Transporter (HKT) ở thực vật

1.2.1. Họ protein HKT ở thực vật
Schachtman và Schroeder là ngƣời đầu tiên đã phát hiện ra các protein HKT
(High-affinity Potassium Transporters) [76] chỉ có ở thực vật nhƣng có trình tự và
chức năng tƣơng tự với lớp protein vận chuyển cation TrkH / TrkB ở vi khuẩn và
nấm [10; 11; 22]. HKTs thuộc lớp các protein màng quan trọng (IMP), tham gia
vào q trình vận chuyển cation qua màng tế bào, đóng vai trò quan trọng trong việc
tham gia vào khả năng chống chịu mặn ở thực vật [56; 69].

Hình 1.5. Sự khác nhau về kích thƣớc intron ở 2 phân họ HKT [37]
(a) Cấu trúc gen từ mã mở đầu đến mã kết thúc. Exon: mầu trắng, intron: mầu xanh.
Tất cả các gen HKT đều chứa 2 intron
(b) So sánh kích thƣớc exon và intron tƣơng ứng ở 2 phân họ. Kích thƣớc exon ở 2
phân họ là tƣơng đƣơng nhau, trong khi kích thƣớc intron ở phân họ 1 dài hơn phân họ 2.

16


Dựa vào sự chọn lọc vận chuyển, HKTs đƣợc phân thành hai phân họ. Phân
họ 1 chỉ vận chuyển Na+; trong khi phân họ 2 vận chuyển cả Na+ và K+ (có vận
chuyển đồng thời những ion này ở điều kiện cụ thể) hoặc chỉ vận chuyển Na+ tại
nồng độ Na+ cao. Gen HKT đƣợc xác định nằm trong locus tính trạng số lƣợng
(quantitative trait loci - QLT), biểu hiện khác nhau về khả năng chịu mặn ở lúa mì
[21; 23]. Tất cả các gen HKT đều chứa 2 intron. Tuy nhiên, các gen thuộc phân họ 1

có tỷ lệ độ dài intron lớn hơn phân họ 2 (Hình 1.5).
Ở điều kiện phát triển bình thƣờng, một số gen nhƣ TaHKT2;1, OsHKT2;1,
OsHKT2;4 biểu hiện ở phần phụ của rễ (bao gồm lơng rễ) và có thể thu thập Na+ từ
dung dịch đất vào trong rễ [46; 47; 75]. Tuy nhiên, chức năng quan trọng của HKTs
còn đƣợc xác định trong việc hỗ trợ thực vật sống sót ở đất nhiễm mặn cao qua
nhiều thí nghiệm bất hoạt gen này dẫn đến sự mẫn cảm của cây với điều kiện mặn
[5; 17; 54] và thông qua sự chuyển gen HKT biểu hiện ở nhiều lồi thực vật khác, ví
dụ sự biểu hiện của AtHKT1;1 trong lúa cho phép cây phát triển tốt hơn trong điều
kiện mặn [64]. Thí nghiệm này cịn có ý nghĩa trong việc chuyển gen để nâng cao
khả năng chịu mặn của cây trồng.
1.2.2. Họ protein HKT ở lúa
Ở lúa có 9 gen thuộc họ HKT, đƣợc phân thành hai phân họ (Bảng 1.2). Phân
họ I gồm OsHKT1;1 - OsHKT1;5, phân họ II gồm OsHKT2;1 - OsHKT2;4. Phân họ
1 có ái lực với Na+. OsHKT1;5 đƣợc xác định nằm trên locus tính trạng số lƣợng
SKC1 mã hóa cho một protein vận chuyển Na+ ở mô xylem rễ [49]. OsHKT1;1 có
thể đƣợc biểu hiện ở chồi và rễ. OsHKT1;2 là một gen giả, sản phẩm phiên mã của
gen cũng đƣợc phân lập từ rễ cây lúa. OsHKT1;3 chủ yếu biểu hiện ở thân lá, ít biểu
hiện ở rễ. OsHKT1;4 đƣợc biểu hiện chính ở thân lá [28]. Các gen thuộc phân họ 2
đồng vận chuyển Na+ và K+ hoặc vận chuyển chọn lọc Na+ hoặc K+. Một số gen
biểu hiện ở cả trong vỏ rễ, và có khả năng thu thập Na+ trong điều kiện thiếu K+,
cung cấp ion nội mô. Dƣới điều kiện stress mặn sự biểu hiện của những gen này sẽ
đƣợc điều hòa giảm hoạt động. Ví dụ nhƣ ở protein OsHKT2;1 vận chuyển Na+

17


vào trong rễ, nhƣng hoạt động của nó bị giảm xuống ở những cây xử lý mặn 30 mM
NaCl, do đó làm giảm tích lũy Na+ gây độc cho cây [33]. Ngoài ra, OsHKT2;1 cũng
đƣợc biểu hiện trong lá [43]. OsHKT2;2 có thể hoạt động đồng vận chuyển Na+ và
K+. Cây lúa xử lý mặn ở 150 mM NaCl làm tăng cƣờng biểu hiện của gen này ở lá,

đặc biệt là ở các tế bào diệp lục [43]. Các gen OsHKT2;3 / 4 Biểu hiện chủ yếu
trong mô thân bẹ, ít biểu hiện ở rễ [29].
Bảng 1.2. Danh pháp, vị trí các locus của các gen thuộc họ HKT ở lúa [37]

1.2.3. Gen OsHKT1;4
Gen OsHKT1;4 nằm trên NST số 4, dài 5252 bp (Hình 1.6), với kích thƣớc
khung đọc mở dài 1503 bp. Gen đƣợc biểu hiện chính ở thân lá [29], có vai trị loại
ion Na+ ra khỏi mơ quang hợp, một cơ chế quan trọng cho khả năng chịu mặn của
cây trồng (Hình 1.7).

Hình 1.6. Vị trí phân bố và kích thƣớc của gen OsHKT1;4 trên NST số 4 ở lúa
(loci LOC_Os04g51830) />
18


Hình 1.7. Mơ hình vận chuyển Na+ của gen OsHKT1;4 ở thân bẹ [61]
Gen OsHKT1;4 mã hóa cho một protein dài 500 axit amin, và có sự tƣơng
đồng 99,8% giữa 2 giống lúa Pokkali và Nipponbare. Sự khác biệt duy nhất nằm
trong một vị trí thay thế Arginine (R) thành Glutamine (Q) ở vị trí 110 đối với
Pokkali. Mơ hình cấu trúc protein OsHKT1;4 dự đoán rằng sự thay thế này nằm
trong vòng loop ở mặt trong của màng tế bào, kết nối 2 chuỗi α-helices xuyên màng
và không ảnh hƣởng đến tốc độ vận chuyển Na+ của protein OsHKT1;4 [61]. Một
dạng biến đổi sai khác cũng có thể tạo ra một protein có trình tự ngắn hơn 47 axit
amin, trong đó khác nhau 19 axit amin ở vùng đầu C tận cùng (Hình 1.8). Một axit
amin Valine bảo tồn đƣợc tìm thấy ở vị trí 344 [61].

19


Hình 1.8. Mơ hình phân tử dạng tồn vẹn (A) và dạng sai khác do cắt nối

luân phiên (B) của protein OsHKT1;4 [61]
Vùng đầu C tận cùng có sai khác của dạng B đƣợc chỉ ra bằng mũi tên nhỏ. Các vị
trí ion Na+ đƣợc biểu thị mầu tím, và gần trung tâm hoạt động. Vùng mầu đen là trình tự
Ser-Gly-Gly-Gly. Mũi tên đen đậm chỉ lỗ kênh.

1.3.

Một số phƣơng pháp sử dụng trong nghiên cứu đa hình
Cây lúa là cây lƣơng thực mẫn cảm với stress mặn. Các giống lúa sinh

trƣởng trong các điều kiện khác nhau sẽ có các cơ chế chống chịu mặn khác nhau.
Quá trình phức tạp này liên quan chặt chẽ tới mức độ biểu hiện của gen nhằm đáp
ứng với các tín hiệu kích thích từ mơi trƣờng. Sự đa hình trình tự mã hóa của gen và
vùng trình tự promoter có thể dẫn đến mức độ biểu hiện gen khác nhau ở các giống
lúa khác nhau. Việc phân tích đa hình di truyền các gen là một trong những bƣớc
đầu tiên để đánh giá mối liên quan đến khả năng chịu mặn ở các giống lúa.
1.3.1. Phƣơng pháp PCR và PCR-RFLP
PCR (Polymerase Chain Reaction) là phƣơng pháp đƣợc xây dựng bởi
Kary Mullis vào những năm 1980. Phản ứng đƣợc thực hiện dựa trên khả năng của
DNA polymerase (DNA pol) để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với trình tự khn
DNA ban đầu. Enzym này chỉ có khả năng kéo dài mạch nhờ việc gắn thêm một

20


nucleotide vào nhóm chức 3’ - OH tự do của nucleotide trƣớc đó, do đó nó cần có
trình tự mồi chứa đầu 3’ - OH tự do để thực hiện kéo dài chuỗi. Yêu cầu này dẫn
đến có thể khuếch đại một vùng gen mong muốn bằng cách thiết kế mồi đặc hiệu
cho phản ứng PCR. Các enzym này có thể sử dụng để sao chép bất kỳ phân đoạn
axit nucleic quan tâm bằng phản ứng PCR. Sự kết hợp của phƣơng pháp PCR và

giải trình tự sản phẩm PCR sẽ giúp xác định đƣợc chính xác trình tự và các vị trí đa
hình trên vùng gen quan tâm. Phƣơng pháp này rất hiệu quả, chính xác, tiết kiệm
thời gian, ít chi phí.
Phƣơng pháp PCR-RFLP là kỹ thuật dựa trên cơ sở khuếch đại có chọn
lọc một đoạn trình tự DNA, sau đó tiến hành phân cắt đoạn DNA bằng enzym cắt
giới hạn. Sự khác nhau của các băng DNA sau khi chạy điện di sẽ cho ta biết đƣợc
sự đa hình đoạn DNA phân tích. Ƣu điểm của phƣơng pháp này là không tốn kém,
thao tác đơn giản, dễ thực hiện, có thể ứng dụng trong phân tích đa hình đơn
nucleotide. Tuy nhiên, nhƣợc điểm là khơng xác định đƣợc chính xác trình tự gen
và vị trí đa hình. Do mỗi enzym giới hạn chỉ nhận biết và cắt tại một trình tự đặc
hiệu nên sẽ khơng phân tích đƣợc các gen đa hình cao, khơng thích hợp cho phân
tích các gen có mức độ đa hình cao, địi hỏi sử dụng nhiều enzym cắt.
1.3.2. Phƣơng pháp giải trình tự
Kỹ thuật giải trình tự đã trở thành cơng cụ quan trọng trong rất nhiều
lĩnh vực khoa học nhƣ khảo cổ học, nhân chủng học, di truyền, công nghệ sinh
học, khoa học pháp y, sinh học phân tử… Theo thời gian, các kỹ thuật ngày càng
đƣợc phát triển để đáp ứng với các yêu cầu chính xác, nhanh nhạy, hiệu suất cao,
giá rẻ,…
Phương pháp Sanger và các phương pháp enzym khác
Phƣơng pháp giải trình tự DNA đầu tiên đƣợc mơ tả bởi Sanger và
Coulson đƣợc gọi là phƣơng pháp “cộng và trừ” [73]. Phƣơng pháp này sử dụng
DNA pol từ vi khuẩn Escherichia coli và bacteriophage T4 [25; 26] với các
nucleoside triphosphate khác nhau. Sản phẩm tạo ra bởi các polymerase đƣợc điện

21


di trên gel acrylamide. Do sự không hiệu quả của phƣơng pháp này, nên 2 năm sau
đó ơng và cộng sự đã mơ tả một phƣơng pháp mới mang tính đột phá, giải trình tự
các oligonucleotide thơng qua chuỗi trùng hợp bằng enzym [74]. Phƣơng pháp này

đã mở ra cuộc cách mạng trong lĩnh vực gen và đƣợc biết đến nhƣ phƣơng pháp
Sanger hay phƣơng pháp dideoxynucleotide. Bao gồm một enzym xúc tác phản ứng
trùng hợp các triphosphate deoxynucleotide (dNTP) bổ sung với các mẫu DNA
quan tâm. Phản ứng sẽ đƣợc kéo dài cho đên khi các enzym kết hợp một
dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) đƣợc đánh dấu vào chuỗi đang tổng hợp.
Do các ddNTP khơng chứa nhóm 3’ - OH nên enzym sẽ không thể xúc tác gắn thêm
nucleotide tiếp theo, dẫn đến phản ứng kéo dài bị kết thúc (Hình 1.9). Các phƣơng
pháp giải trình tự bằng enzym khác cũng đƣợc sử dụng để xác định trình tự các
đoạn nucleotide trong nghiên cứu di truyền. Trong đó 2 hƣớng tiếp cận đƣợc sử
dụng nhiều nhất là shotgun sequencing và walking primer sequencing [32].

Hình 1.9. Giải trình tự theo phƣơng pháp Sanger
Phương pháp Maxam - Gibert và các phương pháp hóa học khác.
Phƣơng pháp giải trình tự bằng phƣơng pháp hóa học đƣợc mô tả đầu tiên
bởi Maxam và Gilbert (1977) [55]. Nguyên tắc của phƣơng pháp là dựa trên phản
ứng hóa học thủy giải đặc hiệu, các DNA khơng tự xoắn lại với nhau, tạo thành tập
hợp nhiều phân đoạn có kích thƣớc khác nhau. DNA đƣợc đánh dấu đồng vị phóng
xạ 32P ở đầu 5’ của mạch đơn, tạo những đoạn đánh dấu có thể phát hiện bằng hiện
hình phóng xạ. Xử lí hóa học đặc hiệu giúp phân hủy một loại nucleotide của mạch

22