Nghiên cứu biểu hiện dấu ấn insulin trong quá trình nuôi cấy biệt hóa tế bào gốc màng ối thành tế bào beta tụy đảo

NGHIÊN CỨU BIÊU HIỆN DẤU ẤN INSULIN TRONG QUÁ TRÌNH NI CẮY
BIỆT HĨA TÉ BÀO GỐC MÀNG ĨI NGƯỜI THÀNH TÉ BÀO BETA T Y ĐẢO
ThS. N guyễn Văn T ần g*
H ư ớng dẫn; TS. Phạm Văn Trân**

TÓM T T
Mục tiêu nghiên cứu:

1

ỉ .Nghiên cứu quy tr nh phân iập, bào quản và nuôi cấy tế bào gốc (TBG) màng ổi người.
2.Biệt hóa TBG màng ối người thành tế bào beta tụy đảo có khả năng biểu hiện dấu ấn insulin.
Phương pháp nghiên cữu:
Tách tế bào bằng enzym trypsin, ni cấy định hướng biệt hóa bằng mơi trường DMEM có bổ sung Nicotinamide,
p­mercaptoethanol và các yếu tố sinh trưởng. Xác định tính gốc của TBG bằng dấu ấn OCT­4 và xác định khà năng biệt
hóa thành tế bào beta tụy đảo bằng dấu ấn insulin.
Kết quả nghiên cứu:
Quy tr nh tách phân lập TBG từ màng ối đạl hiệu quả cao, dấu ấn insulin được xác định bằng kỹ thuậ£ RT­PCR tăng
dần theo thời gian nuôi cấy.
Kểt luận:
TBG tách từ màng ối có thể ni cấy định hướng biệt hóa thành tế bào beta tụy đảo để phục vụ cho nghiên cứu và
điều trị.
* Từ khóa: Tê bào gốc; Màng ối; Tế bào beta tụy đảo.

E x p r ssio n o f in su lin m a rk rs in th p ro c ss o f sp c m lzin g a n d cultu rin g st m c ils
fr o m h u m a n a m n w tic m m bran into b ta c ils
Summ ary
Research objectives:
­ To study process of isolating, preserving and culturing stem cells from human araniotic membrane.
­ To differentiate stem cells from human amniotic membrane into beta cells with the ability of expressing insulin
markers.

Research methodology: Isolating stem cells by enzyme trypsin, culturing them in specialized orientation in DMEM
added to Nicotinamide, B­mercaptoethanol and other growth factors. The origin of stem cells was determined by OCT­4
and specialized abilities into beta cells by insulin markers.
Results: Protocol for isolating stem cells from amniotic membrane achieved high efficiency, insulin which was
determined by RT­PCR technique increase gradually according to culturing time.
Conclusion: Stem cells isolated from amniotic membrane can differentiate into beta cells to serve for study and treatment.
* Key words: Stem cells; Amniotic membrane; Beta cells.
I.Đ Ặ T V Ấ N Đ Ề
Tế bào gốc là những tể bào có tiềm năng phát triển, tự làm mới và có thể biệt hóa thành những loại
tế bào b nh thường khác nhau củ a c ơ thể. T ừ TB G có thể b iệt hoá thành nhiều loại tế bào chuyên biẹt
để điều trị các bệnh như: Đ ái tháo đường tý p 1, đột quỵ não, nhồi m áu cơ tim , chấn thương tu ỷ sống
bòn g và nhiều bệnh khác. Cho tớ i nay, b iện pháp hữu hiệu nhất để điều trị những trường hợp này ỉà
ghép mô, cơ quan ­ nhưng nhu cầu ghép lại cao hơn rất nhiều so với nguồn cung cấp.
* Cao đẳng Y tể Thanh H a
** Học viện Quân y

568


M àng ối là sản phẩm thường bỏ đi sau quá tr nh sinh nở, chứa một số ỉượng tiềm năng các TBG gọi
là TB G màng ối. Đ ây là TB G đa tiềm năng có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau,
trong đó, có tê bào beta tụy đảo [6].
V vậy, chúng tôi tiến hành đề tài này nhằm:
­ Nghiên cứu quy trình phân lập, bảo quản và nuôi cậy TBG màng ối người.
- Biệt hóa TBG màng ầ người thành tể bào beta tuy đảo có khả năng b iầi hiện dấu ẩn ừtsuUn.

II. ĐỔI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u
2.1. Đối tượng nghiên cửu
Màng ối và TB G m àng ối được lấy từ các sản phụ mổ đẻ có kế t quả âm tín h với H IV, HBV, HCV
và giang mai tại K hoa sản ­ Bệnh viện Quân y 103 ­ Học viện Q uân y.

2.2. P hư on g p h áp nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả thực nghiệm in vitro. Nghiên cứu được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu Y Dược
học quân sự, Học viện Quân y.
2.3. Các quy trình kỹ thuật
2.3.1. Kỹ th u ậ t p h â n lập
Các TBG được phân lập từ màng ối bằng kỹ thuật sử dụng enzym phân cắt mô (Trypsin, Hyaluronidase và
CoUagenase B 0,1%) phối họp vói các biện pháp cơ học.
2.3.2. Quy trình ni c y tăng sinh số lượng và biệt hóa TBG màng ối người thành tế bào p tụy đảo
Nuôi cấy tăng sinh
TBG màng ối được nuôi cấy ữong môi trường DMEM có bổ sung thêm penicillin (50 Ư/mỉ), streptomycin
(50 Jig/ml),_L­glutamin (2 X 10’3M ), huyết thanh bào thai bê (10%), hai ngày thay môi trường một lần để loại
bỏ những tế bào chết và cung cấp chất dinh dưõng đồng thời cấy chuyển tế bào 2 tuần một lần để duy tr trong
phịng thí nghiệm.
N i cấy biệt hóa T B G màng ối thành tế bào be ta tụy đào (B eta cells).
Sử dụng tế bào P2 (passage 2) để biệt hóa TBG màng ối thành tế bào beta tụy đảo. Ni cấy tăng sinh trong vịng
7 ngày. Quan sát thấy tế bào bao phù kín đĩa ni cây. Sau đó, bổ sung vào mơi trường cơ bản các yếu tố định hưóng
biệt hóa TBG màng ối thành tê bào beta tụy đảo bao gồm 10 mM nicotinamide, 55 (iM B~ mercaptoethanol, ỉ mmol
natri pyruvat [2,3]. Thu hoạch tế bào vào ngày thứ 1 (N l) ngày thứ 7 (N7) và ngày thứ Í4 (N14) sau khi bổ sung
yếu tố biệt hóa vào mơi trường ni cấy.
Đánh giá két q uả biệt hóa T B G màng ối thành tế bào b eta tụy đảo bằng giảm dấu ấn T BG (OCT­4,
xác định bằng W estern blot) với sự xuất hiện và tăng dấu ấn củ a tế bao b eta insulin ở cả mức độ
protein (định iượng theo phươ ng pháp hóa m iễn d ịch phát quang) và m ức độ A R N tt (RT­PCR).
2.3.3. Các kỹ thuật khác
­ Xác định khả năng b iệt h a bằng định lượng nồng độ insulin trong dịch ly giải tế bào: Định
lượng nông độ insulin theo phương pháp m iên dịch điện hóa ph át quang sử dụng kit (A bbott) Erên máy
m iễn dịch tự động hoàn toàn A sxym (Abbott).
­ K ỹ th uậ t W st rn blot: X ác định biểu hiện protein trong địch ly giải tế bào.
­ Phư ng ph á p điện h a p h á t quang định lượng insulin: Định lượng insulin trong nghiên cứu này
sử dụng phương pháp m iễn dịch điện hóa phát quang sử dụng k ít của hãng A bbott trên máy Asxym.
r a . K Ế T QUẢ

3.1. K ết q u ả p h â n lập
­ M àng ối sau khi bồc tấch được rử a sạch bằng dung dịch PBS IX , các T B G m àng ối được phân lập
theo quy tr nh.
­ Chúng tôi đã lựa chọn được môi trường phân lập TBG màng ối người. Chọn được môi trường tối ưu là Trypsin
0,25% + Coliagenase B 0,1% thể hiện trong bảng 1.

569


Bảng 1. Thòi gian tác .đụng của enzym phân cắt mô
STT

T ên enzym

T h ời g ian làm tan r ã m àn g ếỉ (phứt)

1

Trypsin 0,25%

45 ± 10

2

Collagenase B 0 ,ỉ%

5 0 + Ỉ0

3

Trypsin 0,25% + Collagenase B 0,1% (1:1)

20 ± 1 0

4

Hyaluronidase 0,6%

Không tác đụng

Sau khi lựa chọn môi trường tối ưu, chúng tôi tiến hành phân lập và sau đó ni cấy tế bào màng
ối vừa phân lập trên đĩa nuôi cấy với môi trường DM EM . Sau 24 giờ, các tế bào bám dính vào bề mặt
đáy đĩa ni cấy, các TBG màng ối có h nh thoi, kích thước trung binh. Sau 24 giờ phân lập thu được
h nh ảnh TBG từ màng ối nh ư h nh 1.

H nh 1. Ảnh TBG m àng ối sau 24 giờ phân lập. (Chụp từ kính hiển vi đối pha, X 200)
3.2. K ết q u ả nuô i cấy tă n g sin h T B G m àng ổi ngưịi
TBG được ni cấy trong đĩa plastic đường kính 10 cm, với mơi trường DMEM high glucose có thêm 10%
FBS + 1% Peniđỉỉine­Streptomycme + ĩ % L­glutamat, trong tủ nuôi cấy HEPA­NƯAĨRE ở 37°c, không khí
có 5% C 0 2, độ ẩm bão hịa như đ ã mô tả ưong phàn đối tượng và phương pháp nghiên cứu. Kết quả nuôi cấy
và môi trường nuôi cấy cũng tương tự như kết quả của các nghiên cứu khác (hình 2).

H nh 2. H nh ảnh tế bào chụp trực tiếp trên đĩa ni cấy qua kính hiển vi đối pha. A: Sau 2 ngày nuôi cấy.
B: Sau 14 ngày nuôi cấy
N gaỵ sau khi nuôi cấy 24 giờ, các TBG m àng ối có xu hướng bám dính vào bề mặt đĩa ni cấy
phát triển thành những cụm tế bào h nh đa diện hoặc h nh thoi và có kích thước trun g b nh. Sau 2 tuần
nuôi cây, m ật độ tế bào phát triển bao phủ khoảng 50 ­ 60% bề mặt^ổĩa nuôi cấy

570

3.3. Biểu hiện d u n sinh học trong quá trình nuối c y
3.3.1.

Biểu hiện của O CT-4 - d u n của TBG

Trái với đấu ấn insuỉỉn, nồng độ ARNtt OCT­4, dấu ấn TBG giảm dần theo thời gian trong nhóm được ni cấy
trong mơi trường có bổ sung nicotinamid và 8­mercaptoetanol. H nh ảnh hóa miễn dịch tế bào ngày thứ 14 rất ít tế
bào cịn biểu hiện OCT­4.

OCT-4 H 5 kDa)
Act n

►

a

A

c

B

H nh 3. A. H nh ảnh TBG màng ối ngirời sau 7 ngày nuôi cấy. B. N huộm hóa miễn dịch tế bào với OCT­4,
màu xanh lá OCT­4, m àu xanh tím nhu ộm nhân bằng DAPĨ, c. H nh ảnh w estern blot phát hiện OCT­ 4
protein của TBG màng ối trong quá tr nh biệt hóa thành tế bào p tụy đảo. Lượng protein OCT­ 4 giảm
dần trong quá tr nh biệt hóa. p ­ actin là protein nội chứng cho thấy lượng protein tỷ số như nhau.
Nồng độ p rotein O CT ­4, dấu ấn TBG giảm dàn theo thời gian củ a nhóm đựợc ni cấy trong mơi
trường có bổ sung n icotinam id v à p­m ercaptoethanol. H nh ảnh w estern blo t cho thấy O CT­4 giảm
dần theo thời gian, trong quá tr nh b iệt hóa.

3.3.2. Biểu hiện của Insulin - D u n TBG màng ối người biệt hóa thành tế bào p íụy đảo

3,5
Xi
ÍJ
e l

if

i

iNhómchứng ■Nhỏmbìệt hỏâ

2.5

3.5­1

ló m b iệt ó a

3.25

2.5'ì ­

jp s

'ễ S

i5 -

‘ủ

ọẹ
>s«

i ­

Ngày 1
Ngày 2
Ngày 14
Thời gian ni cấy
H nh 4. Đ ồ thị nồng độ ARNtt của insulin so với
nhóm chứng

Ngày 1

Ngày 7
Thời gian nuôi cấy

Ngày 14

H nh 5. Đồ thị nồng độ của insulin so với
nhóm chứng

Có sự biệt hóa của TB G m àng ối người thành tế bào b eta tụy đảo. S au 7 ngày nuôi cấy trên đĩa
plastic thấy nồng độ A R N tt của insuỉin (xác định bằng RT­PCR) không tăng. Sau 14 ngày nuôi cấy

571


trên plastic, trong nhóm có bổ sung trong mơi trường nuôi cấy N icotinam ide và p ­ M ercaptoetanol
thấy tăng cao insulin. K ết q uả định lượng protein insulin cũng phù hợp với kế t qu ả định lượng ARNtt.

K ết quả hóa m iễn dịch tế bào thấy TB G biểu hiện rõ nét insulin trong nhóm được xử lý vói nicotinamide và
p­mercaptoethanol.
IV . BÀN LƯẶN
4.1. Quy trình phân lập
T ừ những k ết quả đạt được về phân lập T BG từ m àng ối bằng các enzym chúng tô i nhận thấy:
Nếu chỉ phân cắt màng ối bằng Trypsin th số lượng tế bào thu được thấp và thịi gian thường phải kéo dài, có khi
60 phút các tế biểu mô màng ối mới bị phân cắt hết.
N ếu cho thêm enzym co llagenase B vào T rypsin với tỷ ỉệ 1:1 th số lượng tế bào thu được sẽ nhiều
hơn và thời gian tan rã m àng ối sẽ nhanh hơn (bàng ĩ).
Chúng tôi sử dụng tryp sin và collagenase B để làm tan rã m àng ối giải phóng tế bào. S ờ d ĩ sử dụng
trypsin trong quá tr nh phân lập v trypsin là enzym protease có khả năng phân giải protein ngoại bào
tương tự như collagenase. N goài ra, các enzym này hầu như khơng có tác đụng trên màng tế bào do cấu trúc
đặc biệt của màng tế bào.
4.2. Bảo q u ản v à nuôi cấy tă n g sinh TB G m àng ối
Khi bảo quản màng ối và TBG màng ối trong glycerol ở 4°c, các tế bào sẽ chết tồn bộ. Bảo quản đơng

lạnh với dimethyl sulphoxide (DMSO) ở nhiệt độ -80°c cho phép giữ lại tới 50% tế bào sống trong vài tháng
[7]. M ột số yếu tố sinh trưởng và cytokine bị mất trong quá tr nh này [5,7 ]. Tuy nhiên, khi bảo quản màng ối
trong dung dịch glycerol 50% khả năng sống của tế bào khơng cịn [5]. Nh n chung, khả năng sống của tế
bào trên màng ối phụ thuộc vào môi trường bảo quản, nhiệt độ.
4.3. Biểu hiện của d u n insulin trong q trình bỉệt hóa TBG màng ối thành tế bào p tụy đảo
Trong nghiên cứu của chúng tôi, sau 7 ngày nuôi cấy trên đĩa plastic thấy nồng độ ARNtt của insulin (xác
định bằng RT­PCR) không tăng. Sau 14 ngày nuôi cấy trên plastic, trong nhóm có bổ sung trong mơi trường
ni cấy nicotinamide và B­mercaptoetanol thấy tăng tổng hợp ARNtt của insulin.
v ề h nh thái, tế bào tron g nhóm chứng được ni cấy trong m ôi trường cơ bản DM EM vẫn đuy trì
h nh thoi tương tự như các TBG màng ối b an đầu. Trong khi té bào định hướng b iệt hóa thành tế bào
beta tụy đảo, dần biến đổi h nh thái. Sau 2 ­ 3 ngày, các tế bào bám dính tố t vào bề m ặt đĩa nuôi cấy,
phát triển nhưng chưa th ấy thay đổi h nh thái. Các tế bào vẫn ph át triển h nh thoi giống như tế bào
ban đầu. Đ iều này chứng tỏ, ở mật độ thấp, khi các tế bào chưa tiếp xúc với nhau, th các tế bào vẫn
chưa biệt hóa mặc dù đã có các cytokin định hướng biệt hóa. T ới ngày thứ 14, phần lớn tế bào có h nh

đa diện, h nh dạng điển h nh của tế bào biểu mô tuyến khi nuôi cấy.
Q uá tr nh biệt h óa T B G thành tế bào b eta tụy có thể chia thành hai giai đoạn: G iai đoạn biệt hóa
chức năng, tức là giai đoạn m à các TB G bắt đầu biểu hiện các d ấu ấn đặc hiệu của tế bào tụy. Giai
đoạn thứ hai là giai đoạn biệt hóa v ề h nh thái, các tể bào tụy sắp xếp tạo thành tiểu đảo Langerhans
và h nh thành các cấu trúc h nh thái củ a tụy. Chóng tơi đùng k ỹ th uật phân tử để xác định các tế bào
đó có biểu hiện của các dấu ấn tế bào tụy hay không. Trong khuôn khổ củ a đề tài, chúng tôi chỉ xác
định dấu ấn sinh học cù a tể bào b eta tụy đảo là insulin v đây à loại tế b ào tiết insulin. S ở d ĩ chúng tôi
chọn đấu ấn này v insulin có biểu hiện cả ở TB G và tế bào tụy với mức độ khác nhau. Khi TB G biệt

572


hóa thành tế bào tụy th biểu hiện củ a insulin tăng lên. N hư vậy, khi tế bào tăng sản xuất insulin có
thể nói về chức năng, T B G đã trờ th ành tế bào có chức năng cùa tế bào tụy.
Qua cả h nh thái và sự biểu hiện của dấu ấn sinh học đã chứng tỏ các TBG màng ối đã cósựbiệt hóa
thành tế bào tụy. Nghiên cứu của chúng tôi cũng phù họp với các tác giả khác [4, 8].
V. K Ế T LUẬN
5.1. Phân iập , đ in h d anh , nuôi c y tăn g sin h và bảo quản TB G m àng ối người
­ Đã phân lập thành công TBG từ màng ối người bằng môi trường tối ưa trypsin 0.25% + Coliagenase
B 0.1%.
­ Nuôi cấy tăng sinh cá c T B G m àng ối người. Bảo quản được TB G m àng ối người thành công.
Không khác biệt về khả năng sống và bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy của tế bào.
5.2. B iểu hiện d u

n in su lin tron g q trình ni c y

­ Đã biệt hóa được tế bào có chức năng của tế bào beta tụy đảo từ T B G m àng ối người.
­ B iểu hiện được A R N tt của insulin chứng tỏ có sự biệt hóa củ a TB G m àng ối người thành tế bào
beta tụy đảo.
T À I L IỆ U T H A M K H Ả O

[Ỉ . Nguyễn Mạnh Khánh, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Tiến Bình, Lý Tuấn Khải, Trư ng Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Thanh
Bình, Ngơ Văn Tồn (2007), “Ghép TBG tự thân điều trị khớp già thân xương chày5'. TCNCYH Phụ trư ng 5 /. (4)/2007): 4 ­ 8

[2]. Bhandarỉ, D.R., t al. (1997), The simpliest method for in vitro beta­cell production from human adult stem
cells. Diff r ntiation. 82(3): pp. 144 ­ 452.
[3]. Furth, M.E. and A. Atala. (2009) Stem cel sources to treat diabetes. J C ll Bioch m. 106(4): pp. 507 ­511.
[4]. G lling, R.W., t a l (2003), Lower blood glucose, hyperglucagonemia, and pancreatic alpha cell hyperplasia in
glucagon receptor knockout mice. Proc Natl Acad Sci USA. 100(3): pp. 1438­ 1443.
5]. Hao, Y., t a l (2000), Identification of antiangiogenic and anti­inflammatory proteins in human amniotic
membrane. Corn a. 19(3): pp. 348 ­ 352.
[6]. Koik , T., t a t (1999), Cultured epithelial grafting using human amniotic membrane: the potential for using
human amniotic epithelial cells as a cultured oral epithelium sheet. Arch Oral Biol. 56(10): pp. 1170 ­ 1776.
[7 . Kubo, T., t al. (2001), Time­sequential changes in biomechanical and morphological properties of articular
cartilage in cryopreserved osteochondral allografting. J Orthop Sci. 6(3): pp. 276 ­ 281.
[8 . Ma da, H., t al. ( 2004), Epidermal growth factor and insulin inhibit cell death in pancreatic beta cells by
activation of PI3­kinase/AKT signaling pathway under oxidative stress. Transplant Proc. 36(4): pp. 1163 ­ 1165.

573