(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu hiệu quả điều hòa enzyme chuyển hóa glucose của lá xoài non (mangifera indica l ) và rễ me keo (pithecellobium dulce (roxb ) benhth ) trên chuột bệnh đái tháo đường

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HUỲNH VĂN TRƯƠNG

NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH Ở
CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata Thunb.)
CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TRÊN
VI KHUẨN Staphylococcus aureus
TỪ MỤN NHỌT (Furuncle) Ở NGƯỜI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Mã ngành: 62420201

2021


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

HUỲNH VĂN TRƯƠNG

NGHIÊN CỨU VI KHUẨN NỘI SINH Ở
CÂY DIẾP CÁ (Houttuynia cordata Thunb.)
CĨ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TRÊN
VI KHUẨN Staphylococcus aureus
TỪ MỤN NHỌT (Furuncle) Ở NGƯỜI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Mã ngành: 62420201

Người hướng dẫn khoa học
PGS.TS. NGUYỄN HỮU HIỆP

2021
i


XÁC NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG
Luận án này với tựa đề “Nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá
(Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn
Staphylococcus aureus từ mụn nhọt (Furuncle) ở người” do nghiên cứu sinh
Huỳnh Văn Trương thực hiện theo sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn
Hữu Hiệp đã báo cáo và được Hội đồng thông qua.
Ủy viên

Thư ký

(ký tên)

(ký tên)

Ủy viên

Phản biện 1

(ký tên)

(ký tên)

Phản biện 2

Phản biện 3

(ký tên)

(ký tên )

Người hướng dẫn

Chủ tịch Hội đồng

(ký tên)

(ký tên )

i


LỜI CẢM TẠ
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến:
Thầy PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp và cô PGS.TS. Đái Thị Xuân Trang
đã dành nhiều thời gian, công sức và tận tình hướng dẫn tơi trong thời gian
thực hiện luận án và học tại trường.
Thầy cô đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi nhất cho việc
nghiên cứu và học tập tại Viện NC và PT Công nghệ sinh học, các nghiên cứu
sinh và bạn Trần Chí Linh học viên cao học khóa 25 ngành Cơng nghệ sinh
học của trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp cho tơi hồn thành luận án.
Xin được gửi lời biết ơn sâu sắc đến Ban Giám Hiệu trường Đại học

Cần Thơ, trường Đại học Y Dược Cần Thơ; Ban lãnh đạo Viện NC và PT
Công nghệ Sinh học và khoa Sau đại học, trường Đại học Cần Thơ cùng quý
thầy cô và các đồng nghiệp tạo điều kiện thuận lợi về thời gian để tơi có thể
hồn thành chương trình học tập.
Cuối cùng, sự thành cơng của luận án khơng thể khơng kể đến sự đóng
góp khơng nhỏ của các thành viên trong gia đình, vợ Lý Tú Hương và con
Huỳnh Gia Bảo, những người luôn ủng hộ, động viên và giúp tơi vượt qua rất
nhiều khó khăn trong thời gian học tập.
Trân trọng cảm ơn.
Cần Thơ, ngày

tháng

năm 2021

Ký tên

Huỳnh Văn Trương

ii


ABSTRACT
Many studies using Houttuynia cardata Thunb. for disease treatment
are based on the fact that Houttuynia cardata Thunb. has antibacterial, antiinflammatory and anti-oxidant activities. However, the study of endophytic
bacteria and extracts of endophytic bacteria in Houttuynia cardata Thunb.
with antibacterial activity on Staphylococcus aureus from furuncles in humans
has not been studied.
The objectives of the research were to isolate and identify some
endophytic bacterial strains of Houttuynia cardata Thunb. with antibacterial

activity on Staphylococcus aureus and determine antibacterial, antiinflammatory and anti-oxidant activities of extracts of endophytic bacteria in
Houttuynia cardata Thunb. with high antibacterial activity against
Staphylococcus aureus.
The result showed that 231 endophytic bacteria strains that are found in
all parts of Houttuynia cardata Thunb. such as leaves, stems and roots of
Houttuynia cardata Thunb. grown in various ecological regions such as salt
water, brackish water and fresh water or sea, islands, high mountains and
plains in Kien Giang, Soc Trang, An Giang and Can Tho. Among 231 strains
65 endophytic bacteria ones in Houttuynia cardata Thunb. with antibacterial
activity on Staphylococcus aureus isolated from human furuncles. Thirteen
endophytic bacteria strains in Houttuynia cardata Thunb. which had strongest
antibacterial activity on Staphylococcus aureus with a sterile ring of 20-33
mm. Endophyic bacteria were identified and belonged to Bacillus genus.
The ethyl acetate extract from selected endophytic bacterial culture
(RGT2) determined antibacterial activity on Staphylococcus aureus bacteria
strain with high concentration of minimal inhibitory extract (MIC) fluctuated
from 80 to 160 µg/mL. The minimum bactericidal concentration (MBC) of the
extract on the Staphylococcus aureus fluctuated from 640 to 1280 µg/mL.
The antioxidant activity of ethyl acetate extract from selected
endophytic bacterial fluid culture (RGT2) was determined through free radical
neutralization methods DPPH, ABTS, RP, TAC and FRAP with EC50
iii


successive values of 57.38 µg/mL; 57.01 µg/mL; 32.00 µg/mL; 94.80 µg/mL
and 41.41 µg/mL respectively. The anti-inflammatory activity of extracts was
investigated based on the inhibitory activity of the denaturation of bovine
serum albumin. Extraction was capable of 50% inhibition of denaturation at a
concentration of 73.74 µg/mL.
The result of this study showed that endophytic bacteria strain (RGT2)

in Houttuynia cardata Thunb not only has antibacterial activity, but also has
antioxidant and anti-inflammatory activities which are potential in treatment
of human diseases of furuncles and skin infections caused by Staphylococcus
aureus.
Keywords: Antibacterial, Bacillus sp., endophytic bacteria, furuncle,
Houttuynia cordata Thunb.

iv


TĨM TẮT
Nhiều cơng trình nghiên cứu cây Diếp cá cho việc điều trị bệnh dựa
trên cơ sở cây Diếp cá có các hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và
kháng oxy hóa. Tuy nhiên, việc nghiên cứu vi khuẩn nội sinh và cao
chiết từ dịch nuôi tăng sinh của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính
kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus từ mụn nhọt ở người chưa
được nghiên cứu nhiều.
Mục tiêu của luận án là phân lập và định danh được một số dòng vi
khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn
Staphylococcus aureus và khảo sát hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm,
kháng oxy hóa của cao chiết từ dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn nội sinh ở
cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn cao với vi khuẩn Staphylococcus aureus.
Kết quả nghiên cứu phân lập được 231 dòng vi khuẩn nội sinh, các
dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được đều hiện diện ở các bộ phận như lá, thân
và rễ của cây Diếp cá, trồng tại các vùng sinh thái như nước mặn, nước lợ và
nước ngọt hay biển đảo, núi cao và đồng bằng thể hiện ở Kiên Giang, Sóc
Trăng, An Giang và Cần Thơ. Trong số 231 dịng có 65 dịng vi khuẩn nội
sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus
aureus phân lập từ mụn nhọt ở người. Mười ba dịng vi khuẩn nội sinh ở cây
Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất trên dịng vi khuẩn

Staphylococcus aureus với vịng vơ khuẩn từ 20 – 33 mm. Các dòng vi khuẩn
nội sinh được nhận diện thuộc chi Bacillus.
Cao chiết ethyl acetate từ dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn nội sinh
(RGT2) được tuyển chọn nghiên cứu, có nồng độ cao chiết ức chế tối thiểu
(MIC) dao động từ 80 đến 160 µg/mL. Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC)
của cao chiết trên dòng vi khuẩn Staphylococcus aureus dao động từ 640 đến
1280 µg/mL.
Hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi cấy
tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh (RGT2) được tuyển chọn nghiên cứu, xác
định thơng qua các phương pháp trung hịa gốc tự do DPPH, ABTS+, RP, TAC
và FRAP với giá trị EC50 lần lược là 57,38 µg/mL, 57,01 µg/mL, 32,00 µg/mL,
v


94,80 µg/mL và 41,41 µg/mL. Ngồi ra, hoạt tính kháng viêm của cao chiết
được khảo sát dựa trên hoạt tính ức chế sự biến tính của albumin huyết thanh
bị, có khả năng ức chế 50% sự biến tính ở nồng độ 73,74 µg/mL.
Kết quả nghiên cứu chứng tỏ được rằng dịng vi khuẩn nội sinh (RGT2)
ở cây Diếp cá khơng chỉ có hoạt tính kháng khuẩn mà cịn có khả năng kháng
oxy hóa, kháng viêm rất có tiềm năng trong lĩnh vực điều trị các bệnh lý cho
con người về mụn nhọt và nhiễm khuẩn da do vi khuẩn Staphylococcus aureus.
Từ khóa: Bacillus sp., cây Diếp cá, hoạt tính kháng khuẩn, mụn nhọt,
vi khuẩn nội sinh.

vi


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan luận án “Nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá
(Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn

Staphylococcus aureus từ mụn nhọt (Furuncle) ở người” là cơng trình nghiên
cứu của tôi với sự hướng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp. Các số liệu và
kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chưa từng được người
khác công bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

Người hướng dẫn khoa học

Tác giả luận án

PGS.TS. Nguyễn Hữu Hiệp

NCS. Huỳnh Văn Trương

vii


MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ .................................................................................................... ii
ABSTRACT...................................................................................................... iii
TÓM TẮT .......................................................................................................... v
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................ vii
MỤC LỤC ...................................................................................................... viii
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... xv
DANH MỤC HÌNH ....................................................................................... xvii
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................ xix
Chương 1. GIỚI THIỆU .................................................................................... 1
1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu ...................................................................... 1
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu ................................................................ 2
1.2.1 Mục tiêu tổng quát ................................................................................ 2
1.2.2 Mục tiêu cụ thể ..................................................................................... 2

1.3 Nội dung nghiên cứu.................................................................................... 3
1.4 Những đóng góp mới về khoa học............................................................... 4
1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ........................................................ 4
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 5
2.1 Đặc điểm thực vật cây Diếp cá .................................................................... 5
2.1.1 Phân loại ............................................................................................... 6
2.1.2 Thành phần hóa học ............................................................................. 6
2.1.2.1 Tinh dầu ........................................................................................ 6
2.1.2.2 Flavonoid ...................................................................................... 6
2.1.2.3 Alkaloid ......................................................................................... 7
2.1.2.4 Acid hữu cơ và acid béo................................................................ 7
2.1.2.5 Sterol ............................................................................................. 7
2.1.2.6 Các acid amin ................................................................................ 8
2.1.2.7 Các thành phần khác ..................................................................... 8
2.1.3 Công dụng của cây Diếp cá .................................................................. 8
2.1.3.1 Tác dụng kháng khuẩn .................................................................. 8
2.1.3.2 Tác dụng kháng virus .................................................................... 9
viii


2.1.3.3 Tác dụng hoạt tính tế bào ung thư................................................. 9
2.1.3.4 Tác dụng kháng viêm .................................................................. 10
2.1.3.5 Tác dụng kháng dị ứng................................................................ 10
2.1.3.6 Tác dụng kháng oxy hóa ............................................................. 10
2.1.3.7 Các tác dụng khác ....................................................................... 11
2.2 Sơ lược về vi khuẩn nội sinh thực vật ....................................................... 11
2.2.1 Vi khuẩn nội sinh thực vật ................................................................. 11
2.2.2 Các dòng vi khuẩn nội sinh thực vật thường gặp ............................... 13
2.2.2.1 Vi khuẩn Pseudomonas sp. ......................................................... 13
2.2.2.2 Vi khuẩn Burkholderia sp. .......................................................... 14

2.2.2.3 Vi khuẩn Bacillus sp. .................................................................. 14
2.3 Tổng quan về da người .............................................................................. 15
2.3.1 Thượng bì (epidemis) ......................................................................... 16
2.3.2 Trung bì (dermis)................................................................................ 16
2.3.3 Hạ bì (hypodermis) ............................................................................. 17
2.3.4 Phần phụ của da .................................................................................. 17
2.3.4.1 Thần kinh da................................................................................ 17
2.3.4.2 Tuyến mồ hôi .............................................................................. 17
2.4 Vi khuẩn Staphylococcus aureus ............................................................... 20
2.5 Sơ lược về khuếch tán đĩa thạch (Disk diffusion assay) ............................ 22
2.6 Một số kỹ thuật trong sinh học phân tử ..................................................... 23
2.6.1 Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction ................................................. 23
2.6.2 Giải trình tự DNA ............................................................................... 24
2.6.3 Phần mềm phân tích trình tự DNA ..................................................... 25
2.7 Nồng độ ức chế tối thiểu và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu ......................... 25
2.8 Phương pháp xác định tác nhân oxy hóa ................................................... 26
2.9 Sơ lược về viêm ......................................................................................... 34
2.9.1 Giới thiệu về viêm .............................................................................. 34
2.9.2 Phân loại viêm .................................................................................... 34
2.9.3 Các tác nhân gây viêm........................................................................ 34
2.9.4 Cơ chế đáp ứng của viêm ................................................................... 35
ix


2.9.5 Điều trị viêm ....................................................................................... 36
Chương 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 38
3.1 Phương tiện nghiên cứu ............................................................................. 38
3.1.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ...................................................... 38
3.1.1.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................................. 38
3.1.1.2 Phạm vi nghiên cứu..................................................................... 38

3.1.1.3 Thời gian nghiên cứu .................................................................. 38
3.1.1.4 Địa điểm nghiên cứu ................................................................... 38
3.1.2 Vật liệu ............................................................................................... 38
3.1.3 Dụng cụ và thiết bị ............................................................................. 39
3.1.4 Hóa chất .............................................................................................. 40
3.1.5 Cơng thức mơi trường nuôi cấy.......................................................... 41
3.2 Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 41
3.2.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu trong nghiên cứu .......................... 41
3.2.1.1 Vi khuẩn Staphylococcus aureus .................................................... 41
3.2.2 Phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá ............................... 42
3.2.2.1 Phân lập vi khuẩn nội sinh trong cây Diếp cá ................................. 42
3.2.3 Khảo sát đặc điểm khuẩn lạc của các dịng vi khuẩn được phân lập. 44
3.2.3.1 Mơ tả đặc điểm khuẩn lạc quan sát vi khuẩn trên đĩa thạch môi
trường PDA......................................................................................... 44
3.2.3.2 Khảo sát khả năng di động .......................................................... 44
3.2.3.3 Khảo sát tế bào vi khuẩn ............................................................. 44
3.2.4 Xác định khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh phân
lập được ở cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus. ............... 45
3.2.4.1 Tính kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá
trên vi khuẩn Staphylococcus aureus. ................................................ 45
3.2.4.2 Đánh giá khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn nội sinh ở
cây Diếp cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus ............................. 46
3.3 Nhận diện những dịng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính kháng khuẩn cao
trên vi khuẩn Staphylococcus aureus .......................................................... 46
3.3.1 Ly trích DNA vi khuẩn ....................................................................... 46
x


3.3.2 Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR ............................... 47
3.3.3 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose ............................................. 48

3.4 Khảo sát dịch nội bào, dịch ngoại bào và dịch ni tăng sinh dịng vi
khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn
Staphylococcus aureus ................................................................................ 49
3.5 Điều chế các cao chiết từ dịch ni dịng vi khuẩn nội sinh ..................... 50
3.6 Xác định hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ethyl acetate từ vi khuẩn nội
sinh ở cây Diếp cá. ...................................................................................... 50
3.6.1 Định tính thành phần hóa học trong của cao chiết từ dịch ni tăng
sinh dịng vi khuẩn nội sinh .................................................................... 50
3.6.1.1 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm alkaloid .... 51
3.6.1.2 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm flavonoid .. 51
3.6.1.4 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm steroid – tri
terpenoid ............................................................................................. 52
3.6.1.5 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm glycoside .. 52
3.6.1.6 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm saponin ..... 53
3.6.1.7 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm tannin ....... 53
3.6.1.8 Khảo sát sự hiện diện của các hợp chất thuộc nhóm polyphenol 53
3.6.2 Định lượng thành phần hóa học trong cao chiết ly trích từ dịch ni
dịng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá ........................................................ 53
3.6.3 Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của cao chiết ................................... 54
3.6.3.1 Phương pháp khuếch tán giếng thạch bằng cách xác định đường
kính vịng vơ khuẩn ............................................................................ 54
3.6.3.2 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC ................ 55
3.6.3.3 Phương pháp xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) ...... 56
3.7 Xác định hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ethyl acetate từ dòng vi
khuẩn nội sinh in vitro ................................................................................. 56
3.7.1 Phương pháp kháng oxy hóa tổng (TAC) .......................................... 56
3.7.2 Phương pháp trung hòa gốc tự do ABTS ........................................... 57
3.7.3 Phương pháp xác định năng lực khử (RP) ......................................... 57
3.7.4 Khảo sát hiệu quả trung hòa gốc tự do DPPH .................................... 58
xi

3.7.5 Phương pháp xác định tiềm năng khử (FRAP) .................................. 58
3.8 Khảo sát hoạt tính kháng viêm in vitro của cao chiết ly trích từ vi khuẩn
nội sinh ........................................................................................................ 59
3.9 Phân tích và xử lý số liệu ........................................................................... 59
Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................... 60
4.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá trồng ở Kiên
Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ. .................................................. 60
4.1.1 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn phân lập ở cây Diếp cá tại Kiên
Giang ....................................................................................................... 60
4.1.2 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại Sóc
Trăng ....................................................................................................... 61
4.1.3 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại An
Giang ....................................................................................................... 62
4.1.4 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại Cần
Thơ .......................................................................................................... 64
4.1.5 Kết quả khảo sát các đặc điểm khuẩn lạc và đặc điểm của các dòng vi
khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá phân lập được trong nghiên cứu .............. 65
4.1.5.1 Kết quả khảo sát đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn nội
sinh ở cây Diếp cá ............................................................................... 65
4.1.5.2 Kết quả khảo sát đặc điểm của các dòng vi khuẩn nội sinh ở cây
Diếp cá ................................................................................................ 67
4.2 Kết quả khảo sát đặc điểm pH đất trồng cây Diếp cá trong nghiên cứu ... 69
4.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp
cá trên vi khuẩn Staphylococcus aureus...................................................... 70
4.3.1 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của
dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại tỉnh Kiên Giang ..................... 70
4.3.2 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của
dịng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại tỉnh Sóc Trăng ....................... 71

4.3.3 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của
dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại tỉnh An Giang ........................ 72

xii


4.3.4 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của
dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá tại Cần Thơ ................................. 74
4.3.5 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây
Diếp cá trên vi khuẩn Staphyloccus aureus tại Kiên Giang, Sóc Trăng,
An Giang và Cần Thơ ............................................................................. 75
4.4. Kết quả giải trình tự vùng 16S rRNA của 13 dịng vi khuẩn nội sinh cây
Diếp cá tại 13 địa điểm lấy mẫu nghiên cứu ............................................... 81
4.5 Cây phả hệ của các dịng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá có hoạt tính kháng
khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus aureus ............................................... 83
4.6. Kết quả khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của dịch ngoại bào, dịch nội bào
và dịch ni tăng sinh của dịng vi khuẩn RGT2 trên vi khuẩn
Staphylococcus aureus ................................................................................ 86
4.7 Kết quả điều chế, định tính và định lượng thành phần hóa học cao chiết từ
dịch ni tăng sinh dịng RGT2 là vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá ........... 89
4.7.1 Điều chế cao chiết ethyl acetate từ dịch nuôi tăng sinh dịng RGT2 . 89
4.7.2 Định tính các nhóm hóa học từ cao chiết dịch ni dịng vi khuẩn
RGT2 ....................................................................................................... 89
4.7.3 Định lượng hàm lượng polyphenol tổng và flavonoid tồn phần từ cao
chiết dịch ni dịng vi khuẩn RGT2 ...................................................... 90
4.8 Kết quả khảo sát đường kính vịng vơ khuẩn của cao chiết ly trích từ dịch
ni tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 và kháng sinh vancomycin trên vi
khuẩn Staphylococcus aureus ..................................................................... 92
4.9 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối
thiểu (MBC) của cao chiết ly trích từ dịch ni tăng sinh dòng vi khuẩn

RGT2 và kháng sinh vancomycin trên vi khuẩn Staphylococcus aureus ... 97
4.10 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ly trích từ dịch
ni tăng sinh dịng vi khuẩn RGT2. ........................................................ 102
4.10.1 Kết quả khảo sát hoạt tính trung hịa gốc tự do DPPH .................. 102
4.10.2 Kết quả hiệu quả khảo sát hoạt tính trung hịa gốc tự do ABTS.+.. 103
4.10.3 Kết quả tiềm năng kháng oxy hóa tổng (TAC) .............................. 105

xiii


4.10.4 Kết quả tiềm năng khử (FRAP) của cao chiết ly trích từ dịch ni
tăng sinh dịng vi khuẩn RGT2. ............................................................ 107
4.10.5 Kết quả năng lực khử (RP) của cao chiết ly trích từ dịch ni tăng
sinh dịng vi khuẩn RGT2. .................................................................... 109
4.10.6 So sánh kết quả hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết ly trích từ
dịch ni tăng sinh dòng vi khuẩn RGT2 của các phương pháp trong
nghiên cứu ............................................................................................. 111
4.11 Kết quả khảo sát hoạt tính kháng viêm của cao chiết từ dịch ni tăng
sinh dịng vi khuẩn nội sinh (RGT2) ở cây Diếp cá. ................................. 114
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ........................................................ 118
5.1 Kết luận .................................................................................................... 118
5.2 Đề xuất ..................................................................................................... 119
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 120
Phụ lục nghiên cứu ........................................................................................- 1 -

xiv


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3. 1 Thành phần môi trường PDA .......................................................... 41

Bảng 3. 2 Thành phần môi trường PDA bán đặc............................................. 41
Bảng 3. 3 Thành phần hóa chất của phản ứng PCR ........................................ 48
Bảng 4. 1 Địa điểm nơi lấy mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá
tại Kiên Giang ................................................................................ 60
Bảng 4. 2 Địa điểm lấy mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá tại Sóc
Trăng .............................................................................................. 61
Bảng 4. 3 Địa điểm nơi lấy mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá
tại An Giang ................................................................................... 63
Bảng 4. 4 Địa điểm nơi lấy mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá
tại Cần Thơ ..................................................................................... 64
Bảng 4. 5 Đặc điểm khuẩn lạc các dòng vi khuẩn phân lập được ở cây Diếp cá
tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ ........................ 66
Bảng 4. 6 Đặc điểm các dòng vi khuẩn nội sinh phân lập được ở cây Diếp cá
tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ ........................ 67
Bảng 4. 7 Đặc điểm pH đất trồng cây Diếp cá nơi lấy mẫu để phân lập các
dòng vi khuẩn nội sinh ................................................................... 69
Bảng 4. 8 Đường kính (mm) vịng vơ khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp
cá tại Kiên Giang có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus
aureus ............................................................................................. 70
Bảng 4. 9 Đường kính (mm) vịng vơ khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp
cá tại Sóc Trăng có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus
aureus ............................................................................................. 72
Bảng 4. 10 Đường kính (mm) vịng vơ khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp
cá tại An Giang có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus
aureus ............................................................................................. 73

xv


Bảng 4. 11 Đường kính (mm) vịng vơ khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp

cá tại Cần Thơ có hoạt tính kháng khuẩn trên Staphylococcus
aureus ............................................................................................. 74
Bảng 4. 12 Kết quả giải trình tự các dịng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá
được tuyển chọn tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ
........................................................................................................ 82
Bảng 4. 13 Kết quả khảo sát đường kính (mm) vịng vơ khuẩn của dịch nội
bào, dịch ngoại bào và dịch nuôi tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh
........................................................................................................ 86
Bảng 4. 14 Kết quả khảo sát các nhóm chức có hoạt tính kháng khuẩn của cao
chiết từ dịch ni tăng sinh dịng RGT2 ........................................ 90
Bảng 4. 15 Kết quả hàm lượng polyphenol và flavonoid của cao chiết .......... 91
Bảng 4. 16 Đường kính (mm) vịng vơ khuẩn ở các nồng độ của cao chiết và
vancomycin trên Staphylococcus aureus ....................................... 93
Bảng 4. 17 Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu
(MBC) của cao chiết và vancomycin ............................................. 97
Bảng 4. 18 Hoạt tính trung hịa gốc tự do DPPH của cao chiết ethyl acetate từ
dịch nuôi tăng sinh dịng RGT2 ................................................... 103
Bảng 4. 19 Hoạt tính trung hịa gốc tự do ABTS+ của cao chiết ethyl acetate từ
dịch ni tăng sinh dịng RGT2 ................................................... 105
Bảng 4. 20 Giá trị Absorbance (Abs) và hàm lượng chất kháng oxy hóa tương
đương (µg/mL) của cao chiết ....................................................... 106
Bảng 4. 21 Giá trị độ hấp thu quang phổ (Abs) và hàm lượng chất kháng oxy
hóa tương đương (µg/mL) của trolox và cao chiết (mg/mL) ....... 108
Bảng 4. 22 Giá trị Abs của chất chuẩn trolox ................................................ 109
Bảng 4. 23 Giá trị Abs và hàm lượng kháng oxy hóa tương đương trolox của
cao chiết ........................................................................................ 111
Bảng 4. 24 Nồng độ trung hòa và khử được 50% gốc tự do của cao chiết ... 112
Bảng 4. 25 Hoạt tính kháng viêm của cao chiết từ dịch ni tăng sinh dịng vi
khuẩn nội sinh (RGT2) và chất đối chứng Diclofenac................. 114

xvi


Bảng 4. 26 Giá trị IC50 của hoạt tính kháng viêm của cao chiết và chất
Diclofenac .................................................................................... 116

xvii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2. 1 Cây Diếp cá sử dụng trong nghiên cứu ............................................. 5
Hình 2. 2 Cơ chế xâm nhập của vi khuẩn nội sinh thực vật ............................ 13
Hình 2. 3 Vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá chụp KHV điện tử quét SEM ...... 15
Hình 2. 4 Cấu tạo của da cơ thể người ............................................................ 16
Hình 2. 5 Sơ đồ cấu tạo của lông, nang lông và hành lơng ............................. 18
Hình 2. 6 Vi khuẩn Staphylococcus aureus chụp KHV điện tử quét SEM ..... 21
Hình 2. 7 Viêm nang lơng do tụ cầu ................................................................ 22
Hình 3. 1 Cây, thân và rễ cây Diếp cá ............................................................. 42
Hình 3. 2 Lá và thân cây Diếp cá sử dụng trong nghiên cứu .......................... 42
Hình 3. 3 Quy trình phân lập vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá ....................... 42
Hình 3. 4 Quy trình khảo sát hoạt tính kháng khuẩn của các dịng VKNS ..... 45
Hình 3. 5 Vịng vơ khuẩn khảo sát tính kháng khuẩn của dịng vi khuẩn nội
sinh ở cây Diếp cá trên Staphylococcus aureus ............................. 46
Hình 3. 6 Quy trình ly trích DNA của vi khuẩn nội sinh ................................ 46
Hình 3. 7 Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR...................................................... 47
Hình 4. 1 Cây phả hệ các dịng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có hoạt tính
kháng khuẩn trên Staphylococcus aureus trong nghiên cứu .......... 84
Hình 4. 2 Sàng lọc hoạt tính kháng khuẩn của vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá
dòng RGT2 trên Staphylococcus aureus ........................................ 88
Hình 4. 3 Khả năng kháng khuẩn của cao chiết từ dịch ni tăng sinh dịng

RGT2 và vancomycin trên Staphylococcus aureus ....................... 94
Hình 4. 4 Đường kính (mm) vịng vơ khuẩn của cao chiết từ dịch ni dòng
RGT2 và kháng sinh thương mại Vancomycin trên Staphylococcus aureus .. 95
Hình 4. 5 Thử nghiệm cao chiết và kháng sinh vancomycin .......................... 98
Hình 4. 6 Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) của cao chiết từ dịch nuôi tăng
sinh ............................................................................................... 100
Hình 4. 7 Hiệu suất trung hịa gốc tự do DPPH của trolox ........................... 102
Hình 4. 8 Hiệu suất trung hòa gốc tự do ABTS của trolox ........................... 104
xvii


Hình 4. 9 Giá trị độ hấp thu quang phổ (Abs) của trolox .............................. 106
Hình 4. 10 Biểu đồ giá trị độ hấp thu quang phổ (Absorbance) của trolox... 108
Hình 4. 11 Biểu đồ giá trị độ hấp thu quang phổ (Absorbance) của trolox... 110
Hình 4. 12 Hiệu suất kháng viêm của cao chiết và Diclofenac ..................... 115

xviii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
ATP

Adenosine triphosphate

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

CFU

Colony Forming Units

DNA

Deoxyribonucleic acid

ĐK

Đường kính

FAME

Fatty acid methyl ester (Este methyl acid béo)

GNFMM

Glucose Nitrogene Free Mineral Medium

HIV

Human Immunodeficiency Virus (virus gây bệnh AIDS)

HSV

Herpes simplex virus (Virus gây bệnh mụn rộp)

KL

Khuẩn lạc

MLST

Multi locus sequence typing (giải trình tự gen nhiều locus)

NCBI

National Center for Biotechnology Information

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng khuếch đại gen)

PDA

Potato dextrose agar (Môi trường dinh dưỡng PDA)

rRNA

Ribosomal ribonucleic acid

RAPD
RFLP

Ron amplified polymorphism DNA
(DNA đa hình được nhân bản ngẫu nhiên)
Restriction fragment length polymorphism
(Đa hình về chiều dài phân đoạn cắt hạn chế)

S. aureus

Staphylococcus aureus

VK

Vi khuẩn

VKNS

Vi khuẩn nội sinh

WHO

World Health Organization

xix


Chương 1. GIỚI THIỆU
1.1 Tính cấp thiết của nghiên cứu
Từ khi Alexander Flemming phát hiện ra kháng sinh đầu tiên là
Penicillin thì kháng sinh đã được ứng dụng rộng rãi trong điều trị các bệnh
nhiễm khuẩn cho người cũng như động vật. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng
sinh một cách tùy tiện đã gây ra những tác hại không nhỏ như quen thuốc và
kháng thuốc ngày càng phổ biến. Đó là nguyên nhân cần phải tìm ra kháng
sinh mới để tiêu diệt các vi khuẩn gây bệnh trong đó có vi khuẩn
Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) là một vi khuẩn thường gặp trên da hoặc
niêm mạc mũi chiếm 30% những người khỏe mạnh. Trong trường hợp này, vi
khuẩn thường không gây hại và biểu hiện triệu chứng. Khi da bị tổn thương,
trầy xước, tụ cầu khuẩn xâm nhập cơ thể và có thể gây ra một loạt các vấn đề
từ nổi mụn nhẹ đến nhiễm khuẩn nặng, đặc biệt là ở trẻ em, người già, và

những người có hệ miễn dịch yếu. Hầu hết các tụ cầu ban đầu nhạy cảm với
kháng sinh nhóm beta-lactam như penicillin, methicillin. Vi khuẩn
Staphylococcus aureus đề kháng methicillin (gọi tắt là MRSA), methicillin là
một kháng sinh được coi là mạnh nhất trong nhóm beta-lactam, methicillin là
một penicillin bán tổng hợp kháng lại enzyme beta-lactamase được giới thiệu
vào năm 1959; ngay sau đó, vi khuẩn Staphylococcus aureus đề kháng với
methicillin đã được báo cáo và sự bùng phát của MRSA xảy ra ở châu Âu vào
đầu những năm 1960 (Dien et al., 2014).
Từ việc sử dụng tràn lan và lạm dụng các loại thuốc kháng sinh ở các
nước đang phát triển cũng như Việt Nam, ngày có nhiều kháng sinh đề kháng
với vi khuẩn Staphylococcus aureus. Chính vì những lý do trên việc nghiên
cứu và tìm ra một biện pháp mang tính hiệu quả từ thiên nhiên có khả năng
kháng với vi khuẩn Staphylococcus aureus thay thế các loại kháng sinh tổng
hợp là cần thiết.
Trong thiên nhiên có rất nhiều cây cỏ được y học sử dụng từ rất lâu như
cây Diếp cá, Hành, Hẹ, Tỏi... có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, kháng
oxy hóa để dùng làm thuốc chữa bệnh ngoài da, mụn nhọt, chóc lở, viêm phế

1


quản... Chính vì vậy, gần đây thế giới y học có xu hướng tìm đến những loại
kháng sinh, kháng viêm, kháng oxy hóa từ những cây dược liệu và thực vật.
Trong đó có cây Diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.) là một loại rất
quen thuộc trong bữa ăn hàng ngày của người Việt Nam, có vị đắng, tính ơn
theo Đơng và Tây y, cây Diếp cá còn được biết đến với nhiều cơng dụng từ
dịch trích của cây như kháng khuẩn, kháng viêm và kháng oxy hóa (Choi
et al., 2010), giúp gia tăng số lượng tế bào lympho nhanh chóng, giúp tăng
tính miễn dịch của người (Sriwanthana et al., 2007).
Hiện tại có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn nội sinh ở cây dược liệu và

thực vật, vi khuẩn nội sinh có khả năng giúp cây tăng trưởng tốt mà cịn có
khả năng sản xuất các hợp chất kháng khuẩn tự nhiên (Strobel, 2003) và kích
thích cây chủ sản xuất ra các hợp chất chuyển hóa trung gian (Hardoim et al.,
2008). Trong đó việc nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có các
hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và kháng oxy hóa chưa được quan tâm
nhiều. Vì vậy, luận án với tựa đề “Nghiên cứu vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá
(Houttuynia cordata Thunb.) có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn
Staphylococcus aureus từ mụn nhọt (Furuncle) ở người” là việc làm có tính
cấp thiết cần được nghiên cứu.
1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
1.2.1 Mục tiêu tổng quát
Phân lập và định danh được một số dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá
ở các vùng sinh thái có hoạt tính kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus
aureus và xác định hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và kháng oxy hóa
từ cao chiết ly trích của dịch ni tăng sinh dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp
cá có hoạt tính kháng khuẩn mạnh nhất với vi khuẩn Staphylococcus aureus.
1.2.2 Mục tiêu cụ thể
Phân lập và khảo sát khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn
Staphylococcus aureus của một số dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá được
trồng tại Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Cần Thơ tương ứng với bốn
vùng sinh thái nước mặn, nước lợ, đồi núi và nước ngọt.

2


Định danh một số dòng vi khuẩn nội sinh ở cây Diếp cá có khả năng
kháng khuẩn mạnh nhất với vi khuẩn Staphylococcus aureus.
Nghiên cứu ở mức độ in vitro các hoạt tính kháng oxy hóa và kháng
viêm liên quan đến khả năng kháng khuẩn trên vi khuẩn Staphylococcus
aureus của dòng vi khuẩn nội sinh cây Diếp cá được tuyển chọn.

1.3 Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1. Phân lập và tuyển chọn dịng vi khuẩn nội sinh có khả
năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus, bao gồm các nội dung sau:
Phân lập và khảo sát đặc điểm những dòng vi khuẩn nội sinh ở cây
Diếp cá trồng ở các tỉnh Kiên Giang, Sóc Trăng, An Giang và Thành phố Cần
Thơ.
Tuyển chọn các dịng vi khuẩn nội sinh có khả năng kháng vi khuẩn
Staphylococcus aureus bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch.
Nội dung 2. Định danh một số dòng vi khuẩn nội sinh có hoạt tính
kháng khuẩn cao trên vi khuẩn Staphylococcus aureus bằng phương pháp giải
trình tự vùng gen 16S rRNA và xây dựng mối quan hệ di truyền của các dòng
vi khuẩn nội sinh.
Nội dung 3. Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus
của cao chiết ethyl acetate dịch nuôi vi khuẩn, gồm các nội dung sau:
Điều chế cao ethyl acetate của dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn nội
sinh.
Khảo sát hoạt tính kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus của cao ethyl
acetate bằng cách xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC (Minimum Inhibitory
Concentration) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC (Minimum Bactericidal
Concentration).
Nội dung 4. Xác định hoạt tính kháng oxy hóa in vitro của cao chiết từ
dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Diếp cá được tuyển
chọn.
Nội dung 5. Xác định hoạt tính kháng viêm in vitro của cao chiết từ
dịch ni tăng sinh dịng vi khuẩn nội sinh phân lập từ cây Diếp cá được tuyển
chọn.
3