Xác định đồng thời thành phần caffeine, theobromine và theophylline trong một số loại chè phân bố ở miền bắc việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

ĐỒN THỊ BÍCH NGỌC

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI THÀNH PHẦN CAFFEINE, THEOBROMINE
VÀ THEOPHYLLINE TRONG MỘT SỐ LOẠI CHÈ PHÂN BỐ Ở MIỀN
BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – 2016


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

ĐỒN THỊ BÍCH NGỌC

XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI THÀNH PHẦN CAFFEINE, THEOBROMINE
VÀ THEOPHYLLINE TRONG MỘT SỐ LOẠI CHÈ PHÂN BỐ Ở MIỀN
BẮC VIỆT NAM

Chun ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. NGUYỄN VĂN RI

Hà Nội - 2016

LỜI CẢM ƠN
Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn tới PGS.TS. Nguyễn Văn Ri, Bộ mơn
Phân tích – Khoa Hóa học – Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội
đã giao đề tài này cho tơi và tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm q
báu cho tơi trong suốt q trình làm luận văn tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Chu Đình Bính đã định hướng nghiên cứu cho
luận văn này, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ để tơi hồn thành luận văn này.
Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Chu Ngọc Châu đã tận tình hướng dẫn và
giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này.
Để hồn thành được luận văn này, tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của
các thầy cơ tại Bộ mơn Hóa Phân tích – Khoa Hóa học – Đại học Khoa học Tự Nhiên.
Xin chân thành cám ơn Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Công nghiệp rừng, Bộ
môn Bảo quản Lâm sản đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn của tơi được hồn
thành.
Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè, những người đã quan tâm giúp đỡ
và động viên, khuyến khích tơi trong suốt thời gian thực hiện luận văn.

Hà Nội, Ngày 08 tháng 12 năm 2016
Học viên cao học

Đồn Thị Bích Ngọc

i


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3

1.1. Tổng quan Chè (Camellia sinensis (L.) Kuntze) ..............................................3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại các lồi Chè ........................................................3
1.1.2. Thành phần hố học của chè .....................................................................4
1.2. Hoạt tính của nhóm ankaloid. ..........................................................................6
1.2.1. Hoạt tính sinh học của caffeine. ................................................................6
1.2.2. Hoạt tính sinh học của theophyline ...........................................................7
1.2.3. Hoạt tính sinh học của theobromine .........................................................8
1.3. Các phương pháp phân tích thành phần ankaloid. ...........................................9
1.3.1. Phương pháp điện di mao quản .................................................................9
1.3.2. Phương pháp phổ hồng ngoại gần ...........................................................10
1.3.3. Phương pháp phổ Raman ........................................................................12
1.3.4. Phương pháp sắc lỏng .............................................................................13
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......20
2.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu.................................................20
2.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu ..........................................................20
2.1.2. Nội dung nghiên cứu ...............................................................................21
2.2. Phương pháp nghiên cứu................................................................................22
2.2.1. Nguyên tắc chung và trang bị của phương pháp HPLC..........................22
2.2.2. Sắc ký hấp phụ pha ngược RP-HPLC .....................................................23
2.2.3. Detector UV-Vis ......................................................................................25
2.2.4. Phân tích định lượng bằng HPLC ...........................................................25

ii


2.3. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu. ......................................................26
2.3.1. Dụng cụ ...................................................................................................26
2.3.2. Thiết bị ....................................................................................................27
2.3.3. Hóa chất ..................................................................................................28
Chương 3. KẾT QUẢ VẢ THẢO LUẬN ................................................................30

3.1. Khảo sát các điều kiện xác định đồng thời caffeine, theobromine và
theophylline bằng phương pháp HPLC .................................................................30
3.1.1. Khảo sát điều kiện chạy sắc ký ...............................................................30
3.1.2. Khảo sát điều kiện chiết mẫu. .................................................................42
3.2. Đánh giá phương pháp phân tích ...................................................................52
3.2.1. Khảo sát khoảng tuyến tính và xây dựng đường chuẩn xác định đồng thời
caffeine, theophylline và theobromine. .............................................................52
3.2.2. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ. ...........55
3.2.3. Độ chụm (độ lặp lại) ...............................................................................57
3.2.4. Độ đúng (độ thu hồi) ...............................................................................60
3.2.5. Đánh giá, so sánh kết quả phân tích caffeine trong mẫu chè bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao trong luận văn. ...............................................62
3.3. Phân tích mẫu thực .........................................................................................64
3.3.1 Phân tích mẫu lá chè. ...............................................................................65
3.3.2 Phân tích mẫu búp chè. ............................................................................69
3.3.3. Đánh giá kết quả phân tích ......................................................................74
KẾT LUẬN ...............................................................................................................78
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................80
PHỤ LỤC ..................................................................................................................87

iii


DANH MỤC BẢNG:
Bảng 1.1: Thành phần hóa học của chè.......................................................................4
Bảng 1.2: Tổng quan các phương pháp RP-HPLC gần đây cho việc xác định các
methylxanthine. .........................................................................................................16
Bảng 2.1: Bảng địa điểm lấy mẫu búp chè và lá chè. ...............................................20
Bảng 3.1: Mối quan hệ giữa bước sóng và diện tích pic ...........................................32
Bảng 3.2: Khảo sát dung môi pha động ....................................................................35

Bảng 3.3: Khảo sát pH pha động ..............................................................................36
Bảng 3.4: Khảo sát thành phần pha động..................................................................37
Bảng 3.5: Khảo sát sự thay đổi tốc độ pha động.......................................................40
Bảng 3.6: Khảo sát dung môi chiết mẫu chè.............................................................43
Bảng 3.7: Khảo sát khả năng chiết mẫu chè tại năm cấp nhiệt độ khác nhau. .........45
Bảng 3.8: Khảo sát các thời gian chiết mẫu chè khác nhau ......................................47
Bảng 3.9 Khảo sát ảnh hưởng của lượng dung dịch NH3 1%/ etanol 60% được sử
dụng trong quá trình chiết. ........................................................................................49
Bảng 3.10: Điều kiện tối ưu xác định đồng thời TB, TP và CF trong chè ................52
Bảng 3.11: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính. ......................................................53
Bảng 3.12: Bảng giá trị đánh giá sai số hệ thống của các đường chuẩn. ..................55
Bảng 3.13: Giới hạn phát hiện tính theo phương trình hồi quy ................................56
Bảng 3.14: Giới hạn định lượng theo phương trình hồi quy. ....................................57
Bảng 3.15: Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)....58
Bảng 3.16: Bảng tính tốn kết quả độ lặp của phép đo .............................................58
Bảng 3.17: Độ lặp của phương pháp trên mẫu chè. ..................................................59
Bảng 3.18: Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau (theo AOAC) ..............60

iv


Bảng 3.19: Độ thu hồi của phương pháp phân tích...................................................61
Bảng 3.20: Kết quả xác định phần trăm caffeine trong các mẫu chè tại hai phịng thí
nghiệm. ......................................................................................................................63
Bảng 3.21: Bảng chi tiết các địa chỉ lấy mẫu lá chè. ................................................65
Bảng 3.22: Kết quả phân tích đồng thời theobromine, theophylline và caffeine trong
mẫu lá chè..................................................................................................................66
Bảng 3.23: Đánh giá các kết quả phần trăm ankaloid trong các mẫu lá chè ở các tỉnh
khác nhau theo phương pháp song sánh các giá trị trung bình .................................69
Bảng 3.24. Bảng chi tiết các địa chỉ lấy mẫu búp chè. .............................................69

Bảng 3.25: Kết quả phân tích đồng thời theobromine, theophylline và caffeine trong
mẫu búp chè ..............................................................................................................71
Bảng 3.26: Độ lệch chuẩn tương đối của các mẫu búp chè đã đo được ở các tỉnh khác
nhau ...........................................................................................................................73
Bảng 3.27: Đánh giá các kết quả phần trăm ankaloid trong các mẫu búp chè ở các
tỉnh khác nhau theo phương pháp song sánh các giá trị trung bình ..........................74
Bảng 3.28: Tỉ lệ phần trăm khối lượng các ankaloid trong mẫu lá và mẫu búp chè.75

v


DANH MỤC HÌNH VẼ:
Hình 1.1: Cấu trúc của caffeine, theophyline và theobromine....................................6
Hình 2.1: Sơ đồ hệ thống HPLC ..............................................................................23
Hình 2.2: Hệ thống thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao LC-ATVP của Shimazu Nhật
Bản ............................................................................................................................27
Hình 3.1: Phổ hấp thụ cực đại của theobromine, theophylline và caffeine ..............31
Hình 3.2: Mối quan hệ giữa bước sóng và diện tích pic. ..........................................32
Hình 3.3: Sắc đồ khảo sát hai loại cột .......................................................................33
Hình 3.4: Khảo sát dung mơi pha động ....................................................................35
Hình 3.5: Sắc đồ khảo sát pH pha động ....................................................................36
Hình 3.6: Ảnh hường của %ACN đến diện tích pic và thời gian lưu. ......................38
Hình 3.7: Sắc đồ khảo sát thành phần pha động .......................................................38
Hình 3.8: Ảnh hưởng của tốc độ pha động đến diện tích pic....................................40
Hình 3.9: Sắc đồ khảo sát tốc độ pha động. ..............................................................41
Hình 3.10. Quy trình phân tích ankaloid trong chè ...................................................42
Hình 3.11: Ảnh hưởng của dung mơi chiết đến diện tích pic. ..................................43
Hình 3.12: Sắc đồ khảo sát dung mơi chiết mẫu chè. ...............................................44
Hình 3.13: Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến diện tích pic. ....................................45
Hình 3.14: Sắc đồ các điểm nhiệt độ chiết mẫu khác nhau ......................................46

Hình 3.15: Ảnh hưởng của thời gian chiết đến diện tích pic. ...................................47
Hình 3.16: Sắc đồ tại các thời gian chiết mẫu khác nhau .........................................48
Hình 3.17: Ảnh hưởng của lượng dung dịch NH3 1%/ etanol 60% với diện tích pic.
...................................................................................................................................50
Hình 3.18: Sản phẩm phản ứng của EGCG với amoniac. ........................................50

vi


Hình 3.19: Sắc đồ khảo sát ảnh hưởng của lượng dung dịch NH3 1%/ Etanol 60%
được sử dụng trong quá trình chiết. ..........................................................................51
Hình 3.20: Khảo sát khoảng tuyến tính của (a) theobromine, (b) theophylline và (c)
caffeine. .....................................................................................................................54
Hình 3.21: Đường chuẩn của (a) theobromine, (b) theophylline và (c) caffeine. .....54
Hình 3.22: Độ lệch chuẩn tương đối của các ankaloid ở các nồng độ khác nhau. ...59
Hình 3.23: Độ thu hồi của các ankaloid ở các nồng độ khác nhau. ..........................61
Hình 3.24: Phần trăm khối lượng các ankaloid trong các mẫu lá chè ......................67
Hình 3.25: Phần trăm khối lượng các ankaloid trong các mẫu búp chè ...................72
Hình 3.26: Tỉ lệ ba thành phần ankaloid trong mẫu búp với mẫu lá chè ..................76

vii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MeOH

: Methanol

TB

: Theobromine

TP

: Theophylline

CF

: Caffeine

HPLC

: Sắc ký lỏng hiệu năng cao
(High Performance Liquid Chromatography)

NIR

: Phổ hồng ngoại gần
(Near-infrared spectroscopy)

FTIR

: Quang phổ hồng ngoại chuyển đổi Fourier
Fourier transform infrared spectroscopy)

LOD

: Giới hạn phát hiện
(Limit of detection)

LOQ

: Giới hạn định lượng
(Limit of quantitation)

SD

: Độ lệch chuẩn
(Standard deviation)

RSD

: Độ lệch chuẩn tương đối
(Relative standard deviation)

viii


MỞ ĐẦU
Chè xanh có tên khoa học Camellia sinensis (L.) Kuntze. Nó là một loại thức
uống rất phổ biến trên thế giới, ở các nước châu Á đặc biệt là vùng Đông Á. Chè là
một phần không thể thiếu trong nền văn hóa cũng như ẩm thực. Việt Nam cũng đã
trồng và sử dụng chè từ hàng nghìn năm nay. Chè được phân loại theo từng vùng xuất
xứ và có hương vị đặc trưng riêng. Ở Việt Nam có một số vùng trồng chè có hương
vị chè vượt trội hơn các vùng khác như là Thái Nguyên, Lào Cai, Yên Bái, Phú
Thọ…Khi uống chè ta thấy hệ thần kinh trung ương và dạ dày được kích thích, đồng
thời cảm thấy có vị đắng và tê tê ở đầu lưỡi. Thành phần chính dẫn đến các cảm giác
đó là do nhóm ankaloid có trong chè bao gồm caffeine (1,3,7-trimethylxanthine),
theobromine (3,7-dimethylxanthine), và theophylline (1,3-dimethylxanthine).
Caffeine trong chè chiếm khoảng 2-5% khối lượng khô. Theobromine và theophylline

với hàm lượng khô nhỏ hơn nhiều so với hàm lượng của caffeine, chiếm khoảng
0,33% khối lượng chất khơ [7], nhưng chúng có vai trị về dược tính quan trọng hơn
so với caffeine.
Hiện nay, việc phát triển các phương pháp phân tích để xác định đồng thời
caffeine, theobromine, và theophylline trong các sản phẩm thực phẩm, dịch sinh học
và đồ uống hoặc sô cô la, cũng như trong quá trình sản xuất dược phẩm đang rất được
quan tâm. Một số phương pháp phân tích khác nhau đã được đề xuất để xác định
những methylxanthine này. Tuy nhiên, chỉ có một vài phương pháp trong đó có
phương pháp sắc ký có khả năng tách biệt hồn tồn ba hợp chất theobromine,
theophylline và caffeine trong mẫu phân tích mà bước xử lý mẫu trước khi đo đơn
giản và cho giới hạn phát hiện thấp. Trong nghiên cứu này, một phương pháp phân
tích đã được phát triển để xác định đồng thời caffeine, theobromine và theophylline
trong chè bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (HPLC) với bộ phát
hiện UV, cho phép bơm trực tiếp mẫu mà không cần xử lý trước, ngoại trừ một bước
lọc. Phương pháp này có thời gian lưu ít hơn 12 phút và cho giới hạn phát hiện thấp.

1


Dựa trên những lý do đó, tơi đã lựa chọn tên luận văn: “Xác định đồng thời
thành phần caffeine, theobromine, và theophylline trong một số loại chè phân
bố ở Miền Bắc Việt Nam”

2


Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tổng quan Chè (Camellia sinensis (L.) K untze)
Tên Khoa học: Camellia sinensis (L.) Kuntze.
Tên tiếng Việt: Chè, Trà.

1.1.1. Nguồn gốc và phân loại các loài Chè
Nguồn gốc
Theo truyền thuyết, cây chè lần đầu tiên được phát hiện bởi người Trung Quốc.
Ngày nay, cây chè được trồng ở nhiều nơi trên thế giới trong vùng nhiệt đới và cận
nhiệt đới. Đến nay có 56 nước trồng chè, sản xuất và chế biến chè ở các quy mô khác
nhau, phân bố ở khắp 5 châu.
Các vùng trồng chè ở Việt Nam
Cây chè được trồng nhiều ở Việt Nam, nó được phân bố rộng rãi ở các vùng như:
-

Tây Bắc: Sơn La, Lai Châu, Điện Biên, Yên Bái.

-

Đông Bắc: Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc Giang, Cao Bằng.

-

Trung du và miền núi phía Bắc: Thái Nguyên, Phú Thọ, Hịa Bình, Hà Nội,
Vĩnh Phúc.

-

Phía bắc miền Trung: Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Tây Nguyên, Lâm Đồng,
Gia Lai, Kon Tum.

Phân loại
Dựa theo đặc điểm thực vật học, đặc điểm sinh hoá, nguồn gốc phát sinh cây chè, chè
được chia làm 4 loại:
a. Chè Trung Quốc lá to (Camellia sinensis var. Macrophylla)

b. Chè Trung Quốc lá nhỏ (Camellia sinensis var. Bohea)
c. Chè Shan (Camellia sinensis var. Shan)
d. Chè Ấn Độ (Camellia sinensis var. Assamica)
Cả 4 loại trà trên đều có trồng ở Việt Nam nhưng phổ biến nhất là 2 loại trà: trà
Camellia sinesis var. Macrophy và trà Camellia sinesis var. Shan.
- Camellia sinensis var. Macrophylla được trồng nhiều nhất ở các tỉnh trung du

3


với các tên gọi của địa phương (theo màu sắc lá) như: Trung du lá xanh, Trung du lá
vàng, v.v...
- Camellisa sinensis var. Shan được trồng ở miền núi các tỉnh miền bắc và ở phía
nam Tây Nguyên (Lâm Đồng). Ở mỗi địa phương có các giống khác nhau như: Shan
Mộc Châu, Shan Tham Vè, Shan Trấn Ninh ... [3]
1.1.2. Thành phần hố học của chè
Thành phần hóa học của chè biến đổi rất phức tạp, nó phụ thuộc vào giống, điều
kiện đất đai, địa hình, kĩ thuật canh tác. Để khảo sát đặc tính lý, hóa của chè, ta sẽ tìm
hiểu thành phần các chất có trong lá chè, từ đó tìm hiểu vai trị và ý nghĩa của nó.
Hiện nay thành phần lá trà được mơ tả khá đầy đủ thành phần lá trà được mô tả trong
bảng 1.1 sau [1]:
Bảng 1.1: Thành phần hóa học của chè
Thành phần
Nước
Flavanol:
(-) Epigallocatechin gallate (EGCG)
(-) Epicatechin gallate (ECG)
(-) Epigallo catechin (EGC)
(-) Epicatechin (EC)
(+) Catechin (C)

(+) Gallcatechin (GC)
Caffeine
Theobromine
Theophylline
Acid hữu cơ (citric, malic, oxalic,…)
Đường (glucose, fructose, saccharose, raffinose, stachyose)
Xơ (cellulose, hemicellulose, lignin)
Protein và acid amin
Lipid
Khoáng
Chất màu (carotenoid, chlorophyl)
Enzyme

4

Hàm lượng (%)
75-80
8-12
3-6
3-6
1-3
1-2
3-4
3-4
0,33
0,33
0,5-0,6
4-5
4-7
14-17

3-5
5-6
0,5-0,6


1.1.2.1. Nước
Nước là thành phần chủ yếu trong búp chè. Trong búp chè (1 tôm + 3 lá) hàm
lượng nước thường có từ 75-82%. Hàm lượng nước trong búp chè thay đổi tùy theo
giống, tuổi cây, đất đai, kỹ thuật canh tác, thời gian hái và tiêu chuẩn hái…
1.1.2.2. Polyphenol
Nhóm các hợp chất polyphenol là thành phần được quan tâm nhiều nhất trong lá
chè. Các hợp chất polyphenol của lá chè rất khác với các hợp chất polyphenol được
tìm thấy trong các loại cây khác. Các cấu tử chính chiếm đa số là các catechin (C,
EC, EGCG, EGC, ECG…). Ngoài ra, trong thành phần polyphenol của chè cịn có
một số chất khác tỉ lệ thấp như các flavonol (quercetin, kaempferol, rutin...) các dẫn
xuất glucoside như myricetin - 3 - glucoside, kaempferol-3 rhamnodiglucoside..., các
leucoanthocyanin, các hợp chất polyflavonoit như theaflavin (theaflavin-3-gallate,
theaflavin-3'-gallate,

theaflavin-3,3'-digallate...),

thearubigin

(procyanidine,

procyanidine gallate...). Các dạng hợp chất như theaflavin, thearubigin chiếm tỉ lệ rất
thấp trong búp chè và lá chè non nhưng tăng dần tỉ lệ trong các lá chè già hơn [7].
1.1.2.3. Alkaloid
Alkaloid là nhóm hợp chất vịng hữu cơ có chứa nitrogen trong phân tử. Phần lớn
các alkaloid là những chất khơng màu, có vị đắng và ít hịa tan trong nước. Trong lá

chè, người ta tìm thấy các alkaloid chủ yếu là caffeine, theobromine và theophylline.
Trong đó, caffeine chiếm khoảng 2 – 5% lượng chất khô; theobromine và
theophylline với hàm lượng nhỏ hơn rất nhiều so với hàm lượng của caffeine, chiếm
khoảng 0,33% khối lượng chất khô. Tuy vậy, vai trị của theobromine và theophylline
trong dược tính của cây chè quan trọng hơn so với caffeine [7]. Nhóm ankaloid này
cũng góp phần tạo nên hương vị đắng của chè. Mức độ của các hợp chất phụ thuộc
vào giống, độ tuổi và khí hậu của chè được sử dụng.
1.1.2.4. Protein và axit amin
Protein trong búp chè phân bố không đều, chiếm khoảng 15% tổng lượng chất
khô của lá chè tươi. Các axit amin cơ bản trong lá chè bao gồm: aspartic, arginin,

5


alutamic, serin, glutamin, tyrosin, valin, phenylalanin, leucin, isoleucin và theanin …
Trong đó theanin chiếm hàm lượng cao nhất, khoảng 50 - 60% tổng hàm lượng axit
amin tự do. Theanin là axit amin đặc trưng của cây chè, theanin chỉ có thể được tìm
thấy ở các cây họ chè và một số ít các lồi nấm [1]

1.2. Hoạt tính của nhóm ankaloid.
Alkaloid là những hợp chất hữu cơ hấp dẫn nhất và có nhiều nghiên cứu rất quan
tâm đến chúng. Các chất caffeine, theophylline và theobromine trong nhóm ankaloid
đều là những chất thông dụng và được con người sử dụng hàng ngày. Các alkaloid đó
có các hoạt tính dược lý như tác nhân trị liệu sinh học. Mặc dù cấu trúc hóa học của
chúng: caffeine (1,3,7-trimethylxantine), theophylline (1,3 dimethylxantine) và
theobromine (3,7-dimethylxantine) rất giống nhau, các hoạt tính sinh học rất khác
nhau; Ví dụ, trong tác dụng lợi tiểu thứ tự dược tính tăng: caffeine < theophylline <
theobromine nhưng theo thứ tự các hiệu ứng trên thần kinh trung ương nhanh chóng
giảm dần. Cấu trúc hình học và điện tử của các alkaloid phản ánh rõ dược tính của
chúng.

Hình 1.1: Cấu trúc của caffeine, theophyline và theobromine.
1.2.1. Hoạt tính sinh học của caffeine.
Caffeine là một hoạt chất có dược tính. Tùy thuộc vào liều lượng, nó có thể gây
kích thích nhẹ đối với hệ thần kinh trung ương. Bất kì tác động dược lý nào của
caffeine đều nhất thời, thông thường tác dụng này sẽ ngưng sau vài giờ. Caffeine
khơng tích tụ trong cơ thể theo thời gian sử dụng. Nó thường bài tiết và thải ra ngoài
sau vài giờ sử dụng. Một số người có thể bị mất ngủ do caffeine. Tuy nhiên, các kết

6


quả nghiên cứu cho thấy rằng những người tiêu thụ caffeine có trí nhớ tăng và cải
thiện khả năng tranh luận. Và những người này có thành tích cao trong khả năng vận
động, cải thiện khả năng luyện tập thính giác thị giác. Tùy theo hàm lượng hấp thu,
caffeine có thể gây kích thích nhẹ. Đơi khi nó cũng dẫn đến việc gây nghiện ở một số
người. Triệu chứng thường thấy nhất là đau đầu, mệt lả hoặc trạng thái mơ màng. Sự
đau đầu có thể xuất hiện sớm nhất sau khi sử dụng lượng caffeine cuối cùng khoảng
18 giờ. Các tác động này thường không kéo dài, khoảng một ngày hoặc hơn và thường
giảm dần khi giảm lượng caffeine sử dụng. Ngồi ra, caffeine cịn có tác dụng giảm
đau đầu, giúp con người cảm thấy năng động. Kích thích hệ thần kinh trung ương,
làm tinh thần minh mẫn, tăng hiệu suất làm việc.
Caffeine có thể làm tăng hiệu quả diệt tế bào ung thu của thuốc chống ung thư.
Các chất gây phá hủy DNA và có thể có thể hỗ trợ trong việc khắc phục sự kháng
thuốc tự nhiên [50]. Bức xạ ion hóa và các tác nhân alkyl hóa làm tăng hiệu lực độc
của caffeine đối với các tác nhân phá hoại DNA. Shoyab [43] đề xuất rằng tác nhân
chống u ung thư của caffeine có thể liên quan đến khả năng ức chế sự tạo liên kết các
chất chuyển hóa hoạt động của các chất gây ung thư đối với chuỗi DNA tế bào. Do
đó caffeine có thể được sử dụng trong việc điều chỉnh hoạt tính của các loại thuốc
thêm vào trong cơ thể. Sự kết hợp của caffeine với adriamycin (một loại thuốc chống

ung thư) có thể làm tăng đáng kể hoạt tính kháng u trong cơ thể mà không làm tăng
tác dụng phụ của nó. Caffeine ức chế các hoạt chất gây ung thư trong khói thuốc lá,
nhưng việc sử dụng đồng thời chất caffeine và thuốc lá tạo thành một mối nguy hại
lớn đối với thai nhi đang phát triển [12]. Caffeine làm giảm lượng paracetamol do đó
làm giảm độc tính cho gan. Anderson và đồng nghiệp [40] đã chỉ ra rằng caffeine làm
tăng epinephrine trong huyết tương, tăng tiêu thụ oxy và chuyển hóa carbohydratee,
trong khi giảm q trình chuyển hóa lipid. Caffeine cũng làm thay đổi hoạt động tim
mạch bằng cách gia tăng động mạch huyết áp.
1.2.2. Hoạt tính sinh học của theophyline
Theophylline thường được sử dụng để ngăn ngừa và điều trị thở khò khè, hơi thở
nặng nề, tức ngực trong bệnh hen suyễn, viêm phế quản mạn tính, khí thủng phổi và

7


một số bệnh về phổi khác. Thuốc có tác dụng mở rộng đường dẫn khí ở phổi, giúp
bạn dễ thở hơn.
Hoạt tính sinh học của theophylline được ứng dụng rộng rãi và có tác dụng nhanh
chóng. Ito và đồng nghiệp (2002) [28] cho thấy với liều lượng thấp theophylline có
tác dụng chống hen suyễn bằng việc tăng hoạt hóa của HDAC sau đó được tập hợp
bởi corticosteroid để ngăn chặn các gene gây viêm. Nó cịn có hoạt tính chống viêm
thích hợp để điều trị hen phế quản, khi được thêm vào thuốc làm giãn phế quản và
làm giảm hàng đờm. Taheuchi et al, (1999), [45] thấy rằng theophyline có thể chết tế
bào eosinoplies ở bệnh nhân hen phế quản, và hiệu quả lâm sàng của nó có thể làm
giảm các tế bào viêm trong đường hô hấp. Theophyline cũng tăng cường chuyển hóa
lipid từ các mơ mỡ, sau đó kích thích sự chuyển dịch carnitine vào các mơ thận để
tạo nhóm acyl-carnitine cho q trình oxy hóa tiếp theo bên trong ti thể.
Việc điều trị kéo dài sử dụng theophylline có thể tăng hoặc giảm phản ứng miễn
dịch, tùy thuộc theo liều dùng, thông qua các modul chuyên biệt mà ảnh hưởng đến
hoạt tính adenosine deaminase và tình trạng corticosteroid của tiểu cầu. Việc điều trị

bằng theophyline ở liều phù hợp có thể khơng tạo nên tác dụng phụ đối với độ chắc
xương, nhưng đối với bệnh nhân sử dụng liều lớn cần phải được theo dõi kỹ càng để
kiểm sốt tình trạng khối xương. Heparin và theophylline ở liều trung bình có hiệu
quả kích hoạt các enzyme chuyển hóa, giữ cho thời gian hoạt động của tinh trùng lâu
hơn, và hiệu quả kìm hãm các tinh trùng hoạt tính quá cao. Theophyline làm tăng
lượng glucocorticoid trong huyết thanh, và được sử dụng như chất giãn cơ hoặc giãn
mạch máu, và cũng hiệu quả như là một chất kích thích lợi tiểu và tim mạch [37].
Nhưng nó có nguy cơ gây loét cao, tăng sự phát triển của sâu răng và hiệu ứng này
có thể liên quan đến cơ chế làm thay đổi thành phần của nước bọt.
1.2.3. Hoạt tính sinh học của theobromine
Theobromine là một chất kích thích thần kinh trung ương nhẹ, nhưng có tính lợi
tiểu mạnh hơn, kích thích tim và làm giãn nở động mạch vành mạnh hơn caffein.
Theobromine ức chế sự tăng Adriamycin trong quy mơ thí nghiệm, tăng hoạt tính
chống gây u của Adriamycin và nồng độ Adriamycin trong các khối u [39] mà không

8


tạo ra ảnh hưởng đối với tim và gan. Theobromine còn ức chế sự tăng doxorubicin từ
các tế bào u, tăng nồng độ doxorubin trong u và nâng cao hiệu quả chống u của
doxorubicin. Theobromine ức chế mạnh mẽ các tác nhân sinh u từ gốc urethane.
Theobromine và theophyline cùng sinh ra hoạt tính chống viêm cao, chống lại sự
viêm cấp tính do acid acetic trong khi caffeine khơng có hoạt tính này [26].

1.3. Các phương pháp phân tích thành phần ankaloid.
Trước đây, một số các phương pháp để xác định lượng caffeine, theobromine và
theophylline trong các cây trồng lấy thức uống như chè, cà phê và ca cao đã được
phát triển. Thơng thường, chỉ có 1 chất chiếm chủ đạo trong 1 loại cây trồng, ví dụ
caffeine trong cà phê hay theobromine trong ca cao. Trong quá khứ, các phương pháp
phân tích chỉ tập trung vào việc xác định mỗi lần chỉ một hợp chất, trong khi các chất

liên quan sẽ bị loại bỏ trong quá trình tinh chế hoặc được cộng gộp để tính tổng hàm
lượng. Hầu hết trong các phương pháp thời kỳ đầu, caffeine và theobromine được
chiết bằng nước nóng hoặc dung dịch kiềm nóng, tiếp đó là được chuyển định lượng
sang một dung mơi hữu cơ, thường là chloroform. Sau khi tinh chế lượng chiết
chloroform, thơng thường rất khó đối với hạt ca cao bởi có lượng chất béo lớn, sau
đó các hợp chất này sẽ được đo bằng nhiều phương pháp khối lượng, Kjeldahl và
chuẩn độ. Trong nhiều ví dụ, việc chiết rất mất công sức và việc xác định lượng cuối
cùng lại bị ảnh hưởng bởi các chất làm nhiễu còn lại sau quá trình chiết chưa hiệu
quả. [29]
1.3.1. Phương pháp điện di mao quản
Điện di mao quản (CE) đã được phát triển như là một kỹ thuật để phân tích các
phân tử tích điện, bao gồm protein, peptide và oligonucleotide. So với phương pháp
tách thông thường như HPLC, CE cung cấp hiệu quả cao hơn (gần hoặc vượt 1 000
000 đĩa lý thuyết), phân tích thời gian ngắn hơn, yêu cầu khối lượng mẫu nhỏ hơn và
chi phí vận hành thấp. Việc áp dụng phương pháp này đã được mở rộng với các phân
tử trung hòa bởi sự ra đời của điện di mao quản micellar (MECC) được phát triển đầu
tiên bởi Terabe et al, (1984) [46]. Trong MECC, chất phân tích được tách ra trên cơ

9


sở cả tính kỵ nước của chúng và độ linh động điện di. Chất tan có thể phân chia giữa
chất kỵ nước của các mixen và pha nước dẫn đến tốc độ di chuyển khác nhau trong
hệ thống MECC. MECC được sử dụng để tách cả phân tử hữu cơ trung tính và phân
tử hữu cơ tích điện, bao gồm dẫn xuất axit amin, các vitamin tan trong nước, dược
phẩm và axit nucleic [12].
Khi sử dụng phương pháp MECC, phương pháp này nhanh chóng, với sự chuẩn
bị mẫu ít hoặc không cần chuẩn bị mẫu. Lee et al. [31] đã mô tả sự chia tách của
theophylline và chất tương tự của nó bằng phương pháp MECC với detector UV trong
mẫu huyết tương người. Việc tách mất 12 phút và các mẫu được chiết với ethyl

acetate. Thormann et al. [48] đã báo cáo việc xác định các purin trong huyết thanh
bằng MECC với việc tiêm mẫu trực tiếp. Việc tách mất 14 phút và chỉ theophylline
và acid uric được tách.
Yeping Zhao (1996) sử dụng phương pháp điện di mao quản micellar (MECC)
để tách caffeine và các chất dẫn xuất của nó, theobromine, paraxanthine, theophylline
và 1,3,7 axit trimethyluric vằng việc sử dụng natri lauryl sulfat (SDS) như pha
micellar. Những ảnh hưởng của pH, nồng độ mixen, nồng độ đệm, muối đệm, điện
áp đặt và thời gian tiêm đã được nghiên cứu để lựa chọn các điều kiện tối ưu cho sự
quyết tâm của caffeine và bốn chất tương tự của nó trong thuốc. Caffeine và ba chất
tương tự của nó đã được tách trong vòng 120 s với giới hạn phát hiện thấp. Các mẫu
có thể được phân tích sử dụng tiêm trực tiếp với độ phân giải thích hợp và tính lặp
lại.[54]
1.3.2. Phương pháp phổ hồng ngoại gần
Phổ hồng ngoại gần (NIR) sử dụng bước sóng 780-2500 nm để đo độ hấp thụ,
tính tốn các nhóm chức hữu cơ và số lượng dự đốn một yếu tố cụ thể. Nó đã được
sử dụng rộng rãi để phân tích chất lượng thực phẩm và để xác định các alkaloid chính
trong thực phẩm.
Phổ hồng ngoại gần (NIRS) đã được sử dụng cho phân tích thực phẩm từ năm
1938. Sự phát triển chính của NIRS cho phân tích xác định cà phê đã được đánh giá
bởi Schulz từ năm 2004. Đánh giá này kể đến những thử nghiệm thành công đầu tiên

10


áp dụng NIRS cho việc thẩm định 2 loại cà phê hạt khác nhau “Arabica” và
“Robusta”. Thông thường, cà phê hạt “Arabica” được đánh giá cao hơn “Robusta” và
do đó đắt hơn. Do vậy việc xác định về sự không đạt kiểm định chất lượng và dán
nhãn mác sai rất quan trọng và ảnh hưởng đến việc bảo vệ người tiêu dùng. Bài đánh
giá cũng kể đến một phương pháp NIR tương tự cho việc xác định đồng thời thành
phần khô trong cà phê “Robusta” xanh và hỗn hợp các loại cà phê rang, bột sấy khô

lạnh, các loại đồ uống cà phê sấy khí và cà phê uống liền. Các phương pháp cổ điển
để xác định các loại cà phê - chủ yếu dựa vào từng loại đặc trưng các nguyên tố
khoáng chất, các hợp chất dễ bay hơi, hoặc các thành phần chứa lưu huỳnh – rất tốn
thời gian. Sự phát triển của hiệu chuẩn NIRS cho phép thực hiện sự đặc trưng hóa
trong thời gian tương đối ngắn. So sánh với phổ FTIR thu được ở cùng mẫu, phương
pháp NIR thể hiện sự vượt trội. Phương pháp tiếp cận khác là kết hợp cả phổ hồng
ngoại gần và hồng ngoại trung cho xác định các loại cà phê sấy lạnh. Schulz cũng báo
cáo về phân tích thành công NIRS cho caffeine và theobromine trong chè (Camellia
sinensis). Caffeine dạng viên có giới hạn định lượng thấp chỉ 13,7g/100g cho thấy
phương pháp này linh động và nhanh chóng hơn so với các phương pháp khác như là
sắc kí lỏng. Phương pháp FTIR-ATR có thể nhanh chóng xác định được hàm lượng
caffeine trong các loại nước có gas, mà khơng cần sử dụng các chất dung môi hữu cơ.
Các phương pháp phổ khác cũng có thể xác định được các ankaloid bao gồm phương
pháp phổ cực tím, phổ NMR và phổ khối [27].
FT-NIR đã được chứng minh là một công cụ phân tích mạnh mẽ để phân tích một
loạt các mẫu được sử dụng trong nơng nghiệp, dinh dưỡng, hóa dầu, dệt may và các
ngành công nghiệp dược phẩm, đặc biệt là việc sử dụng nó trong phân tích chất lượng
của nông sản và các mẫu dược phẩm. Các kỹ thuật quang phổ FT-NIR là một phân
tích kỹ thuật khơng phá hủy mẫu với những ưu điểm của phân tích nhanh chóng mẫu
đơn giản, và các mẫu nhỏ, và đặc biệt là việc sử dụng các mẫu rắn. So với phương
pháp phân tích thơng thường, FT-NIR là một kỹ thuật nhanh chóng, chính xác, và
khơng phá hủy mẫu có thể được sử dụng như là một thay thế các phương pháp đánh
giá cảm quan thơng thường và phương pháp hóa học tốn thời gian [18].

11


Kể từ năm 1990, các nỗ lực của các nhà khoa học đã được thực hiện để dự đoán
đồng thời các alkaloid và các chất phenolic trong lá trà xanh sử dụng phương pháp
quang phổ hồng ngoại gần (Schulz et al,1999) [42]. Một số nghiên cứu về phân tích

định lượng các chất chống oxy hóa trong trà xanh bằng NIR cũng đã được báo cáo
bởi Zhang et al, (2004) [53]. Gần đây, một số nhà nghiên cứu cũng áp dụng phương
pháp quang phổ hồng ngoại gần để phân tích đồng thời các hàm lượng của các axit
amin tự do, caffeine, tổng polyphenol, và amylose trong trà xanh (Chen et al, 2006)
[19].
1.3.3. Phương pháp phổ Raman
Phổ Raman đã được chứng minh là phương pháp phân tích tuyệt vời cho việc xác
định các dược chất và chất hóa sinh có trong cây và các sinh vật trong tự nhiên. Vì là
phương pháp định lượng nhanh chóng, rõ ràng các dược phẩm với sự có mặt của các
chất phụ gia và tá dược. Vì vậy các kỹ thuật phổ Raman được sử dụng trong khoa học
pháp y để phân tích vỏ cây, gỗ, trái cây và các loại hạt thực vật mà không cần phương
pháp chiết [41]. Trong một nghiên cứu mới đây [22], những hạt giống của cây
Guarana, Paullinia sorbilis (hoặc Paullinia cupana), được chứng minh là có chứa
caffeine dạng khan phức với tanains; chất chiết xuất từ những hạt giống có chứa
xanthine alkaloid, guaranine, hoặc caffeine. Các nghiên cứu về phổ Raman đã chỉ ra
rằng thành phần alkaloid chính trong guarana là caffeine. Kết quả này có liên quan
để xác định caffeine trong nhà máy chiết xuất guarana được lấy từ nhiều nguồn nhà
máy nhỏ.
Phương pháp phổ FT-Raman có thể xác định caffeine, theophylline, và
theobromine đã được nghiên cứu ở dải dao động đặc trưng của chúng. Xét về cấu trúc
riêng biệt và đối xứng nhóm của các phân tử, phân tích phối trí thơng thường đã được
áp dụng để hỗ trợ việc phân tích định tính phổ dao động. Dải dao động mạnh cho phổ
FT-Raman tại 1600/1560 cm-1. Caffeine có trong hạt cà phê với nồng độ tương đối
cao của các alkaloid này (lên đến 8%), cũng như theophylline và theobromine với số
lượng nhỏ hơn. Theobromine đã được phân biệt với caffeine và theophylline bởi sự
xuất hiện của nó ở bước sóng 620 cm-1, caffeine xuất hiện tại bước sóng 643 và 741

12

cm-1 và theophylline xuất hiện tại 668 cm-1. Hơn nữa, các tác giả đã thành công trong
việc phân biệt caffeine dạng khan và dạng monohydrate của nó bằng cách so sánh tín
hiệu phổ gốc cacbonyl xảy ra trong dải bước sóng 1656 và 1698 cm-1 [25].
1.3.4. Phương pháp sắc lỏng
Có hai loại phương pháp sắc ký lỏng có thể xác định được các chất theobromine,
theophylline và caffeine là phương pháp sắc ký ion và phương pháp sắc ký lỏng pha
đảo.
1.3.4.1. Phương pháp sắc ký ion
Phương pháp sắc ký ion đã được đề xuất để xác định đồng thời các chất caffeine,
theobromine và theophylline. Sự tách dựa trên rửa rải đẳng dịng và xác định ở bước
sóng hấp thụ tử ngoại ở 274 nm. Hiệu suất thu hồi với các mẫu khác nhau dao động
từ 87% đến 103%. Ngoài ra, các cơ chế duy trì trong ba hợp chất trên các loại nhựa
trao đổi ion khác nhau. Các kết quả thu được cho thấy trao đổi ion sắc ký có thể là
một lựa chọn tốt để sắc ký lỏng thông thường cho việc tách và xác định một số phân
tử hữu cơ trung tính hịa tan trong nước và một số chất kị nước nhất định. Chen et al,
(2002); đã sử dụng sắc ký ion để xác định đồng thời 3 loại xanthine trong các mẫu
thực phẩm và dược phẩm. Giới hạn xác định của các 3 loại chất cần phân tích đều ở
dưới mức µg/mL. Mức độ thu hồi mẫu giả cho cả 3 loại chất cần phân tích (khoảng
từ 2mg/g đến 20mg/g) trong các mẫu chứa ca cao sử dụng sắc ký trao đổi anion đạt
cao hơn 90%. Các kết quả so sánh được từ caffeine và theobromine sử dụng cả 2 kỹ
thuật trao đổi anion và cation; theophylline không xác định được bằng cả 2 phương
pháp [16].
Một phương pháp sắc ký ion mới đã được đề xuất để xác định đồng thời các chất
làm ngọt nhân tạo (natri saccharin, aspartame, acesulfame-K), chất bảo quản (acid
benzoic, axit sorbic), caffeine, theobromine và theophylline. Việc tách được thực hiện
trên một cột phân tích trao đổi anion hoạt động ở 40oC trong vịng 45 phút bởi q
trình rửa rải isocratic với dung dịch NaH2PO4 (pH 8.20) 5 mM có chứa 4% (v / v)
acetonitrile, và được xác định bằng detector bước sóng phát hiện hấp thụ tia cực tím.

13

Các giới hạn phát hiện (signal-to-noise tỷ lệ 3: 1) cho tất cả các chất phân tích là dưới
mức ml/mg. Phương pháp này đã được áp dụng thành công để phân tích nhiều chế
phẩm thực phẩm và dược phẩm, và độ thu hồi trung bình cho mẫu thực dao động 85104%. Các kết quả cũng chỉ ra rằng phương pháp sắc ký ion sẽ có thể là một thay thế
có lợi với hiệu suất cao hơn so với phương pháp sắc ký lỏng thông thường trong việc
tách và xác định đồng thời các hợp chất này [15].
1.3.4.2. Phương pháp sắc ký lỏng pha đảo (RP-HPLC)
Một số ít phương pháp phân tích đã được cơng bố có thể xác định các xanthines
trong nhiều sản phẩm thực phẩm. Một vài trong số các phương pháp đó địi hỏi q
trình xử lý mẫu vất vả và không phù hợp để phân tách đồng thời các xanthine khỏi
các chất gây nhiễu. Các phương pháp khác lại có vẻ khơng cho ra được kết quả chính
xác cho mẫu thực phẩm được đo. Chỉ một vài trong số đó có thể xác định được cả ba
hợp chất trong cùng một mẫu. Sự kết hợp của hai phương pháp: phổ UV tích hợp và
sắc ký lỏng có thể xác định đồng thời xác định các xanthine trong các mẫu thực phẩm
được chọn. Độ chụm của các phương pháp này được thấy là tốt cho việc xác định
chọn lọc các hợp chất xanthine trong khoảng nồng độ từ 5µg/mL tới 40µg/mL.
Theobromine chưa từng được xác định trong cacao và các sản phẩm có chứa socola
với bất cứ một trong 2 phương pháp này. Meyer et al, (1996), đã đồng thời xác định
caffeine, theobromine và theophylline trong các thực phẩm khác nhau bằng LC với
cảm biến ampe. Phương pháp đưa ra độ nhạy gấp 2 đến 5 lần so với việc xác định
bằng hấp thụ UV. [36]
Trong những năm gần đây, các quy định của cơ quan chức năng quốc tế trở nên
khắt khe trong việc kiểm soát chất lượng thực phẩm và dược phẩm. Đây là một thách
thức lớn cho hóa học phân tích hiện đại để cung cấp phương pháp đáng tin cậy, chính
xác và cơng suất cao. Đặc biệt trong phương pháp sắc ký lỏng được quyết định bởi
vai trị quan trọng của nó trong các ứng dụng kiểm sốt chất lượng trong mơi trường
cơng nghiệp [34]. Hiện nay, có bốn xu hướng chính trong các ứng dụng phân tích
nhanh bằng sắc kí lỏng: (i) sắc ký lỏng ở nhiệt độ cao, (ii) sắc ký lỏng áp suất cao
(UHPLC) sử dụng cột có kích thước hạt 2µm, (iii) cột hạt dựa trên cơng nghệ nung

14


chảy lõi hoạt động ở áp suất trung gian giữa UHPLC và cột thông thường và (iv) pha
tĩnh nguyên khối monolithic có độ thấm cao có hiệu quả tách tốt. Kết quả nghiên cứu
các phương pháp được trình bày ở bảng 1.2 dưới đây.

15