LUẬN VĂN ĐẠI HỌC HOÀN CHỈNH (Y DƯỢC) chiết tách, tinh chế, xác định cấu trúc một số hợp chất alcaloid trong rễ cây lỏ ngún (gelsemium elegans benth) ở việt nam

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN
1

H-NMR

13

C-NMR

DEPT

: Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hưởng
từ hạt nhân proton)
: Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng
hưởng từ hạt nhân cacbon-13)
: Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer (Phổ DEPT)

1

H -1H-COSY: 1H -1H- Correlated Spectroscopy ( Phổ tương tác proton)

HSQC

: Heteronuclear Single Quantum Coherence

HMBC

: Heteronuclear Multiple Bond Correlation (Phổ tương tác dị hạt nhõn
qua nhiều liên kết)

IR

: Infrared Spectroscopy (Phổ hồng ngoại)

ESI-MS

: Electron Spray Ionisation - Mass Spectroscopy (Phổ khối bụi
electron)

SKLM

: Sắc ký lớp mỏng

DMSO

: DiMethylSulfoxide

TMS

: Tetramethylsilan

s

: singulet

s (br)

: singulet tù

d

: dublet

dd

: dublet của dublet

dt

: dublet của triplet

m:

: multiplet

t

: triplet

td

: triplet của dublet

J (Hz)

: Hằng số tương tác tớnh bằng Hz

δ (ppm)

: Độ dịch chuyển hoá học tớnh bằng ppm

1


DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Số liệu các phân đoạn thu được chất tinh khiết.......................................13
Bảng 2.2 : Số liệu phổ 1H-NMR của chất A2 (500 MHz, CDCl 3)...........................16
Bảng 2.3 : Số liệu phổ 1H-NMR của chất A4 (500 MHz, DMSO)..........................19
Bảng 3.1: Kết quả định lượng alcaloid toàn phần trong rễ cây Lỏ ngún.................23
Bảng 3.2: Kết quả SKLM hệ dung môi
Toluen: aceton: ethanol: amoniac đặc [45: 45: 7: 3]...............................26
Bảng 3.3: Kết quả phõn lập alcaloid bằng sắc ký cột..............................................28

2


MỞ ĐẦU
Nguồn cây cỏ trên đất nước ta vô cùng phong phú và đa dạng. Nú đó, đang và
sẽ trực tiếp hoặc gián tiếp góp phần giải quyết các nhu cầu của đời sống chúng ta về
ăn, mặc, ở, thuốc chữa bệnh, v.v. Cùng với việc tìm hiểu để sử dụng mặt có lợi của
cây cỏ, từ lâu người ta đã quan tâm đến mặt trái của vấn đề này, đó là những tác hại
của cây độc đối với con người và động vật.
Lĩnh vực nghiên cứu cây độc, có liên quan đến giám định hoá pháp các vụ ngộ
độc và bị đầu độc bằng cây cỏ. Nhưng quan trọng hơn cả là mối liên hệ giữa cây
độc và cây thuốc. Người ta đã sử dụng nhiều cây độc để làm thuốc như cà độc dược,
mã tiền, ô đầu... bởi vì hoạt tính của những cây này có tác dụng chữa bệnh khi dựng
đỳng liều lượng và đúng bệnh khi đú cõy độc trở thành cây thuốc. Ngược lại, một
số cây thuốc khi dùng khơng đúng chỉ định cũng có thể gây độc cho người bệnh. Sự
nhầm lẫn đó thường xảy ra và dẫn tới những vụ ngộ độc đáng tiếc không chỉ ở
những nước sử dụng rộng rãi cây cỏ để làm thuốc như nước ta, mà còn ở nhiều nơi

trên thế giới.
Cõy Lỏ ngún (Gelsemium elegans Benth.) chứa hàm lượng alcaloid có độc
tính rất mạnh [5]. Hàng năm ở nước ta xảy ra nhiều vụ ngộ độc cõy Lỏ ngún do sử
dụng nhầm lẫn, đầu độc, tự sát. Theo thống kê của Viện Pháp y Quốc gia, từ năm
2000 - 2004 số người tử vong do ngộ độc cõy Lỏ ngún được giám định húa pháp ở
các tỉnh miền Bắc là 82 người. Để đáp ứng yêu cầu giám định y pháp và phục vụ
công tác cấp cứu nạn nhân ngộ độc cõy Lỏ ngún tại các trung tâm chống độc cần
phải có các chất chuẩn, phục vụ cho các phương pháp phân tích.
Trong luận văn này chúng tơi xin đóng góp một phần vào việc chiết tách, tinh
chế, xác định cấu trúc một số hợp chất alcaloid trong rễ cây Lỏ ngún (Gelsemium
elegans Benth.) ở Việt Nam.

3


Chương 1: TỔNG QUAN
1.1 Đại cương về cây độc
1.1.1 Khái niệm về cây độc
Cây độc là cây mà khi người hay động vật ăn phải, có khi chỉ một lượng nhỏ,
đã có thể gây ra những bệnh rối loạn trong cơ thể, nếu nặng có thể chết [5].
Số lượng cây độc trên trái đất khơng phải là ít, đến nay người ta đã biết hàng
nghìn lồi. Số lồi này thường tập trung vào nhóm cây hạt kín và ngành Nấm. Đặc
biệt ở lớp Ngọc lan (cây hai lá mầm) có tỷ lệ cây độc cao hơn ở lớp Hành (cây một
lá mầm). Các họ thực vật có nhiều cây độc như họ Thầu dầu, họ Trúc đào, họ Cà, họ
Đậu, họ Mã tiền v.v… Số loài cây độc ở vùng nhiệt đới nhiều hơn ở cỏc vùng ôn
đới và hàn đới [5].
Nước ta có thảm thực vật phong phú, trong đó cũng có hàng trăm lồi cây
độc và khá nhiều loài nấm độc [5].
Cỏc cây độc được chia làm hai nhúm, nhúm cõy cú độc tính ổn định kéo dài
suốt cả quá trình sinh trưởng và phát triển của chúng (như lá ngón, trúc đào, cà độc

dược…) và nhúm cõy mà tính độc chỉ xuất hiện trong giai đoạn nhất định (như ở củ
khoai tây, chất độc solanin chỉ xuất hiện trong thời gian củ khoai tây nảy mầm và
chỉ tập trung ở mầm) [5].
Các chất thường gặp ở cỏc cõy độc rất phong phú và đa dạng, trong đó chủ
yếu là các alcaloid, glycozit, acid hữu cơ, lacton, và còn nhiều chất khác chưa được
nghiên cứu [5].
Sự phân bố của các chất độc trong từng bộ phận của một cây cũng khơng đều
nhau, đơi khi chúng được tích luỹ ở một phần nhất định như: tập trung ở hạt (thầu
dầu, mã tiền), ở quả (thuốc phiện, hồi núi), ở lá (trúc đào, cà độc dược…), ở rễ (ô
đầu, chỳt chớt…), ở nhựa mủ (nhựa sui, nhựa xương rồng…). Cá biệt cũn có sự
tương phản điển hình trong cùng một cây, như ở cây củ đậu: người ta vẫn dùng củ
đậu để ăn, trong khi đó hạt của cây này có chất độc, có thể gây chết người khi ăn
phải một lượng nhỏ [5].

4


Trong quá trình phơi sấy chế biến cây cỏ cũng làm thay đổi một số tính chất
của chúng, vỡ cú chứa các chất độc dễ bay hơi. Ngược lại, cỏc cõy độc chứa
alcaloid, độc tính khơng hề thay đổi khi phơi hoặc sấy. Cỏc cõy độc chứa glycozit
khi ủ làm thức ăn cho gia súc thỡ cỏc quá trình lên men phát triển dẫn tới sự phá
huỷ hoàn toàn các glycozit độc. Trong khi đó ở một số cây, chất độc mới lại được
hình thành trong quá trình phơi sấy, chế biến hay ủ làm thức ăn [5].
1.1.2 Hợp chất alcaloid trong cây độc
Alcaloid là những hợp chất hữu cơ, có chứa nitơ, đa số có nhân dị vũng, cú
phản ứng kiềm, thường gặp trong thực vật và đôi khi trong động vật, thường có hoạt
tính sinh học mạnh và cho phản ứng hoá học với một số thuốc thử gọi là thuốc thử
chung của alcaloid [12].
Trong cõy, cỏc alcaloid thường ở dạng muối của các acid malic, limonic,
oxalic, sucxinic, … Chúng đều dễ tan trong nước, vì vậy dễ hấp thụ qua bộ máy

tiờu hoỏ của người và động vật. Khi ở dạng tự do, chỳng khú tan trong nước nhưng
lại dễ tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, ether, chloroform [5].
Các alcaloid khi tác dụng với một số acid như acid silicotungstic, acid
photphomolipdic và tanin, dễ dàng bị tủa, trở thành chất khó tan trong nước. Lợi
dụng tính chất này người ta dùng acid tanic hoặc nước sắc cỏc cõy cú chứa tanin để
giải độc khi bị ngộ độc alcaloid [5].
Hàm lượng của alcaloid trong cây dễ dàng thay đổi. Ngày nay, với những
phương pháp hiện đại người ta có thể phát hiện được vết của chúng trong nhiều loài,
nhưng chỉ quy ước núi cõy cú alcaloid khi hàm lượng của chúng lớn hơn một phần
vạn. Tỷ lệ alcaloid trong nhiều cây chiếm từ một phần vạn đến vài phần trăm so với
trọng lượng khô của cây. Đặc biệt, trong vỏ cây canhkina có thể tới 10 phần trăm
[5].
Nhiều tổng kết cho thấy đại đa số cõy cú chứa alcaloid là cây hai lá mầm.
Theo thống kê đến nay thỡ cõy thuộc thảo và cây bụi có nhiều alcaloid hơn cây gỗ.
Cây một năm thường chứa nhiều alcaloid hơn cây lưu niên [7].

5


1.2 Cõy Lỏ ngún
1.2.1 Đặc điểm thực vật và phân bố

Hình 1: Gelsemium elegans Benth.
Cõy Lỏ ngún mọc tại Việt Nam có tên khoa học là Gelsemium elegans
Benth., thuộc họ Mã tiền (Loganiaceae) [6], cịn có tên gọi là: Co ngón, Thuốc r út
ruột, Hồ mạn trường, Đại trà đắng, Hồ mạn đằng, Hoàng đằng, Cầu vẫn [5], Đoạn
trường thảo, Ngón vàng, Khau nguụn [11].
Cõy Lỏ ngún là loại cây mọc leo, dài 5 - 7 m. Thân cành hình trụ [11], khơng có
lơng , trờn thân hơi có khía dọc. Lá mọc đối, hình trứng thn dài, hơi hỡnh mỏc,
mộp nguyờn, mặt nhẵn bóng [1]. Hoa mọc hình xim ở đầu cành hay kẽ lá, cánh hoa

màu vàng có thể có hoa trắng [4]. Quả nang, màu nâu. Hạt nhỏ, cú rỡa mỏng bao
quanh, mộp khớa rỏch. Mựa hoa vào tháng 10 - 12, mùa quả vào tháng 1 - 3 [11].
Cõy Lỏ ngún phân bố chủ yếu ở Nam và Đông Nam châu Á như: Ấn Độ,
Thái Lan, Indonesia, Lào, Srilanca, Malaysia, Trung Quốc, và Việt Nam [15]. Ở
Việt Nam cây mọc hoang khá phổ biến ở các vùng núi cao như: Hà Giang, Tuyên
Quang, Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Lạng Sơn, Hồ Bình, Quảng Ninh, Quảng nam,
các tỉnh Tõy Nguyờn…[2, 11].
Ngoài loài Gelsemium elegans Benth., trên thế giới cũn cú 2 loài cõy Lỏ
ngún mọc tại Bắc Mĩ [11] có tên khoa học là: Gelsemium sempervirens (Linne) [21]
và Gelsemium rankinii [20].

6


1.2.2 Độc tính và tác dụng
Cõy Lỏ ngún cú độc tính rất mạnh, Chất độc chính là các alcaloid có trong
toàn cây. Độc nhất là rễ và lá non, rồi đến lá thường và hoa, thân và quả; thân già
độc hơn thân non. Nguời ta cho rằng chỉ cần ăn 3 lá kèm theo một chén rượu có thể
làm chết một người sau vài giờ. Chính vì vậy nhân dân ta thường không dùng cõy
Lỏ ngún để làm thuốc [5, 6, 11].
Triệu chứng ngộ độc cõy Lỏ ngún là khát nước, sốt, đau rát họng, đau bụng,
nôn mửa, tiếp theo là hoa mắt, răng cắn chặt, sùi bọt mép, thân nhiệt hạ, huyết áp
hạ, cuối cúng là chết do ngừng hô hấp [11]. Trong dân gian người ta thường dùng
mỡ lợn, dầu lạc để uống, hoặc dùng dịch chiết rau má và rau muống để làm hồi tỉnh
lại [1].
Theo Võ Văn Chi, cõy Lỏ ngún có vị đắng, cay, tớnh núng, rất độc; có tác
dụng thanh nhiệt, tiêu thũng, bạt độc, giảm đau, sát trùng, chống ngứa. Lá cây tươi
giã nhỏ đắp ngoài hoặc nấu nước rửa ngoài để trị các bệnh như: eczema, nấm ở
chân, ở thõn; đũn ngó tổn thương, đụng giập; trĩ, tràng nhạc; đinh nhọt, viêm mủ da;
phong hủi [1].

Trong y học cổ truyền của Nhật Bản, người ta cũng sử dụng cõy Lỏ ngún để
trị các bệnh lở loét, viêm da, ung nhọt [16]. Ở Trung Quốc và Bắc Mĩ bên cạnh
những sử dụng tương tự như trên người ta con sử dụng rễ để chữa các bệnh động
kinh và giảm đau [6].
Gần đây đã có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu về tác dụng dược lý
như: giảm đau, chống viêm, chống ung thư từ cõy Lỏ ngún [3, 16, 18].
1.2.3 Các hợp chất alkaloid
Những năm gần đõy, các nhà khoa học trên thế giới đã nghiờn cứu nhiều về
cõy độc Gelsemium elegans Benth., thu hái tại Bắc Mĩ, Thái Lan, Trung Quốc.
Nhiều alcaloid có nhõn indol (1) đã được phõn lập và xác định cấu trúc, chủ yếu là
các alcaloid thuộc phõn nhúm oxindol và indolenin [3, 19].

7


N
H

(1)
Chúng ta có thể chia các alcaloid có nhõn indol trong cõy Lá ngún thành 5
phõn nhúm [19].
- Nhúm 1: Các alcaloid loại sarpagin
- Nhúm 2: Các alcaloid loại koumin
- Nhúm 3: Các alcaloid loại humantenin
- Nhúm 4: Các alcaloid loại gelsemin
- Nhóm 5: Các alcaloid loại gelsedin và gelselegin
Trong đó các alcaloid thuộc nhóm 1 có nhõn indol, thuộc nhúm 3, 4, 5 có
khung oxindol [19], cũn các alcaloid thuộc nhóm 2 có khung indolenin [3].
Nhúm 1 bao gồm các alcaloid: koumidin (2), 19 - (z)- akuammidin (3) [3].
CH2OH

COOCH3
CH2OH

H
C
3

N
H

N

N

N
H

D

H

CH3

(2) koumidin

(3) 19 - (z) - akuammidin

Nhúm 2 bao gồm các alcaloid: koumin (4) [14], 19 - (R) hydroxydihydrokoumin (5), 19 - (S) - hydroxydihydrokoumin (6) [3].
22

N

H

19

22

CH 3

OH

H

H

H

(4) koumin

H

H

N

O

CH 3

H

19

H3C

H

N

N

O

(5) 19 - (R) - hydroxydihydrokoumin
(6) 19 - (S) - hydroxydihydrokoumin

8


Nhúm 3 bao gồm các alcaloid: humantenirin (7), humantenin (8), 11 hydroxyhumantenin (9), 11 - metoxyhumantenin (10), rankinidin (11), N desmetoxyrankinidin (12), 11- hydroxyrankinidin (13) [3], Ngồi ra cũn có 11 hydroxyhuman - humantenine [15].
O

H

H

H
H

1

R3

Na

Nb

20

O
R2

R1

(7) R1 = OCH3

R2 = H

R3 = OCH3

: humantenirin [19]

(8) R1 = OCH3

R2 = H

R3 = H

: humantenin [19]

(9) R1 = OCH3

R2 = OCH3

R3 = OH

: 11 - hydroxyhumantenin

(10) R1= OCH3

R2 = OCH3

R3 = OCH3

: 11 - metoxyhumantenin

(11) R1 = OCH3

R2 = H

R3 = H

: rankinidin

(12) R1 = H

R2 = H

R3 = H

: N - desmetoxyrankinidin

(13) R1 = OCH3

R2 = H

R3 = OH

: 11 - hydroxyrankinidin

Nhúm 4 bao gồm các alcaloid: gelsemin (14), gelsevirin (15), 21 oxogelsemin (16), 21 - oxogelsevirin (17), 19 - (R) - hydroxydihydrogelsevirin (18),
19 - (R) - acetyldihydrogelsevirin (19), 19 - (S) - hydroxydihydrogelsevirin (20), 19
- (R) - hydroxydihydrogelsemin (21) [3].
O

O
H

H

H
N

CH3

H

CH3

N
O

N

O

N

O

R

R

(14) R = H
: gelsemin
(16) R = H
: 21 - oxogelsemin
(15) R = OCH3 : gelsevirin(17) R = OCH3 : 21 - oxogelsevirin

9


O

H

H

CH3

N

O
O

N

19

R2

R1

(18) R1 = OCH3

R2 = OH

: 19 - (R) - hydroxydihydrogelsevirin

(19) R1 = OCH3

R2 = OAc

: 19 - (R) - hcetyldihydrogelsevirin

(20) R1 = OCH3

R2 = OH

: 19 - (S) - hydroxydihydrogelsevirin

(21) R1 =H

R2 = OH

: 19 - (R) - hydroxydihydrogelsemin

Nhúm 5 bao gồm các alcaloid: gelselegin (22), 11 - metoxy - 19 hydroxygelselegin (23) [19, 3], gelsenicin (24), elegansamin (25), gelsedin (26),
gelsemicin (27), 14 - ò - hydroxygelsedin (28), 14 - ò - hydroxygelsemicin (29) [3],
14,15 dihydroxygelsenicine (30), 14 - hydroxy - 19 - oxogelsenicin (31), 14 acetoxygelsenicin (32), 14 - acetoxy - 15 - hydroxygelsenicin (33), 14 acetoxygelselegin (34) [16, 17], gelsamydin (35), 19 - hyđroxygelsamyin (36), [3].
Ngoài ra cũn có 4 monoterpenoid oxindol alcaloid mới được tách ra từ phần lá, có
liên quan đến Gelsenicin là: gelsedilam C17H18N2O4, 14 - acetoxygelsedilam
C19H20N2O6, gelsefuranidin C24H25N2O5, và gelseiridon C29H35N2O8 [17].
O
CH3OH
CH3
R1

N

N

O

R2 H

OCH3

(22) R1 = H

R2 = H: gelselegin

(23) R1 = OCH3

R2 = OH

: 11 - methoxy - 19 - hydroxygelselegin

10


O
OCH3

H
O
CH3
N

O

N

R H

O
H

OCH3

(24) R = H

: gelsenicin

(25) R = iridoit

: elegansamin

R = iridoit

R1

O

N

O

N

R2

OH

OCH3

(26) R1 = H R2 = H: gelsedin
(27) R1 = H R2 = OCH3

: gelsemicin

(28) R1 = OH R2 = H: 14 - ò - hydroxygelsedin
(29) R1 = OH R2 = OCH3

H

O
H

: 14 - ò - hydroxygelsemicin

1

OH

H

HO
3

H

H

O

OH

N

O

N

OMe

(30) 14,15 Dihydroxygelsenicin

O

14

H

N

R
20

N

19

O

OMe

(31) 14 - Hydroxy - 19 - oxogelsenicin

11

18


17

O
H

H

16

AcO

3

H

15

9
7

8

10

14
6

13
12

N

21

N

H
N

O

OH

20

14

18

OMe

(32) R = H

AcO

3

19

20

N

H

2

11

5

H

O

R

18
19

H

O

OMe

14 - acetoxygelsenicin

(34) 14 - acetoxygelselegin

(33) R = OH 14 - acetoxy - 15 - hydroxygelsenicin
H

H

O

O

H

H

H

H

CH3
N

O

H

N

OH

H
H
O

OH H

OCH3

CH3

N
OCH3

O

O

H

N H3C
H

CH3

H

(35) gelsamydin

O

OH H
O
H

(36) 19 - hyđroxygelsamyin

Ngoài ra cũn tỡm thấy trong cõy Lá ngún có các alcaloid: gelsemamit, 11 metoxygelsemamit, sempervirin, ... [3, 11].
Năm 1981, Hoàng Văn Tố và các cộng sự đã phõn lập và xác định được cấu
trúc của koumin và gelsemin từ Lá ngún thu hái tại Hồ Bình, Việt Nam [10]. Đến
năm 2004, Lại Thị Kim Dung phõn lập và xác định được gelsemin, gelsevirin,
humantenin, gelsenicin, 19 - (Z) - ankuammidin và koumin từ Lá ngún (Gelsemium
elegans Benth.) thu hái tại Lạng Sơn, Việt Nam [3].
1.2.4 Các hợp chất khác
Ngoài các hợp chất alcaloid, trong cõy Lá ngún cũn chứa nhiều hợp chất
khác như: coumarin, tinh dầu, các acid béo (palmitic, stearic, oleic, linoleic), npentatriacomtan, tanin [10].

12


Chương 2: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Trong quá trình chiết tách alcaloid tồn phần, chúng tơi thu được hai phõn
đoạn là: cặn chiết alcaloid và một chất alcaloid tương đối sạch ký hiệu là A8. A8 thu
được khi kiềm hoá dịch chiết alcaloid trong mơi trường nước - acid, có giá trị R f =
0,06 khi chạy hệ dung môi toluen: aceton: ethanol: amoniac đặc [45: 45: 7: 3], là
một chất phát quang ở bước sóng 254 nm, khơng tan trong nước, rất ít tan trong
ethanol, tan tương đối trong methanol, tan tốt trong ethanol - H2SO4.
Tiến hành chạy sắc ký cột từ cặn chiết alcaloid chúng tôi thu được 3 phõn

đoạn lớn. Phõn đoạn II thu được chất dầu. Phõn đoạn IV thu được chất bột, màu
trăng. Phõn đoạn VII thu được chất rắn, sau khi tiến hành kết tinh lại chúng tôi thu
được chất tinh khiết. Kết quả được túm tắt ở bảng 2.1.
Bảng 2.1: Số liệu các phân đoạn thu được chất tinh khiết
STT các

Ký hiệu

Rf

Lượng tách ra

Hàm lượng

phân đoạn lớn
II
IV
VII

A1
A2
A4

0,85
0,75
0,62

(mg)
246,5
106,9

447,6

(%)
4,740
2,056
8,607

Các chất sạch A2 và A4 đã được ghi phổ để xác định cấu trúc hoá học. Ngoài
các loại phổ sơ bộ nhận dạng như UV và IR, để xác định cấu trúc của các hợp chất
A1 và A2 chúng tôi đã sử dụng các loại phổ ESI-MS, NMR ( 1H-HNR, 13C-HMR,
DEPT, COSY, HSQC, HMBC).
2.1 Nhận dạng chất A2
Chất A2 là chất bột, không màu.
Chất A2 tan tốt trong các dung môi hữu cơ như ethanol, chloroform, … ,
khơng tan trong nước.
- Nhiệt độ nóng chảy: 2450C
- Phổ UV: đo trong MeOH cho các đỉnh hấp thụ cực đại λ max: 209 nm và 255
nm.

13


- Phổ IR: đo dưới dạng viờn nộn KBr cho các đỉnh hấp phụ mạnh ở 3433;
3089; 2931; 2866; 1724; 1620; 1462; 1313; 1230; 1078; 1039; 869; 750 cm-1.
- Phổ khối (ESI-MS): phương pháp ion hoá bằng bụi electron, chất A2 có số
khối của pic phân tử [M+H] = 353, tương ứng với cơng thức cấu tạo C21H24N2O3.
Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon 1 chiều và 2 chiều
(1D, 2D, 1H, 13C-NMR).
- Phổ công hưởng từ hạt nhân: các tín hiệu của phổ cơng hưởng từ hạt nhân 1
chiều (1D-NMR) như phổ 1H-NMR, cho các thông tin sau :

Phổ proton (1H-NMR) chất A2 được đo trong CDCl 3 (500MHz) cho 24 tín
hiệu proton có độ dịch chuyển hóa học từ 2,00 đến 7,45 ppm, đúng bằng số proton
có mặt trong Gelsevirin. Ở vùng trường thấp từ 6,96 - 7,45 ppm, có tín hiệu của 4
proton thơm, đó là các proton của nhân indol bị thế, trong đó proton H 9 có độ dịch
chuyển hóa học xa nhất (7,45 ppm) về phía trường thấp do hiệu ứng điện tử Nitơ
của nhân oxindol. Ở vùng trường tiếp theo từ 6,23 - 4,98 ppm, có tín hiệu của 3
proton olefin (liên kết đôi). Ở vùng trường cao hơn từ 4,09 - 2,00 ppm, có 17 tín
hiệu proton là các tín hiệu của vịng monoterpen, N-methoxy và N-methyl.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-MNR), phổ COSY ( 1H-1H, NMR)
cho phép xác định các tương tác giữa proton và proton. Ở vùng dịch chuyển hóa
học của các proton thơm (4 proton: H 12, H9, H11 và H10), cho thấy mỗi proton thơm
tương tác với 2 proton gần nó ở vị trí othor (Jor = 7,5 - 8,0 Hz) và meta (Jm = 1
Hz).
Ở vùng dịch chuyển hóa học δ = 5,16 và 4,98 ppm, proton H 18 là proton
olefin (H18α và H18β) tương tác với H19 (δ = 6,23)có hằng số tương tác lớn (J = 11 Hz
và J = 17,5 Hz).
Tương tự như vậy, khi xét tương tác từng cặp proton tương tác với nhau dựa
trên phổ COSY và phổ hai chiều HSQC, các proton còn lại được xác định như H 17α
và H17β; H21α và H21β; H3, H5, H15, H16 và H6 cũng như nhúm N-OCH3, N-CH3. Chi tiết
độ dịch chuyển hóa học, dạng pic và hằng số tương tác giữa các proton được tóm tắt
trên bảng 2.2.

14


Phổ cộng hưởng từ 1 chiều 13C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho biết chất
A2 có 21 nguyên tử carbon, trong đú có 2 nhóm CH 3, 4 nhóm CH2, 10 nhóm CH và
5 carbon bậc 4 (Cq).
Phổ hai chiều HSQC cho biết các tương tác 1J của proton với nguyên tử
carbon. Đặc biệt các nhúm methylene (CH2) có 2 proton tương tác với 1 nguyên tử

carbon như δH 5,16 ; 4,98/δC 113,5 đó là proton H18 - C18; δH 2,77 ; 2,47/δC 65,8 đó là
proton H21 - C12; δH 4,09 ; 3,91/δC 61,4 đó là proton H17 - C17; δH 2,84 ; 2,02/δC 23,0
đó là proton H14 - C14.
Từ phổ HSQC các carbon bậc 1 (CH 3), bậc 2 (CH2) và bậc 3 (CH) được xác
định. Từ các nguyên tử carbon bậc 1, bậc 2 và bậc 3 đã được xác định ở trên kết hợp
với phổ HSBC (cho biết tương tác xa 3J hay 4J giữa proton và nguyên tử carbon) các
carbon bậc 4 (Cq) được xác định.

17
16

O

14

H
8

H

4 CH3
15 Nb
6 5

3

9
10

H

7
20

11

13
12

1

2

Na

19

O

21
18

OCH3

Gelsevirin

Bảng 2.2 : Số liệu phổ 1H-NMR của chất A2 (500 MHz, CDCl3)

15

Hằng số tương tác

Độ dịch chuyển

J (Hz)

hóa học δ (ppm)

Vị trí proton

Số proton

Độ bội

H9

1H

d

J = 7,5 Hz

7,45

H11

1H

dt

J = 1 Hz; J = 8 Hz

7,30

H10

1H

dt

J = 1 Hz; J = 7,5 Hz

7,06

H12

1H

d

J = 8 Hz

6,96

H19

1H

dd

J = 11 Hz; J = 17,5 Hz

6,23

H18α

1H

dd

J = 1 Hz; J = 11 Hz

5,16

H18β

1H

dd

J = 1 Hz; J = 18 Hz

4,98

H17α

1H

dd

J = 2 Hz; J = 11 Hz

4,09

N-OCH3

3H

s

H17β

1H

dd

H3

1H

s (br)

3,81

H5

1H

s

3,48

H14α

1H

dd

J = 3 Hz; J = 14,5 Hz

2,84

H21α

1H

d

J = 11 Hz

2,77

H16

1H

d

J = 8,5 Hz

2,51

H21β

1H

d

J = 11 Hz

2,47

H15

1H

t

J = 6,5 Hz

2,34

N-CH3

3H

s

H14β

1H

ddd

3,97
J = 2 Hz; J = 11,5 Hz

3,91

2,30
J = 3Hz; J = 5,5Hz; J =

2,02

14,5Hz
H6

1H

s

2,00

Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3, δ ppm) :
172,7 (C2); 139,5 (C13); 137,6 (C19); 128,4 (C9); 128,2 (C11); 127,8 (C8); 122,9 (C10);
113,5 (C18); 107,2 (C12); 72,4 (C5); 69,4 (C3); 65,8 (C21); 63,2 (OCH3); 61,4 (C17);
54,0 (C20); 52,2 (C7); 50,7 (C6); 40,9 (N-CH3); 38,3 (C16); 35,7 (C15); 23,0 (C14).

16

Qua phõn tích phổ và so sánh với số liệu đã công bố trong tài liệu [3], chất
A2 được xác định cấu trúc là Gelsevirin.
2.2 Nhận dạng chất A4
Chất A4 kết tinh trong acetone, là tinh thể khơng màu, hình khối.
Chất A4 tan tốt trong các dung môi hữu cơ như ethanol, methanol,
chloroform… , không tan trong nước.
- Nhiệt độ nóng chảy: 1700 C.
- Phổ UV: đo trong MeOH cho các đỉnh hấp thụ cực đại λ max: 222 nm và 266
nm.
- Phổ IR: đo dưới dạng viờn nộn KBr cho các đỉnh hấp phụ mạnh ở 3462;
3261; 3067; 2924; 2852; 2780; 1740; 1627; 1577; 1442; 1320; 1237; 1157; 1074;
988; 927; 852; 778; 753 cm-1.
- Phổ khối (ESI-MS): phương pháp ion hóa bằng bụi electron , chất A4 có số
khối của pic phân tử [M+H] = 307, tương ứng với cơng thức cấu tạo C20H22N2O.

4
21

18

9

20

8

10

15

7

11
12

13

a

6

5

16
17

14

2
3

Koumin
Phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton và carbon 1 chiều và 2 chiều
(1D, 2D, 1H, 13C-NMR).

17

- Phổ cơng hưởng từ hạt nhân: các tín hiệu của phổ công hưởng từ hạt nhân 1
chiều (1D-NMR) như phổ 1H-NMR, cho các thông tin sau:
Phổ proton (1H-NMR) chất A4 được đo trong DMSO (500MHz) cho 22 tín
hiệu proton có độ dịch chuyển hóa học từ 1,67 đến 7,57 ppm, đúng bằng số proton
có mặt trong Koumin. Các tín hiệu này có thể được chia làm 2 vùng: ở vùng trường
thấp từ 7,51 - 7,57 ppm, có tín hiệu của 4 proton thơm, đó là các proton của nhân
indolein bị thế, trong đó proton H9 có độ dịch chuyển hóa học xa nhất (7,57 ppm) về
phía trường thấp do hiệu ứng điện tử Nitơ của nhân indolein. Ở vùng trường cao
hơn từ 4,83 - 1,67 ppm, có 18 tín hiệu proton trong đó các tín hiệu proton ở phía
trường thấp là các proton olefin (liên kết đôi), methine (CH-) và đặc biệt là nhóm
methylenoxy, cịn lại là các tín hiệu của proton methylene (CH2-) và methyl (CH3-).
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều (2D-MNR), phổ COSY ( 1H-1H, NMR)
cho phép xác định các tương tác giữa proton và proton. Ở vùng dịch chuyển hóa
học của các proton thơm (4 proton: H 12, H9, H11 và H10), cho thấy mỗi proton thơm
tương tác với 2 proton gần nó ở vị trí othor (Jor = 7,5 Hz) và meta (Jm = 1,5 Hz).
Ở vùng dịch chuyển hóa học ở trường cao hơn δ = 4,83 ppm, proton H 18 là proton
olefin (H18α và H18β) tương tác với H19 có hằng số tương tác lớn (J = 11 Hz và J = 18
Hz). Có độ dịch chuyển hóa học δ = 4,81 ppm là proton H 3 có tín hiệu là triplet (t)
tương tác với 2 proton H14α và H14β, proton H3 này đã dịch chuyển mạnh về phía
trường thấp do hiệu ứng điện tử của nguyên tử Oxy.
Ở vùng dịch chuyển hóa học tiếp theo về phía trường cao hơn, 2 proton H 21α
và H21β tương tác với nhau có hằng số tương tác J = 12 Hz.
Tương tự như vậy, khi xét tương tác từng cặp proton tương tác với nhau dựa
trên phổ COSY và phổ hai chiều HSQC, các proton còn lại được xác định như H 17α
và H17β; H6α và H6β; H5, H15 và H16 cũng như nhúm N-CH3. Chi tiết độ dịch chuyển
hóa học, dạng pic và hằng số tương tác giữa các proton được tóm tắt trên bảng 2.3.
Bảng 2.3 : Số liệu phổ 1H-NMR của chất A4 (500 MHz, DMSO)
Vị trí proton Số

Độ bội

Hằng số tương tác

18

Độ dịch chuyển


H9
H12
H11
H10
H18α
H3
H18β
H19

proton
1H
1H
1H
1H
1H
1H
1H
1H

d
d
dt

dt
dd
t
dd
dd

J (Hz)
hóa học δ (ppm)
J = 7 Hz
7,57
J = 7,5 Hz
7,51
J = 1,5 Hz; J = 7,5 Hz
7,33
J = 1,5 Hz; J = 7 Hz
7,24
J = 1 Hz; J = 18 Hz
4,83
J = 1,5 Hz
4,81
J = 1 Hz; J=11,5 Hz
4,74
J = 11,5 Hz; J = 18
4,57

H21α

1H

dd

Hz
J = 4,5 Hz; J= 11,5

H21β
H17α
H17β
H5
H16
H14α
N-CH3
H15
H6α
H6β
H14β

1H
1H
1H
1H
1H
1H
3H
1H
1H
1H
1H

d
d

d
m
m
td
s
m
m
dd
td

Hz
J = 11,5 Hz
J = 11 Hz
J = 11 Hz
J = 3,5 Hz; J = 15 Hz

J = 4 Hz; J = 14 Hz
J = 2 Hz; J = 14,5 Hz

4,14
3,51
3,05
2,96
2,74
2,71
2,58
2,48
2,26
2,24
2,13

1,67

Phổ cộng hưởng từ 1 chiều 13C-NMR, DEPT 90 và DEPT 135 cho biết chất
A4 có 20 nguyên tử carbon, trong đó có một nhóm CH 3, 5 nhóm CH2, 9 nhóm CH
và 5 carbon bậc 4 (Cq).
Phổ hai chiều HSQC cho biết các tương tác 1J của proton với nguyên tử
carbon. Đặc biệt các nhúm methylene (CH2) có 2 proton tương tác với 1 nguyên tử
carbon như δH 4,83 ; 4,74/δC 115,74 đó là proton H18 - C18; δH 4,14 ; 3,51/δC 60,5 đó
là proton H21 - C12; δH 3,05 ; 2,96/δC 56,9 đó là proton H17 - C17; δH 2,58 ; 1,67/δC
24,7 đó là proton H14 - C14; δH 2,24 ; 2,13/δC 28,6 đó là proton H6 - C6.
Từ phổ HSQC các carbon bậc 1 (CH 3), bậc 2 (CH2) và bậc 3 (CH) được xác
định. Từ các nguyên tử carbon đã được xác định ở trên kết hợp với phổ HMBC
(tương tác xa 3J hay 4J giữa proton và nguyên tử carbon) các carbon bậc 4 (Cq) được
xác định.

19


Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO, δ ppm) :
185,5 (C2); 154,5 (C13); 143,8 (C8); 137,5 (C19); 127,9 (C11); 125,8 (C10); 123,1 (C9);
120,4 (C12); 115,7 (C18); 69,9 (C3); 60,5 (C21); 57,4 (C7); 56,9 (C17); 55,8 (C5); 44,8
(C20); 42,2 (N-CH3); 37,9 (C16); 32,4 (C15); 28,6 (C6); 24,7 (C14).
Qua phõn tích phổ và so sánh với số liệu đã công bố trong tài liệu [3, 13],
chất A4 được xác định cấu trúc là koumin. Koumin (Kou - Wen) tiếng Trung Quốc
có nghĩa là độc, đã được phõn lập từ cõy Gelsemium elegans vào năm 1932, nhưng
đến năm 1981 cấu trúc của nó mới được xác định bằng phổ cộng hưởng từ phõn giải
cao và khẳng định lại bằng phương pháp phổ nhiễu xạ tia X [13]. Koumin có cấu
trúc của nhúm chất corynanthein alcaloid và có cấu hình tuyệt đối ở C15.

Chương 3: THỰC NGHIỆM

Rễ cây Lỏ ngún (Gelsemium elegans Benth.) của Việt Nam chưa được
nghiên cứu nhiều về thành phần hoá học, đồng thời trong giám định hố pháp chưa
có các chất chuẩn alcaloid chiết tách từ cõy Lỏ ngún.
Nhiệm vụ của luận văn này là:
- Định tính alcaloid và định lượng alcaloid toàn phần
- Chiết xuất và phõn lập alcaloid trong rễ cõy Lá ngún

20


- Xác định cấu trúc hoá học của các alcaloid tinh khiết bằng các phương
pháp phổ: phổ cổng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (13C-NMR, 1H-NMR,
HSQC, COSY, …), Phổ khối lượng, …
3.1 Dụng cụ và hoá chất
Chúng tôi sử dụng cỏc hoỏ chất và thiết bị sau:
- Dung môi hữu cơ: chloroform, methanol, ethyl acetate, ethanol, …
- Axit HCl, dung dịch NH3 25%, …
- Chất hấp phụ silicagel:
+ Loại dùng cho bản mỏng: silicagel 60 F254 Merck
+ Loại dùng cho cột: silicagel 60 (0,040 - 0,063) Merck
- Đèn tử ngoại: Desaga Min UV - VIS
- Máy điều nhiệt: Buchi B - 480
- Máy cất quay: Buchi R - 114
- Cân: Metter Toledo AB204
Các kết quả phổ đều được gửi phân tích ở Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt
Nam.
3.2 Chuẩn bị mẫu
Mẫu rễ cây Lá ngón được thu hái tại Sơn La vào tháng 1 năm 2005. Mẫu
được thái nhỏ, sấy khô ở 50 - 600C. Sau đó được nghiền nhỏ, bảo quản trong lọ thuỷ
tinh đậy kín.

3.3 Định tính alcaloid và định lượng alcaloid tồn phần
3.3.1 Định tính alcaloid
Lấy 10g bột rễ cây Lỏ ngún, cho vào bình nón dung tích 250 ml, làm ẩm
bằng 3 ml dung dịch NH3 25% trong 1 giờ. Sau đó thêm vào bình 100 ml
chloroform, lắc đều, để yên qua đêm, lọc, lấy dịch lọc đem chiết với 50 ml dung
dịch acid HCl, gạn lấy phần dịch acid.

21


Cho vào hai ống nghiệm sạch 1 ml dịch chiết acid rồi thêm vào mỗi ống mọt
giọt thuốc thử sau:
- Thuốc thử Dragendorff
- Thuốc thử Mayer
Quan sát hiện tượng thấy có xuất hiện kết tủa màu đỏ gạch ở ống sử dụng
thuốc thử Dragendorff, và kết tủa màu trắng ở ống sử dụng thuốc thử Mayer. Số
lượng hạt kết tủa nhiều.
Kết luận: có thành phần alcaloid trong rễ cây Lỏ ngún
3.3.2 Định lượng alcaloid toàn phần
Để định lượng alcaloid toàn phần trong rễ cây Lỏ ngún chỳng tôi sử dụng
phương pháp acid - base.
a. Xác định độ ẩm
Độ ẩm của bột dược liệu dùng để định lượng được xác định trên máy
Sartorius (Germany) tại bộ môn Dược liệu Trường Đại học Dược - Hà Nội.
Kết quả độ ẩm của rễ là: 9,72%
b. Tiến hành định lượng
Cân chính xác 10g bột dược liệu đã xác định độ ẩm cho vào bình dung tích
250 ml, thấm ẩm bằng NH4OH 25%, để yên 12 giờ, cho bột dược liệu vào tuí lọc rồi
đặt vào bình Soxhlet. Chiết với dung mơi CHCl3 đến kiệt alcaloid (thử bằng thuốc
thử Dragendorff). Cất thu hồi dung môi, hoà tan cặn trong HCl 5%, rửa dịch acid

bằng ether 3 lần mỗi lần 10 ml, kiềm hoá bằng dung dịch NH 3 25% đến pH = 12.
Sau đó, chiết bằng CHCl3 5 lần mỗi lần 10 ml để lấy kiệt alcaloid toàn phần. Tập
trung dịch chiết rồi rửa bằng nước cất đến pH = 7, để bốc hơi tự nhiên đến khơ. Hồ
tan cặn bằng một lượng chính xác 10 ml HCl 0,1 N. Thêm nước cất đun sôi để
nguội và 3 giọt dung dịch methyl. Định lượng acid thừa bằng dung dịch NaOH 0,1
N.
c. Tính tốn kết quả

22


Khi định lượng nhiều alcaloid trong dược liệu người ta thường tính kết quả
theo một alcaloid chính trong đó. Với cõy Lỏ ngún thỡ tớnh theo Koumin, 1 ml
dung dịch HCl 0,1 N tương ứng với 0,0306 g alcaloid toàn phần tính theo Koumin.
Vậy hàm lượng alcaloid tồn phần tính theo Koumin là:
(10 – V).0,0306.100
Χ% =
P
- X: Hàm lượng phần trăm alcaloid tồn phần trong dược liệu khơ tuyệt đối.
- V: Thể tích NaOH 0,1 N dùng để trung hồ HCl dư
- 10 - V: Số ml dung dịch acid đã tham gia bão hoà alcaloid
- P: Khối lượng dược liệu đã trừ độ ẩm (g)
Tiến hành định lượng 5 lần. Kết quả định lượng được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả định lượng alcaloid toàn phần trong rễ cây Lỏ ngún
Lần thí nghiệm
V (ml)
X (%)
Trung bình

1

7,50
0,85

2
7,40
0,87

3
7,35
0,89
0,87 ± 0,01

4
7,45
0,86

5
7,35
0,89

Kết luận: Kết quả định lượng cho thấy, hàm lượng alcaloid toàn phần trong
rễ cây Lỏ ngún là khá cao khoảng 0,87%.
3.4 Chiết xuất và phân lõp alcaloid từ rễ cây Lỏ ngún
3.4.1 Chiết xuất alcaloid toàn phần
Alcaloid toàn phần trong rễ cõy Lỏ ngún được chiết bằng cồn, theo phương
pháp ngấm kiệt ở nhiệt độ thường. Quy trình chiết được trình bày ở sơ đồ 3.1.

Bột dược liệu
1. Ngâm lạnh trong cồn - acid tactric 1%
2. Lọc

Bã

Dịch chiết cồn - acid
1.
Cất quay thu hồi cồn

Cao đặc

23


1. Nước cất
2. Lọc loại tạp
Dịch chiết nước - acid
Chiết bằng Ethyl acetate

Dịch chiết
Ethyl acetate
(tạp)

Dịch chiết nước - acid
(loại tạp)
1. Dung dịch NH3 25%
2. Lọc

Kết tủa

Dịch chiết nước
pH = 11-12

1. Hoà tan bằng cồn- acid
2. Kờt tủa lại bằng

Chiết bằng CHCl3

Dịch chiết CHCl3

NH3
3. Rửa bằng H2O nhiều lần

Cất quay thu hồi CHCl3

Cặn chiết alcaloid

A8

Alcaloid toàn phần

Sơ đồ 3.1: Sơ đồ chiết xuất alcaloid trong rễ cây Lỏ ngún
3.4.2 Phân tích cặn chiết alcaloid bằng sắc ký lớp mỏng
Để khảo sát thành phần và khả năng tỏch cỏc alcaloid cũng như tìm kiếm
một hệ dung mơi thích hợp cho q trình tách, chúng tôi dùng phương pháp sắc ký
lớp mỏng nhằm tiết kiệm lượng mẫu và dung môi.
a. Chuẩn bị bản mỏng

24


Sử dụng bản mỏng có chiều dài 10 cm, chiều rộng tuỳ thuộc vào số lượng

các chất đưa lên bản mỏng. Hai mép bản mỏng phải làm phẳng đều tránh hiệu ứng
bờ.
b. Đưa chất lên bản mỏng
Dựng thìa kim loại lấy một lượng nhỏ cặn chiết cho vào ống nghiệm, hồ tan
mẫu trong dung mơi thích hợp. Dùng capila (loại chấm bản mỏng) có đường kính
0,3 mm để hút và chấm chất lên bản mỏng. Chấm chất sao cho có vế tròn và gọn,
cỏch mộp của bản mỏng 0.5 cm và cỏch chõn bản mỏng chừng 1 cm. Lượng chất
đưa lên bản mỏng phải đủ để hiện các vết trên bản mỏng, nhưng không quá nhiều
để trỏnh cỏc vết trựng lờn nhau.
Nếu chất có nồng độ thấp trong dung mơi thì chấm chất nhiều lần ở một
điểm, chấm một lần rồi chờ cho dung môi bay hơi hết lại tiếp tục chấm tiếp lần
khác.
c. Triển khai
Để bình chạy sắc ký bản mỏng có miệng rộng, nắp nhỏm, đỏy phẳng và được
bão hồ bằng hệ dung mơi đã lựa chọn.
Bản mỏng sau khi đã chấm chất để ngồi khơng khí khoảng 2 phút cho dung
mơi bay hơi hết, sau đó đặt vào bình sao cho chân bản mỏng phía có chất ở dưới và
tấm bản mỏng nghiêng với thành bình 150. Chờ cho tuyến dung môi chạy lờn cỏch
mộp trờn của bản mỏng chừng 1 cm thì lấy ra, để ngồi khơng khí cho bay hơi hết
dung mơi.
d. Hiện sắc kí đồ
Để hiện sắc đồ, dựng đốn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365nm để soi bản
mỏng đã được chạy sắc ký, đáng dấu các vết. Sau đó phun bản mỏng bằng thuốc thử
Dragendorff. Tính Rf cho mỗi chất tách ra ở một hệ dung mơi nhất định
Q trình trên được áp dụng trong suốt thời gian làm thực nghiệm với sắc ký
lớp mỏng.
Dựa vào kết quả này thu nhận được các thông tin sau:

25