Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
***************

Phan Thị Thu Mai

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH
ENZYME PHYTASE

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
***************

Phan Thị Thu Mai

PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN VI SINH VẬT SINH
ENZYME PHYTASE

Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. ĐÀO THỊ LƯƠNG

Hà Nội – Năm 2012


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN .....................................................................................14
1.1

AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE ..................................................................14

1.1.1

Cấu trúc của axit phytic ........................................................................14

1.1.2

Sự phân bố phytate trong tự nhiên và chức năng của phytate ..............15

1.1.3

Đặc tính kháng dinh dưỡng của axit phytic ..........................................17

1.1.4

Ảnh hưởng của phytic tới môi trường ..................................................21

1.2

PHYTASE ...................................................................................................21

1.2.1

Chức năng của phytase .........................................................................21

1.2.2

Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của phytase ...........................................22

1.2.3

Nguồn phytase trong tự nhiên ...............................................................23

1.2.4

Phân loại phytase .................................................................................24

1.2.4.1

Histidine axit phosphatase (HAP) ..................................................25

1.2.4.2

ß-propeller phytase (BPPhys) ........................................................26

1.2.4.3

Purple axit phosphatase (PAP) phytases ........................................27

1.2.5

Gen mã hóa phytase ..............................................................................27

1.2.6

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất phytase từ vi sinh vật....29

1.2.6.1

Các yêu tố vật lý.............................................................................29

1.2.6.2

Các yếu tố dinh dưỡng ...................................................................30

1.2.7

Điều khiển sinh tổng hợp phytase .........................................................31

1.2.8

Các ứng dụng của phytase ....................................................................33

1.2.8.1
Ứng dụng của phytase là phụ gia thức ăn chăn nuôi và nuôi trồng
thủy sản… .......................................................................................................33

1.3

1.2.8.2

Ứng dụng của phytase trong công nghiệp thực phẩm....................35

1.2.8.3

Ứng dụng của phytase trong cải tạo đất .........................................36

1.2.8.4

Ứng dụng của phytase trong dược phẩm .......................................36

1.2.8.5

Bán tổng hợp peroxydase ...............................................................37

TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU PHYTASE....................................................37

1.3.1

Nghiên cứu làm tăng tính bền nhiệt của phytase ..................................37

1.3.2

Nghiên cứu về thay đổi pH hoạt động tối ưu của phytase ....................38

1.3.3

Nghiên cứu về khả năng bền axit và enzyme protease của phytase .....39


1.3.4

Nghiên cứu về tăng hiệu suất của quá trình sản xuất phytase ..............40

1.3.5

Nghiên cứu về động vật và thực vật chuyển gen phytase .....................41

1.3.6

Những nghiên cứu về phytase ở Việt Nam ...........................................41

1.4

LÊN MEN XỐP...........................................................................................43

1.4.1

Khái niệm về lên men xốp ....................................................................43

1.4.2

Những ưu điểm và nhược điểm của lên men xốp .................................44

1.4.3

Các ứng dụng của lên men xốp .............................................................46

1.4.3.1

Sản xuất các axit hữu cơ ................................................................47

1.4.3.2

Sản xuất các hợp chất tạo hương và tạo vị.....................................47

1.4.3.3

Sản xuất enzyme ............................................................................47

1.4.3.4

Sản xuất Fructooligosaccharides ....................................................47

1.4.3.5

Sản xuất các hợp chất hoạt tính sinh học .......................................48

1.4.3.6

Sản xuất thuốc trừ sâu sinh học .....................................................48

1.4.3.7

Sản xuất cồn sinh học.....................................................................48

1.5

CHI BACILLUS VÀ PHÂN LOẠI TRONG CHI BACILLUS ....................48

1.6

THU HỒI ENZYME ...................................................................................53

1.6.1

Chiết rút enzyme ...................................................................................53

1.6.2

Cô đặc enzyme – tủa enzyme ...............................................................53

1.6.2.1

Tủa enzyme bằng muối ammonium sulfate ...................................53

1.6.2.2

Tủa bằng dung môi hữu cơ ............................................................54

CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................56
2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MƠI TRƯỜNG, THIẾT BỊ VÀ HĨA CHẤT
NGHIÊN CỨU ......................................................................................................56
2.1.1

Chủng vi sinh vật ..................................................................................56

2.1.2

Môi trường nghiên cứu .........................................................................56

2.1.2.1

Môi trường sàng lọc chủng ưa nhiệt và môi trường nhân giống ...56

2.1.2.2
Môi trường sàng lọc chủng sinh phytase (PSM – phytase screening
media)……………..........................................................................................56
2.1.2.3

Môi trường dịch thể kích thích sinh phytase..................................56

2.1.2.4

Mơi trường ni xốp ......................................................................57

2.1.3

Thiết bị ..................................................................................................58

2.1.4

Hóa chất ................................................................................................58


2.2

CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................59

2.2.1

Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase.................................59

2.2.2

Tuyển chọn chủng .................................................................................61

2.2.3

Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng .......................................61

2.2.4

Phương pháp phân loại .........................................................................61

2.2.4.1

Phương pháp phân loại vi khuẩn dựa vào đọc trình tự ADN.........61

2.2.4.2

Quan sát hình thái ..........................................................................65

2.2.5 Nghiên cứu điều kiện ni cấy thích hợp cho khả năng sinh phytase
của chủng vi sinh vật nghiên cứu .......................................................................66
2.2.5.1
Nghiên cứu điều kiện ni cấy giống thích hợp cho khả năng sinh
trưởng ở chủng nghiên cứu .............................................................................66
2.2.5.2
Nghiên cứu các điều kiện ni cấy xốp thích hợp cho khả năng
tổng hợp phytase ở chủng nghiên cứu ............................................................67

2.2.6

Thu hồi enzyme ....................................................................................68

2.2.6.1

Chiết xuất enzyme ..........................................................................68

2.2.6.2

Thu hồi enzyme bằng các dung mơi hữu cơ ..................................68

2.2.7

Nghiên cứu enzyme phytase .................................................................69

2.2.7.1

Gen mã hóa phytase .......................................................................69

2.2.7.2

Các đặc tính của enzyme ................................................................70

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................72
3.1

KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN .........................................................................72

3.1.1

Lựa chọn chủng ưa nhiệt.......................................................................72

3.1.2

Lựa chọn chủng có hoạt độ phytase cao ...............................................72

3.1.3

Lựa chọn chủng sinh tổng hợp phytase bền nhiệt ................................73

3.2

PHÂN LOẠI ................................................................................................74

3.2.1

Xác định trình tự ADNr 16S .................................................................74

3.2.2

Đặc điểm hình thái ................................................................................77

3.3

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NI CẤY...................................................78

3.3.1

Nghiên cứu điều kiện ni cấy giống ...................................................78

3.3.2

Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp ......................................................81

3.4

THU HỒI ENZYME ...................................................................................88

3.4.1

Thu hồi enzyme bằng các dung dịch chiết khác nhau ..........................88

3.4.2

Tủa enzyme bằng các dung môi khác nhau ..........................................89


3.5

NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE CỦA CHỦNG SP1901 .................90

3.5.1 Phân tích trình tự gen phytase và so sánh với các lồi có quan hệ gần
gũi……… ...........................................................................................................90
3.5.2

Đặc tính enzyme phytase thơ……… ....................................................90

DANH MỤC TÀI LIÊU THAM KHẢO ..................................................................93

DANH MỤC BẢNG, HÌNH
Tên bảng

Trang

Bảng 1. Hàm lượng phosphor và phytate ở một số loại thức ăn gia cầm phổ biến...

6

Bảng 2. Các loại môi trường dùng cho lên men xốp……………………………….

47

Bảng 3. Trình tự mồi dùng cho phản ứng khuếch đại 5 gen gyrA, rpoB, purH,
polC, groEL…………………………………………………………………………

53

Bảng 4. Trình tự mồi dùng cho phản ứng đọc trình tự ADNr 16S…………………

54

Bảng 5. Hoạt tính phytase của 2 chủng SP1901 và D15 trong lên men xốp và lên
men dịch thể...............................................................................................................

63

o

Bảng 6. Độ bền nhiệt của 2 chủng SP1901 và D15 ở 60 C…………………………

Tên hình

64

Trang

Hình 1. Cấu trúc của axit phytic được đề xuất bởi Neuberg, 1908 (A) và Anderson,
1914 (B)………………………………………………………………………………….

5

Hình 2. Sự tương tác của các ion kim loại với IP6………………………………………

8

Hình 3. Sự liên kết của IP6 với protein và tinh bột trực tiếp (A) hoặc gián tiếp (B)…….

10

Hình 4. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân phytate……………………………….

12

Hình 5. Cấu trúc khơng gian của phyA từ A. niger NRRL 3135………………………..

16

Hình 6. Mơ hình cấu trúc phytase β-propeller…………………………………………...

17

Hình 7. Lên men xốp trong các túi nilon………………………………………………...

34

Hình 8. Đồ thị chuẩn xác định hàm lượng Pvc………………………………………….

50

Hình 9. Sinh trưởng và vịng phân giải phytase của chủng SP1901 (trái) và D15 (phải)
trên PSM………………………………………………………………………..………..

62

Hình 10. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các lồi Bacillus có
quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự AND r16S……………………………………….

65

Hình 11. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài thuộc nhóm
Bacillus subtilis dựa vào trình tự kết nối 6 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S
rRNA…………………………………………………………………………………….

66

Hình 12. Hình thái tế bào (trái) và khuẩn lạc (phải) của chủng SP1901………………..

67

Hình 13. Mơi trường nhân giống thích hợp chủng SP1901……………………………..

68

Hình 14. pH thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901………………………………….

69

Hình 15. Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901……………………………

69

Hình 16. Thời gian thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901…………………………..

70

Hình 17. Chế độ thơng khí thích hợp cho sinh trưởng chủng SP1901…………………..

70

Hình 18. Cơ chất thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901………………………

71

Hình 19. Độ ẩm thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901………………………..

72

Hình 20. Ảnh hưởng của tỷ lệ cấy giống cho lên men xốp của chủng SP1901…………

72

Hình 21. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên sinh khối và hoạt tính phytase của
chủng SP1901……………………………………………………………………………

74

Hình 22. Nguồn các bon thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901 (Đối chứng
âm: khơng bổ sung nguồn các bon)……………………………………………………..

75

Hình 23. Nguồn nitơ thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901 (Đối chứng âm:
khơng bổ sung nguồn nitơ)………………………………………………………………

75

Hình 24. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả năng sinh tổng hợp phytase của
chủng SP1901……………………………………………………………………………

76

2+

Hình 25. Ảnh hưởng của hàm lượng Ca đến khả năng sinh tổng hợp phytase của
chủng SP1901……………………………………………………………………………

77

Hình 26. Chiết xuất enzyme bằng các dung mơi khác nhau…………………………….

78

Hình 27. Tủa enzyme bằng cồn và aceton……………………………………………….

80

Hình 28. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các lồi Bacillus có
quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen phytase……………………………………...

81

Hình 29. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của phytase chủng SP1901……………..

82

Hình 30. pH hoạt động thích hợp của phytase chủng SP1901…………………………..

84

Hình 31. Nhiệt độ hoạt động thích hợp của phytase chủng SP1901…………………….

84

Hình 32. Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính của phytase chủng SP1901…..

85

2+

Hình 33. Ảnh hưởng của Ca đến độ bền nhiệt của phytase chủng SP1901 xử lý ở
60oC (trái), xử lý ở 70oC (phải)………………………………………………….............

86

Hình 34. Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất được sấy khô ở 50oC trong 24h..

87

Hình 35. Ảnh hưởng của enzyme tiêu hóa đến hoạt động của phytase chủng SP1901…

88


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VIẾT TẮT
ANFs

Anti-nutritional factors

BPP

ß-propeller phytase

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylene diamine tetracetic acid

GRAS

Generally regarded as safe

GIT

Gastro intestinal tract- ống dạ dày ruột

HAP

Histidine acid phosphatase phytase

IP1, IP2, IP3,IP4,IP5

Inositol mono-, bis-, tris-, tetrakis-, pentakis-phosphate

IP6

Phytic acid/ myo-inositol hexakisphosphate

IUB

International Union of Biochemistry

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry

NCBI

National Center for Biomedical Informatics

PAP

Purple acid phosphatase phytase

PDB

Protein database bank

Pi

Phosphate vơ cơ

Tm

Nhiệt độ biến tính

ppm

Một phần triệu


MỞ ĐẦU
Phospho (P) là một nguyên tố thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của
sinh vật, phospho chủ yếu được tìm thấy trong các loại đá phốtphat vơ cơ và trong
các cơ thể sống. Ở các cơ thể sống, phospho vô cơ dưới dạng phốtphat PO43- tham

gia vào cấu trúc các đại phân tử sinh học như ADN và ARN (hình thành liên kết
phosphoeste giữa gốc 3’OH và 5’phosphate của 2 nu kế tiếp, tham gia cấu thành
“đồng tiền năng lượng” trong các cơ thể sống ATP (adenosin triphosphate), là thành
phần chủ yếu trong màng tế bào (phospholipid), muối canxi phốtphat làm cứng
xương động vật…. Do độ hoạt động hóa học cao, khơng bao giờ người ta tìm thấy
nó ở dạng đơn chất trong tự nhiên và vì thế các cơ thể sống không thể hấp thụ P ở
dạng các hợp chất này.
Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng dự trữ chủ yếu của
phospho trong tự nhiên, có mặt nhiều trong các loại ngũ cốc, hạt của các cây họ đậu
và hạt lấy dầu (Axit phytic chiếm hơn 80% lượng P trong các thực vật này) và đây
là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho người và động vật. Axit phytic có khả năng tạo
phức chặt chẽ với các ion kim loại tạo nên các muối (phytate: muối của axit phytic
với Na+, phytin: muối của axit phytic với Ca2+, Mg2+) và các hợp chất khác như axit
amin, protein, làm ức chế các enzyme tiêu hóa, ngăn cản sự hấp thu các chất này
của các cơ thể sống. Vì thế axit phytic được coi là một yếu tố kháng dinh dưỡng (an
anti-nutrient compound) trong thức ăn và thực phẩm.
Phytase là một enzyme đóng vai trị quan trọng trong cơng nghiệp chế biến
thực phẩm và thức ăn chăn nuôi. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân các muối
của axit phytic (phytate, phytin) giải phóng ra orthophosphate và myo-inositol-6phosphate và các cấp độ thấp hơn của phản ứng phosphoyl hóa. Việc sử dụng
phytase không chỉ làm tăng khả năng hấp thu phospho vơ cơ mà cịn tăng khả năng
hấp thu các ngun tố khống và khả năng tiêu hóa các hợp chất khác. Do đó dùng
phytase để thủy phân, loại bỏ axit phytic trong thành phần thức ăn là rất cần thiết.


Ở các động vật nhai lại, axit phytic được phân giải bởi các phytase do khu hệ
vi sinh vật kị khí như nấm và vi khuẩn sống trong dạ cỏ sinh ra. Nhưng những động
vật dạ dày đơn như lợn, gia cầm và cá không thể sử dụng muối phytate vì trong
đường tiêu hóa của chúng thiếu hụt enzyme quan trọng này. Bởi vậy, người ta
thường bổ sung phốt pho vô cơ (Pi) vào trong thức ăn để đáp ứng nhu cầu P cho cơ
thể, nhằm đảm bảo cho động vật sinh trưởng, phát triển bình thường. Tuy nhiên, bổ

sung Pi không làm giảm được hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit phytic mà cịn
gây ơ nhiễm mơi trường do P dư thừa thải qua phân động vật. Đồng thời làm tăng
chi phí khẩu phần thức ăn. Vì vậy, giải pháp tốt nhất thay thế cho việc bổ sung Pi là
thêm phytase vào thức ăn của vật nuôi, nhằm phân giải phytate thực vật sẵn có
trong thức ăn, giải phóng Pi dễ hấp thụ cho vật nuôi cũng như các yếu tố dinh
dưỡng và khống khác. Ngồi ứng dụng vào trong thức ăn chăn ni, phytase cịn
được sử dụng cho thực phẩm ở người, trong điều chế các dẫn xuất myo-inositol
phosphate cho ngành dược phẩm, ứng dụng trong công nghiệp giấy và cải tạo đất
trồng. Bởi thế, việc nghiên cứu sản xuất phytase đã và hiện đang là mối quan tâm
của nhiều nhà khoa học.
Với tầm quan trọng trong ứng dụng cho ngành chăn nuôi, Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn đã đưa phytase vào danh mục thức ăn chăn nuôi được nhập
khẩu theo Quyết định số 88/2008/QĐ-BNN ngày 22/8/2008. Chính vì vậy, những
nghiên cứu về sản xuất phytase giá thành thấp thay thế phytase nhập khẩu đang
được nhiều nhà khoa học trong nước quan tâm. Chúng ta đã biết đến phytase từ
Aspergillus niger với rất nhiều ưu điểm như: bền nhiệt, khả năng hoạt động ở pH
axit; hoạt tính cao; chống chịu được tác động của các proteinase trong hệ tiêu hóa
của vật ni. Tuy nhiên việc tìm kiếm các lồi vi sinh vật khác có khả năng sinh
enzyme phytase cũng là một việc rất cần thiết.
Với đặc điểm là một đất nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có sự đa dạng lớn
về địa hình và hệ sinh thái tạo nên sự đa dạng phong phú của các loài vi sinh vật,
cũng như do nhu cầu và tầm quan trọng của các sản phẩm phytase thương mại,
chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh


enzyme phytase” nhằm tìm kiếm các lồi vi sinh vật có khả năng sinh enzyme
phytase cao và là các chủng an tồn, đáp ứng nhu cầu trong cơng nghiệp chế biến
thức ăn chăn ni và thực phẩm.
Những đóng góp của đề tài
-

Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng trình tự đa gen (gyrA, rpoB, purH, polC,

groEL và ADNr 16S) để phân loại chính xác đến dưới lồi của chi Bacillus.
-

Là đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phytase bền nhiệt ở loài Bacillus

amyloliquefaciens.
-

Chủng vi khuẩn nghiên cứu là chủng an tồn, nên có thể được sử dụng trực

tiếp trong thức ăn chăn nuôi để cung cấp phytase và là nguồn probiotic cho động
vật.


CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE
Các thuật ngữ axit phytic, phytate và phytin lần lượt để chỉ axit phytic tự do,
muối của axit phytic với Na+ và muối của axit phytic với Ca2+, Mg2+. Trong nhiều
tài liệu, thuật ngữ axit phytic và phytate, phytin được sử dụng lẫn nhau và phần lớn
phospho tổng số trong các loại hạt tồn tại dưới dạng phytate, đây là dạng dự trữ
chính của phospho trong ngũ cốc, hạt đậu và các mô thực vật khác [111].
1.1.1 Cấu trúc của axit phytic
Axit phytic lần đầu tiên được Hartig tìm thấy năm 1855-1856 ở dạng hạt nhỏ,
không phải là tinh bột trong các hạt của một số loài thực vật [43, 44]. Sau Hartig,
cũng đã có nhiều nhà nghiên cứu tìm thấy phytate dưới dạng “globoid” (dạng cầu)
và khẳng định thành phần hóa học chính của nó là C, P và các ion kim loại. Năm
1897 Winterstein đưa ra tên là axit inositol-phosphoic và sau đó năm 1968 được

duyệt lại là ‘myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 hexakis (dihydrogen) phosphate (IP6) bởi
IUPAC-IUB [44, 110].
Cấu trúc của phytic axit là đối tượng tranh cãi của ngành hóa học trong nhiều
năm ở thế kỷ 20 và cuối cùng 2 cấu trúc do Neuberg và Anderson đề xuất được
chấp thuận nhiều nhất [87, 88]. Nhiều ý kiến khác nhau cho rằng chúng là dạng
đồng hình và có hay khơng 3 phân tử nước gắn kết trong cấu trúc này, thì sau đó với
những phân tích về nguyên tử, chuẩn độ natri phytate với các ion kim loại, tinh thể
học tia X và cộng hưởng từ hạt nhân đã dẫn đến kết luận rằng cấu trúc do Anderson
đề xuất là dạng chiếm ưu thế hơn được tìm thấy trong các loài thực vật [43].


(A)

(B)

Hình 1. Cấu trúc của axit phytic được đề xuất bởi Neuberg, 1908 (A) và
Anderson, 1914 (B) [4, 87, 88]
1.1.2 Sự phân bố phytate trong tự nhiên và chức năng của phytate
Phytate là một hợp chất có mặt ở nhiều loại thực vật khác nhau, chúng chiếm
đến 1-5% khối lượng các cây họ đậu, ngũ cốc, các hạt chứa dầu và hạnh nhân. Hầu
hết các loại thức ăn có nguồn gốc thực vật chứa 50-80% hàm lượng phospho tổng
số dưới dạng phytate. Ở thực vật, phytate được tìm thấy đầu tiên ở các loại hạt tuy
nhiên vị trí của chúng trong hạt lại khác nhau ở các loài thực vật khác nhau, ở ngô
tới 90% phytate tập trung ở phần mầm của hạt, trong khi đó ở lúa mỳ và gạo,
phytate tập trung chủ yếu ở lớp vỏ aleurone của hạt và cám bên ngoài [43, 44, 91,
92, 109]. Phytate trong các hạt chứa dầu và hạt các cây họ đậu thường liên kết với
các protein và tập trung chủ yếu trong các thể cầu (globoid), các thể vùi phân bố
trong toàn bộ hạt, ngược lại phytate ở hạt đậu nành lại có mặt ở những vị trí khơng
đặc trưng [109]. Ngồi ra phytate có thể được tìm thấy ở rễ, thân, quả, lá…và hạt
phấn của một số loài thực vật [10, 42, 51, 108, 122]. Trong số các loài thực vật

được sử dụng làm thức ăn gia súc, cây vừng, bí ngơ, lanh có hàm lượng IP6 cao nhất
tính theo khối lượng khơ, có thể lên đến 3,7-4,7% [66]. Các loại thức ăn gia súc
khác IP6 chiếm 1-3% trọng lượng khô [18].


Bảng 1. Hàm lượng phospho và phytate ở 1 số loại thức ăn gia cầm phổ biến
(Tyagi và cộng sự, 1998)
Thành phần

P tổng số (%)

P dạng phytate (%)

Ngũ cốc
Ngô

0,39

0,25

Gạo

0,15

0,09

Lúa mỳ

0,44

0,27

Lúa miến

0,3

0,22

Đại mạch

0,33

0,2

Bajra

0,31

0,23

Hạt chứa dầu
Lạc

0,6

0,46

Đỗ tương

0,88

0,56

Hạt bông

0,93

0,786

Hạt hướng dương

0,9

0,45

Phân tử IP6 có chứa 28,2% phospho, trong đó thường tồn tại dưới các dạng
muối khác nhau như muối của magie trong gạo, lúa mỳ, đậu tằm và hạt vừng, muối
Ca-Mn-K trong hạt đậu nành [5, 67, 92, 93, 103, 134, 135]. Phytate được tích lũy
trong hạt trong suốt q trình chín và trưởng thành, cùng với các hợp chất khác như
tinh bột, protein và lipid [46, 94, 105]. Năm 1980, Cosgrove và Irving đã đưa ra
những vai trò của phytate trong các loại hạt là: (i) là nguồn dự trữ phospho, (ii) là
nguồn dự trữ năng lượng, (iii) là chất cạnh tranh với adenosine triphosphate trong
suốt quá trình sinh tổng hợp phytin trong thời gian trưởng thành của hạt khi quá
trình trao đổi chất của hạt bị ức chế và trạng thái tiềm sinh, (iv) như là một chất bất
hoạt các ion hóa trị II cần cho sự điều khiển các quá trình của tế bào và được giải
phóng trong suốt q trình nảy mầm dựa trên hoạt động của enzyme phytase sẵn có
trong thực vật, (v) là chất điều chỉnh hàm lượng Pi sẵn có trong hạt [22]. Ngồi ra,


axit phytic cịn đóng vai trị là chất kháng nấm trên các cánh đồng, ngăn ngừa sự sản

sinh aflatoxyn ở các hạt đậu nành nhờ sự gắn kết với Zn2+ [39].
IP6 có thể được tìm thấy trong nhân hồng cầu ở các loài chim, cá nước ngọt và
rùa, cũng như được tìm thấy trong các loại đất hữu cơ [17, 27]. Ngồi ra, các phân
tử dưới IP6 trong q trình phosphoyl hóa như IP5, IP4, IP3, IP2 và cả IP6 cũng tham
gia vào q trình truyền tín hiệu tế bào và hệ thống vận chuyển phosphate có mặt ở
hầu hết các mô động và thực vật [79]. Ở thực vật quá trình tổng hợp IP6 diễn ra
thường xuyên tuy nhiên đã có những bằng chứng chứng minh rằng ở người đơi khi
có sự tổng hợp IP6 từ D-glucose nhờ hoạt động của enzyme phosphoylase đối với
inositol-phosphate từ sự đóng vịng của glucose-6- phosphate. Một số loại mơ của
động vật có vú như tinh hồn, tuyến vú, não, gan, thận có thể tổng hợp 4g IP6 mỗi
ngày [41, 112].
1.1.3 Đặc tính kháng dinh dưỡng của axit phytic
IP6 là một cấu trúc tích điện âm ở dải pH rộng nên dễ dàng kết hợp với các ion
tích điện dương như các ion kim loại, các hợp chất tích điện âm hình thành các phức
khó tan làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thụ các chất này trong ruột non. Do đó
phytate được coi là một hợp chất kháng dinh dưỡng (an anti-nutritional compound)
[138]. Trong các điều kiện trung tính hoặc kiềm nhẹ, các ion kim loại thiết yếu như
Ca2+, Zn2+, Fe2+ có mặt trong thức ăn có thể liên kết với axit phytic và hình thành
nên các phức IP6-kim loại kết tủa xuống. Độ bền vững của các kết tủa này theo thứ
tự: Zn2+> Cu2+>Co2+> Mn2+> Ca2+, trong khi đó ở pH 7,4 thứ tự này có thể là là:
Cu2+> Zn2+> Ni2+> Co2+> Mn2+> Fe2+> Ca2+ [69, 150]. Các ion kim loại có thể
tương tác với các nhóm OH- của cùng một nhóm phosphate hoặc các nhóm
phosphate khác nhau trong phân tử IP6, thậm chí ion kim loại có thể liên kết với các
nhóm phosphate của các phân tử IP6 khác nhau. Sự khơng hịa tan của các phức này
cũng là nguyên nhân chính gây ra giảm khả năng hấp thu các ion kim loại trong các
khẩu phần ăn có chứa hàm lượng axit phytic cao. Ngồi ra, sự có mặt đồng thời của
2 ion kim loại khác nhau làm tăng quá trình kết tủa của các phức IP6-kim loại [126].
Sự ảnh hưởng của IP6 tới khả năng hấp thụ các ion kim loại này còn phụ thuộc vào

các yếu tố khác như cách thức chế biến thức ăn, các loại IP6 khác nhau, sự có mặt
của các yếu tố khác cũng có tương tác với ion kim loại (yếu tố cạnh tranh với IP6)
như cellulose, axit oxalic, tannin, sự có mặt của phytase trong ruột hoặc phytase vi
khuẩn hay q trình thích nghi trao đổi chất của cá thể với khẩu phần ăn giàu
phytate [138].

Hình 2. Sự tương tác của các ion kim loại với IP6
Sự hình thành phức giữa IP6 và canxi gây ra hiện tượng kháng vơi hóa
(anticalcifying) dẫn đến lỗng xương (hình thành các vách trống trong xương) ở chó
và người [78, 151]. Tuy nhiên theo các nghiên cứu năm 1951 của Walker và cộng
sự, dưới cùng một điều kiện, hàm lượng axit phytic trong khẩu phần ăn có ảnh
hưởng đến sự hấp thụ Ca2+ nhưng sự ảnh hưởng này không phải là mãi mãi, con
người có thể thích nghi với các khẩu phần ăn có hàm lượng phytate cao và tự điều
chỉnh sau một thời gian ngắn nên hàm lượng canxi hấp thụ được khơng có sự khác
biệt giữa chế độ ăn thơng thường và chế độ ăn khi thí nghiệm [151].
Một báo cáo cũng đã nêu ra tình trạng suy dinh dưỡng ở quần thể dân cư ở
vùng bắc Ấn Độ, Pakistan, Iran và trong số những người Ả-rập du cư có liên quan
đến loại thức ăn chính làm từ ngũ cốc khơng lên men là chapatis (1 loại bánh mỳ
khơng có men) có chứa 1 lượng lớn phytate [113, 154].
Sự thiếu hụt magie liên quan tới khẩu phần ăn có hàm lượng phytate cao cũng
đã được đề cập tới ở gà và chuột [77, 117]. Bên cạnh đó các triệu chứng sự thiếu hụt
kẽm do khẩu phần ăn có hàm lượng phytate cao cũng đã được nghiên cứu ở người,


gà, lợn và chuột [23, 30, 68, 69, 89, 90]. Do các phức IP6-Ca-Zn ít hịa tan hơn so
với các phức IP6-Zn tương ứng nên sự hình thành của phức IP6-Ca-Zn thậm chí cịn
kích thích các triệu chứng của sự thiếu hụt kẽm [15,138]. Ngoài ra khi bổ sung natri
phytate vào bánh mỳ trắng hoặc sữa cũng làm giảm sự hấp thụ sắt ở người xuống 15
lần [127]. Đã có rất nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng phytate khơng có ảnh hưởng tới sự
hấp thu sắt ở động vật mặc dù protein đậu nành (có chứa hàm lượng lớn phytate)

được cho là nguồn thức ăn giàu sắt [131]. Sau này những nghiên cứu của các nhà
khoa học đã tìm ra rằng dạng tồn tại chính của sắt ở trong cám lúa mỳ và đậu nành
là dạng mono, có khả năng sử dụng được trực tiếp cao, tương tự như khẩu phần ăn
có bổ sung sắt vơ cơ hoặc ammoni sulfate sắt [82]. Sự bổ sung 1% phytate vào chế
độ ăn có albumin trứng làm giảm đáng kể khả năng hấp thụ đồng và mangan ở
chuột [24].
IP6 là một cấu trúc tích điện âm nên IP6 cịn có khả năng tương tác trực tiếp
với các nhóm tích điện dương hoặc gián tiếp với các nhóm tích điện âm của các
protein tích điện dương có mặt trong thức ăn thơng qua các ion kim loại tích điện
dương như Ca2+ để hình thành nên các phức IP6- protein tích tụ lại và kết tủa xuống,
do đó làm giảm khả năng tiếp xúc với protease, dẫn đến giảm hiệu quả tiêu hóa
protein [14, 18, 58, 111, 130, 138, 146]. Bên cạnh đó, tính tan kém của protein còn
do bị axit phytic bao phủ điện tích dương làm thay đổi điểm đẳng điện của protein
[59, 111]. IP6 có thể tạo phức với một số protein trong lúa mỳ, cám yến mạch, đậu,
mầm ngô, vỏ đậu nành, bột vừng, đậu nành, lạc cũng như hạt bong [31, 92]. Sự hình
thành phức giữa IP6-ion kim loại- protein dưới điều kiện trung tính hoặc kiềm khá
kém bền nhưng có thể dẫn tác động đồng thời gây thiếu hụt khống và giảm hiệu
quả tiêu hóa protein. Tuy nhiên cũng đã có những nghiên cứu in vivo và nghiên cứu
in vitro ở động vật và người cho kết quả âm tính về tác động của IP6 với khả năng
tiêu hóa protein, do đó ảnh hưởng của IP6 đối với khả năng tiêu hóa protein vẫn cịn
nhiều tranh cãi.
Ngồi khả năng tương tác với các ion kim loại, protein, IP6 còn có khả năng
tạo phức trực tiếp (nhờ sự hình thành liên kết hydro) hoặc gián tiếp với tinh bột
(thông qua các phân tử protein) để hình thành nên các phức IP6- tinh bột làm giảm


hiệu quả tiêu hóa tinh bột, gây ra sự giảm đường huyết [137]. Ngoài ra sự tạo phức
đồng thời giữa IP6 và protein, tinh bột có thể làm giảm sự tiêu hóa những chất này
từ khẩu phần ăn [5]. Tuy nhiên, sự tương tác giữa IP6 và tinh bột vẫn chưa chi tiết
và vẫn cần rất nhiều các nghiên cứu invivo.

(A)

(B)

Hình 3. Liên kết của IP6 với protein và tinh bột trực tiếp (A) hoặc gián tiếp (B)
Bằng cách liên kết với các ion kim loại, protein IP6 gián tiếp làm suy giảm
hoạt tính của một số các enzyme như protease, các enzyme tiêu hóa khác mà cần
các ion kim loại cho sự hoạt động cũng như tính bền vững của chúng. Một số các
metalloenzyme

như

cacboxypeptidase,

leucine

aminopeptidase,

amylase,

phosphates kiềm và aminopeptidase chứa kẽm hoặc canxi có mặt một lượng nhỏ
trong ruột và cần thiết cho quá trình phân giải thức ăn. Phức IP6-Cu có thể làm giảm
tới 95% hoạt tính của cacboxypeptidase A do thay thể Cu2+ bằng Zn2+ trong phân tử
enzyme ở pH 7,5 [75, 124, 147]. IP6 và EDTA có khả năng làm giảm hoạt tính của
α-amylase ở mức độ tương đương nhau [52]. Canxi là yếu tố tham gia vào quá trình
tự xúc tác của trypsinogen thành trypsin và sự bền vững của trypsin. Do đó, khi IP6
liên kết với Ca2+ thì sự sản sinh và tính bền vững của trypsin bị ảnh hưởng. Sự suy
giảm của enzyme phosphatase kiềm trong ruột và phytase trong ống dạ dày-ruột của
các động vật dạ dày đơn là do chế độ ăn nhiều canxi trong đó có sự hình thành phức

IP6-Ca [71]. Ngồi ra, các enzyme thymidinine kinase cũng bị ức chế mạnh mẽ bởi
sự liên kết IP6-Zn trong chế độ ăn chứa hàm lượng phytate cao [102].


1.1.4 Ảnh hưởng của phytic tới môi trường
Thực vật cần phospho vô cơ (Pi) cho sự sinh trưởng của chúng và thực vật tích
trữ phytate trong hạt, rễ và các mơ trong suốt thời gian chín. IP6 cần được phân giải
trở lại thành dạng Pi cung cấp cho đất và do đó khép kín chu trình phospho. Tuy
nhiên, sự có mặt quá nhiều của Pi, đặc biệt là khu vực nước bề mặt có thể gây ra
hiện tượng phú dưỡng (eurotrophication), đây là một dạng mất cân bằng sinh trưởng
của tảo và các thực vật thủy sinh khác dẫn tới sự thất thốt oxy, gây ảnh hưởng đến
các mơi trường nước hiếu khí khác. Vì vậy, sự mất cân bằng hệ sinh thái nước là tác
động chính về mặt mơi trường khi hàm lượng phospho được giải phóng vào nước
quá giới hạn [149].
Phytate có mặt trong khẩu phần ăn của người, lợn, gia cầm và các động vật dạ
dày đơn khác, thường được thải ra ngoài qua phân. Ngày nay cùng với sự phát triển
rộng của các nông trại nuôi gia cầm, gia súc, vấn đề phân thải ngày càng được quan
tâm. Con người và các động vật dạ dày đơn khơng có enzyme phytase trong ruột và
do đó sự thủy phân phytate trong ống ruột-dạ dày là nhờ hoạt động không đặc hiệu
của enzyme phosphatase ở ruột hoặc vi khuẩn ở ruột [24, 41, 70]. Vì thế mà việc
cung cấp Pi vào trong khẩu phần ăn nhằm đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng là một việc
phổ biến, tuy nhiên việc làm này lại làm tăng giá thành thức ăn và tăng lượng IP6, Pi
giải phóng ra mơi trường. Các vi sinh vật có mặt trong đất, nước có các loại enzyme
thủy phân phytate khác nhau góp phần vào sự thủy phân phytate trong rác thải chăn
nuôi [128, 148, 149]. Khi IP6 và Pi trở lại các thủy vực sẽ gây ra hiện tượng tảo nở
hoa, sự giảm oxy và sự chết của các thủy sinh vật, bên cạnh đó là vấn đề ô nhiễm về
mùi cũng khá phổ biến [72].
1.2 PHYTASE
1.2.1 Chức năng của phytase
Phytase (myo-inositol hexakisphosphate hydrolases) là một nhóm enzyme đặc

biệt trong số các enzyme phosphatase, có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân
từng bước axit phytic thành myo-inositol, các nhóm phosphate (Pi) và các myoinositol phosphate trung gian (IP5, IP4, IP3, IP2, IP1) [149].


Hình 4. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân phytate
1.2.2 Các đặc tính sinh lý, sinh hóa của phytase
Khối lượng phân tử phytase của vi khuẩn biến thiên từ 35-50 kDa trừ phytase
từ Klebsiella aerogenes có 2 dạng phân tử cảm ứng [134]. Phytase từ eukaryote như
nấm men, nấm sợi, thực vật và động vật thường được glycosyl hóa và có khối lượng
phân tử cao hơn, nằm trong khoảng từ 85-150 kDa đối với nấm, khoảng 500 kDa
đối với phytase của nấm men và từ 50-150 kDa đối với phytase của thực vật và
động vật.
Phần lớn các loại phytase đã biết đều hoạt động ở khoảng nhiệt độ tối ưu từ
45-80oC. Nhiệt độ tối ưu cao nhất được tìm thấy là 77oC của phytase phân lập từ
Schwanniomyces castellii và 70oC của phytase phân lập từ Bacillus sp. MD2 và
Bacillus amyloliquefaciens DS11 [57, 95, 123, 140, 141]. Tính bền nhiệt của
phytase ít có liên quan tới nhiệt độ tối ưu của phytase, hầu hết các loại phytase đều
bị bất hoạt ở nhiệt độ 40-65oC như phytase của S. castellii [96]. Phytase của A.
fumingatus chỉ giảm 10% hoạt tính sau 10 phút xử lý ở 100oC nhưng bắt đầu bất
hoạt ở 60oC [143]. Do các thức ăn thương mại thường được đóng viên ở nhiệt độ
cao 60-80oC, các loại phytase bền nhiệt như ß-propeller phytase từ Bacillus
amyloliquefaciens DS11 (với nhiệt độ nóng chảy là khoảng 80oC), phytase của
Bacillus sp. MD2 và phytase của A. fumingatus thực sự có ý nghĩa thực tiễn [139,
140].
Hầu hết các HAP phytase có khoảng pH hoạt động tối ưu từ 4-6 ngoại trừ pH
tối ưu của phyB từ Aspegillus niger là 2,5 [64, 96, 148]. PhyA của Aspegillus niger


có 2 điểm pH tối ưu là 2,5 và 5,5; phytase ß-propeller có pH tối ưu trong khoảng 67,5 [20, 54, 57, 139]. Vì thế HAP có thể hoạt động trong đoạn trên ống ruột của
động vật – nơi mà pH axit chiếm ưu thế cịn phytase ß-propeller có thể hoạt động

tốt trong đoạn sau của ống ruột – nơi có pH kiềm và trung tính chiếm ưu thế. Khả
năng chống chịu pH thấp trong dạ dày động vật là một điều rất quan trọng, các
phytase HAP khá bền trong điều kiện pH axít trong khi đó phytase ß-propeller
khơng thể hoạt động ở pH thấp nhưng lại khá bền ở pH thấp [57, 139, 141].
Khả năng bền với các protease là một điều rất quan trọng của các phytase khi
chúng được ứng dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm hoặc thức ăn. Tính bền
protease của phytase từ E.coli cao hơn so với tính bền protease của phytase từ A.
niger [49, 118, 125]. Phytase của các loài thuộc chi Bacillus biểu hiện tính bền
mạnh với papain, pancreatin và trypsin nhưng lại khá mẫn cảm với pepsin [55,
141].
Hoạt tính và độ bền của phytase ß-propeller khá phụ thuộc vào nồng độ Ca2+
và EDTA là chất ức chế tới hoạt tính của enzyme [40, 55 95, 129] . Mặt khác, hoạt
tính của phytase HAP thường tăng nhẹ khi có mặt của EDTA. NaCl với nồng độ
500mM có thể giảm bớt sự chênh lệch giữa 2 pH hoạt động tối ưu (2,5 và 5,5) của
phytase từ Aspergillus niger cũng như làm thay đổi pH tối ưu của phytase E. coli từ
5,5 đến 2 [143].
1.2.3

Nguồn phytase trong tự nhiên
Enzyme phytase được phân bố rộng rãi trong tự nhiên bao gồm ở thực vật,

động vật và các lồi vi sinh vật.
Phytase có mặt ở nhiều loài vi sinh vật bao gồm cả vi khuẩn, nấm, nấm men và
động vật nguyên sinh [65, 149]. Phytase vi khuẩn phần lớn thường liên kết với các
tế bào, trừ một số loài như Bacillus subtilis, Lactobacillus amylovorus và
Enterobacter sp. Năm 1998, Yanke và cộng sự đã phát hiện thấy một số loại vi
khuẩn kỵ khí sinh phytase trong ruột bê và trong đó các lồi Selenomonas sinh tổng
hợp phytase cao nhất, tiếp đó là lồi Mitsuokella multiaxitus. Năm 2003, Cho và
cộng sự đã tách chiết được enzyme phytase từ Pseudomonas syringae, cũng trong

năm đó Kim và cộng sự đã tách chiết được phytase từ vi khuẩn Citrobacter braaki.
Ngồi ra, phytase cịn được tìm thấy ở nhiều lồi vi khuẩn khác như:
Obesumbacterium proteus, vi khuẩn đất Klebsiella sp. ASR1 và một số loài của chi
Bifidobacterium [65].
Có khoảng trên 200 loại nấm thuộc các chi như Aspergillus, Penicillium,
Mucor và Rhizopus có khả năng sinh tổng hợp phytase và hầu hết các loài này đều
sản sinh phytase ngoại bào trong đó Aspergillus niger có khả năng sinh tổng hợp
phytase cao nhất. Aspergillus niger NRRL 3135 có khả năng sinh tổng hợp hai loại
phytase thích hợp ở 2 pH khác nhau là pH 5,5 và pH 2, nhiệt độ tối ưu là 55oC,
Aspergillus ficuum NRRL 3135 có thể sinh tổng hợp phytase trong lên men xốp sử
dụng cơ chất là bột canola. Ngoài ra các loại phytase chịu nhiệt cịn được tìm thấy ở
một số lồi nấm chịu nhiệt như Thermomyces lanuginosus, Sporotrichum
thermophile. Ở nấm men, phytase ngoại bào được tìm thấy ở các lồi như
Schwanniomyces castellii, Arxula adeninivorans, Pichia spartinae và P.
rhodanensis, Saccharomyces cerevisia, phytase nội bào được tìm thấy ở P.
anomala, trong đó Arxula adeninivorans là một trong hiếm các lồi nấm men có
khả năng đồng hóa phytate như là một nguồn cacbon và phosphate duy nhất [149].
Năm 1992, Freund và cộng sự đã phát hiện ra sự có mặt của phytase ở động
vật nguyên sinh Paramecium tetraurelia với kích thước 240 kDa, hoạt động tối ưu
ở pH 7 và không cần các ion kim loại hóa trị II trong q trình hoạt động và thứ tự
phân cắt nhóm phosphate là vị trí số 6, 5, 4, và 1 trên vòng inositol [65].
1.2.4 Phân loại phytase
Năm 1907, Suzuki và cộng sự lần đầu tiên tách chiết được enzyme phytase và
kể từ đó tới nay đã có rất nhiều loại enzyme phytase được phát hiện ra và mơ tả.
Theo hiệp hội hóa sinh quốc tế (The International Union of Biochemists) hiện nay
phytase được chia ra làm 2 loại chính là 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC
3.1.3.26), dựa trên vị trí cắt nhóm phosphate ở vị trí số 3 hoặc 6 của vịng inositol
khi phản ứng khử nhóm phosphate được bắt đầu [50]. Như vậy, sản phẩm của 3phytase trong lần cắt đầu tiên là Pi + myo-inositol 1,2,4,5,6-pentakisphosphate, sản

phẩm của 6-phytase trong lần cắt đầu tiên là Pi + myo-inositol 1,2,3,4,5pentakisphosphate sau đó các myo-inositol pentakisphosphate gắn trở lại phytase và
giải phóng ra các Pi tiếp theo, ngồi ra 6-phytase có thể cắt hồn tồn 6 Pi của
phytate cịn 3-phytase thì khơng cắt được hồn tồn [149, 155]. Enzyme 3- phytase
thường được sản sinh bởi các vi sinh vật cịn enzyme 6-phytase có mặt nhiều trong
thực vật, tuy nhiên cũng có một số ngoại lệ phytase của đậu nành là 3- phytase,
phytase của Escherichia coli là 6-phytase [34, 86, 110].
Phytase còn được phân loại dựa trên pH hoạt động tối ưu, theo căn cứ này
phytase được chia thành 3 loại: phytase ưa axit, ưa kiềm và trung tính [84].
Ngồi ra, dựa vào cấu hình trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác, phytase
được phân thành 3 loại khác nhau là: histidine axit phosphatase (HAP) phytases, ßpropeller phytase (BPP) và purple axit phosphatase (PAP) phytases [84]. Oh và
cộng sự căn cứ trên trình tự aminoaxit và các thuộc tính hóa sinh lại phân loại
phytase thành 2 loại chính là: HAPs và phytase kiềm với 4 nhóm phụ là PhyA, B,
C, D tuy nhiên phytase thực vật khơng có trong cách phân loại này [96].
Hầu hết các loại phytase được tìm thấy là các monomer, trừ trường hợp ngoại
lệ phyB của Aspergillus niger và phytase PL của Penophora lycii là các protenin
tetrameric và dimeric [60, 96, 145].
1.2.4.1 Histidine axit phosphatase (HAP)

Histidine axit phosphatase (HAP) là nhóm phytase được nghiên cứu rộng rãi
nhất, bao gồm phytase ở prokaryote như appA phytase của Escherichia coli và
eukaryote như phyA và B của các loài thuộc chi Aspergillus sp., phytase HAP của
nấm men và thực vật. Tất cả các HAP phytase đều có chung một cơ chế xúc tác và
vùng hoạt động. Kiểu trình tự vùng hoạt động gồm trình tự bảo thủ RHGXRXP ở
phần đuôi N và kiểu HD ở đuôi C trong trình tự amino axit. HAP được phân thành 2
loại khác nhau dựa trên tính đặc hiệu cơ chất của chúng: nhóm thứ 1 gồm các HAP
có tính đặc hiệu cơ chất rộng tương đương với hoạt động đặc hiệu thấp đối với
phytate, nhóm thứ 2 gồm các HAP có tính đặc hiệu cơ chất hẹp và do đó hoạt động
đặc hiệu cao đối với phytate. Tính đặc hiệu cơ chất này được quyết định bởi cấu
trúc vùng đặc hiệu cơ chất của mỗi enzyme.

HAP có thể bắt đầu phản ứng thủy phân IP6 ở vị trí nhóm P thứ 3 đối với phyA
và phyB hoặc ở vị trí nhóm P thứ 6 đối với phytase appA của E. coli và phytase PL
từ Penophora lycii. Sản phẩm cuối cùng của phytase HAP là các gốc Pi và inositol
monophosphate [84, 140].

Hình 5. Cấu trúc khơng gian của phyA từ Apergillus niger NRRL 3135
(Kostrewa và cộng sự, 1997)
1.2.4.2 ß-propeller phytase (BPPhys)

Các phytase thuộc nhóm này bao gồm các phytase của các loài thuộc Bacillus
spp, hạt phấn của Thypha lattifolia và Lilium longiflorum. Các trình tự gen mã hóa
cho enzyme phytase của chi Bacillus đã được cơng bố nhiều tuy nhiên chỉ cấu trúc
protein của phytase của Bacillus amyloliquefaciens DS11 đã được cơng bố. Khác
với HAP, ß-propeller phytase khơng sở hữu trình tự amino axit đặc trưng là
RHGXRXP và HD, mà có 2 vị trí riêng biệt gắn Ca2+ trong đó 3 ion Ca2+ gắn vào
vùng có ái lực với canxi cao và 3 ion Ca2+ gắn vào vùng có ái lực với canxi thấp, do
đó phytase loại này được gọi là các metallo-enzyme. Điều này khiến cho ß-propeller
phytase được gọi là một metallo- enzyme và có thể dẫn đến các cơ chế thủy phân
phytate khác nhau. Mặc dù trình tự phytase β-propeller rất đa dạng (độ tương đồng
65-99%) nhưng chúng vẫn bảo thủ ở 2 vị trí gắn canxi. Khơng giống như cấu trúc
của HAP, phytase ß-propeller chứa 6 tấm dạng β được sắp xếp thành 6 hướng giống
như chân vịt (hình 6) tạo nên các khe hoạt tính hẹp tích điện âm cao. Mỗi tấm trong
phân tử enzyme phytase β-propeller chứa 4 tới 5 chuỗi β không cùng chiều, và