Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng phân giải độc tố cảu một số chủng microcystis phân lập ở hồ hoàn kiếm hà nội

đại học quốc gia hà nội
VIệN VI SINH VậT Và CÔNG NGHệ sinh học
-----o0o-----

BO CO TI C BIT CP HQG
đề tài nghiên cứu khoa học 2007-2008

NGHIấN CU C IM SINH HỌC VÀ KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI
ĐỘC TỐ CẢU MỘT SỐ CHỦNG Microcystis PHÂN LẬP Ở HỒ
HOÀN KIẾM, HÀ NỘI

Mã s: QG.07.24

Chủ trì đề tài : Nguyễn Thị Hoài Hà

Hà néi - 2008


BÁO CÁO TÓM TẮT

1. Tên đề tài
Nghiên cứu đặc điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một
số chủng Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội
2. Các thành viên tham gia đề tài
Chủ trì đề tài
- Họ và tên: Nguyễn Thị Hồi Hà
Các thành viên:
Lƣu Thị Thùy Giang
Nguyễn Quang Huy
Lê Trung Thủy
Phạm Thị Bích Đào

Trần Thị Điệp
3. Tóm tắt tổng quan của đề tài
Trong những năm gần đây Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kéo
theo đó là sự ơ nhiễm hàng loạt thủy vực nội thành và vùng lân cận. Hồ Hồn Kiếm
một địa danh nổi tiếng của thủ đơ cũng bị ô nhiễm. Chất lƣợng nƣớc thay đổi dẫn
tới sự phát triển thƣờng xun và khơng bình thƣờng của vi khuẩn lam, làm biến đổi
cấu trúc thành phần loài của hệ vi tảo trong hồ. Sự suy giảm một số loài vi tảo đặc
hữu đồng thời với sự gia tăng thành phần loài và mật độ của vi khuẩn lam gây độc ở
hồ Hoàn Kiếm đã đƣợc cảnh báo và gây nên những lo ngại về môi trƣờng cho khu
hệ động thực vật sống trong hồ.
Trong số các loài vi khuẩn lam gây nở hoa nƣớc hồ Microcystis aeruginosa
Kutzing là loài bị bắt gặp thƣờng xuyên và phổ biến nhất M.aeruginosa chứa độc tố
thuộc nhóm hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ các peptid mạch vịng có tên gọi là


microcystin.. Microcystin là chất ức chế đối với enzyme protein phosphatases
(nhóm PP1 và PP2A) [30]. Độc tố cũng gây ảnh hƣởng xấu lên hai loại protein
serine và threonin phosphatases. Đã có một số bài báo chứng minh hiện tƣợng nƣớc
nở hoa của vi khuẩn lam gây hại tới sinh vật thủy sinh, động vật và con ngƣời.
Microcystin thƣờng tích luỹ trong nội quan tế bào hoặc dƣới dạng tự do trong nƣớc.
Đã có khơng ít các cơng trình nghiên cứu hiện tƣợng nở hoa nƣớc và giảm thiểu tác
hại của độc tố vi khuẩn lam gây độc, tuy nhiên kết quả vẫn còn ở các mức độ khác
nhau. Để bảo vệ môi trƣờng nƣớc hồ, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu đặc
điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một số chủng Microcystis
phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội.
4. Mục tiêu của đề tài
* Phân lập, định tên, nuôi cấy và lƣu giữ đƣợc các chủng vi khuẩn lam
Microcystis trong Bảo tang Vi tảo của Phịng Cơng nghệ Tảo và Sinh học Môi
trƣờng - Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học - ĐHQGHN.
* Thăm dò khả năng phân giải độc tố của chúng bằng vi khuẩn.

5. Tóm tắt nội dung nghiên cứu của đề tài
-

Phân tích thành phần thuỷ lý, thuỷ hố của nƣớc hồ Hồn Kiếm tại

thời điểm thu mẫu.
-

Phân lập, thuần khiết và nghiên cứu các điều kiện ni cấy thích hợp

của các chủng Microcystis.
-

Phân loại đến lồi các chủng Microcystis tuyển chọn đƣợc.

-

Tách chiết và phân loại độc tố của các chủng Microcystis trên máy sắc

ký lỏng cao áp (HPLC).
-

Thăm dò khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam gây

độc bằng vi khuẩn bản địa (vi khuẩn nƣớc).
6. Kết quả chính của đề tài


- Hồ Hồn Kiếm đang ở tình trạng ơ nhiễm, hàm lƣợng COD, BOD vƣợt
tiêu chuẩn Việt Nam, TCVN 4942- 1995 (loại B) 20 lần. Với giá trị NH4+ từ 0,1290,699 (mg/l), NO2- từ 0.012- 0,05 (mg/l), NO3- từ 0,047- 0,129 (mg/l), PO43- từ

0,08- 0.64 (mg/l) chứng tỏ hồ có hàm lƣợng dinh dƣỡng N, P khá cao.
- Đã phân lập thuần khiết và nuôi cấy 10 chủng vi khuẩn lam thuộc chi
Microcystis theo phƣơng pháp của Shirai có cải tiến. Môi trƣờng thạch agarose B12
với tỷ lệ 0,4% là mơi trƣờng thích hợp nhất cho việc phân lập Microcystis.
- Các chủng Microcystis đều sinh trƣởng tốt trên môi trƣờng Bold 3N với số
lƣợng tế bào đạt từ 32,94 – 68,6 ×106 tế bào/ml sau 15 đến 19 ngày ni cấy. Đặc
biệt chủng LT2 số lƣợng tế bào đạt cao nhất là 68,6 ×106 tế bào/ml sau ngày thứ 19.
Trên môi trƣờng J, các chủng Microcystis sinh trƣởng số lƣợng tế bào của các
chủng đạt từ 40,42 – 76,46 ×106 tế bào/ml sau 15 đến 19 ngày nuôi cấy. Trong đó
chủng LT2 vẫn phát triển với số lƣợng tế bào đạt cao nhất 76,46 × 106 tế bào/ml sau
ngày thứ 19. Trên môi trƣờng B12, số lƣợng tế bào đạt từ 35,36 – 54,78 ×106 tế
bào/ml sau 12 đến 15 ngày nuôi cấy. Ở môi trƣờng này chủng LT8 phát triển với
mật độ tế bào đạt cao nhất 54,78 ×106 tế bào/ml sau ngày thứ 15.
- Có 7 loại axít béo không no dạng C15, C17 và C19 trong tế bào 2 chủng
Microcystis LT2 và LT8. trong đó thành phần axit palmitic (C16H32O2) chiếm lƣợng
lớn nhất với 1,302 μg/mg trọng lƣợng khô ở chủng LT2, chủng LT8 là 0,9683
μg/mg trọng lƣợng khơ. Kết quả cho thấy có sự sai khác nhau về lƣợng của 7 loại
axit béo có ở trong tế bào 2 chủng LT2 và LT8.
- Dựa vào phƣơng pháp phân loại truyền thống theo phân loại hình thái học
và phƣơng pháp phân loại hiện đại dựa trên phân tích trình tự rADN 16S, 2 chủng
vi khuẩn LT 2, LT8 đƣợc xác định là Microcystis aeruginosa, 2 chủng vi khuẩn
nƣớc N4 và N7 đƣợc xác định thuộc các loài Sphingomonas mali và Sphingomonas
asaccharolytica
- Dựa vào kết quả phân tích trên HPLC, hàm lƣợng độc tố MC – RR đạt lớn
nhất là 512,8 ng/mg trọng lƣợng khô, độc tố MC – YR là 236,8 ng/mg và thấp nhất
là độc tố MC – LR: 114,25 ng/mg.


- Hai chủng vi khuẩn Sphingomonas tuyển chọn đƣợc có khả phân giải
microcystin khá nhanh. Ở nồng độ microcystin 3 µg/l thời gian bán phân giải là

1,34 giờ và với nồng độ 20µg/l, thời gian là 3,43 giờ.
- Nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của các chủng vi khuẩn
Sphingomonas mali N4 và Sphingomonas asaccharolytica N7 là 30°C. Sau 7 ngày
sự phân giải gần nhƣ hoàn toàn là 100%.
7. Các cơng trình cơng bố và sản phẩm đào tạo
 Cơng trình cơng bố
- Phạm Thị Mai, Phạm Tiến Đức, Vũ Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Hoài Hà
2008. Đánh giá sự biến động số lượng theo mùa và theo tầng nước của vi khuẩn
lam Microcystis aeruginosa ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội, Tạp chí Khoa học Đại học
Quốc gia Hà Nội. Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 24 số 15, tr 125 – 128.
- Phạm Thị Mai, Phạm Tiến Đức, Vũ Thị Lan Anh, Nguyễn Thị Hoài Hà
2008. Tìm hiểu khả năng phân giải độc tố của vi khuẩn lam Microcystis trong hồ
Hoàn kiếm bằng vi khuẩn. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội. Khoa học
Tự nhiên và Công nghệ 24 số 15, tr 119 – 122.
 Đào tạo 4 Cử nhân
- Bƣớc đầu phân lập, tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân
giải độc tố của vi khuẩn lam Microcystis ở hồ Hồn Kiếm, Hà Nội. 2007. Khố
luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy của Đặng Thị Kim Anh.
- Bƣớc đầu đánh giá khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam
Microcystis aeruginosa bằng vi khuẩn Sphingomonas. 2008. Khố luận tốt nghiệp
hệ đại học chính quy của Nguyễn Thị Hoài.
- Khảo sát sự biến động theo mùa của vi khuẩn lam Microcystis aeruginosa ở
hồ Hoàn Kiếm và khả năng ức chế sinh trƣởng của chúng bằng dịch chiết vỏ chuối,
vỏ quýt. 2009. Khoá luận tốt nghiệp hệ đại học chính quy của Lê Thị Trang.
- Phân lập, nghiên cứu một số đặc tính của tảo độc Microcystis tách chiết độc
tố và thăm dò biện pháp xử lý.2009. Đồ án tốt nghiệp của Nguyễn Hữu Hiếu


 Đào tạo 1 Thạc sỹ
Phân giải tế bào Microcystis và sự phân huỷ độc tố microcystin bằng vi

khuẩn nƣớc 2007 - 2009.
Những đóng góp của đề tài:
- Là cơng trình đầu tiên tách và lƣu giữ đƣợc chủng vi khuẩn lam
Microcystis.
- Phân lập đƣợc 2 chủng vi khuẩn thuộc chi mới Sphingomonas có khả năng
phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam Microcystis.
- Xây dựng đƣợc quy trình tách chiết độc tố microcystin.
8. Tình hình sử dụng kinh phí của đề tài
- Kinh phí đƣợc cấp: 100 000 000 đồng
- Kinh phí thực hiện: 100 000 000 đồng

Hà Nội , ngày 18 tháng 10 năm 2008
Chủ trì đề tài

Thủ trƣởng đơn vị
(ký tên, đóng dấu)

TS. Nguyễn Thị Hồi Hà


ABSTRACT OF PROJECT

1. Title of the project: “Study on biological characteristis and capacity of
biodegradation toxin of some Microcystis isolated from Hoan Kiem Lake, Hanoi”
2. Coodinator: Nguyen Thi Hoai Ha
Member:

Luu Thuy Giang
Nguyen Quang Huy
Le Trung Thuy

Pham Thi Bich Dao
Tran Thi Diep

3. Introduce
Hoan Kiem Lake is a famous place because of its historical and cultural
value. This is the habitat of valuable and rare species with endemicity and is also
diversifying about the component of microalgae species. In recent years, the
socioeconomic developmental process caused a lot of influences on the lake
ecosystem especially on water quality. Mesotrophic situation of this lake resulted in
the bloom water reducing specific microalgae species and concurrently increasing
the species component and density of toxic algae. Among toxic cyanobacterial
genera, Microcystis accounts for highest population (approximately 80% of total
cyanobacterial strains that cause the bloom water). Microcystis aeruginosa Krutzing
is the most popular species. This is a species which produces hepatotoxin, a type of
liver toxin, composed from cyclic peptides called microcystin.
They have effect on both animals and plants in waters. microcystin usually
accumulates in cells or releases to surrounding waters. Thus the research on toxic
cyanobacteria Microcystis in Hoan Kiem lake, Hanoi and finding effective methods
to diminish their negative effects are essential. In this report, we describe the


isolation, selection and classification location as well as biological characters of
some Microcystis strains from Hoan Kiem lake, as a basic for the next researches.
4.The airm of project
- Isolation, identification, inoculation and maitainance of Microcystis strains
(blue-green, Cyanobacteria) at Microalgal Technology and Enviromental Biology
Lab, Institute of Microbiology and Biotechnology, Vietnam National of University,
Hanoi.
- Capacity of toxin degradation by aquatic bacteria.
5. Brief summary:

- Biophysical and biochemical analysis of freshwater in Hoankiem lake at
sampling time.
- Isolation, screening, study on characteristics of Microcystis isolated.
-

Identification of Microcystis isolated.

-

Determination microcystin of same Microcystis strains by HPLC.

-

Capacity of toxin degradation by fresh bacteria

6. Results obtained
- Hoankiem lake is in pollution condition in the aspect of chemical
evacuation such as COD and BOD concentration is over the corresponding ones in
Vietnamese standard system, TCVN 4942-1995 (type B) 20 times. Concentration of
ammonium cation 0,129- 0,699 (mg/l), nitrite 0.012- 0,05 (mg/l), nitrate 0,0470,129 (mg/l), and phosphate 0,08- 0.64 (mg/l) that demonstrate concentration of
nitrogen and phosphorus are relatively high.
- Based on modified Shirai method, 10 pure strains of Microcystis were
isolated and cultured. B12 medium (0.4% agarose) was selected as the most suitable
for Microcystis isolation.
- All of Microcystis strains were grown well on the Bold 3N medium that the
numbers of cell from 68,6 ×106 cells/ml after 15-19 days of culture. Especially, the


maximal cell number of LT2 strain increased to 68,6 ×106 cells/ml after 19th culture.
For J medium, the cell density was from 40,42 – 76,46 ×106 cells/ml after 15-19

days of culture in which LT2 was the best growth strain with the numbers of cell
76,46 ×106 cells/ml after 19th culture.
- Analytical results of unsaturated fatty acid in Microcystis LT2 and LT8
strains showed different 7 types of C15, C17 and C19 in which Palmitic acid
occupied as major part with 1,302 μg/mg and 0,9683 μg/mg (in dry weight) in LT2
and LT8, respectively. The results indicated the diference in the concentration
between 7 types of fatty acid.
- Based on morphological and molecular taxonomy (for example
comparision the sequence of 16S rDNA), LT2 and LT8 cyanobacterial strains were
identified as M. aeruginosa; aquatic N4 and N7 bacterial strains were type of
Sphingomonas mali và Sphingomonas asaccharolytica.
- HPLC analysis showed the maximal concentration of MC-RR of 512,8
ng/mg in dry weight, 236,8 ng/mg of MC-YR and the lowest 114,25 ng/mg MCLR.
- Sphingomonas strain was demonstrated to degrade microcystin in relatively
good level. Time for degradation of a half of 3 µg/l and 20µg/l microcystin was
1,34 h and 3,43 h; respectively.
- The suitable temperature for microcystin degradation by Sphingomonas
mali N4, Sphingomonas asaccharolytica N7 strains was at 30°C. The degradation
was completely after 7 day.

7. Publications and training activity


Publications
- Pham Thi Mai, Pham Tien Duc, Vu Thi Lan Anh, Nguyen Thi Hoai Ha.
Investigate water quality and the composition of algae in some lakes in Hanoi.
2008. Vietnam National University, Hanoi. Journal Natural Science. Vol 24, No 18,
pp 125 – 128.
- Pham Thi Mai, Pham Tien Duc, Vu Thi Lan Anh, Nguyen Thi Hoai Ha.
Study on toxin lysis in blue green algae by some strains bacteria isolated in Hoan

Kiem lake. 2008. Vietnam National University, Hanoi. Journal Natural Science. Vol
24, No 18, pp 119 – 122.
Training activity
Master thesis completed in 2009
-

Lysis of Microcystis and degradation of microcystin by aquatic bacteria.
2007-2009. Tran Thi Diep‟s official undergraduate thesis.

Bacheler thesis completed
- Isolation and screening of Microcystis toxin-degrading bacterial strains in
Hoankiem lake, Hanoi, 2007. Dang Thi Kim Anh‟s official undergraduate thesis.
- Investigation of Microcystis aeruginosa microcystin degradation by
Sphingomonas. 2008. Nguyen Thi Hoai ‟s official undergraduate thesis.
- Study on the seasonal fluctuation of cyanobacterial Microcystis aeruginosa
in Hoankiem lake and growth restriction by banana skin and mandarin peel
extracted solution, 2009. Le Thi Trang‟s official undergraduate thesis.
- Isolation and study on Microcystis toxic cyanobacterial characteristics:
toxin extraction and treatment investigation, 2009. Nguyen Huu Hieu‟s official
undergraduate thesis.

8. Contributions of project:


- Here is the first report that described isolation, maintaince and preservation
of Microcystis strain.
- Two Sphingomonas bacterial strains were isolated and proved as potent
microcystin-degrading agent.
- Establishment of toxin microcystin extraction procedure.
9. Research grant

- Supplied expenditute: 100 000 000 Vnd
- Used expenditute: 100 000 000 Vnd
The project is supported by Vietnam, National University, Hanoi
Hanoi, 18th October 2008
Project Coodinator

Institute of Microbiology and Biotechnology

Nguyen Thi Hoai Ha
Vietnam, National University, Hanoi


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3
1.1. VÀI NÉT VỀ HỒ HOÀN KIẾM .........................................................................3
1.2. VI KHUẨN LAM (CYANOBACTERIA) GÂY ĐỘC .......................................3
1.2.1. Vi khuẩn lam Microcystis................................................................................... 6
1.2.2. Độc tố microcystin của Microcystis .................................................................. 6
1.2.3. Cơ chế gây độc của microcystin ......................................................................... 8
1.3. SỰ PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ MICROCYSTIN CỦA VI KHUẨN NƢỚC
Sphingomonas .............................................................................................................9
1.3.1. Vi khuẩn Sphingomonas ...................................................................................... 9
1.3.2. Cơ chế phân giải độc tố microcystin của Sphingomonas .............................. 10
1.4. ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘC TỐ TỚI NGƢỜI VÀ GIA SÚC ............................11
1.5. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ VI KHUẨN LAM TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT
NAM..........................................................................................................................13
1.5.1. Trên thế giới ........................................................................................................ 13
1.5.2. Ở Việt Nam ......................................................................................................... 14
Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................16

2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ...........................................................................16
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu ........................................................................................ 16
2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .................................................................... 16
2.1.3. Máy móc, dụng cụ .............................................................................................. 17
2.1.4. Hóa chất ............................................................................................................... 17
2.1.5. Môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn lam và vi khuẩn .............................................. 18
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................18
2.2.1. Phƣơng pháp điều tra thu mẫu vi khuẩn lam ở hồ Hoàn Kiếm và đánh giá
chất lƣợng nƣớc ............................................................................................................. 18
2.2.2. Phƣơng pháp phân lập và nuôi cấy vi khuẩn lam Microcystis ..................... 18
2.2.2.1. Làm giàu mẫu .......................................................................................18
2.2.2.2. Phƣơng pháp tách và thuần khiết trên thạch đĩa ...................................18
2.2.3. Phân loại vi khuẩn lam Microcystis ................................................................. 19
2.2.3.1. Bằng phƣơng pháp hình thái .................................................................19
2.2.3.2 . Phƣơng pháp tách ADN .......................................................................19
2.2.3.3. Hóa phân loại phân tích thành phần acid béo .......................................20


2.2.4. Xác định mật độ tế bào ...................................................................................... 21
2.2.5. Phƣơng pháp tách chiết độc tố microcystin từ tế bào của Microc ystis ....... 22
2.2.6. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng trên máy quang phổ ................................ 22
2.2.7. Các phƣơng pháp sắc ký .................................................................................... 22
2.2.7.1. Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng (TLC) ..................................................23
2.2.7.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ............................................23
2.2.8. Phƣơng pháp nuôi cấy chủng vi khuẩn Sphingomonas ................................. 24
2.2.9. Phƣơng pháp xác định khả năng phân giải microcystin ................................ 24
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................26
3.1. PHÂN TÍCH CÁC CHỈ TIÊU THỦY LÝ, THỦY HĨA NƢỚC HỒ HỒN
KIẾM .........................................................................................................................26
3.1.1. Nhiệt độ ............................................................................................................... 26

3.1.2. pH ......................................................................................................................... 26
3.1.3. Các chất lơ lửng SS ............................................................................................ 26
3.1.4. Hàm lƣợng oxy hòa tan trong nƣớc (DO- Dissolve oxygen) ........................ 27
3.1.5. Nhu cầu oxy hóa học (COD- Chemical oxygen demand) ............................. 27
3.1.6. Nhu cầu oxy sinh hóa (BOD- Biochemical oxygen demand)....................... 27
3.2. TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN LAM THUỘC CHI Microcystis
PHÂN LẬP ĐƢỢC ...................................................................................................27
3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy .............................................................................................. 27
3.2.2. Phân lập các khuẩn lạc của Microc ystis ......................................................... 29
3.2.3. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis LT1, LT2, LT3, LT4,
LT5, LT6, LT7, LT8, LT9 và LT10 trên các môi trƣờng khác nhau ................. 32
3.2.4. Thành phần acid béo trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8 ........................ 35
3.2.5. Xác định và phân tích trình tự rADN 16S ...................................................... 36
3.3. TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ MICROCYSTIN ....................................................38
3.3.1. Sắc ký bản mỏng (TLC) .................................................................................... 38
3.3.2. Xác định hàm lƣợng microcystin trên máy quang phổ .................................. 38
3.3.3. Hàm lƣợng microcystin trên sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ............................. 39
3.4. PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN NƢỚC CÓ KHẢ
NĂNG PHÂN GIẢI MICROCYSTIN .....................................................................44
3.4.1. Phân lập các chủng vi khuẩn nƣớc .................................................................. 44
3.4.2. Xác định và phân tích trình tự rADN 16S 2 chủng N4 và N7 ..................... 47
3.5. KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI ĐỘC TỐ MICROCYSTIN CỦA 2 CHỦNG
Sphingomonas N4 VÀ N7 .........................................................................................49


3.5.1. Hiệu quả phân giải microcystin của 2 chủng N4 và N7 ................................ 49
3.5.2. Xác định điều kiện nhiệt độ thích hợp cho sự phân giải microcystin của
chủng Sphingomonas N4 và N7 .................................................................................. 51
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................54
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................56

PHỤ LỤC 1 ...............................................................................................................62
PHỤ LỤC 2 ...............................................................................................................65
PHỤ LỤC 3 ...............................................................................................................66
PHỤ LỤC 4 ...............................................................................................................77
PHỤ LỤC 5 ...............................................................................................................78
PHỤ LỤC 6 .................................................................................................................1


DANH MỤC HÌNH VÀ BẢNG
Danh mục hình
Hình 1.1. Hồ Hồn Kiếm Hà Nội ................................................................................3
Hình 1.2. Microcystis flos-aquae [62] ........................................................................6
Hình 1.3. Microcystis aeruginosa [63] .......................................................................6
Hình 1.4. Mơ hình cấu trúc hố học của độc tố MC – LR [54] ..................................7
Hình 1.5. Mơ hình cấu trúc hố học của độc tố MC – RR [54] ..................................7
Hình 1.6. Mơ hình cấu trúc hố học của độc tố MC – YR [54] ..................................8
Hình 1.7. Hình dạng tế bào của Sphingomonas [57] .................................................9
Hình 1.8. Con đƣờng phân giải mycrocystin nhờ Sphingomonas [20] .....................11
Hình 2.1. Sơ đồ vị trí thu mẫu ...................................................................................16
Hình 3.1. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên mơi trƣờng C .........................28
Hình 3.2. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên môi trƣờng Bold 3N ................28
Hình 3.3. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên mơi trƣờng B12 .......................28
Hình 3.4. Hình thái khuẩn lạc của Microcystis trên mơi trƣờng J ...........................28
Hình 3.5. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT1 ..........................................29
Hình 3.6. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT2 ..........................................29
Hình 3.7. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT3 ..........................................30
Hình 3.8. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT4 ..........................................30
Hình 3.9. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT5 ..........................................30
Hình 3.10. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT6 ........................................30
Hình 3.11. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT7 ........................................31

Hình 3.12. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT8 ........................................31
Hình 3.13. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT9 ........................................31
Hình 3.14. Hình dạng tế bào chủng Microcystis sp., LT10 ......................................31
Hình 3.15. Sinh trƣởng của các chủng Microcystis trong mơi trƣờng dịch thể Bold
3N ..............................................................................................................................33
Hình 3.16. Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trƣờng dịch thể Bold 3N
...................................................................................................................................33
Hình 3.17. Sinh trƣởng của các chủng Microcystis trong mơi trƣờng dịch thể J .....34
Hình 3.18. Các chủng Microcystis phát triển tốt trong môi trƣờng dịch thể J ..........34
Hình 3.19. Sinh trƣởng của các chủng Microcystis trong mơi trƣờng dịch thể B12 35
Hình 3.20. Các chủng Microcystis phát triển tốt trong mơi trƣờng dịch thể B12.....35
Hình 3.21. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của 2 chủng LT2,
LT8 và các lồi có quan hệ họ hàng gần ...................................................................37
Hình 3.22. Kết quả chạy TLC trƣớc khi nhuộm nihyđrin .........................................38


Hình 3.23. Kết quả chạy TLC sau khi nhuộm nihyđrin ............................................38
Hình 3.24. Đồ thị đƣờng chuẩn microcystin .............................................................39
Hình 3.25a. Sắc ký đồ microcystin RR chuẩn .........................................................40
Hình 3.25b. Sắc ký đồ microcystin YR chuẩn .........................................................40
Hình 3.25c . Sắc ký đồ microcystin LR chuẩn ..........................................................41
Hình 3.25d. Sắc ký đồ microcystin của chủng LT2 .................................................41
Hình 3.25e. Sắc ký đồ microcystin của chủng LT8 .................................................42
Hình 3.26. Ni cấy làm giàu các chủng vi khuẩn nƣớc trên mơi trƣờng NA và M7
...................................................................................................................................45
Hình 3.27. Cấy pha khuẩn lạc vi khuẩn trên mơi trƣờng NA ...................................45
Hình 3.28. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của chủng N4 và
các lồi có quan hệ họ hàng gần................................................................................48
Hình 3.29. Cây phả hệ dựa trên phân tích giải trình tự rADN 16S của chủng N7 với
các lồi có quan hệ họ hàng gần................................................................................49

Hình 3.30. Thời gian bán phân giải microcystin ở các nồng độ khác nhau của 2
chủng N4, N7. ...........................................................................................................50
Hình 3.31. Khả năng phân giải microcystin của vi khuẩn Sphingomonas N4 ở các
nhiệt độ khác nhau ....................................................................................................52
Hình 3.32. Khả năng phân giải của vi khuẩn Sphingomonas N7 ở nhiệt độ khác
nhau ...........................................................................................................................53
Danh mục bảng
Bảng 1.1. Những loài vi khuẩn lam gây độc và sự phân bố của chúng [16] ..............4
Bảng 3.1. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trên môi trƣờng Bold3N
...................................................................................................................................32
Bảng 3.2. Khả năng sinh trƣởng của 10 chủng Microcystis trên môi trƣờng J ........33
Bảng 3.3. Khả năng sinh trƣởng của các chủng Microcystis trên môi trƣờng B12 ..34
Bảng 3.4. Thành phần acid béo có trong tế bào của 2 chủng LT2 và LT8 ..............36
Bảng 3.5. Hàm lƣợng microcystin của 2 chủng LT2 và LT8 ................................43
Bảng 3.6. Đặc điểm hình thái của 2 chủng vi khuẩn nƣớc N4 và N7 .......................46
Bảng 3.7. Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của 2 chủng N4 và N7 ...................................46
Bảng 3.8. Hằng số tốc độ phân giải (K) và thời gian bán phân giải microcystin ở các
nồng độ khác nhau ....................................................................................................50
Bảng 3.9. Tỷ lệ % microcystin không bị phân giải do chủng Sphingomonas N4 ở
các nhiệt độ khác nhau ..............................................................................................52
Bảng 3.10. Tỷ lệ % microcystin không bị phân giải do chủng Sphingomonas N7 ở
các nhiệt độ khác nhau ..............................................................................................52


BẢNG CÁC CHỮ VIẾT TẮT

Các chữ viết tắt

Tên đầy đủ

Adda

3-amino-9-methoxy-2,6,8-trimethyl-10-phenyldeca-4,6dienoic acid

MC-LR

Leucine and arginine in the positions of X and Z of
microcystin

MC-RR

Arginine and arginine in the positions of X and Z of
microcystin

MC-YR

Tyrosine and arginine in the positions of X and Z of
microcystin

PCR

Phản ứng trùng hợp (Polymerase chain reaction)

WHO

Tổ chức y tế thế giới (World Health Organisation)

TLC

Sắc ký bản mỏng (Thin layer chromatography)

HPLC

Sắc ký lỏng cao áp (High permormance liquid
chromatography)

bp

Cặp bazơ (Base pair)

tb

Tế bào


MỞ ĐẦU
Trong những năm gần đây Hà Nội phát triển với tốc độ nhanh chóng, kéo
theo đó là sự ơ nhiễm hàng loạt thủy vực nội thành và vùng lân cận. Hồ Hoàn Kiếm
một địa danh nổi tiếng của thủ đô cũng bị ô nhiễm. Chất lƣợng nƣớc thay đổi dẫn
tới sự phát triển thƣờng xun và khơng bình thƣờng của vi khuẩn lam, làm biến đổi
cấu trúc thành phần loài của hệ vi tảo trong hồ. Sự suy giảm một số loài vi tảo đặc
hữu đồng thời với sự gia tăng thành phần loài và mật độ của vi khuẩn lam gây độc ở
hồ Hoàn Kiếm đã đƣợc cảnh báo và gây nên những lo ngại về môi trƣờng cho khu
hệ động thực vật sống trong hồ [1, 2, 5, 9].
Trong số các loài vi khuẩn lam gây nở hoa nƣớc hồ Microcystis aeruginosa
Kutzing là loài bị bắt gặp thƣờng xuyên và phổ biến nhất M.aeruginosa chứa độc tố
thuộc nhóm hepatotoxin (độc tố gan) cấu tạo từ các peptid mạch vịng có tên gọi là
microcystin (MC) [14, 15, 19, 23, 29]. Microcystin là chất ức chế đối với enzyme
protein phosphatases (nhóm PP1 và PP2A) [30]. Độc tố cũng gây ảnh hƣởng xấu
lên hai loại protein serine và threonin phosphatases [15, 16, 17, 18, 22]. Đã có một

số bài báo chứng minh hiện tƣợng nƣớc nở hoa của vi khuẩn lam gây hại tới sinh
vật thủy sinh, động vật và con ngƣời [16,17, 19, 20, 21]. Microcystin thƣờng tích
luỹ trong nội quan tế bào hoặc dƣới dạng tự do trong nƣớc [16, 18, 35, 36, 42]. Đã
có khơng ít các cơng trình nghiên cứu hiện tƣợng nở hoa nƣớc và giảm thiểu tác hại
của độc tố vi khuẩn lam gây độc, tuy nhiên kết quả vẫn còn ở các mức độ khác
nhau. Để bảo vệ môi trƣờng nƣớc hồ, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc
điểm sinh học và thăm dò khả năng phân giải độc tố của một số chủng
Microcystis phân lập ở hồ Hoàn Kiếm, Hà Nội”.
Mục tiêu của đề tài
* Phân lập, định tên, nuôi cấy và lƣu giữ đƣợc các chủng vi khuẩn lam
Microcystis trong Bảo tàng Vi tảo của Phịng Cơng nghệ Tảo và Sinh học Môi
trƣờng - Viện Vi sinh vật và Cơng nghệ Sinh học - ĐHQGHN.
* Thăm dị khả năng phân giải độc tố của chúng bằng vi khuẩn.

1


Nội dung của đề tài
-

Phân tích thành phần thuỷ lý, thuỷ hố của nƣớc hồ Hồn Kiếm tại

thời điểm thu mẫu.
-

Phân lập, thuần khiết và nghiên cứu các điều kiện ni cấy thích hợp

của các chủng Microcystis.
-

Phân loại đến lồi các chủng Microcystis tuyển chọn đƣợc.

-

Tách chiết và phân loại độc tố của các chủng Microcystis trên máy sắc

ký lỏng cao áp (HPLC).
-

Thăm dò khả năng phân giải độc tố microcystin của vi khuẩn lam gây

độc bằng vi khuẩn bản địa (vi khuẩn nƣớc).

2


Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VÀI NÉT VỀ HỒ HỒN KIẾM
Hồ Hồn Kiếm nằm ở trung tâm thủ đơ Hà Nội, xƣa là một đoạn của dịng
sơng hồng và cịn có tên gọi khác là sơng Nhị. Diện tích hồ ƣớc tính khoảng 12
hecta, chiều dài Nam - Bắc là 700m. Chiều rộng Đông – Tây là 200m.
Trong vài thập kỷ gần đây song
song với quá trình phát triển kinh tế
xã hội của Hà Nội,do khơng có biện
pháp ngăn chặn những tác động gây ô
nhiễm làm biến đổi hệ sinh thái hồ,
ảnh hƣởng tới chất lƣợng nƣớc hồ,
hàm lƣợng N và P tăng lên đã dẫn tới
sự phát triển bùng nổ của vi khuẩn
lam. Hồ Hoàn Kiếm trở thành một

Hình 1.1. Hồ Hồn Kiếm Hà Nội

trong những hồ phú dƣỡng ở Hà Nội.

Trong hồ có sự phát triển mạnh mẽ của một số vi khuẩn lam thuộc chi
Microcystis, tạo thành những váng lớn nổi bồng bềnh che kín mặt một góc hồ. Kết
thúc sự nở hoa, vi khuẩn lam chết hàng loạt gây mùi hôi lan xung quanh khu vực hồ
[6].
1.2. VI KHUẨN LAM (CYANOBACTERIA) GÂY ĐỘC
Vi khuẩn lam là nhóm cơ thể cổ xƣa nhất và mang nhiều tên gọi khác nhau
trong quá trình nghiên cứu: thực vật phân cắt (Schizophyceae), tảo nhầy
(Myxophyceae), tảo lam (Cyanophyta), vi khuẩn lam (Cyanobacteria). Từ năm
1854, Kopp đã coi vi khuẩn và tảo lam là một nhóm có chung nguồn gốc phát sinh.
Trong phân loại hiện đại, sinh vật chƣa có cấu trúc nhân hoàn hảo (Procaryota) gồm
vi khuẩn lam và vi khuẩn, căn cứ vào đặc điểm cả hai đều không có nhân điển hình,
chỉ có chất nhân và nhiễm sắc thể. Vi khuẩn lam và vi khuẩn cịn có những nét
giống nhau nhƣ: màng tế bào đều cấu tạo từ murein, một loại glucozaminopeptit;

3


trong tế bào chất có nhiều riboxom; nhiều lồi vi khuẩn và vi khuẩn lam đều có khả
năng đồng hố đƣợc N2 tự do; cả hai đều có thể hình thành các pha cyanophase và
bacteriophase. Vi khuẩn lam khác với các ngành tảo và thực vật bậc cao ở cấu trúc
rất cổ xƣa, tế bào khơng có cấu trúc nhân điển hình và khơng có các giai đoạn phân
chia nhân. Vi khuẩn lam phân bố khắp nơi trên trái đất, đa số sống trong nƣớc ngọt,
một số phân bố trong thuỷ vực nƣớc mặn giàu chất hữu cơ hoặc trong nƣớc lợ [7].
Độc tố vi khuẩn lam phổ biến nhất là độc tố gan (hepatotoxin) và độc tố thần
kinh (neurotoxin). Một số lồi vi khuẩn lam có chứa cả hai loại độc tố trên. Các
quần thể nở hoa trong thuỷ vực nƣớc ngọt chủ yếu thuộc về chi Microcystis thƣờng

gây độc [8, 9], nhƣng cũng có các chủng thuộc chi này khơng gây độc [29]. Có ý
kiến cho rằng độc tính khơng phải là tính trạng đặc hiệu ở những lồi nhất định nào
đó, nhƣ với microcystin (hepatotoxin) thì độc tính của một chủng phụ thuộc vào
điều kiện là chủng đó có mang gen mã hóa cho microcystin hay khơng [38, 39]. Thí
nghiệm ni cấy vi khuẩn lam cũng chỉ ra rằng sản sinh microcystin là tính trạng
khơng đổi của một số chủng nhất định, hiếm khi bị tác động bởi các yếu tố môi
trƣờng [16, 49]. Trong khi các điều kiện dẫn tới sự nở hoa của vi khuẩn lam đã
đƣợc sáng tỏ, thì các yếu tố dẫn tới sự bùng nổ của các chủng gây độc so với các
chủng không độc vẫn chƣa đƣợc làm sáng tỏ [15, 20, 22, 34].
Bảng 1.1. Những loài vi khuẩn lam gây độc và sự phân bố của chúng [16]
Loài
Anabaena spp. (flosaquae,
lemmermannii,
circinalis)
Anabaena circinalis
Anabaena flos-aquae
Microcystis aeruginosa
M. viridis
M. botrys
Planktothrix agardhii
P. agardhii
Oscillatoria limosa

Loại độc tố
Microcystins

Nơi phát sinh
Anh

Microcystins

Microcystins
Microcystins
Microcystins
Microcystins
Microcystins
Microcystins
Microcystins

Pháp
Nauy
Worldwide
Nhật Bản
Đan Mạch
Trung Quốc
Nauy
Thuỵ Sỹ

4


Loài
Nostoc sp.
Anabaenopsis millerii
Haphalosiphon
hibernicus (soil isolate)
Nodularia spumigena
Aphanizomenon
Ovalisporum
Cylindrospermopsis
raciborskii

Umezakia natans
Anabaena flos-aquae
Anabaena blooms
Anabaena sp.
Aphanizomenon sp.
Aphanizomenon blooms
Cylindrospermum sp.
Microcystis sp.
Planktothrix sp.
Planktothrix Formosa
Anabaena flos-aquae
A. lemmermannii
Anabaena circinalis
Aphanizomenon
flosaquae
Cylindrospermopsis
raciborskii
Lyngbya wollei

Loại độc tố
Microcystins
Microcystins
Microcystins

Nơi phát sinh
Anh
Bỉ
Mỹ

Nodularins

Cylindrospermopsin

Úc
Isaen

Cylindrospermopsin

Úc

Cylindrospermopsin
Anatoxin-a
Anatoxin-a
Anatoxin-a
Anatoxin-a
Anatoxin-a
Anatoxin-a
Anatoxin-a
Anatoxin-a
Homoanatoxin-a
Anatoxin-a(S)
Anatoxin-a(S)
Sacidoxins
Sacidoxins

Nhật
Canada
Đức
Nhật
Phần Lan
Đức

Phần Lan
Nhật Bản
Anh
Nauy
Canada
Đan Mạch
Úc
Mỹ

Sacidoxins

Braxin

Sacidoxins

Mỹ

Sự nghiên cứu vi khuẩn lam gây độc ở nhiều nƣớc trên thế giới cho thấy có
khoảng 60% các mẫu vi khuẩn lam đƣợc điều tra mang độc tố (bảng 1.1). Tuy
nhiên, độc tố của hiện tƣợng nở hoa nƣớc có thể thay đổi theo thời gian và không
gian. Nếu chứng minh đƣợc quần thể vi khuẩn lam trong một hồ nào đó có mang
độc tính nhƣng mật độ của chúng thấp thì không nhất thiết phải báo động cho cộng

5


đồng về những tác hại của chúng đối với sức khỏe con ngƣời và môi trƣờng [16, 22,
43, 48, 50].
1.2.1. Vi khuẩn lam Microcystis
Trong số các loài vi khuẩn lam đƣợc xác định gây độc cho con ngƣời thì

Microcystis aeruginosa đƣợc xem là thƣờng gặp nhất, là một trong những lồi vi
khuẩn lam tham gia đáng kể hình thành hiện tƣợng nở hoa của nƣớc. Với đặc điểm
là tập đoàn bao gồm hàng nghìn tế bào riêng lẻ cỡ từ 2- 3 µm và mỗi tế bào đều
chứa một khơng bào khí. Chính sự tập hợp của hàng nghìn khơng bào khí định vị
trong vơ số các tế bào này giúp chúng nổi trên mặt nƣớc và thu nhận đƣợc nguồn
ánh sáng mặt trời, thơng qua q trình quang hợp tổng hợp sắc tố diệp lục tạo nên
váng xanh trên mặt nƣớc [25].

Hình 1.2. Microcystis flos-aquae [62]
Hình 1.3. Microcystis aeruginosa [63]
1.2.2. Độc tố microcystin của Microcystis
Microcystin [16, 40] là những độc tố vi khuẩn lam gặp phổ biến và rộng rãi
nhất.

Hợp chất này đƣợc tách ra đầu tiên từ loài vi khuẩn lam Microcystis

aeruginosa do vậy đƣợc gọi là microcystins. Chúng là các heptapeptide mạch vịng
do có chứa 1 amino acid đặc hiệu (ADDA) chuỗi bên [24]. Cho đến nay, đây là
những dạng cấu trúc chỉ gặp ở microcystins và nodularin (một loại pentapeptide
vòng của vi khuẩn lam ở trong nƣớc lợ). Ngƣời ta đã biết khoảng 70 loại độc tố
microcystins khác nhau. Chúng khác nhau ở các nhóm metyl và 2 amino acid. bên
trong chuỗi. Từ đó dẫn đến sự khác nhau về cấu trúc bậc 4, tính độc cũng nhƣ các

6


đặc tính ƣa nƣớc hoặc kỵ nƣớc. Microcystin gắn protein phosphataza 1 và 2 là
những loại protein quan trọng trong tế bào nhân thật bằng 1 liên kết đồng hóa trị
khơng thuận nghịch. Các kênh gắn acid mật đƣợc tìm thấy trong tế bào gan là con
đƣờng cho phép microcystin đi vào trong tế bào. Đối với động vật có xƣơng sống,

liều lƣợng gây chết của microcystin sẽ làm cho gan bị hoại tử trong thời gian vài
giờ hoặc vài ngày. Có lẽ rằng các cấu trúc kỵ nƣớc có thể đi xuyên qua 1 vài loại tế
bào mà thậm chí khơng theo kênh acid mật.
Ngồi ra, Fitzgeorge đã cung cấp bằng chứng cho rằng các MC-LR thƣờng
gặp có thể huỷ hoại cấu trúc của mơ mũi. Trong khi đó, độc tính gây ra do hấp thụ
qua đƣờng miệng thƣờng ít gây ảnh hƣởng hơn nếu so với tiêm vào dƣới màng
bụng trong các thí nghiệm mà ngƣời ta tiêm sẽ khiến chúng có tác dụng phá huỷ
màng tế bào và làm gia tăng độc tính của anatoxin-a (một loại độc tố thần kinh)
[49].

Hình 1.4. Mơ hình cấu trúc hố học của độc tố MC – LR [54]

Hình 1.5. Mơ hình cấu trúc hố học của độc tố MC – RR [54]
7


Hình 1.6. Mơ hình cấu trúc hố học của độc tố MC – YR [54]
Biến thể xảy ra chủ yếu tại các vị trí 1 và 2. Ví dụ, Microcystin-LR chứa
leucine amino acid (L) và arginine (R) tại các vị trí 1 và 2 tƣơng ứng. MicrocystinRR có arginine ở cả hai vị trí. Các nghiên cứu cơ chế độc học tế bào đã cho biết
microcystins ảnh hƣởng đến các cấu trúc tế bào và quá trình nguyên phân và điều
này giúp giải thích khả năng kích thích gây ung thƣ của chúng.
1.2.3. Cơ chế gây độc của microcystin
Cơ chế gây độc của microcystin ở mức độ phân tử là ức chế các hepatocyte
protein phosphatases P 1 (PP1) và 2A (PP2A) – hai enzyme điều chỉnh nhiều quá
trình diễn ra trong tế bào động vật và thực vật. Sự kìm hãm này dẫn tới sự siêu
phosphoryl hóa của tế bào cytoskeratin. Trong tế bào gan của ngƣời và động vật,
điều này còn làm tăng sự phá vỡ các vi sợi hình thành nên khung tế bào. Khi các vi
sợi trở lên tách rời màng tế bào sẽ làm xuất hiện các bóng nƣớc trong màng, đồng
thời làm màng tế bào bị co lại, dịch tế bào thoát ra. Đây đƣợc xem là nguyên nhân
gây ra chảy máu gan, phá vỡ cấu trúc của gan thƣờng thấy ở động vật. Sự tiếp xúc

lâu dài với nồng độ microcystin thấp trong nƣớc uống là nhân tố gây ra ung thƣ gan
ở ngƣời [14]. Các nghiên cứu cơ chế động học tế bào đã cho biết microcystin ảnh
hƣởng lớn đến cấu trúc tế bào và quá trình nguyên phân, điều này giúp giải thích
khả năng kích thích gây ung thƣ của chúng. Độc tố này cũng gây ảnh hƣởng xấu
đến hai loại enzyme là serin – photphatase và threonin – photphatase liên quan tới
sự điều hòa phát triển các tế bào nhân thật (Eukaryote), điều khiển sự hoạt động của
tế bào động thực vật trong quá trình phân chia, sinh trƣởng, trao đổi chất, sao chép
8