Đánh giá tính đa dạng di truyền nhờ chỉ thị phân tử rapd pcr và khả năng sinh tổng hợp sinensetin ở loài cây thuốc có tiềm năng xuất khẩu ở việt nam orthosiphon stamineus benth

Đ Ạ I H Ọ C Q U Ố C G IA H À N Ộ I

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HOC Tự NHIÊN
____________ Q ____________

ĐỀ TÀI NGHIÊN c ú u KHOA HỌC
ĐÁNH GIÁ TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỂN n h ờ c h ỉ t h i p h â n t ử
RAPD-PCR VÀ KHẢ NĂNG SINH T ổN G HỢP SINENSETIN ở LỒI
CÂY THUỐC CĨ TIỀM NĂNG XT KHAL ớ v i ệ t n a m
ORTHOSIPHON STAMINEƯS BENTH.

(BÁO CÁO TỔNG HỢP)

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Lê Duy Thành
Cơ quan chủ trì: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,
Đại học Quốc gia Hà Nội

Hà Nội, 3 - 2007

Để tài này được hoàn thành với sư tài trợ cua
Đại hoc Quốc gia Hà Nội (Mã sỏ: QG.04.28)


DANH SÁCH NHỮNG NGƯỜI THựC HIỆN ĐỂ TÀI

1. PGS.TS. Lê D uy T hành, Trường Đ ại học K h o a học Tự nhiên, Đ H Q G H N
2. TS. Đ inh Đ oàn Long, Trường Đại học K ho a học T ự nhiên, Đ H Q G H N
3. T h.s. H oàn g Thị H òa, Trường Đại học K h o a học T ự nhiên, Đ H Q G H N
4. PGS.TS. Trịnh Đ ình Đạt, Trường Đại học K h o a học Tự nhiên, Đ H Q G H N
6. TS. N g uy ễn V ăn Tập, V iện Dược liệu, Bộ Y tế
7. ThS. P hạm T h a n h H uy ền, V iện Dược liệu, Bộ Y tế

8. TS. N g u yễn Bích T hu, V iện Dược liệu, Bộ Y tế


LỜI CẢM ƠN

Đ ề tài được h o àn th àn h với sự tài trợ của Đ ại họ c Q u ố c gia H à Nội, thuộc diện
Đ ề tài đặc biệt, m ã số: Q G .04 .2 8. N h ân dịp này, tập thể cán bộ thực hiện đề tài xin
bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới sự ủng hộ và giú p đ ỡ củ a Đ ại học Q u ố c gia Hà Nội.
Trong qu á trình thực hiện đề tài, các cán bộ củ a các Ban chức n ăng thuộc Đại học
Q uốc gia Hà N ội đã luôn tạo m ọi điều kiện thuận lợi đê ch ú n g tơi hồn thành được
những cơng việc đã đ ả m nhận.
Chúng tôi cũng xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến lãnh đạo Trường Đại học
K hoa học Tự nhiên, các P h òn g ban chức năng của n h à trường, Ban chú nhiệm K hoa
Sinh học, Ban g iám đốc T run g tâm Sinh học P hân tử và C ôn g ng h ệ T ế bào đã luồn
tạo điều kiện và ủng hộ để đề tài được triển khai thuận lợi.
Cuối cùng, xin gửi lời cám ơn đến các cán bộ củ a Bộ m ô n Di truyền học,
Trường Đại học K h o a học T ự nhiên; K hoa Tài n g u y ên Dược liệu và K ho a Phân tích
tiêu chuấn, V iện Dược liệu đã úng hộ và hợp tác với c h ú n e tơi về chu n món
trong q trình thực hiện đề tài này.

Thay mặt nhóm nghiên cứu

PGS.TS. Lé Duy Thành


TÓM TẮT

ĐỂ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC
Tên Đề tài: "Đ ánh giá tính đa dạng di truyền n hờ chí thị phân tử RA PD -PCR
và khả năng sinh tổng hợp sinensetin ở lồi cây thuốc có tiềm năng xuất khẩu

của Việt N am Orthosiphon stamineus Benth.".
C hủ nh iệm đ ề tà i: PGS.TS. Lê Duy Thành

C ơ quan chủ trì đ ề tài: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN.
C ơ quan p h ố i hợp thực hiện: Viện Dược Liệu, Bộ Y tế.

Mục tiêu và nội dung của Để tài
Đ ề tài được thực hiện với các mục tiêu chính như sau: (1) Thu thập
được ít nhất 10 dòng Râu m èo từ m ột số địa phương khác nhau ở Việt
Nam; (2) X ác định k ho ản g cách (mối qu an hệ) di truyền giữa các quần
thể m ẫu bằng việc phân tích chí thị R A P D -P C R ; (3) Phân tích được sự
biến độn g về thành phần hợp chất có ho ạt tính sinh học sinensetin từ các
m ẫu thu thập được n hằm chọn ra d ị n g R âu m èo có h àm lượng dược
chất sinensetin cao phục vụ công tác bảo tồn và phát triển nguồn
n g uy ên liệu làm thuốc; (4) Bước đầu đề xu ất m ột số phư ơng án bảo tổn,
chọn, tạo g iốn g n h ằm phát triển n g u ồ n n g u y ên liệu làm thuốc từ cây
Râu m èo ở V iệt N a m trên cơ sở kết q uả đ án h giá tính đa dạng di truyền
nhờ sử dụn g chỉ thị R A P D -P C R .
C á c nội dụng nghiên cứu của đ ề tài gồm có: (1) Đ iều tra và thu thập
m ẫu thực vật từ các quần thế R âu m èo 0O ríhosiphon stam ìneus Benth.)
từ m ột số địa phương khác nhau ớ Việt N a m phục vụ cho các nghiên
cứu phân tích về cấu trúc A D N và th àn h phần hó a học, (2) N s h iê n cứu
hồn thiện q u y trình tách chiết A D N , và p hán tích chi thị R A P D -P C R
loài cây th u ố c R âu m èo ở Việt N am . (3) N g h ién cứu h ồn thiên quy
trình chiết x uất và phân tích thành p hần sin ensetin từ Orthosiphon
sĩam ineus Benth. bằng kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp R P -H P L C . (4) Xác
đ ịnh m ứ c độ k hác biệt (đa dạng) vể m ặt di tru y ề n và thành phần


sinensetin giữa các quần thể

Orthosiphon stam ỉneus Benth. củ a Việt

N am n h ằ m định hướng bảo tổn, chọn, tạo g iố ng và phát triển loài cây
thuốc q uý này ở Việt N am trong tương lai.

2. Kết quả
-

K ế t q u ả k h o a h ọ c : Đ ã thu thập được 10 d ò ng Râu m èo (Orthosiphon
stamineus Benth.) trồng tại các địa phương khác nhau ở Việt N am (H à Nội,
Thanh Hóa, Phú Thọ, Q u ản g Nam ). K ết q uả p hân tích R P -H P L C cho thấy
dược chất sinensetin có m ật trong dịch chiết lá củ a tất cả các dò n g R âu m èo
thu thập được. Tuy vậy, hàm lượng hợp chất này rất dao độn g, từ 0,00 2 % đến
0 ,1 88 % (hàm lượng chất khơ). Sinensetin cũng có trong thân, nhưng chỉ ở
hàm lượng vết (thấp hơn k ho ản g 30 lần so với lá). Trên cơ sở kết quá phân
tích R P -H P L C đã chọn lọc được dòng T H 0 (thu ở T h a n h H óa) có hàm lượng
sinensetin cao nhất.

-

Đ ã xây

dựng

được q uy trình tách chiết A D N và p hân tích chỉ thị R A P D -P C R

nhằm đánh giá tính đa d ạng di truyền và xác định k h o án g cách di truyền
giữa các d ò n g R âu M èo khác nhau được thu thập trong n g h iên cứu. K ết q
phân tích cho thấy các dịn g R âu M èo hiện có ở m iền Bắc nước ta có tính đa

dạng di truyền k h ơ n g cao và tương q uan với vị trí phân b ố ở các địa phương.
-

K h ơn g có sự tương q u an chặt giữa sự biến đ ộ n g về h à m lượng sinensetin và
sự khác biệt về m ặt di truy ền của dòn g R âu M èo k h ác n h au cho thấy có thê
các yếu tố m ơ i trường đã có ảnh hưởng trực tiếp (bên cạn h yếu tố về kiểu
gen) đến k hả n ăn g tổn g hợp và tích lũy sinen setin ở cây R âu M èo.
Kết q u ả n g h iên cứu của đề tài đổng thời k h ẳn g định: m ơ hình sử dụng
các kỹ thuật p hân tích chỉ thị phân tử (A D N ), h ó a học và m ộ t số biện pháp
công nghệ sinh học, nh ư nuôi cấy m ô thực vật in vitro có thế được áp dung
n h ằm m ục đích bảo tồn. phát triển n e u ồ n gen cây dược liệu và tiêu chuẩn
hóa nguồn n g u y ên liệu làm thuốc từ các loài th áo dược ơ Việt N am trong
tương lai.
- K ế t q u ả ứ n g d ụ n g : T hiết lập được 01 q u y trình kỹ th uật chiết xuất và phán
tích dược chất sin en setin từ các dịn g R âu m èo ở V iệt N am . 01 quv trình

IV


p hân tích chỉ thị A D N từ các dò n g R âu m èo ở Việt N a m bàng phương pháp
R A P D -P C R .
- K ế t q u ả đ à o tạo: Đ ào tạo được 01 Cử n hân hệ Đ ào tạo Cứ nhân K hoa học
Tài năng (SV. T rần T uấn Tú, K hoá 7, tốt n g h iệp n ăm 2006). Đ ang tiếp tục
đào tạo m ột NC S T iến sĩ (ThS. V ũ H oài Sâm, K h o a Sinh học Trường Đ ại học
K h oa học Tự nhiên).
- K ế t q u ả cô n g bố: Đ ã công b ố được 01 bài b áo T iến g A nh trên Tạp chí
K hoa học, Đ ại học Q u ốc gia H à Nội; 02 bài b áo Tiếng A n h khác được cơng
b ố trên Tạp ch í K ho a học, Đại học Q uốc gia H à N ội có m ột phần nội dung
liên quan đến đề tài.

3. Tình hình sử dụng kinh phí:
- Số kinh phí đã được cấp: 60 .0 0 0 .0 0 0 đồng (Sáu mươi triệu đồng).
- Số kinh phí đã sử dụng : 60.000.000 đổn g (Sáu mươi triệu đồnạ).

Đã thanh quyết toán

Khoa quản lý

Chủ nhiệm đề tài

PGS.TS. Lê Duy Thành
T R Ư Ờ N G Đ A I H Ọ C K H O A H O C TI
T ự N H IÊ N

V


SUMMARY

SCIENTIFIC RESEARCH PROJECT

1. Title o f project

: “A ssessm en t o f genetic p o ly m o rp h ism o f V ietnam ese

exportable m edicinal plant Orthosiphon stam ineus Benth. using R A P D -P C R
m arkers in relation with the biosynthesis o f sinesetine”

2. Number code: QG.04.28
3. Grant holder: Prof. Dr. Le Duy Thanh

4. Instỉtutỉon: Hanoi University o f Science, Vietnam National ưniversity.
Associated institution: Vietnam Institute o f Medicinal Materials, Ministry o f
Health.

5. Objects and contents of project
O b ịe c ts : (1) collection o f at least ten accessions o f O rthosiphon stam ineus Benth.
from different locations in V ietnam ; (2) determ in atio n o f genetic distance o f the
population sam ples using R A P D -P C R m arkers; (3) analysis o f variation o f the
content o f bioactive c o m p o u n d - sinensetin fro m the collected sam ples, in order
to find the accession s w hich have high con ten t o f sinensetin and use for
conservation

and

d ev elo p m en t

of

m edical

m aterials

resource;

(4)

first

proposition o f som e m eth o d s for conservation, selection and breeding, aim ed for
the dev elo pm en t the m ed ical m aterials from O rthosiphơn stam ìneus in V ietnam

and evaluation o f the genetic diversity using R A P D -P C R .
C o n ten ts: (1) Investigation and collection o f plant sam ples fro m populations of
Orthosiphon stam ineus Benth. in different locations oí' V ietnam . w hich used for
analysis o f D N A ch aracterizatio n and ch em ical com p o sitio n s; (2) Study for
co m pletion o f D N A extraction procedure, an aly sis o f R A P D -P C R m ark ers from
O rthosiphon stam in eu s Benth.; (3) Study for co m p letio n o f extractio n procedure
and co m p o sitio n an aly sis o f sinensetin from O rtliosiphon stam ineus Benth.
using R P -H P L C m ethod; (4) Identification o f gen etic d iv ersity and variaties of
VI


sinensetin con ten t in Orthosiphon stamineus Benth. fro m different populations
in V ietnam , aim in g to the direction o f conservation, selection, breeding and
d evelop m ent o f this valuable m edicinal plant in V ietn am in future.

6. Results
- Scientific results :

(1) Collected ten accessions o f O rthosiphon stamineus

Benth., w hich are plated at different areas in V ietn am (H anoi, T hanh Hoa, Phu
T ho and Q u an g N am ). The results o f R P -H P L C analysis shovved that sinensetin
exists in extract from

leaves o f all collected accession s

o f Orthosiphon

stamineus Benth. H ow ever, these contents are variable, fro m 0 .0 0 2 % to 0.18 8%
(dry m aterials). Sinensetin presents in stem, but in trace co n ten t (low er 30 times

than that in leaves). Based on results o f R P -H P L C analysis, we have collected
the accession T H 0 (collected from T hanh H oa), w hich has h ig h est sinensetin
content. (2) D esigned the D N A extraction and R A P D -P C R analysis procedure,
used for assessm ent o f genetic diversity and identification o f genetic distance of
different accessions o f Orthosiphon stam ineus Benth.. The results show that
accessions o f O rthosiphon stam ineus Benth. p resenting in N othern o f V ietnam
have low genetic diversity and co rresponding to locations o f their distibution. (3)
T here is no close c o rresp o n d en ce betv/een the variation o f con tent o f sinensetin
and difference o f gen etic characteristics o f d ifferent accesstion s o f Orthosiphon
stamineus, w hich reflects the direct affection o f e n v iro n m e n ta l factors to
potential o f syn thesis and acu m m u latio n o f sinensetin in O rthosiphon stamineus.
The results co n firm e d that the m od el o f an aly sis te c h n iq u e s using m olecular
m ark er (D N A ), ch em ical m ark ers and b io tech n o lo g y as in vitro plant tissue
propagation could be used for conservation, d ev elo p m en t gene pool o f m edicinal
plants and stan dardization o f m aterials from m edicinal plants in V ietnam .
- A p p lie d results: E stab lism en t o f 01 proced ure o f ex tractio n and analysis of
sinensetin from V ietn am Orthosiphon stam ineus, 01 p ro ced u re o f analysis D N A
m a rk e r from O rthosiph on stam ineus u sin s R A P D -P C R m eth od .


- Training resu lts: 01 Bachelor (H o no r B achelor T rain in g P rog ram in Biological
Sciences - T ran T u a n Tu, 6 lh Course, 2006), 01 PhD student in progress.

- Publications: 01 paper (in English) publised in the Jounal o f Science, V N U
(2006); 02 o ther related papers published also in the Jounal o f Science, V N U
(2005 and 2006).

Grant holder

Assc. Prof. Dr. Le Duy Thanh

V 111


M Ụ C LỤC
T rang
Mở đ ầ u ...........................................................................................................................................

1

1. Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngồi n ư ớ c .....................................................

4

1.1. Tổng quan về cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus B en th .).............................

4

1.1.1. Phân loại học thực vật, phân bố và tên g ọ i .....................................................

4

1.1.2. Hình thái học thực v ậ t ..........................................................................................

5

1.1.3. Trồng t r ọ t ................................................................................................................

6

1.1.4. Công dụng trong y học cổ tr u y ề n .....................................................................

6

1.1.5. Các hợp chất sinh học đã b i ế t ............................................................................

7

1.1.5.1. Các hợp chất íla v o n o id ...............................................................................

7

1.1.5.2. Các hợp chất d ite rp e n ..................................................................................

8

1.1.5.3. Các hợp chất k h á c .........................................................................................

9

1.1.6. Các nghiên cứu về dược lý học và lâm s à n g ...................................................

10

1.1.7. Các chỉ định sử dụng trong chữa b ệ n h .............................................................

13

1.2. Sử dụng chỉ thị ADN (RAPD-PCR) và hóa học trong nghiên cứu phát triển
các loài cây dược l i ệ u ..................................................................................................

15

1.2.1. Giới thiệu c h u n g ...................................................................................................

15

1.2.2. Chỉ thị ADN và hóa học trong cơng tác kiểm định dược l i ệ u ...................

17

1.2.3. Chỉ thị ADN trong nghiên cứu đa dạng di truyền cây th u ô c s ...................

19

1.2.4. Sử dụng các chi thị RAPD-PCR và hóa học trong chọn, tạo giống cây
t h u ố c .........................................................................................................................

19

1.2.2. Chi thị ADN và hóa học trong cơng tác kiểm định dược l i ệ u ...................

17

1.3. Các nội dung nghiên cứu của đề t à i ...........................................................................

20

2. Thời gian, địa điểm và phương pháp nghiên cứu ............................................................

22

2.1. Thời gian n g h iê n c ứ u ..............................................................................................................

22

2.2. Đ ịa điểm n g h iê n c ứ u ................................................................................................................

22

2.3. Phương pháp nghiên c ứ u ...............................................................................................

22

2.3.1. Chuẩn bị mẫu thực v ậ t .........................................................................................

22

2.3.2. Các hợp chất sử dụng trong nghiên c ứ u ...........................................................

23

2.3.3. Chiết xuất và phân tích thành phần sinensetin băng R P - H P L C .................

23

2.3.4. Các thí nghiệm phân tích chỉ thị R A P D -P C R .................................................

26

3. Kết quả và bàn l u ậ n .................................................................................................................

28

3.1. Kết quả điều tra và thu thập cây Râu Mèo ờ các địa p h ư ơ n s ..............................

28

3.2. Phân tích thành phđn sinensetin trong các dịng Râu mèo Việt N a m ................

31

IX


3.2.1. Chiết xuất và phân tích sinensetin bằng phương pháp R P -H P L C .............

31

3.1.2. Thành phần sinensetin trong các dòng Râu mèo thu thập ở Việt Nam ...

32

3.3. Kết quả phân tích tính đa dạng di truyền nhờ chỉ thị R A P D -P C R ....................

34

3.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng s ố ........................................................................

34

3.3.2. Kết quả phân tích R A P D -P C R ..........................................................................

35

3.4. Đề xuất phương án bảo tồn, chọn giống, nhân giống nhằm mở rộng sản xuất
cây Râu M è o ...................................................................................................................

39

4. Kết luận và đề nghị ................................................................................................................

41

4.1. Kết l u ậ n ...........................................................................................................................

41

4.2. Đề n g h ị.............................................................................................................................

42

5. Tài liệu tham k h ả o ..................................................................................................................

43

X


BẢNG CÁC KÝ HIỆU VÀ TỪ VIẾT TẮT

ADN

Axit deoxyribonucleic

cs.

cộng sự

ED50

Liều hiệu lực 50%
(.effective dose)

FDA

Cơ quan thực phẩm và dược phấm Hoa Kỳ

HIV

Virut gây suy giảm miễn dịch ớ người
(human immunodefìciency virus)

HPLC

Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp
(high per/orm ance liquid chromatography)

RP-HPLC

Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp đảo pha

(reverse-phase high perỷormance liquid chromatography)

LD50

Liều gây chết 50%
(,lethal dose)

M

Mole

MeOH

Methanol

PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp khuếch đại ADN
(polym erase chain reaction)

RAPD

Đa hình độ dài ADN khuếch đại ngẫu nhiên
(random ampliỷied polymorphism o fD N A )

RAPD-PCR

Giống RAPD

RP-HPLC

Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp đảo pha
(reverse phase higlì perỷormance liquid chromatographv)

SD

Phương sai tiêu chuẩn
(Standard deviation)

TLC

Sắc ký lớp mỏng
(thin lơỵer chromatography)

SE

Sai số tiêu chuẩn trung bình
(.Standard error o fth e means)

UV-VIS

Dải ánh sáng vùng cực tím và nhìn thấy
(,uỉtravioìet - visible wavelength)

XI


DANH M Ụ C CÁ C BẢNG
T rang
Bảng 1. Danh sách và địa điểm các dòng Râu mèo 0Orthosiphon stamineus Benth.)

được thu thập và sử dụng trong nghiên c ứ u ........................................................
23
Bảng 2. Danh sách các mồi RAPD-PCR được sử dụng trong nghiên c ứ u ...................
Bảng 3. Danh sách các địa điểm điều tra và thu thập các dòng Râu mèo tại một số tinh
miền Bắc và tại tỉnh Quảng N a m ..............................................................................
Bảng 4. Hàm lượng sinensetin trong các dòng Râu mèo thu thập ở Việt N a m .............
Bảng 5. Dịch chiết ADN tổng số thu được từ 10 dòng Orthosiphon stamineus Benth..
Bảng 6. Số băng ADN được khuếch đại bằng kỹ thuật RAPD-PCR thu được từ 10
dòng Râu mèo được thu thập ở Miền Bấc và Miền Trung, Việt N a m .............
Bảng 7. Hệ số khoảng cách di truyền giữa các dòng cây Râu Mèo (Orthosiphon
stamineus Benth.) thu thập ở Việt Nam dựa trên chỉ thị RAPD-PCR ....... ........

26
28
33
34
36
38

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. Hình thái lá cây Râu mèo Orthosiphon stamineus Benth....................................

5

Hình 2. Hình thái hoa của Orthosiphon stamineus Benth..................................................

5

Hình 3. Dược liệu được thu hái từ cây Orthosiphon stamineus Benth..........................

6

Hình 4. Cấu trúc hố học của các hợp chất ílavonoid và dẫn xuất tìm thấy ở Râu mèo ...

8

Hình 5. Cấu trúc hố học của các hợp chất diterpen và dẫn xuất tìm thấy ở Râu m è o ....

9

Hình 6. Một số hợp chất sinh học khác tìm thấy ở cây Orthosiphon stamineus Benth....

10

Hình 7. Một số biệt dược và chế phẩm được bào chế từ cây o . stamineus Benth.............

14

Hình 8. Quy trình chiết xuất Aavonoid tổng số từ cây Râu mèo o . stamineus Benth......

24

Hình 9. Sơ đồ tóm tất quy trình phân tích sinensetin từ các dịch chiết Râu mèo (0 .
stamineus Benth.) bằng kỹ thuật RP - H P L C ........................ ...............................

25

Hình 10. Các dịng Râu Mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) THn thu tại vườn trồng
của người dân tại Thanh Hóa và dịng HN| thu tại Hà N ộ i ...................................

29

Hình 11. Hình ảnh các mẫu cây Râu Mèo (■Orthosiphon stamineus Benth.) thu tại
Thanh Hóa (ảnh trái) và Phú Thọ (ánh phải) được đưa về Phịng thí nghiệm
tiến hành phân tích chỉ thị RAPD-PCR và thành phần sin en setin .......................

3Q

Hình 12. Đường biếu diễn mức độ tuyến tính và chính xác cúa phương pháp phân
tích H P L C .........................’...................................................................... . ...........*.......

31

Hình 13. Phổ hấp thụ UV-VIS của hợp chất sin en setin .....................................................

32

Hình 14. Phổ sắc ký RP-HPLC của hợp chất sinensetin chuấn và của dịch chiết
ílavonoid tổng số từ lá của dịng Râu mèo TH0.....................................................

33

Hình

35

7

15. Ảnh điện di dịch chiết ADN tốns số từ các dòng Râu m èo .............................

Hình 16. Mối quan hệ di truyền đươc xác định trên cơ sớ chi thị RAPD-PCR giữa 10
dòng Râu M èo ..........................................................................................................
xii

37


Hình 17. Tính đồng hình di truyền giữa các dịng Râu Mèo được phán ánh bới phổ
điện di c á c phân đoạn ADN được khuếch đại bằng các mồi RAPD là OPA18 và O P C -4 ...........'.................... ’.................... .........................................

38

Hình 18. Tính đa hình biểu hiện qua phổ điện di RAPD-PCR các dịng Râu Mèo khác
nhau có ADN được khuếch đại bằng các mồi OPA-5 và O PC -1 8 .....................

38

Hình 19. Tính đa hình biểu hiện qua phổ điện di RAPD-PCR các dịng Râu Mèo khác
nhau có ADN được khuếch đại bằng các mồi OPA-3 và O P C -IO ......................

39

X111


MỞ ĐẦU
Ở nước ta nói riêng và trên thế giới nói chung, việc sử dụng các chỉ thị phàn tử, đặc
biệt là các chỉ thị A DN (như RAPD-PCR, RFLP, AFLP, SSR, ...) đã và đang ngày càng
được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học, xác
định đặc trưng cá thể và khoảng cách di truyền giữa các cá thể hoặc quần thể thực vật

nhằm mục đích định hướng bảo tồn và chọn tạo giống.
So với các chỉ thị truyền thống (chỉ thị hình thái, chỉ thị izozym), các chỉ thị ADN
có một số ưu điểm nổi bật như sau: 1) Dễ thực hiện trong điều kiện phịng thí nghiệm,
trong đó đặc biệt là chỉ thị RAPD-PCR là phép phân tích nhanh, đơn giản, có chi phí
tương đối thấp; 2) Khơng phụ thuộc vào các yếu tố môi trường (là các yếu tô' thường ảnh
hưởng đến sự biểu hiện của kiểu gen); 3) Không phụ thuộc vào hiện tượng tương tác giữa
các gen và hiệu quả biểu hiện kiểu hình của các gen (chẳng hạn như các gen đột biến,
gen gây chết, gen lặn thường không biểu hiện trong tự nhiên); 4) Có thể phát hiện được
các dạng biến dị ADN trong các giai đoạn phát triển khác nhau hoặc giữa các cơ quan
khác nhau ở thực vật.
Đối với phần lớn các loài cây thuốc, phương pháp thu hái hiện nay chủ yếu từ các
nguồn nguyên liệu mọc hoang dại nên không rõ về bản chất di truyền, thành phần hoá
học cũng như hoạt tính sinh học. Phương pháp thu hái này còn bộc lộ nhiều nhược điểm,
chẳng hạn như: 1) Việc thu hái bừa bãi khơng có quy hoạch dẫn đến nguy cơ mất đi các
nguồn tài nguyên di truyền. Do vậy, nhiều loài cây thuốc quý hiếm dễ dàng trở nên có
nguy cơ tuyệt chủng; 2) Các nguồn nguyên liệu từ các cây mọc hoang dại không đáp ứng
được yêu cầu của công nghiệp dược phẩm chất lượng cao, do nguồn nguyên liệu ban đầu
thường không ổn định và không kiểm soát được về mặt hoá học, hoạt chất sinh học, hoạt
lực sinh học, cũng như độc tính; 3) Các dạng nguyên liệu hoang dại có nguy cơ nhiễm
độc với các nguồn hoá chất độc khác nhau, như chất diệt cỏ, chất trừ sâu, các chất thải
cơng nghiệp, thậm trí chất phóng xạ ... và thực tế tình trạng này hiện nay ở nước ta
khơng kiểm sốt được; 4) Dược liệu thu thập hoang dại có nguy cơ nhiễm với các dạng
vi sinh vật (nấm, vi khuẩn), vì vậy có thể mang theo các nguồn chất độc khác ngoài ý
muốn; v.v...
Trong hồn cảnh đó, một trong những u cầu hàng đầu hiện nay của nền công
nghiệp dược phẩm dựa trên các sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên là yêu cầu tiêu chuán
hóa nguồn nguyên liệu ban đầu. Trong đó, việc xác định thành phần các hợp chất có hoạt
tính sinh học, hoạt lực sinh học và độc tính, cũng như cơng tác chọn tạo giống có vai trị
1

hết sức quan trọng. Trên cơ sở tiêu chí này, nhiều sản phẩm dược phẩm từ các loài cây
thuốc hiện nay trên th ế giới đang được định hướng sản xuất dựa trên tiêu chuẩn về thành
phần các hợp chất có hoạt tính sinh học đã biết. Tuy vậy, trong nhiều trường hợp, việc
chỉ sử dụng các chỉ thị hóa học cũng có nhược điểm là bản thân q trình sinh tổng hợp
các hợp chất sinh học thứ cấp có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường. Vì vậy, khi
trồng các dịng cây thuốc có cùng nguồn gốc (vật liệu di truyền tương tự nhau) nhưng ở
các điều kiện sinh thái và khí hậu khác nhau, hiệu suất thu hoạch các hợp chất sinh học
thứ cấp có thể khác nhau và ngược lại, dẫn đến việc có thể đánh giá nhầm mức độ đa
dạng của một loài cây thuốc nếu chỉ dựa vào các chỉ thị hoá học .... Trong khi đó, các
dấu chuẩn ADN do khơng bị ảnh hưởng bởi các nhân tố môi trường là một cơng cụ có
thể khắc phục được hiện tượng này.
Cây Râu mèo (Orthosiphon stơmineus Benth) là loài cây thuốc thuộc họ Lamiaceae
phân bố rộng rãi trên nhiều vùng ở nước ta. Gần đây, loài cây thuốc này và các chế phẩm
của nó đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của m ột số phịng thí nghiệm trên thê
giới. Trong y học cổ truyền của các nước Đông Á (Trung Quốc, Ấn Độ, M alaysia, Thái
Lan, Việt Nam), Râu m èo được sử dụng trong điều trị m ột số rối loạn đường tiết niệu, trị
bệnh sỏi thận, bệnh đái tháo đường, và bệnh huyết áp cao. Ở các nước châu Âu và Nhật
Bản, lá của loài cây thuốc này được sử dụng cho mục đích lợi tiểu. Trên cơ sở đó, dịch
chiết lá và dược chất sinesetin của loài cây Orthosiphon stamineus đã được ghi nhận
trong dược điển m ột số nước Châu Âu để điều trị một số rối loạn đường tiết niệu. Một số
nghiên cứu gần đây cũng chứng minh tác dụng gây độc đối với tế bào ung thư ruột kết
của dịch chiết m ethanol của cây Râu mèo cho thấy tiềm năng sử dụng các chế phẩm của
nó trong điều trị ung thư. Từ những hiểu biết trên đây, trong nhưng năm qua ở nước
ngoài cũng như ở Việt Nam, dược liệu từ Râu mèo đã được m ột số công ty dược phẩm
phát triển thành m ột số biệt dược hoặc thực phẩm chức năng dùng trong điều trị các
chứng bệnh đường tiết niệu, đặc biệt là bệnh sỏi thận, như Uriphron® (Phytopharmica,
Mỹ), Kim Tiền Thảo - Râu mèo® (Fidopharm, Việt Nam ), Râu mèo - Chuối hột®
(Domesco, Việt Nam ), v .v ...
Về thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học, phần lớn các nghiên cứu đến nay

đã xác định tác dụng lợi niệu của các dịch chiết từ cây râu m èo có liên quan đến nhóm
hợp chất polyphenol, trong đó đáng quan tâm nhất là các hợp chất ílavonoid là sinesetin.
eupatorin, và các dẫn xuất của axít caffeic, axit rosm arinic, và axit cichoric. Hiện nay.
Indonesia đang là các nước xuất khẩu lớn nhất các chế phẩm từ Râu mèo sang thị trường
2


Châu Âu và Bắc M ỹ ... Hàm lượng senensetin thường được dùng làm tiêu chí để đánh
giá chất lượng các nguồn dược liệu có nguồn gốc từ Orthosiphon stamineus. Riêng Việt
nam, trong vài năm qua cũng đã bắt đầu xuất khẩu được dược liệu từ Râu mèo. Năm
2002, sản lượng xuất khẩu Râu mèo của nước ta đạt gần 50 tấn (tương đương doanh thu
là 100.000 USD). Tuy vậy, sản lượng xuất khẩu này còn thấp so với tiềm năng phát triển
của loài cây dược liệu này ở Việt Nam (theo số liệu của Bộ Y Tế, 2003).
Về các nghiên cứu cơ bản, cho đến nay ngoài một số nghiên cứu điều tra tương đối
rời rạc phân bố của lồi cây Râu mèo, có thể nói ở nước ta chưa có m ột nghiên cứu nào
được tiến hành nhằm đánh giá sự đa dạng về cấu trúc di truyền, thành phần hố học và
hoạt tính sinh học của lồi cây thuốc này. Việc ứng dụng các dấu chuẩn di truyền hiện
nay còn chưa được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu các lồi cây thuốc ở Việt nam nói
chung. Đây chính là m ột trong những trở ngại cho việc định hướng và xây dựng chương
trình chọn tạo giống và tiêu chuẩn hố nguồn dược liệu từ các lồi cây thuốc phục vụ
cho q trình cơng nghiệp hóa, hiện đại hóa nền y-dược học cổ truyền ở nước ta.
Trong hoàn cảnh như vậy, việc tiến hành thu thập, phân tích mức độ đa dạng di
truyền và thành phần hố học ở loài cây Râu mèo (Orthosiphon stamineus) sẽ là cơ sở
cho việc định hướng bảo tổn, chọn tạo giống và tiêu chuẩn hóa các nguồn dược liệu từ
lồi cây thuốc này nói riêng, và xây dựng một mơ hình sử dụng các chỉ thị phân tử trong
việc nghiên cứu đánh giá và tiêu chuẩn hoá các nguồn dược liệu từ các lồi cây thuốc
của Việt nam nói chung. Đây là lý do để chúng tôi lựa chọn và tiến hành thực hiện đề tài

“Đánh giá tính đa dạng di truyền nhờ chỉ thị phân tử RAPD-PCR và khả năng sinh
tổng hợp sinensetin ở lồi cây thuốc có tiềm năng xuất khẩu ở Việt Nam

Orthosiphon stam ineus B en th .” .

3


1. TỔNG QUAN TÌN H HÌNH NGHIÊN c ứ u TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1. TổNG QUAN VỂ CÂY RÂU MÈO (Orthosiphon stamineus Benth.)
1.1.1. Phàn loại học thực vật, phân bô và tên gọi
Cầy Râu mèo (Orthosiphon stamineus Benth.) là loài cây thuốc thuộc chi Orthosiphon
Benth., họ Lamiaceae, lớp hai lá mầm Dicotyledonae. Chi này gồm khoảng 40 loài, phân bố
rải rác ở nhiều vùng nhiệt đới Châu Á, Châu Phi và Châu Đại Dương. Vùng nhiệt đới Đông
Nam Á được coi là nơi tập trung và có tính đa dạng cao nhất các lồi của chi Orthosiphon,
trong đó riêng ở nước ta đã có 8 lồi được phát hiện. Đây là một lồi cây nhiệt đới tương đối
điển hình tìm thấy mọc tự nhiên ở Indonesia, Ấn độ, Malaysia, Thái lan, các nước Đông
Dương và ở một số nước Châu Phi. Ngồi ra, cây cịn được trồng ở Indonesia, Ấn độ, Thái
lan, Malaysia, CuBa và gần đây là Nhật Bản. Ở nước ta, cây được trồng ở một sô' nơi nhưng
chỉ mang tính tự phát chưa có quy hoạch (Đỗ Huy Bích, 2004).
Theo điều tra của Viện Dược liệu khoảng 5 năm trước đày, Râu mèo phân bố rải rác ở
một số tỉnh như Cao Bằng, Thanh Hóa (Vĩnh Lộc); Hà Tây (Ba Vì); Lâm Đồng, Phú n
(Tuy Hịa); Vũng Tàu — Côn Đảo (Bà Rịa); Ninh Thuận (Phan Rang); Kiên Giang (Phú
Q u ố c)... Cây ưa ẩm, ưa sáng và có thể hơi chịu bóng, thường mọc trên đất giàu chất mùn ớ
ven rừng, gần bờ nước hoặc trong thung lũng. Độ cao phân bô' của cây từ khoảng 10 m (ở
Phú Yên) đến 600 m (ở Cao Bằng) so với mặt nước biển.
Nguồn dự trữ Râu mèo tự nhiên ở Việt Nam hiện nay không đáng kể. Dược liệu từ loài
cây này chủ yếu do trồng trọt. Indonesia hiện là nước trồng và xuất khẩu Râu mèo nhiều
nhất, với sản lượng xuất khẩu hàng năm đạt khoảng 200 tấn dược liệu khô.
Trong các tài liệu về phân loại học thực vật, loài cây Râu mèo ngoài tên Orthsiphon
stamineus Benth. còn được biết đến dưới một số tên đồng nghĩa khác, chẳng hạn như
Orthosiphon aristatus, Ortỉĩosiphon spicatus, Orthosiphon spiralis. Ngồi ra, đơi khi bị

dùng nhầm để chỉ các loài Clerodendranthus spicatus (Thunb) C.Y.Wu ex H. w . Li,
Ocimum aristatum Blume, Ocimum grandiỊỉorum Blume, Orthosiphon grandiýìorus
(Blume) Boldingh. ex Heyne. Sở dĩ như vậy chủ yếu là do sự giống nhau về hình thái giữa
những lồi này.
Do cây Râu mèo đã và đang được sử dụng từ lâu đời trong nền y học cổ truyền ở nhiều
nước (như Trung quốc, ấn độ, Thái lan, Malaysia, Việt Nam, Indonesia,...) đồng thời cũng
được những người Châu Âu bắt đầu biết đến từ khoảng 1000 năm trước, cho nên đến nay
loài cây này được gọi với nhiều tên gọi địa phương khác nhau, như java tea,javatee, kidney

4


tea (Hawaii, Ấn Độ); kumis kuching, kumis
kucing, misai kucing, misai kuching hay
remurung (Malaysia); Yaa Nuat Maeo,
Koemis Koetjing (Indonesia); Secho hay
Myit-Shwe ở Malaysia; Orthosiphon-blatter
hay Indisher Nierentee (Đức, Áo, Thụy sĩ);
Feuilles de Barbiflore (Pháp); v.v. .. Trong
khi đó ở nước ta, trong dân gian tên Râu
mèo được dùng chung để gọi tên các loài
cây thuộc chi Orthosiphon và cả dược liệu
chế biến từ chúng.

1.1.2. Hình thái học thực vật
Cây Orthosiphon stamineus Benth. có
đặc điểm hình thái cơ bản như sau: thân

Hình 1. Hình thái lá cây Râu mèo
Orthosiphon stamineus Benth.

thảo, sống lâu năm, cao trung bình 0,3 - 0,5
mét, tuy nhiên đơi khi có thể mọc cao đến
1,5 mét. Thân mảnh cứng hình vng, mọc
đứng, thường có màu nâu tím, nhẵn hoặc có
ít lơng, ít phân cành. Lá mọc đối hình trứng,
dài 4 —6 cm, rộng 2,5 —4 cm, gốc tròn, đầu
nhọn, mép khía răng to, gân lá hơi nổi rõ ở
mặt dưới, cuống lá thường dài 3 - 4 cm
(Hình 1)
Cụm hoa mọc thẳng ở ngọn thân và
đầu cành, dài khoảng 8 - 1 0 cm, gồm 6 —
10 vòng, mỗi vịng có 6 hoa màu trắng hoặc
hơi tím; lá bắc nhỏ rụng sớm; đài hình
vng có 5 răng, răng trên rộng toẽ ra
ngồi; tràng hình ống hẹp, thảng hoặc hơi
cong, dài 2 cm, môi trên chia 3 thùy, môi
dưới nguyên; nhị mọc thị ra ngồi hoa, dài

Hình 2. Hình thái hoa của Orthosiphon
slamineus Benth.

gấp 2 —3 lần tràng, chỉ nhị mảnh, nhần; vịi
nhụy dài hơn nhị (Hình 2).

5


1.1.3. Trồng trọt
Râu mèo thích hợp với nhiều loại đất, ưa khí hậu nóng, ẩm, sinh trưởng mạnh vào

mùa hè và mùa thu, nhưng không chịu được úng.
Cây được trồng bằng thân cành vào khoảng tháng 2 — 3 hàng năm. Đất được cày
bừa kỹ, nhặt sạch cỏ, lên luống cao 20 — 25 cm, rộng 0,8 — 1,0 m, bón lót một lượng
phân chuồng kèm NPK. Các đoạn thân cành gồm 3 —4 mắt được trồng ở độ sâu 5 - 7
cm với khoảng cách khoảng 30 X 40 cm. Trồng xong, tưới ngay và duy trì độ ẩm trong 1
- 2 tuần đầu cho đến khi cây mọc đểu. Trong 1 — 2 tháng đầu, khi cây chưa phủ kín
luống, cần làm cỏ và tưới thúc 2 —3 lần bằng nước giải hoặc phân chuồng pha loãng. Sau
mỗi ỉần thu hái, tỉa bớt thân cành và bón thúc. Khi trời mưa to, tháo nước kịp thời.
Dược liệu thu hoạch bao gồm lá và phần thân trên mặt đất, thu hái trước khi cây ra
hoa, sấy khơ. Có thể thu hoạch 5 - 6 lứa / 1 vụ hè (Đỗ Huy Bích và cs., 2004).

1.1.4. Cơng dụng trong y học cổ truyền
Theo kinh nghiệm dân gian, Râu
mèo đưực dùng làm thuốc lợi tiểu trong
điều trị viêm thận, sỏi thận, sỏi mật, tê
thấp, phù thũng, viêm gan. Tài liệu Ấn
Độ coi dịch hãm lá Râu m èo là thuốc
điều trị đặc hiệu các bệnh thận và bàng
quang, ngồi ra cịn dùng điều trị bệnh
thấp khớp và bệnh gút.

Trong một số bài thuốc y học cổ
truyền Việt Nam, Râu mèo được sử dụng
trong điều trị các bệnh sỏi thận, chứng
phù nề, sốt ban cua, cúm, thấp khớp,
viêm gan, vàng da và sỏi mật (Nguyễn
Huy Bích và cs, 2004). ở Indonesia, lá
Râu m èo đưực dùng là thuốc lợi tiểu,

Hình 3. Dược liệu được thu hái từ cây

Orthosiphon stamineus Benth.

điểu trị thấp khớp, tiểu đường và cao

huyết áp. Trong khi ở M yanm a, cày này thường được dán địa phương dùng chú yếu để
điểu trị chứng tiểu đường, hoặc sắc nước uống trong điểu trị các bệnh thận và đường tiết
niệu (Banskota et al., 2003).

6


Trong m ột số bài thuốc y học cổ truyền Việt Nam, Râu mèo được sử dụng như sau:
lấy 5 - 12 g lá hãm với nước sôi, chia làm 2 lần uống trước khi ăn cơm 1 5 - 3 0 phút. Nên
uống lúc dịch hãm cịn nóng, hoặc sắc nước uống, thường dùng liên tục 8 ngày, nghỉ 2 4 ngày lại tiếp tục nếu cần thiết. Có thể nấu thành cao lỏng, mỗi ngày dùng 2 - 5g cao.
Cao lỏng Râu m èo được dùng làm thuốc hạ đường huyết trong bệnh tiểu đường. Nếu
dùng cả cây Râu m èo thì liều lượng hàng ngày là 30 - 40g, dùng riêng hoặc phối hợp với
các vị thuốc khác.
Một số tài liệu cho rằng khi thu hái dược liệu từ cây Râu mèo, nếu cây ra hoa thì
phải ngắt bỏ hoa vì hoa làm giảm lượng hoạt chất trong lá.

1.1.5. Các hợp chất sinh học đã biết
Các nghiên cứu về các hợp chất sinh học ở cây Râu mèo được tiến hành từ rất sớm,
ngay từ những năm 1930. Cho đến nay, các nhóm chất sau đã được phát hiện và nghiên
cứu nhiều nhất: các diterpen kiểu isopimarane và stam inane, triterpene, saponin,
ílavonoid, các dẫn xuất của axit cinnamic, và chromen.
7.7.5.7. Các hợp chấtfỉavonoid
Một số hợp chất thuộc nhóm ílavonoid (Hình 4) được tìm thấy khá phổ biến ở
Orthosiphon stamineus Benth.. M alterud và cs. (1989) là nhóm nghiên cứu đầu tiên phát
hiện và tách chiết được 8 hợp chất ílavonoid từ lồi cây này, bao gồm sinensetin (1),
tetramethylscutellarein (2), eupatorin (3), 5-hydroxy-6,7,3’,4’-tetramethoxyflavone (4),

salvigenin (6), 5,7,4’-trim ethoxyflavone (7) và 5,7,3’,4’-tetram ethoxyflavone (8), trong
số đó thì hai hợp chất là sỉnensetin và tetramethylscutellarein là phổ biến nhất. Một sô
tác giả khác cũng tìm thấy sinensetin và tetram ethylscutellarein cùng với cirsimaritin,
pillion và rham nazin khi phân tích các mẫu Râu mèo khác (W ollenweber and Mann,
1985; Bombardelli et al., 1972; M atsuuta et al., 1973; Schneider và Tan, 1973).
Sumarayono và cộng sự gần đây (1997) đã tách chiết thêm được 20 hợp chất phenol
khác, trong đó có 9 loại aglycon và 2 hợp chất Aavonol glycoside. Khi phân tích thành
phần dịch chiết M eOH, các tác giả tìm thấy sinensetin là ílavonoid phổ biến nhất, với
hàm lượng là 5,3 |im ol/g mầu khô. Khi nghiên cứu trên đối tượng mẫu Râu mèo Việt
Nam,

nhóm

nghiên

cứu

của

Banskota

(2003)

cũng

tìm

thấy

có

sinensetin.

tetrascutellarein, eupatorin cùng với 7 ,3 \4 ’-tri-0 -m e th y llu te o lin (1 7 ), ladanein và 6hydroxy-5,7,4’-trim ethoxyflavon (13).

7


Hình 4. Cấu trúc hố học của các hợp chất ílavonoid và dẫn xuất tìm thấy ở Râu mèo.
(1) sinensetin, (2) tetramethylscutellarein, (3) eupatorin, (4) 5-hydroxy-6,7,3’,4’tetramethoxyAavone, (5) 3-hydroxy-5,6,7, 4'-tetramethoxyflavone, (6) salvigenin, (7) 5,7,4’trimethoxydavone, (8) 5,7,3’,4'-tetramethoxyfiavone, (9) cirsimatin, (10) pillion, (11) rtiamnazin,
(12) 5,4’-dihydroxy-6,7-dimethoxyflavone, (13) 6-hydroxy-5,7,4’-trimethoxyfiavone, (14) 4'hydroxy-5,6,7-trimethoxyflavone, (17) 7,3’,4’-tri-0-methỵlluteolin, (18) ladanein, (19) 6-hydroxy5,7,4'-trimethoxyflavone ; 2 dẫn xuất glycoside: (15) kaempíerol 3-O-p-glucoside, và (16)
quercetin 3-O-p-glucoside.

1.1.5.2. Các hợp chất diterpen
o.

stamineus chứa nhiều hợp chất thuộc nhóm diterpen (Hình 5), bao gồm các

diterpen kiểu isopim arane, và gần đây các nhà nghiên cứu tìm thấy thêm một số loại
diterpen kiểu stam inane. M asuda và cs. (1992b) là những tác giả đầu tiên tách chiết được
các orthosiphol A (20) và B (21), thuộc nhóm diterpen kiểu isopimarane từ lá của Râu
mèo được trồng ở vùng Okinawa, Nhật Bản. Sau đó, Takeda và cs. (1993) tiếp tục tìm ra
hai hai hợp chất diterpen hàm lượng nhỏ hơn gọi là orthosiphol D (22) và E (23) cũng từ
lá và thân của mẫu Râu mèo thu ở vùng Okinavva. Gần đây, nhóm nghiên cứu tại Nhật
bản của Banskota (2003) đã phát hiện thêm một số hợp chất diterpen từ mẫu Râu mèo
thu ở Việt nam, gồm có: 5 loại diterpen kiểu isopimarane được đặt tên là orthosiphol F
(24), G (25), H (26), I (27), và J (28); và 2 loại diterpen kiểu stam inane được gọi tên là
staminol A (31) và B (32). Từ nguồn vật liệu này, các tác giả cũng tìm ra các dẫn xuất
của các diterpen kiểu stam inane là staminolactone A (35) và B (36), và norstaminol A
(37). Trong khi đó, Shibuya và cs. (1999) ghi nhận việc phát hiện thấy 2 hợp chất

diterpen kiểu isopim arane mới, đặt tên là orthosiphonol A (29) và B (30); cùng với 2
staminane mới là neoorthosiphol A (33) và B (34) từ mẫu Râu mèo thu được từ
Indonesia.

8


Hình 5. Cấu trúc hố học của các hợp chất diterpen và dẫn xuất tìm thấy ở Râu mèo.
(20) orthosiphol A, (21) orthosiphol B, (22) orthosiphol D, (23) orthosiphol E, (24) orthosiphol F,
(25) orthosiphol G, (26) orthosiphol H, (27) orthosiphol I, (28) orthosiphol J, (29) orthosiphonol
A, (30) orthosiphonol B, (31) staminol A, (32) staminol B, (33) neoorthosiphol A, (34)
neoorthosiphol B, (35) staminolactone A, (36) staminolactone B, (37) norstaminol A.

7.7.5.5. Các hợp chất khác
Một số hợp chất khác như benzochromene, coumarin, các hợp chất triterpen, axit
caffeic và m ột số dẫn xuất của nó cũng đã từng được tìm thấy và tách chiết từ Râu mèo.
Hợp chất m ethylripariochrom ene A được tìm thấy từ cây Râu mèo thu ở Indonesia bằng
phương pháp chụp tinh thể tia X (Guerin et al., 1989). Sumaryono và cs. (1997) ghi nhận
việc tìm thấy coum arin (39), axit caffeic (40), axit rosm arinic (41), axit 2,3dicaffeoyltartaric cùng với m ột số dẫn xuất khác của axit caffeic. Cũng trong các dòng
Râu mèo thu ở Indonesia, các tác giả cùng phát hiện thấy axit rosm arinic là hợp chất
phenol phổ biến, có hàm lượng đạt tới 22,2 |amol/g dịch chiết khô bằng M eOH, tiếp theo
là axit 2,3-dicaffeoyltartaric với hàm lượng là 7,4 I^mol/g. Axit rosm arinic cũng được
tìm thấy từ các mẫu Râu m èo thu ở Okinawa, Nhật bản (Takeda và cs., 1993). Từ mẫu
Râu mèo thu ở Việt Nam , nhóm nghiên cứu của Tezuka đã xác định được các hợp chất
axit caffeic, axit rosm arinic, vom iíoliol, aurantiamide acetate, axit oleanolic, axit ursolic.
axit betulinic, và P-sitosterol. Bên cạnh các hợp chất phenol, m eso-inositol (Nikonov.
1971) và m ột số hợp chất kém bền cũng tìm thấy ở cây o . stamineus (Kudritskaya et al..
1987; Schmidt and Bos, 1986; Schut and Zwaving, 1986).
9

0

ỌH

HO

COOH

HO
OMc
38. R -OMê
43.R -H

OMo

OH
39.

44.

40.
o

COOH

OH

HO

HO
OM

42.

41.

H ình 6. Một số hợp chất sinh học khác tìm thấy ở cây Orthosiphon stamineus Benth.
(38) methylripariochromene, (39) coumarin, (40) axit caffeic, (41) axit rosmarinic,
(42) axit 2-caffeoỵltartaric, (43) acetovanillochromene, (44) orthochromene A.

Ngoài ra, một số nghiên cứu ở Ấn Độ trước đây (K rish n am u rth y , 1971) cho thấy
lá Râu mèo chứa saponin, m ột alcaloid, tinh dầu 0,2 - 0,6% , tanin, axit hữu cơ (axit
tartic, axit citric, và axit glycolic) và dầu béo. Saponin khi thủy phân cho sapogenin và
đường là arabinoza và glucoza (hoặc fructoza). Phần khơng xà phịng của dầu béo là Psitosterol và a-am yrin. Hoạt tính của lá do có hàm lượng kali cao (0,7 - 0,8%) và một
glycosid đắng là orthosiphonin. Theo Schmidt và cs (1985), tinh dầu lá, cành và thân của
Orthosiphon stamineus chứa P-caryophylen, Ị3-elemen humulen, P-bourbonen và 1octen-3-ol, caryophyllen oxyt.
Mặc dù, các nghiên cứu về thành phần hóa học như trình bày ở trên cho thấy đến
nay đã phát hiện được nhiều các hợp chất sinh học khác nhau từ cây Râu mèo, nhưng
trong thực tế chế biến và sản xuất dược phẩm từ loài Râu mèo hiện nay ở Châu Âu và
Bắc Mỹ, người ta thường chỉ tập trung quan tâm vào thành phần các flavonoid ưa nước là
sinensetin, scutellareintetram ethylether và eupatorin. Trong đó, hàm lượng sinensetin
(khoảng 0,2% trọng lượng chất khô) thường được sử dụng làm chỉ thị đánh giá dịch chiết
từ Râu mèo được nhập khẩu vào thị trường Châu Âu và Bắc Mỹ (Bueter, 2004).

1.1.6. Các nghiên cứu về dược lý học và lâm sàng
Gần đây, Orthosiphon stamineus và một sơ' hợp chất chính được tách chiết từ loài
cây này đã thu hút được sự quan tâm nghiên cứu của các phịng thí nghiệm về dược lý
học. Nhờ vậy, một sơ' hoạt tính sinh học của Râu mèo đã được xác định bẽn cạnh các
thông số về độc tính, dược động học, q trình bài tiết các hợp chất khi sử d ụ n g ,...

Theo các tác giả Chow và Liao (Đài loan), dịch chiết từ Râu mèo trên chó thí
nghiệm bằng đường truyền tĩnh mạch với liều 18,8 m g/kg/phút có tác dụng tăng cường
10


bài tiết nước tiểu và chất điện giải N a+, K+, c r . Trên chuột nhắt trắng, Râu mèo bằng
đường tiêm xoang bụng với liều 2 - 4 g/kg làm giảm hoạt động vận động của chuột. Trên
chó, bằng đường tiêm tĩnh mạch với liều 0,179 g/kg có tác dụng hạ huyết áp và làm giảm
tần số hô hấp. Dịch chiết bằng ethanol của Râu mèo trên chuột nhắt trắng bằng đường
tiêm xoang bụng có giá trị LD 50= 196 g/kg.
Các tác giả Schut và Zwaving (1996) đã xác định tác dụng lợi tiểu của 2 hợp chất
ílavonoid là sinensetin và 3 ’-hydroxy-3,6,7,4’-tetramethoxyflavon của Râu mèo. Thí
nghiệm trên chuột nhắt trắng cho thấy chất 3’-hydroxy-3,6,7,4’-tetramethoxyflavon
bằng đường tiêm tĩnh m ạch với liều 10 mg/kg, lượng nước tiểu thu được sau 140 phút là
410mg, còn sinensetin dùng cùng liều trên, lượng nước tiểu thu được sau 160 phút là
614mg, trong khi đó ở chuột lơ đối chứng, sau 120 phút khơng thu được lượng nước tiểu
nào. Hai hợp chất ílavonoid nêu trên dùng với liều 1 m g/kg có so sánh với tác dụng của
hydrochlorothiazid thấy tác dụng lợi tiểu yếu hơn và xuất hiện chậm. Đổng thời, các tác
giả trên cũng khẳng định hai Aavonoid trên với liều 10 m g/kg trên chuột công trắng
không thể hiện tác dụng lợi m ật tuy trong y học cổ truyền có ghi nhận là Râu mèo có tác
dụng lợi mật. Xuất phát từ tác dụng điều trị viêm thận của Râu mèo, hai tác giả trên đã
tiến hành nghiên cứu tác dụng chống viêm và tác dụng kháng khuẩn của các ílavonoid
tách chiết từ Râu mèo. Kết quả cho thấy trên thí nghiệm gây viêm bằng phương pháp cấy
viên bơng, sinensetin không thể hiện tác dụng chống viêm, v ề tác dụng kháng khuẩn, đã
nghiên cứu với các chủng Escherichia coli, Proteus m irabilis, Pseudomonas aeruginosa,
Stapphylococcus aureus và Enterococcus là những chủng có thể gây nhiễm đường tiết
niệu, nhưng kết quả cho thấy cả sinensetin, tetram ethylscuttellarein và 3 ’- hydroxy3,6,7,4’-tetram ethoxyflavon đều khơng có tác dụng kháng khuẩn rõ rệt.
Về dược lý lâm sàng, theo các tác giả Ấn Độ, Râu m èo rất có ích cho điều trị bệnh
thận và phù thũng. Trên bệnh nhân, Râu mèo có tác dụng làm kiềm hóa máu, sự có mặt
của hợp chất orthosiphonin và muối kali trong dược liệu có tác dụng giữ cho axit uric và

muối urat ở dạng hòa tan, do đó phịng ngừa được sự lắng đọng của chúng để tạo thành
sỏi thận. Ở Thái Lan, thí nghiệm trên những người tình nguyện khoẻ mạnh, dịch chiết
Râu mèo có tác dụng làm tăng sự bài tiết citrat và oxalat; nếu như oxalat có hàm lượng
cao trong cơ thể có thể tăng nguy cơ sỏi thận, thì sự bài tiết citrat được tăng cường giúp
ngăn ngừa sự hình thành sỏi thận.
Nghiên cứu trên chuột nhắt trắng, Robins (1988) chứng m inh sinensetin có tác
dụng chống ngưng kết tiểu cầu m ạnh hơn cả nobiletin là hợp chất đã được biết trước đây

11