Đánh giá khả năng ức chế tăng trưởng của một số dòng tế bào ung thư phổ biến bởi các dịch chiết vi khuẩn lam

Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II
Hà Nội - 2015

ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG ử c CHẾ TĂNG TRƯỞNG CỦA MỘT s ố DÒNG TẾ BÀO
UNG THƯ PHỔ BIẾN BỞI CÁC DỊCH CHIẾT VI KHUẨN LAM
Bùi Thi Thùv Dung \ Hà Hữu Cường
Hoàng Thị Mỹ Nhung

Trịnh Thị Loan \

Phạm Thị Lương Hằng *

* Trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
TÓM TẮT
Vi khuẩn lam là nguồn giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học với tiềm năng dược
phẩm có ý nghĩa quan ữọng. Trên thế giới, một số hợp chất và chất dẫn xuất tìr vi khuẩn lam
đã cho kết quả khả quan trong các thử nghiệm lâm sàng điều trị ung thư ở pha I và II như
Dolastatin 10, Curacin A, Cryptophycin-52... Từ tiềm năng dược liệu của vi khuẩn lam,
chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng ức chế của dịch chiết từ 10 chủng vi khuẩn lam lên sự
tăng trưởng của ba dòng tế bào ung thư (MCF7, HepG2, và HCT116) bằng mơ hình thử
nghiệm đơn lớp với thuốc nhuộm sulforhodamine B. Sinh khối khô của mỗi chủng vi khuẩn
lam được chiết lần lượt với ethyl acetate và methanol để thu được các dịch chiết ethyl acetate
và methanol tương ứng. Kết quả cho thấy, trong 20 dịch chiết tìr 10 chùng vi khuẩn lam chỉ
có các dịch chiết tị ba chủng APA4, APD4 và APA5 có tác dụng đối ức chế sự tăng trưởng
của dòng tế bào ung thư vú MCF7, đồng thời các dịch chiết tìr hai chủng APA4, APD4 cùng
và DL12 có tác dụng ức chế sự sống của dòng tế bào ung thư đại trực tràng HCTl 16. Tất cả
các dịch chiết từ 10 chủng này đều khơng có tác dụng ức chế đối với dòng tế bào ung thư
gan HepG2. Điều này cho thấy dịch chiết từ các chủng vi khuẩn lam có khả năng ức chế
chọn lọc đối với các dịng tế bào ung thư khác nhau. Đây là kết quả khả quan để chúng tôi
tiến hành sắc ký để phân lập các đơn chất có tác dụng kháng ung thư từ dịch chiết của 4
chủng vi khuẩn lam APA4, APD4, APA5 và DL12.

Từ khóa: Vi khuẩn lam, phương pháp sulíorhodamine B, mơ hình thử nghiệm đơn lớp,
APA4, APD4, CDL12
EVALUATION OF CYTOTOXICITY OF SEVERAL CYANOBACTERIA
EXTRACTS TO COMMON CANCER CELL LINES
SUMMARY
Cyanobacteria produces various types of bioactive compounds with anticancer,
antiviral, antibacterial, and antiíiingal activities... In the world, many compounds from
cyanobacteria and their analogues are found to be effective for cancer treaứnent at phase

36


Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược iần II
Hà Nội - 2015

I&II of clinical trial such as Dolastatin 10, Curacin A, Cryptophycin-52...Basing on this
pharmaceutical potential, we evaluated inhibitory activities of extracts from

10

cyanobacteria strains on 3 cancer cell lines (breast cancer MCF7, liver cancer HepG2,
colorectal cancer HCT116) by using the sulforhodamine B assay. Dried biomass of each
sừain was exữacted in ethyl acetate and methanol in order to gain ethyl acetates and
methanol extracts, respectively. The extracts from three cyanobacteria strains including
APA4, APD4, and APA5 could inhibit proliferation of MCF7 cells; moreover, the extracts
from two strains (APA4 and APD4) with CDL12 strain had cytotoxicity against HCT116
cells. None o f extracts from 10 strains could affect viability o f HepG2 cells. These results
indicate that the cyanobacteria extracts have selective activities to different cancer cell lines.
Thereíore, the extracts from APA4, APD4, APA5 and CDL12 sfrains will be used for
isolation of cytotoxic compounds by chromatographic methods.

Key vvords: Cyanobacteria, Sulforhodamine B assay, 2D culture method, APA4, APD4,
DL12.
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư là căn bệnh nguy hiểm hàng đầu trên thế giới với tỷ lệ mắc phải ngày càng tăng.
Theo số liệu báo cáo của Viện nghiên cứu quốc tế về ung thư, trong năm 2012, trên tồn thế
giới có hơn 14 triệu người bị chết vì các loại bệnh ung thư khác nhau. Các chun gia cảnh
báo nếu con người khơng sớm tìm được biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn tốc độ phát triển
như hiện nay của căn bệnh này, thi sau 20 năm nữa, mỗi năm ung thư sẽ cướp đi sự sống của
ít nhất 22 triệu người. Hóa trị và xạ trị từ lâu được xem là các phương pháp đặc trị ung thư,
tuy nhiên hai phương pháp này kéo theo những tác dụng phụ, ảnh hưởng xấu tới sức khỏe
người bệnh, người bệnh có thể tử vong trước khi tiêu diệt được tận gốc các tế bào ung thư.
Bởi vậy, việc tìm ra một loại thuốc đặc hiệu điều trị ung thư và an toàn với người bệnh là
một vấn đề vô cùng cấp bách và được quan tâm hàng đầu hiện nay. Trong cơng cuộc tìm
kiếm đó, các hợp chất tìr thiên nhiên được quan tâm nhiều hơn cả bởi chúng lành tính và tìr
xa xưa đã được xuất hiện trong những bài thuốc trị bệnh dân gian.
Cùng với xu hướng thế giới, tận dụng thế mạnh của một nước ẩm nhiệt đới với hệ thống
thực vật đa dạng phong phú, Việt Nam đang tìm kiếm và đã phát hiện ra nhiều loại thảo mộc
có tiềm năng trở thành thuốc điều trị ung thư. Và, việc tìm ra một loại thuốc có nguồn gốc từ
thiên nhiên an tồn cho người sử dụng, thân thiện với môi trường đang là một hướng đi tích
cực.

37


Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II
Hà Nội - 2015

Vi khuẩn lam là nguồn giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học với tiềm năng dược
phẩm có ý nghĩa quan trọng. Chúng cho thấy khả năng chống lại các khối u, kháng vims,
kháng khuẩn, kháng nấm[2,4,5,6,7]. Các hợp chất được phân lập và tiiứi sạch từ vi khuẩn

lam đã cho kết quả, bước đầu thành công trong frong các thử nghiệm khám và điều trị bệnh.
Các hợp chất này được xem là hợp chất tiên phong cho sự phát triển, tổng hợp các hợp chất
tương tự với hoạt tính sinh học tốt hom. Từ các tính chất tiềm năng của vi khuẩn lam, chúng
tôi tiến hành đánh giá khả năng ức chế sự sống các dòng tế bào ung thư của 10 chủng vi
khuẩn lam lên ba dòng tế bào img thư: ung thư vú ở người MCF7, ung thư gan HepG2, ung
thư đại trực ữàng HCT116 bằng mơ hình thử nghiệm đơn lớp sử dụng thuốc nhuộm
Sulforhodamine B (SRB) nhằm tìm ra chất mới có khả năng kháng lại xmg thư.

2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯOỈNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.ỉ. Đổi tượng
2.1.1. Dòng tế bào
- Dòng tể bào ung thư vú MCF7
- Dòng tế bào ung thư gan HepG2
- Dòng tế bào ung thư đại trực tràng HCT116
Cả ba dòng tế bào trên được cung cấp bởi trung tâm lưu trữ giống ni cấy Hoa Kỳ
(ATCC) và được bảo quản tại Nhóm nghiên cứu Ung thư học Thực nghiệm, bộ môn Sinh
học xế bào, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội
2.1.2. Vật liệu
Bảng 2.1. Các chủng Vi khuẩn lam được dùng trong thí nghiệm thử đánh giá độc tính
STT

C hất thử

STT

C hất thử

1

APA4- Met

11

APA5- Met

2

APA4- EtAc

12

APA5- EtAc

3

APD4- EtAc

13

APD3- Met

4

APD4- Met

14

APD3- EtAc

5

DL12- Met

15

TVN9- Met

6

DL12- EtAc

16

TVN9- EtAc

7

AHK7- Met

17

T202- Met

8

AHK7- EtAc

18

T202- EtAc

9

CN4- Met

19

APD3*- EtAc

10

CN4- EtAc

38


Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược ỉần II
Hà Nội - 2015

Dịch chiết tổng số các chủng vi khuẩn lam được cung cấp bởi Phịng thí nghiệm nuôi
cấy mô thực vật và vi tảo, bộ môn Sinh lí Thực vật và Hóa sinh, khoa Sinh học trường Đại
học Khoa học tự nhiên Hà Nội. Mười chín dịch chiết tổng số được thống kê trong bảng trên.
Các mẫu thử được cung cấp dưới dạng cao khô.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phtrơngpháp hoạt hóa tế bào
- Rã đơng tế bào tìr -196°c trong bể ổn nhiệt 37°c
- Ly tâm 1500 rpm trong 5 phút bỏ dịch nổi
- Hòa đều tế bào trong môi trường nuôi cấy mới, cho vào đĩa nuôi cấy đặt trong tủ ấm

37°c, 5% CO2

- Thay môi trường thưcmg xuyên từ 2-3 ngày/ lần
- Cấy chuyển khi mật độ tế bào đạt 70-90% bề mặt nuôi cấy bằng Trysin Ix trong 5
phút ờ 37°c, 5% CO2 . Xác định số lượng tế bào bằng buồng đếm Thomas.
2.2.2. Đảnh giá khả năng ức chế tăng sình tế bào
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng bộ kit The Sulforhodamine B (SRB) để đánh
giá độc tính của các chất thử nghiệm lên tế bào ung thư nuôi cấy.
Quy trình thực hiện:
- Tế bào sau khi nhân ni được bổ sung và các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng với
mật độ 5000 tế bào/giếng và nuôi cấy ổn định tại điều kiện 37°c, 5% C02, 95% không khí
trong 24h.
- Bổ sung các chất thử nghiệm và các giếng tế bào nói trên để đạt nồng độ các mẫu
thử nghiệm lần lượt là 200, 100, 50, 25, 5 ụg/ml. Mỗi nồng độ được lặp lại 4 lần.
- Sau 48h, các đĩa tế bào thử nghiệm được đo bởi máy đo ELISA ở bước sóng kích
thích 540nm.
Số liệu được OD thu được được xử lý, tính tốn bằng chưomg trình Excel và phần mềm
GraphPad Prism 6.1.

3. KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u
3.1. Kết quả hoạt hóa tế bào
Dịng tể bào ung thư vú MCF7 nuôi cấy trong môi trường RPMI, sau 24h hoạt hóa, tế
bào có dạng sao, chiếm 70-80% bám trên bề mặt đĩa ni cấy. Dịng tế bào HCT116 và
HepG2 được nuôi cấy trong môi trưèmg DMEM low, tể bào HCTl 16 có dạng dài, chiếm 7080% bề mặt đĩa ni cấy; tế bào HepG2 có xu hướng co cụm, các tế bào liên kết chặt với

39


Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II
Hà Nội - 2015

nhau. Cả ba dòng đều có các tế bào khỏe mạnh, sinh trưởng tốt, bám chặt vào bề mặt đĩa

nuôi cấy, môi ttuờng nuôi cấy sạch, không vẩn đục, bề mặt đĩa không nhiễm nấm móc.

Hình 3.1. Các dịng tế bào ung thư phục vụ cho thí nghiệm thử hoạt tính: MCF7,
HCT116, HepG2 (từ trái qua phải)
3.2. Kết quả đánh giá khả năng ức chế tăng sinh tế bào của các chủng Vi khuẩn lam
Dưới ảnh hường của chất thử có hoạt tính, tể bào bị ức chế khả năng sinh trường, phân
chia và có thể chết, biểu hiện khi tế bào khơng cịn dạng dài hoặc sao, bám trên bề mặt đĩa
mà co tròn và mất đi khả năng bám dính. Điều này được quan sát thấy ờ hai dòng tế bào
MCF7 và HCTl 16. Trong đó, MCF7 bị ức chế sự sống dưới tác dụng của ba chủng vi khuẩn
lam: APA4, APD4, APA5. Tương tự, 3 chủng có tác dụng ức chế sự sống dòng tế bào ung
thư đại trực tràng HCTl 16 đó là: APA4, APD4 và DL12.

Hình 3,2. Tế bào ung thư vú MCF7 dưới tác dụng của mẫu thử APD4- EtAc ở các nồng độ 400,
100 và 25Fig/ml (từ trái qua phải). Bar= 20fini.

Hình 3.3. Tế bào ung thư đại trực tràng HCT116 dưới tác dụng của mẫu thử APD4- EtAc ở các
nồng độ 400,100 và 25^g/ml (từ trái qua phải). Bar= 20^ni.

40


Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II
Hà Nội - 2015

Sau 48h thử nghiệm, tất cả các chủng vi khuẩn lam đều không thể hiện khả năng ức
chế tăng sinh với tế bào ung thư gan HepG2. Các tế bào giữ nguyên hình dạng, phân chia và
phát triển tốt.

Hình 3.4. xế bào ung thư gan HepG2 dưới tác dụng của APD4- EtAc ở các nồng độ 400,100 và
25^g/ml (từ trái qua phải). Bar= 20fỉin.

Kết thúc 48h thí nghiệm, chúng tơi tiến hành ủ tế bào với SRB để kiểm tra độc tính và
đo mật độ quang học (OD) ở bước sóng 540nm bằng máy Microplate Reader Model 680, sau
đó, chúng tơi sử dụng phần mềm Excel để tính tốn chỉ số tăng sinh A% tương ứng với mỗi
nồng độ thuốc thử. ở những mẫu thử có giá trị A% nhỏ hơn 50%, chúng tơi tiến hành dựng
đường cong đáp ứng liều và sử dụng phần mềm Graphad Pristn 6.1 để tính tốn giá trị ICsoGiá trị nồng độ thuốc thử tại đó có khả năng ức chế 50% sự sống của tế bào.

HCT116
1.0

APA4 ETAc
APD4- ETAc
A P D 4- M fl

APA4- Mft
D L lĩ Met

0.0

—I-----------1—
1.5

Z0
I.o g

c

—I—
2.5

—I

3.0

(|ig /inl)

Hình 3.5. Đường cong đáp ứng liều của các mẫu thử có giá trị A% <50% ở hai dịng tế
bào MCF7 và HCT116.
Giá trị ICso của các mẫu thử có hoạt tính được thống kê lại trong bảng. Tất cả các giá trị
đều có hệ số tưoTig quan

> 0.80, chứng tỏ kết quả thu được có độ tin cậy cao.

41


Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lần II
Hà Nội-2015

Bảng 3.2. Giá trị ICso thu được ở các mẫu thử có hoạt tính.
MCF7
ICso (Ịtig/ml)
91.4

Chất thử
APA4- EtAc

HCT116
IC5o(fig/ml)
109.2

R2
0.927

APA4- Met
APD4- EtAc
APD4- Met
APA5- EtAc
DL12- Met

R2
0.862

168.9

0.879

54.5

0.962

47.8

131.8
112.1

0.805

232.2

0.949

0.843

23.13

0.894

0.9759

Ngoài ra, để chứng minh kết quả thu được là hoàn toàn đáng tin cậy, trong thí nghiệm
này, chúng tơi có sử dụng đối chứng đương là Taxol, một chất đã được chứng minh có tác
dụng tiêu diệt tế bào ung thư và đã được sử dụng thương mại.
Bảng 3.3. Giá trị ICsocủa Taxol trên ba dòng tế bào MCF7, HCT116 và HepG2.
MCF7

HCT116

HepG2

ICso (^g/ml)

R2

IC50(ng/ml)

R2

IC5o(^g/ml)

R2

6.60

0.756

10.19

0.990

6.77

0.875

Taxol

4. KẾT LUẬN
Trong 10 chủng Vi khuẩn lam được đánh giá khả năng ức chế tăng sinh, có:
- Ba chủng có tác dụng ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thư vú MCF7, đó là: APA4,
APD4, APA5 với giá trị ICso thu được lần lượt là: 91.4^g/ml (APA4-EtAc), 54.5ng/ml
(APD4-EtAc), 131.8^g/Inl (APD4-Met), 112.1ng/ml (APA5-EtAc).
- Ba chủng có tác dụng ức chế tăng sinh dòng tế bào ung thư đại trực tràng HCTl 16:
APA4, APD4 và DL12 với giá trị ICsolần lượt là: 109.2fig/mi (APA4-EtAc), 168.9^g/ml
(APA4-Met), 47.8ng/ml (APD4-EtAc), 232.2ng/ml (APD4-Met), 23.13ng/ml (DL12Met).
- Tất cả 10 chủng này đề khơng có tác dụng ức chế đối với dòng tế bào ung thư gan
HepG2.

5. BÀN LUẬN
Từ 10 chủng Vi khuẩn lam được đánh giá hoạt tính, có ba chủng có tác dụng ức chế
khả năng tăng sinh tế bào ung thư vú MCF7, ba chủng có tác dụng ức chế khả năng tăng sinh

42

Hội nghị Khoa học Công nghệ Tuổi trẻ Khoa Y Dược lăn II
Hà Nội - 2015

6. Le,

T.T.A.

(2010),

“Chemical

and

Biological

Investigations

of

Vietnamese

Cyanobacteria”, Emst Moritz Amdt- Universitat Greifswald
7. Pham, H.T.L. (2007), “Bioassay- guided isolation o f cytotoxic and antiíungal compounds
from cyanobacteria”, Emst Moritz Amdt- Universitat Greifswald.
8. Satoshi Nakayama, Y.T., Takeshi Takahashi, Tomokazu Yoshida, Tamotsu Sudo, Tomoko
Matsushima, Yuko Kawasaki, Aya Katayama, Keigo Gohda, Gabriel N Hortobagyi,
Shũizaburo Noguchi, Toshiyuki Sakai, Hideki Ishihara and Naoto T. (2009)," Prediction of
paclitaxel sensitivity by CDKl and CDK2 activity in human breast cancer cells", Breast

Cancer Res.
9. Sulforhodamine B,VitroVivo Biotechnology
10. Vanicha Vichai, Kanyavvim Kirtikara, (2006), “Sulforhodamine B colorimetric assay for
cytotoxicity screening”, Nature Protocoỉs, pp. 1112-1116
11.Wenlong

Fang,

Songtao

Liu,

Yinglam

Nie,

(2011),

“Anticancer Activity of

Chamaejasmine - Effect on tubulin protein”, Molecules, 16, pp. 6243- 6254.
Wiegand, c ., and Pílugmacher, s. (2005). Ecotoxicological effects of selected

12.

cyanobacterial secondary metabolites a short review. Toxicol. Appl. Pharmacol. 203, 201218.

44