Xác định đặc điểm sinh học và bước đầu nghiên cứu chuyển gen vào chủng nấm mốc aspergillus niger TL8 phân lập được tại việt nam

p h

ho h

H GHN: ho h

nhi n v C ng ngh

p 33

2S (2017) 8-13

Xá định đặ điểm sinh h v bướ đầu nghi n ứu
huyển gen v o hủng nấm m Aspergillus niger TL8
phân l p đượ t i Vi t N m
ỗ hị Bình Xn Lộ

1,2

rần Văn uấn1,2,*

1

Phịng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, ĐHQGHN,
334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam
2
Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam
Nh n ng y 16 tháng 8 năm 2017
Chỉnh sử ng y 20 tháng 9 năm 2017; Chấp nh n đăng ng y 10 tháng 10 năm 2017

Tóm tắt: Aspergillus niger l lo i nấm m đượ sử dụng phổ biến trong sản xuất ng nghi p

nhiều lo i enzym v xit hữu ơ. Do lo i nấm n y ó khả năng tiết nhiều lo i enzym v o m i
trường để phân giải á nguy n li u th v t n n A. niger ũng là tác nhân gây hỏng một s lo i
n ng sản s u thu ho h. rong nghi n ứu n y húng t i đã phân l p đượ một hủng nấm m
đen ký hi u l L8 từ vỏ quả th nh long bị hỏng. D tr n đặ điểm hình thái v kết quả giải trình
t vùng I
ủ rDNA hủng L8 đượ xá định thuộ lo i A. niger. Chủng A. niger L8 ó khả
năng sử dụng nhiều nguồn
bon khá nh u ho sinh trưởng v phân hủy đượ vỏ quả th nh long
ở điều ki n th nghi m. ể t o tiền đề ho á nghi n ứu về ơ hế phân giải nguy n li u th
v t ủ A. niger, bướ đầu chúng t i đã th hi n thành công vi
huyển gen huỳnh qu ng GFP
v o hủng L8 sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và marker kháng kháng sinh
hygromycin.
Từ khóa: Thanh long, Aspergillus niger
gen huỳnh qu ng GFP, hygromycin.

huyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens,

1. Đặt vấn đề

(phytase, xylanase, pectinase, cellulase,...) và
xit hữu ơ. Gần 99% lượng xit itri đượ sản
xuất tr n thế giới l nhờ A. niger [2, 3]. ặ
bi t A. niger ó khả năng sinh trưởng t t tr n
nhiều nguồn nguy n li u th v t khá nh u
như xyl n pe tin tinh bột ellulose v inulin
nhờ tiết một lượng lớn á enzym v o m i
trường để phân giải những ơ hất n y. ây
ũng l đặ t nh giúp A. niger sinh trưởng v
gây h i tr n một s lo i n ng sản s u thu ho h

[2-4].

Aspergillus niger l lo i nấm m (nấm sợi)
phổ biến nhất thuộ hi Aspergillus, phân nhóm
Nigri h y ịn g i l phân nhóm Aspergillus đen
[1]. Nhiều hủng A. niger đã đượ Cụ quản lý
h phẩm v Dượ phẩm Ho ỳ (FDA) ng
nh n l n tồn v giữ v i trị qu n tr ng trong
sản xuất
ng nghi p nhiều lo i enzym

_______


á giả li n h .
.: 84-24-35575492.
Email:
/>
Cải biến di truyền A. niger để t o đượ á
hủng ó đặ t nh mong mu n phụ vụ sản xuất
8


Đ.T.B.X. Lộc, T.V. Tuấn / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, T p 33, S 2S (2017) 8-13

thường y u ầu á
ng ụ v phương pháp
huyển gen t i ưu. Hi n n y h i phương pháp
hủ yếu đượ sử dụng để huyển gen v o nấm
là chuyển gen thông qua tế b o trần (protopl st)

v huyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens. Chuyển gen thơng qua tế b o trần
địi hỏi sử dụng hỗn hợp enzym đắt tiền để lo i
bỏ th nh tế b o nấm v quy trình th hi n với
nhiều bướ phứ t p. rong khi đó phương
pháp huyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens
đơn giản hơn với hi ph thấp v đã đượ áp
dụng th nh ng với nhiều loài nấm sợi khá
nhau [5, 6]. rong nghi n ứu n y húng t i đã
phân l p đượ hủng nấm m A. niger TL8 và
bướ đầu huyển gen thành công vào hủng
nấm này bằng phương pháp huyển gen nhờ vi
khuẩn A. tumefaciens.
2. Vật liệu và phương pháp
2.1. V t liệu
Chủng A. niger TL8 phân l p đượ từ vỏ
quả th nh long bị hỏng. Chủng vi khuẩn A.
tumefaciens AGL1 [7] v ve tor nhị thể
pGreen2 đượ ung ấp bởi Phòng Genomi
Phòng th nghi m r ng điểm C ng ngh
Enzym và Protein rường
i h
ho h
nhi n
ih
u gi H Nội.
2.2. Phương pháp
2.2.1. Phân l p, xác định đặc điểm của
chủng TL8
Phân l p: mẫu th nh long nhiễm nấm m

đen đượ thu từ hợ Nhân Ch nh h nh Xuân
H Nội. Dùng tăm vô trùng g t một lượng nhỏ
b o tử nấm m tr n vỏ quả v ấy ri 3 ph
tr n m i trường PDA (2% glu ose dị h hiết từ
200 g kho i tây 2% th h). u 3 ng y ủ ở
30°C những khuẩn l nấm ó b o tử m u đen
đượ l
h n ho phân t h tiếp theo. B o tử
nấm tr n bề mặt đĩ nu i ấy đượ hò v o
nướ v trùng l qu m ng Mir loth v thu
hồi nhờ ly tâm.

9

Xác định hình thái ủ hủng L8: Nhỏ 5
µl dị h b o tử (106 b o tử/ml) ủ hủng L8
lên đĩ Petri hoặ ti u bản hứ m i trường
PDA (pot to dextrose g r) hoặ CD (CzapekDox) để phụ vụ quan sát hình thái h sợi nấm
và u ng sinh b o tử. Mẫu đượ nu i ở 30°C
trong 2-3 ngày.
ái lây nhiễm để xá định khả năng phân
hủy vỏ quả: uả th nh long tươi đượ rử s h
bằng nướ v trùng v bề mặt đượ l u s h
bằng ồn 70%. u đó dùng tăm v trùng để t o
vết xướ tr n vỏ quả v ấy 5 µl dị h b o tử
nấm v o vị tr vết xướ . uả s u khi lây nhiễm
đượ giữ trong hộp nh s h ở 30°C trong
3 ngày.
Xá định khả năng sử dụng á nguồn
bon khá nh u: 5 µl dị h b o tử ủ hủng

L8 đượ nhỏ l n m i trường CD với á
nguồn
bon khá nh u gồm glu ose su rose
dextrin xyl n ellulose tinh bột. ĩ đượ ủ ở
30°C trong 5 ng y để kiểm tr khả năng sinh
trưởng ủ nấm.
2.2.2. Định danh chủng TL8 bằng giải trình
tự vùng ITS của rDNA
DNA h gen ủ hủng L8 đượ tá h hiết
từ h sợi nấm theo quy trình đã đượ
ng b
ủ nhóm nghi n ứu [8]. PCR khuế h đ i vùng
ITS từ DNA h gen với ặp mồi đặ hi u
ITS1/ITS4 [9]. ản phẩm PCR đượ đi n di tr n
gel agarose 0 7% v tinh s h bằng kit ủ hãng
Promeg . Mẫu DNA tinh s h đượ giải trình
t bởi ng ty 1st BA E ( ing pore). rình t
I
đượ phân t h so sánh với dữ li u ủ
GenBank và cây phát sinh hủng lo i đượ xây
d ng bằng phần mềm MEGA6.
2.2.3. Chuyển gen vào chủng TL8
Ve tor nhị thể pGreen2 đượ biến n p v o
hủng vi khuẩn A. tumefaciens AGL1 nhờ h
th ng huyển gen bằng xung đi n Bio-Rad
Gene Pulse XcellTM Electroporation System.
uy trình huyển gen v o A. niger TL8 đượ
th hi n theo ng b trướ đây [10] với á
điều hỉnh phù hợp. Cụ thể: thời gi n đồng nu i
ấy hỗn hợp vi khuẩn v b o tử nấm l 2 5 ng y

10

Đ.T.B.X. Lộc, T.V. Tuấn / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, T p 33, S 2S (2017) 8-13

ở 20°C m i trường h n l l CD (pH 7) ó
bổ sung kháng sinh hygromy in (300 mg/l) v
kháng sinh cefotaxime (300 mg/l). ĩ đượ ủ ở
nhi t độ 28-37ºC trong khoảng 3-5 ng y để
nh n đượ á khuẩn l nấm huyển gen. Cá
khuẩn l nấm xuất hi n tr n đĩ m i trường
h n l đượ thuần khiết bằng phương pháp
ấy ri b ph . u khi nu i ấy v tá h hiết
DNA, các thể huyển gen sẽ đượ xá nh n
bằng PCR sử dụng á ặp mồi đặ hi u ho
marker kháng hygromycin (PgpdA-F: GGGC
TCGAGAGGCCTCCGGTGACTCTTTCTGGC và
HPH-R: GGACTAGTCTATTCCTTTGCCCTCG
G) v ho gen huỳnh qu ng GFP (GFP-orf-F:
AAATACGTAGGGCCCGGTACCATGGTGAGA
AGGGCGAG và GFP-orf-R: AAAGCGGCCGC

AGATCTAGGCCTTTACTTGTACAGCTCGTCT
GC).

3. Kết quả và thảo luận
3.1. Đặc điểm của chủng A. niger TL8
Sau 3 ngày nu i ấy ở 30°C hủng TL8
sinh trưởng m nh tr n m i trường PDA với h

sợi l n rộng hứ nhiều b o tử m u đen và sinh
trưởng yếu hơn tr n m i trường t i thiểu CD
(Hình 1A). M i trường CD có thành phần xác
định dễ kiểm soát nên đượ sử dụng để đánh
giá khả năng sinh trưởng ủ nấm và phụ vụ
nghi n ứu huyển gen.

Hình 1. Xá định hủng TL8 d tr n hình thái v giải trình t vùng I . (A) Hình thái h sợi ủ hủng L8
tr n m i trường th h v u ng sinh b o tử dưới k nh hiển vi. (B) inh trưởng ủ hủng L8 tr n vỏ quả th nh
long ở điều ki n th nghi m. (C) ản phẩm PCR vùng I tr n gel g rose 0 7%. M là DNA marker huẩn 1 kb
ủ hãng hermo ientifi (U A). (D) Cây phát sinh hủng lo i hỉ r hủng L8 thuộ loài A. niger.

Khi quan sát dưới k nh hiển vi ó độ phóng
đ i 400 lần hủng TL8 hình th nh u ng sinh
b o tử dài với thể bình hứ nhiều b o tử đ nh
(conidia) t o th nh b ng hình ầu m u đen
(Hình 1A). ây ũng l ấu trú sinh sản vơ
tính điển hình ủ các lồi thuộ chi Aspergillus
[11]. ết quả tái lây nhiễm tr n quả th nh long
bị l m xướ vỏ ho thấy hủng TL8 phân hủy
m nh vỏ quả, t o ra á vết nứt v hình thành

h sợi nhiều b o tử m u đen tr n bề mặt quả
(Hình 1B). Phân tích sản phẩm PCR vùng ITS
của rDNA trên gel agarose cho thấy chỉ xuất
hi n một băng DNA duy nhất với k h thước
595 bp (Hình 1C). ử dụng hương trình
BLA v phần mềm MEGA6 để so sánh trình
t I thu đượ với dữ li u trong GenBank cho
thấy L8 thuộ lo i A. niger với độ tương đồng

đ t đến 100% (Hình 1D).


Đ.T.B.X. Lộc, T.V. Tuấn / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, T p 33, S 2S (2017) 8-13

3.2. Chủng A. niger TL8 sử dụng t t các nguồn
cacbon khác nhau cho sinh trưởng
A. niger có khả năng tiết nhiều lo i enzym
ngo i bào v o m i trường để phân giải á ơ

11

chất ho sinh trưởng [2]. Sau 5 ngày ủ ở 30°C,
chủng L8 sinh trưởng trên tất cả các nguồn
cacbon kiểm tr v sinh trưởng t t nhất trên môi
trường chứa dextrin và cellulose (Hình 2).

Hình 2. inh trưởng của chủng A. niger TL8 trên các nguồn cacbon khác nhau.

3.3. Chuyển gen vào chủng A. niger TL8 nhờ vi
khuẩn A. tumefaciens
Gen GFP mã hó protein huỳnh quang xanh
ó nguồn g từ sứ Aequorea victoria đượ sử

dụng rộng rãi trong huyển gen v o nấm sợi v
đượ biểu hi n th nh ng ở các lo i thuộ chi
nấm sợi khác nhau như Colletotrichum,
Trichoderma,
Magnaporthe,
Verticillium,

Aspergillus,... [12, 13].

Hình 3. Xá nh n huyển gen th nh ng ở A. niger TL8. (A) PCR với ặp mồi PgpdA-F/HPH-R. (B) PCR với
ặp mồi GFP-orf-F/GFP-orf-R. i hứng âm (-) sử dụng nướ v trùng đ i hứng dương (+) sử dụng pl smid
pGreen2 M l DNA m rker 1 kb. (C) Biểu hi n ủ gen GFP ở hủng G3 dưới k nh hiển vi huỳnh qu ng.

Ve tor nhị thể pGreen2 m ng m rker kháng
hygromycin v ấu trú biểu hi n gen hỉ thị
huỳnh qu ng GFP [13] đượ sử dụng ho
huyển gen v o hủng L8 nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens. ết quả huyển gen ho thấy trên
đĩ m i trường hứ hygromycin đã xuất hi n

một s khuẩn l nấm. B khuẩn l m ri ng
rẽ (k hi u G1 G2 G3) đượ h n để phân tích.
ể xá nh n rằng ba khuẩn l nấm nói tr n đã
nh n đượ gen kháng kháng sinh hygromycin
v gen huỳnh qu ng GFP, á hủng n y đượ
nu i để tách DNA h gen cho PCR với các ặp


12

Đ.T.B.X. Lộc, T.V. Tuấn / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, T p 33, S 2S (2017) 8-13

mồi PgpdA-F/HPH-R và GFP-orf-F/GFP-orfR. ết quả đi n di sản phẩm PCR trên gel
agarose cho thấy hỉ 2 hủng (G1, G3) xuất
hi n băng 1 913 kb tương ứng với k h thướ
ủ marker kháng hygromycin (Hình 3A). Khi
kiểm tr với ặp mồi đặ hi u ho gen GFP là

GFP-orf-F/GFP-orf-R thì hỉ hủng G3 xuất
hi n băng 764 bp tương ứng với gen GFP
(Hình 3B). iều n y ó thể lý giải l do hủng
G1 hỉ nh n đượ một phần ấu trú -DNA
mang gen kháng hygromycin trong khi hủng
G2 ó thể đã mất ấu trú huyển gen trong q
trình nu i ấy. Do đó hủng G3 đượ h n để
kiểm tr s biểu hi n ủ gen GFP dưới k nh
hiển vi huỳnh qu ng. Kết quả ho thấy hủng
G3 biểu hi n t n hi u huỳnh qu ng xanh khá t t
ở ả h sợi nấm b o tử v u ng sinh b o tử
(Hình 3D). Như v y bướ đầu húng t i đã
huyển th nh
ng ấu trú biểu hi n gen
huỳnh qu ng GFP và marker kháng
hygromy in từ ve tor pGreen2 vào h gen ủ
hủng A. niger TL8 nhờ vi khuẩn A.
tumefaciens. áng hú ý l nồng độ kháng sinh
hygromy in sử dụng trong nghi n ứu n y chỉ
l 300 mg/l thấp hơn nhiều so với nồng độ l n
tới 900 mg/l sử dụng trong một nghi n ứu
trướ đây [14].

nghi m r ng điểm C ng ngh Enzym v
Protein rường
i h
ho h
nhi n
ih
u gi H Nội đã hỗ trợ các thiết bị

nghi n ứu.
Tài liệu tham khảo
[1]

[2]

[3]

[4]

[5]

4. Kết luận
Chủng nấm m đen TL8 phân l p đượ từ
vỏ quả thanh long bị hỏng thuộ lo i A. niger
d tr n đặ điểm hình thái và trình t ITS của
rDNA. Chủng L8 sinh trưởng t t tr n nguồn
cacbon là dextrin và cellulose. Bướ đầu chúng
tôi đã biểu hi n thành công gen huỳnh qu ng
GFP ở hủng nấm n y sử dụng phương pháp
huyển gen nhờ vi khuẩn A. tumefaciens và
marker kháng kháng sinh hygromycin.

[6]

[7]

[8]

Lời cảm ơn

Cơng
ủ
uỹ
u
gi
2014.75.

trình đượ hỗ trợ kinh ph từ đề t i
phát triển ho h v C ng ngh
(NAFOSTED) mã s 106-NN.04Cá tá giả xin ảm ơn Phòng th

[9]

Meijer M., Houbraken J., Dalhuijsen S., Samson
R. and de Vries R., Growth and hydrolase
profiles can be used as characteristics to
distinguish Aspergillus niger and other black
Aspergilli, Studies in Mycology 69 1 (2011) 19.
de Vries R. P. and Visser J., Aspergillus enzymes
involved in degradation of plant cell wall
polysaccharides, Microbiology and Molecular
Biology Reviews 65 4 (2001) 497.
Jørgensen T. R., Goosen T., van den Hondel C.
A., Ram A. F. and Iversen J. J., Transcriptomic
comparison of Aspergillus niger growing on two
different sugars reveals coordinated regulation of
the secretory pathway, BMC Genomics 10 1
(2009).
Yuan X. L., Goosen C., Kools H., van der Maarel
M. J., van den Hondel C. A., Dijkhuizen L. and

Ram A. F., Database mining and transcriptional
analysis of genes encoding inulin-modifying
enzymes of Aspergillus niger, Microbiology 152
10 (2006) 3061.
Michielse C. B., Hooykaas P. J., van den Hondel
C. A. and Ram A. F., Agrobacterium-mediated
transformation as a tool for functional genomics
in fungi, Current Genetics 48 1 (2005) 1.
de Groot M. J., Bundock P., Hooykaas P. and
Beijersbergen A., Agrobacterium tumefaciensmedi ted tr nsform tion of fil mentous fungi,
Nature Biotechnology 16 9 (1998) 839.
Lazo G. R., Stein P. A. and Ludwig R. A., A
DNA transformation–competent Arabidopsis
genomic library in Agrobacterium, Nature
Biotechnology 9 10 (1991) 963.
Nguyễn hị huyến Võ hị H nh Ph m hị
Hiển M i hị
m Linh rần ứ Long rần
hị hùy Anh rịnh ất Cường rần Văn uấn
Cải tiến phương pháp tá h hiết ADN từ nấm sợi
phụ vụ huẩn đoán phân tử phân bi t
Aspergillus oryzae với Aspergillus flavus,
p
h ho h
H GHN: ho h
nhi n v
C ng ngh 31 4S (2015) 167.
White T. J., Bruns T., Lee S. and Taylor J.,
Amplification and direct sequencing of fungal
ribosomal RNA genes for phylogenetics, PCR

Đ.T.B.X. Lộc, T.V. Tuấn / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, T p 33, S 2S (2017) 8-13

Protocols: A Guide to Methods and Applications
18 1 (1990) 315.
[10] Li M., Zhou L., Liu M., Huang Y., Sun X. and
Lu F., Construction of an engineering strain
produ ing high yields of α-transglucosidase via
Agrobacterium
tumefaciens-mediated
transformation of Aspergillus niger, Bioscience,
Biotechnology and Biochemistry 77 9 (2013) 1860.
[11] Bennett J. W., An overview of the genus
Aspergillus, Caiser Academic Press, Portland, 2010.
[12] Lorang J., Tuori R., Martinez J., Sawyer T.,
Redman R., Rollins J., Wolpert T., Johnson K.,
Rodriguez R. and Dickman M., Green fluorescent

13

protein is lighting up fungal biology, Applied and
Environmental Microbiology 67 5 (2001) 1987.
[13] Tran V. T., Braus-Stromeyer S. A., Kusch H..
Reusche M., Kaever A., Kuhn A., Valerius O.,
Landesfeind M., Asshauer K., Tech M., Hoff K.,
Pena-Centeno T., Stanke M., Lipka V. and Braus
G. H., Verticillium transcription activator of
adhesion
Vta2 suppresses microsclerotia

formation and is required for systemic infection
of plant roots, New Phytologist 202 2 (2014) 565.
[14] Park S. M., Improved transformation of the
filamentous fungus Aspergillus niger using
Agrobacterium tumefaciens, Mycobiology 29 3
(2001) 132.

Identification of Biological Characteristics and Preliminary
Research on Genetic Transformation of the Aspergillus niger
TL8 Strain Isolated in Vietnam
Do Thi Binh Xuan Loc1,2, Tran Van Tuan1,2
1

National Key Laboratory of Enzyme and Protein Technology,
VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam
2
Faculty of Biology, VNU University of Science, 334 Nguyen Trai, Thanh Xuan, Hanoi, Vietnam

Abstract: Aspergillus niger is a mold commonly used in industrial production of many enzymes
and organic acids. Because this fungus can produce different extracellular enzymes to degrade plant
materials, it also causes the damages for some agricultural products at postharvest stages. In this study,
we isolated a black mold strain named TL8 from a decayed dragon fruit. Based on morphological
characteristics and the rDNA ITS (internal transcribed spacer) sequence, the TL8 strain was identified
as A. niger. The A. niger TL8 strain is able to use different carbon sources for the growth and decay
the peel of dragon fruits in vitro. In order to establish the basis for future studies on the mechanism of
plant material decomposition of the fungus, we have successfully transferred and expressed the GFP
reporter gene in this A. niger strain using the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation
method and the hygromycin resistance marker.
Keywords: Dragon fruit, Aspergillus niger, Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,
GFP reporter gene, hygromycin.