LUẬN VĂN THẠC SỸ HOÀN CHỈNH (Y DƯỢC) đặc điểm sinh học phân tử của haemophilus influenzae typ b phân lập từ bệnh nhi viêm màng não dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ, mẫu giáo

1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Giống vi khuẩn Haemophilus là một trong những loại vi khuẩn ký sinh
ở đường hô hấp người và một số loài động vật. Loài H. influenzae là căn
nguyên của một số bệnh nhiễm trùng ở người (có thể từ viêm đường hô hấp
cho đến viêm màng não). H.influenzae typ b (Hib) đã được thế giới xác định
là một trong những căn nguyên chớnh gõy viờm màng não do vi khuẩn, đặc
biệt ở trẻ em dưới 5 tuổi [24], [89].
Tại những nước phát triển như khu vực Bắc Mỹ, Tây Âu, châu Úc hầu
hết những nghiên cứu đã cho thấy tỷ lệ mang Hib ở họng rất cao ở trẻ nhỏ,
đặc biệt là những trẻ được chăm sóc tại các trung tâm giữ trẻ ban ngày có thể
mang Hib đến 15% [52], [69]. Bên cạnh đó, Hib cũng được đánh giá là
nguyên nhân hàng đầu gõy cỏc bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ như
viêm màng não, viêm phổi... để lại di chứng và tỷ lệ tử vong cao (khoảng
10%). Gánh nặng bệnh tật do Hib đã giảm đáng kể nhờ có vacxin phịng bệnh
tại các nước này [89]. Tuy nhiên, một số nước trên thế giới sau khi đánh giá
q trình thực hiện phịng bệnh do Hib bằng vacxin đã cho thấy tỷ lệ thất bại
của vacxin cũng không nhỏ. Xuất phát từ vấn đề này, đã có nhiều nghiên cứu
về đặc điểm sinh học phân tử (phổ biến nhất là sử dụng kỹ thuật PFGE) của
Hib được tiến hành để đỏnh giá dịch tễ học phân tử của vi khuẩn này dựa trên
nghiên cứu so sánh với đặc điểm các chủng Hib phõn lập từ người khỏe mạnh
và người tiếp xúc mang vi khuẩn [82], [100], [105], [111], [112].
Tại Việt Nam, một số nghiên cứu đã đánh giá tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang
vi khuẩn H. influenzae nói chung [1] và Hib nói riêng [7], tỷ lệ mắc viêm
màng nóo do H.influenzae (chưa có điều kiện xác định typ huyết thanh) ở trẻ
dưới 5 tuổi [6], [22]. Cho thấy tỷ lệ trẻ dưới 5 tuổi mang H.influenzae chiếm
khoảng 21,4% - 35,5% [8], Hib chiếm khoảng 15,0% - 17,5% [7] và
H.influenzae là căn nguyên hàng đầu gây viêm màng nóo (50 - 60% các

2
trường hợp viêm màng nóo xác định được vi khuẩn) ở trẻ nhỏ [6]. Từ năm
1994 đến 2004, một số nghiên cứu của Ngô Thị Thi, Phan Lê Thanh Hương
cùng cộng sự đã đưa ra tỷ lệ viêm màng nóo do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi tại Hà
Nội và một số tỉnh phớa Bắc [11], cũng như tìm hiểu về sự phân bố theo
biotype, genotype (phân loại bằng PFGE) và gen mã hóa tổng hợp enzym
lactamase của Hib phân lập từ trẻ viêm màng não dưới 5 tuổi đã được thực
hiện [10]. Tuy nhiên, số lượng chủng Hib sử dụng trong nghiên cứu vẫn cịn
hạn chế và chưa có những so sánh với những chủng Hib phõn lập được ở trẻ
khỏe mạnh. Vì vậy, để góp phần tìm hiểu nguồn gốc, đặc điểm sinh học phân
tử của những chủng Hib gõy viêm màng não cho trẻ dưới 5 tuổi và trẻ khỏe
mạnh ở lứa tuổi mẫu giáo có mang Hib. Chúng tôi thực hiện đề tài: “Đặc
điểm sinh học phân tử của Haemophilus influenzae typ b phân lập từ
bệnh nhi viêm màng não dưới 5 tuổi và trẻ khỏe mạnh tại nhà trẻ, mẫu
giáo”, nhằm thực hiện 3 mục tiêu:
1. Xác định biotype, genotype, khả năng sinh enzym  -lactamase và
mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng Hib phân lập được
từ bệnh nhi viêm màng nóo dưới 5 tuổi.
2. Xác định tỷ lệ, biotype, genotype, khả năng sinh enzym  -lactamase
và mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng Hib phân lập
được từ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi tại một số nhà trẻ, mẫu giáo.
3. So sánh đặc điểm sinh học giữa Hib gây viêm màng não ở trẻ dưới 5
tuổi với Hib được phân lập từ trẻ khỏe mạnh mang vi khuẩn.


3

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Haemophilus influenzae typ b (Hib)

1.1.1. Haemophilus influenzae: lịch sử và tên gọi
Haemophilus influenzae (H.influenzae) được phân lập lần đầu tiên bởi
Richard Pfeiffer từ đờm của một bệnh nhân bị viêm phổi trong đại dịch cúm
năm 1890. Lúc đó, vi khuẩn này được hiểu lầm là nguyên nhân gây ra bệnh
cúm nên được gọi là trực khuẩn cúm (Influenzae bacteria). Mãi cho đến khi đại
dịch cúm xảy ra trong những năm 1918-1919, người ta mới biết H.influenzae
chỉ là thành viên của hệ vi khuẩn ký sinh ở đường hô hấp trên và không phải
lúc nào cũng gây bệnh. Năm 1933, khi phát hiện ra virus cúm là căn nguyên
của bệnh cúm, vai trò của H.influenzae mới được làm sáng tỏ: virus cúm gây ra
bệnh cúm, còn H.influenzae chỉ là vi khuẩn “ăn theo” (second invader) sau khi
các tế bào đường hô hấp đã bị tổn thương nặng bởi virus cúm. Xuất phát từ yếu
tố lịch sử có liên quan đến bệnh cúm (influenzae: bệnh cúm) và nhu cầu địi hỏi
những yếu tố phát triển có mặt ở máu (Haemophilus: ưa mỏu) nờn vi khuẩn
này có tên gọi H.influenzae [19], [43], [89].
1.1.2. Đặc điểm sinh học của H.influenzae typ b (Hib)
1.1.2.1. Hình thể và cấu trúc [19], [89]
H. influenzae là một trong những loài vi khuẩn nhỏ nhất, cịn được gọi
là cầu trực khuẩn vì vi khuẩn này có dạng trực khuẩn ngắn (1,0–1,5m)
nhưng uốn cong ở hai đầu trơng như hình cầu. Tuy nhiên khi chúng ở dịch
não tuỷ, hình thể của H. influenzae có thể kéo dài ra gấp vài lần so với chiều
dài thông thường (Hình 1.1). H. influenzae bắt màu Gram õm, khơng di động
và khơng hình thành nha bào. Thành tế bào của vi khuẩn này có cấu trúc bề
mặt lipopolysaccharide–protein tương tự như thành của những vi khuẩn Gram


4
õm khác. Tuy nhiên, H. influenzae được phân loại thành 2 nhóm: loại khơng
vỏ polysaccharide (non-typeable khụng xác định được typ huyết thanh) và
loại có vỏ (typeable xác định được typ huyết thanh). Lồi H. influenzae có vỏ
bọc được phân loại tiếp tục theo các typ huyết thanh (serotype) từ a đến f tuỳ

thuộc vào đặc tính kháng nguyên của vỏ polysaccharide do gen qui định [19],
[43], [89]. Vỏ bọc typ b là một dạng trùng hợp của ribose, ribitol và
phosphate, được gọi là polyribosyl - ribitol - phosphate (PRP). Những
polysaccharide bề mặt này có liên quan chặt chẽ với độc lực của vi khuẩn, đặc
biệt là H. influenzae typ b (Hib), nguyên nhân của nhiều trường hợp nhiễm
trùng hệ thống nghiêm trọng bao gồm cả viêm màng nóo (chiếm trên 90% các
ca nhiễm khuẩn xõm hại do Hib).

Bạch cầu đa nhân
Hib

Hình 1.1 Hình thể của Hib trên tiêu bản nhuộm Gram dịch não tuỷ dưới
kính hiển vi quang học (độ phóng đại ì 1000) [99].
Trên thực tế, nếu nhuộm Gram bệnh phẩm dịch nóo tủy mà trên vi
trường cho thấy nhiều vi khuẩn Gram (-) nhỏ, đa hình thái và nhiều bạch cầu
đa nhõn thì đõy là dấu hiệu rất quan trọng gợi ý cho chẩn đoán sớm viêm
màng nóo do H. influenzae [89].
1.1.2.2. Sức đề kháng [127]
H. influenzae là loại vi khuẩn chịu đựng rất kém với các yếu tố ngoại
cảnh. Trong bệnh phẩm, chúng chết nhanh chóng nếu để ánh sáng mặt trời


5
chiếu trực tiếp, để khô hoặc lạnh giá. Các chất sát khuẩn thông thường tiêu
diệt vi khuẩn này một cách dễ dàng.
Vì vậy, bệnh phẩm để chẩn đốn vi khuẩn này nên được vận chuyển về
phịng thí nghiệm trong vịng 1 giờ, hoặc không quá 6 giờ ở nhiệt độ phịng
thí nghiệm (24 - 28oC). Nếu là tăm bơng bệnh phẩm phải giữ trong môi
trường vận chuyển (môi trường bảo quản), có thể giữ ở nhiệt độ 4 - 8 oC tối đa
24 giờ trong môi trường này.

1.1.2.3. Đặc điểm nuôi cấy [19]
Điều kiện nuôi cấy:
H. influenzae là loại vi khuẩn khó ni cấy. Chỳng khụng mọc trờn cỏc
mụi trường nuôi cấy thông thường, chỉ mọc khi trong môi trường đã có sẵn cả
hai yếu tố X và V. Yếu tố X có lẽ khơng phải là một chất thuần túy mà là hỗn
hợp của các chất có chứa sắt (như hemin và hematin).
H. influenzae dùng yếu tố X để tổng hợp một số enzym như catalase,
peroxidase và cytochrom của hệ thống vận chuyển điện tử. Máu và các sản
phẩm của máu, kể cả hemin là nguồn nguyên liệu truyền thống được sử dụng
để sản xuất yếu tố X. Thạch máu (5%) có khả năng cung cấp đủ lượng yếu tố
X mà H. influenzae cần thiết phát triển. Khi dùng hematin tinh chế thì nồng độ
cần thiết là 0,1 - 1,0 g/ml. Yếu tố V là NAD hoặc NADP mặc dù có mặt
trong máu, nhưng một phần chúng nằm bên trong tế bào. Mặt khác, trong máu
của nhiều loài động vật có enzym NADase có tác dụng phõn hủy NAD, nên
trong máu tươi khơng có NAD ở dạng tự do. Thạch chocolate, NAD được giải
phóng ra khỏi tế bào và enzym NADase bị nhiệt phá huỷ. Khi dùng NAD tinh
chế, nồng độ cần thiết là 0,2 - 1,0 g/ml.
H. influenzae hiếu khí, địi hỏi mơi trường ni cấy có CO 2 (2 - 5%) khi
mới phân lập. Mọc tốt trờn mụi trường chocolate và Levinthal ở nhiệt độ
khoảng 23 - 390C, tối ưu là 370C. Không mọc được trên thạch máu cừu; nếu


6
mọc trờn cỏc loại thạch mỏu khỏc (ví dụ máu thỏ) thỡ khụng gõy tan máu và
khuẩn lạc nhỏ hơn nhiều so với trên chocolate trong cựng cỏc điều kiện nuôi
cấy. Cũng trên thạch máu, người ta thấy khuẩn lạc H. influenzae mọc xung
quanh các khuẩn lạc Staphylococcus aureus bội nhiễm rất to, trong khi đó ở
những vùng xa thì khuẩn lạc hoặc là không mọc, hoặc là rất bé. Hiện tượng này
gọi là hiện tượng “vệ tinh” (satellitism), do khả năng tiết ra yếu tố V của vi
khuẩn bội nhiễm đó giúp H. influenzae phát triển được thạch mỏu thụng

thường.

Hình 1.2: Hiện tượng "vệ tinh", khuẩn lạc của H. influenzae mọc xung
quanh khuẩn lạc của S. aureus trờn môi trường thạch máu thỏ
Môi trường nuôi cấy và đặc điểm khuẩn lạc:
Để ni cấy H. influenzae, có 3 loại mơi trường có thể được được sử
dụng [19], [43], [89], [127]:
- Thạch chocolate có hoặc khơng có 300g bacitracin/ml mơi trường
(có tác dụng ức chế một số vi khuẩn khác, đặc biệt là liên cầu) để phõn lập
H.influenzae. Đõy là loại môi trường thường được sử dụng nhất trong nuôi
cấy và phõn lập vi khuẩn này.
- Thạch máu thỏ tươi 7% và thạch Levinthal


7
Sau khi nuôi cấy vi khuẩn vào môi trường phân lập, ủ ấm trong khí
trường 5% CO2 (nếu khơng có tủ ấm CO2, môi trường nuôi cấy được đặt trong
một chuông thủy tinh và đốt 1 cây nến trong quả chng này. Sau khi ngọn
nến tắt, khí trường bên trong quả chng có thể là 3 - 5% CO 2) ở 37oC trong
thời gian 18 - 24 giờ.

Hình 1.3: Khuẩn lạc H. influenzae mọc trờn mụi trường chocolate
Sau 16 - 18 giờ nuôi cấy, H. influenzae phát triển thành những khuẩn
lạc bóng mờ, vồng nhẹ, đường kính từ 1 - 2mm và khụng gõy tan huyết. Vi
khuẩn Hib ln có vỏ, khuẩn lạc thường sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi
ánh sáng chiếu vào và có đường kính lớn hơn. Ngồi ra, mơi trường ni cấy
vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indol). Sau 24 - 48
giờ, trạng thái mất vỏ xuất hiện, tính óng ánh biến mất, vi khuẩn tự ly giải và
có thể tính chất bắt màu Gram thay đổi.
Trên môi trường lỏng, H. influenzae thường phát triển làm đục mơi

trường. Tình trạng mất vỏ xảy ra sớm hơn trên mơi trường thạch, vì vậy nếu
muốn xác định vỏ cần chọn thời điểm nuôi cấy thích hợp (18 giờ).
Tính chất sinh hóa đặc trưng của H. influenzae:


8
Tính chất sinh hóa đặc trưng của H. influenzae là nhu cầu đòi hỏi bắt
buộc 2 yếu tố phát triển là X và V trong mơi trường ni cấy. Tính chất này có
thể được xác định bằng thử nghiệm XV hoặc thử nghiệm "vệ tinh" [19], [127]:

(1)

(2)

Hình 1.4: Thử nghiệm với bằng 3 khoanh giấy X, V và XV (1); thử
nghiệm "vệ tinh" (2), cho thấy H. influenzae đòi hỏi bắt buộc phải có cả 2 yếu
tố X và V cho sự phát triển
H. influenzae được phân biệt với những loại Heamophilus khác ở các
đặc điểm sau đây:
Bảng 1.1: Những đặc điểm sinh học để phân biệt H. influenzae với các
Haemophilus khác [127].
Tính chất

Tan huyết Cần yếu tố X Cần yếu tố V Cần CO2
Loài
H. influenzae
+
+
+
H. parainfluenzae

+
H. hemolyticus
+
+
+
H. parahemolyticus
+
+
±
H. aphrophilus
+
+
H. paraphrophilus
+
+
1.1.3. Đặc điểm phân loại theo typ huyết thanh (serotype) và typ sinh học
(biotype) của H. influenzae
1.1.3.1. Đặc điểm phân loại H. influenzae theo typ huyết thanh [19], [43], [89]


9
Năm 1930, H. influenzae được xác định thành 2 nhúm chớnh, đó là lồi
khơng vỏ (khụng xỏc được typ huyết thanh - non typeable) và lồi có vỏ (xác
định được typ huyết thanh - typeable). Dựa trên tính đặc hiệu kháng nguyên của
vỏ polysaccharide, vi khuẩn H. influenzae có vỏ được chia ra thành 6 typ huyết
thanh từ a đến f. Theo hầu hết các nghiên cứu cho thấy vi khuẩn H. influenzae
gây bệnh thuộc loại có vỏ, nhiều nhất là H. influenzae typ b.
1.1.3.2. Đặc điểm phân loại H. influenzae theo typ sinh học (biotype)
Bảng 1.2: Phân loại H. influenzae theo typ sinh học của Killian [43]
Biotype

Các tính chất hoá học
Test Urease

Test Indol

Ornithin decarboxylase (ODC)

I

+

+

+

II

+

+

-

III

+

-

-

IV

+

-

+

V

-

+

+

VI

-

-

+

VII

-

+

-

VIII

-

-

-

Kilian đã đưa ra phương pháp sử dụng một số thử nghiệm sinh hoá để
xác định biotype và đặc điểm sinh học của các loài Haemophilus dựa trên kết
quả của 3 thử nghiệm: tìm khả năng sinh indol, hoạt động của hai enzym
urease và decarboxylase của vi khuẩn. Trước đây, Kilian nghiên cứu và chia
H. influenzae thành 4 biotype từ I đến IV. Những biotype này độc lập với typ
huyết thanh của vi khuẩn đó, bởi vì các chủng khơng có vỏ cũng cho kết quả
tương tự với ba phản ứng sinh hoá ở trên. Sau này, cũng với những thử
nghiệm tương tự, Kilian đã bổ sung thêm 4 biotype từ V đến VIII. Vì vậy,
H. influenzae được chia ra làm 8 typ theo tiêu chuẩn của Killian [43].
1.1.4. Miễn dịch [28], [89]


10

Kháng thể (Kháng kháng nguyên thân)
Kháng nguyên thân (LPS và protein màng ngoài)
Vỏ (Polyribosyl-ribitol phosphate)
Kháng thể (Kháng kháng nguyên vỏ)

Đại thực bào
Đại thực bào

Hình 1.5 : Đại thực bào nuốt vi khuẩn Hib bị opsonin hóa bởi kháng thể
đặc hiệu với kháng nguyên vỏ và kháng nguyên thân [89]
Miễn dịch tự nhiên của cơ thể đối với Hib rất đa dạng, bao gồm một sự
hợp tác phức tạp của nhiều thành phần trong hệ thống miễn dịch: 1) Các yếu
tố miễn dịch niêm mạc, 2) Kháng thể dịch thể, 3) Sự opsonin hóa và q trình
hoạt hóa các phản ứng viêm qua trung gian bổ thể, 4) Khả năng thực bào, diệt
vi khuẩn bởi những đại thực bào và tế bào đa nhân, 5) Chức năng miễn dịch
qua trung gian tế bào lympho T. Trong đó khó có thể đánh giá rạch ròi cơ chế
miễn dịch nào là quan trong nhất trong những cơ chế bảo vệ cơ thể vật chủ.
Tuy nhiên, hầu hết các cá thể có được khả năng miễn dịch bảo vệ trong những
năm đầu của cuộc đời mà không mắc bệnh nhiễm khuẩn Hib lan tràn. Khả


11
năng miễn dịch thu được một cách tự nhiên này, đó là kết quả của đáp ứng với
sự xâm nhiễm họng - mũi của Hib cũng như sự xâm nhiễm không triệu chứng
ở ruột của hệ vi khuẩn đường ruột bình thường, dẫn đến có phản ứng chéo với
kháng ngun Hib. Mối liên quan tỷ lệ nghịch giữa nguy cơ mắc bệnh nhiễm
khuẩn do Hib đặc thù đối với tuổi và nồng độ kháng thể tự nhiên kháng Hib
có được trong những năm tháng đầu của cuộc đời. Đặc điểm này cũng đã nêu
lên được tầm quan trọng của kháng thể trong việc bảo vệ cơ thể khỏi bệnh
nhiễm khuẩn lan tràn do Hib. Hiện tượng trên được mô tả đầu tiên bởi
Fothergill và Wright năm 1933 [47], người ta biết trẻ sơ sinh đã có được
kháng thể diệt khuẩn immunoglobulin G (IgG) từ mẹ, kháng thể này yếu dần
đi trong những tháng tuổi đầu tiên, đồng thời với nguy cơ nhạy cảm theo tuổi
giữa tháng tuổi thứ 6 cho đến 2 - 4 tuổi nên để bảo vệ cơ thể cần phải thông

qua việc gây miễn dịch chủ động.
Mặc dù đặc điểm miễn dịch tự nhiên đối với vi khuẩn Hib là miễn dịch
đáp ứng với vài loại kháng nguyên bề mặt của vi khuẩn này, song kháng thể
kháng polysaccharide vỏ thuộc typ b (PRP) dường như có tầm quan trọng
nhất. Đối với loài H. influenzae typ b, 90% tổng số những kháng thể kháng
PRP có khả năng hoạt hóa bổ thể giúp tăng hoạt động thực bào và diệt vi
khuẩn nhờ opsonin hóa để bảo vệ cơ thể. Ở người, trước khi có kháng sinh,
việc sử dụng thụ động globulin miễn dịch chống lại Hib đã là phương pháp để
điều trị hiệu quả bệnh nhiễm khuẩn lan tràn này. Tuy nhiên, kháng nguyên vỏ
của Hib lại không được nhận biết bởi đại thực bào và tế bào lympho T nhưng
lại kích thích cỏc dũng tế bào lympho B đặc hiệu, do đó được gọi là kháng
nguyên độc lập với tế bào T. Vì vậy, kháng nguyên vỏ của Hib sẽ bị hạn chế
về khả năng đáp ứng miễn dịch, khơng hoạt hóa được các tế bào lympho T hỗ
trợ đặc hiệu. Tế bào T hỗ trợ tác động đến sự chín muồi, biệt hóa và tăng sinh
các tế bào B để những tế bào này trở thành tương bào sản xuất kháng thể. Tế


12
bào T hỗ trợ cũng có thời gian sống dài và tạo nên trí nhớ miễn dịch cần thiết
cho đáp ứng tăng cường tiếp theo khi cơ thể tiếp xúc trở lại với kháng nguyên
này. Kết quả của những đáp ứng kháng thể thiếu sự tham gia của tế bào T thì
hiệu lực miễn dịch sẽ thấp. Để khắc phục nhược điểm này, trong sản xuất
vacxin, thành phần PRP đã được cộng hợp (liên kết cộng hóa trị) với nhiều
loại protein có tính sinh miễn dịch làm tăng cường khả năng nhận biết của đại
thực bào và tế bào T, để có những ưu điểm như sau:
1) Tạo được nồng độ kháng thể cao hơn, đặc biệt ở trẻ nhỏ.
2) Khi nhắc tiêm nhắc lại, vacxin sẽ kích thích miễn dịch tăng lên, vì
thế đõy là một phương pháp làm tăng tối đa tính miễn dịch.
3) Đáp ứng miễn dịch chín muồi hơn, đặc thù hơn bởi sự chiếm ưu thế
của các kháng thể IgG-1.

4) Việc dùng trước hay dùng đồng thời các protein mang (dạng haptennhư độc tố uốn ván hoặc bạch hầu) đã tăng cường đáp ứng của tế bào T, nhờ
đó làm tăng tối đa đáp ứng miễn dịch với PRP khi cộng hợp với chất mang.
1.1.5. Khả năng gõy bệnh viêm màng nóo của Hib
1.1.5.1. Đặc điểm sinh bệnh học [24]
Hib lây truyền qua tiếp xúc hoặc hít phải các chất bài tiết bị nhiễm
khuẩn của đường hô hấp. Sau khi định cư ở vùng mũi họng, vi khuẩn có thể
gõy nhiễm khuẩn đường hơ hấp, lan ra tổ chức lân cận hoặc xâm nhập vào
dòng máu. Người ta cho rằng vi khuẩn từ mũi họng vào dòng máu do kết quả
của sự vận chuyển trong những tế bào thực bào từ niêm mạc vào các mạch
bạch huyết. Trong máu, những vi khuẩn Hib có vỏ PRP kháng lại được hiện
tượng đại thực bào và hoạt tính bổ thể. Ở trạng thái nhiễm khuẩn huyết, Hib
có thể lan tràn và vượt qua hàng rào mỏu - não. Vị trí Hib từ máu vào dịch
não tủy là đám rối màng mạch, nơi có sự phân bố mạch cao.
1.1.5.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh viêm màng nóo [24]


13
Trên lâm sàng, viêm màng nóo do H. influenzae typ b có thể tiến triển
âm ỉ trên vài ngày, thường phối hợp với nhiễm trùng đường hô hấp trên hoặc
đột ngột tiến triển trong vài giờ. Những dấu hiệu và triệu chứng của viêm
màng nóo do vi khuẩn này cũng giống hệt như triệu chứng và dấu hiệu gặp
trong viêm màng nóo do các vi khuẩn gây bệnh khác.
Những dấu hiệu khơng đặc hiệu, bao gồm: sốt, ngủ gà, kích thích, chán
ăn, nơn, suy hơ hấp và rối loạn tõm thần. Đối với trẻ lớn thường có nhức đầu,
cứng gáy, sợ ánh sáng. Các dấu hiệu Brudzinski, Kernig và cứng gáy đặc
trưng ít thấy ở trẻ dưới 15 tháng tuổi. Thêm vào đó, những dấu hiệu khu trú
có thể xuất hiện sớm, có đến 1/3 số bệnh nhõn bị co giật trước khi nhập viện.
Tỷ lệ tử vong bởi viêm màng nóo do Hib khoảng 5% và tỷ lệ mắc bệnh
kéo dài là 15 – 30%.
1.1.6. Phương pháp chẩn đoán phịng thí nghiệm viêm màng não do Hib

H. influenzae là loại vi khuẩn khó ni cấy, chỉ mọc trên mơi trường
giàu chất dinh dưỡng có chứa đầy đủ hai yếu tố phát triển X (hemin), V (NAD
hoặc NADP) và không có khả năng mọc trờn cỏc mơi trường thơng thường.
Vì vậy, việc chẩn đốn viêm màng nóo do Hib chủ yếu được thực hiện ở bệnh
viện tuyến tỉnh hoặc tuyến trung ương dựa vào phương pháp nuôi cấy phân
lập nên gặp rất nhiều khó khăn. Thêm vào đó, đõy cũng là phương pháp
thường được áp dụng nhất ở Việt Nam nhưng khả năng phát hiện căn nguyên
vi khuẩn Hib lại có độ nhạy thấp (khoảng xấp xỉ 50%) [12], [14].
Hiện nay, bên cạnh phương pháp nuôi cấy phân lập truyền thống,
những phương pháp chẩn đốn có độ nhạy và độ đặc hiệu cao cũng được áp
dụng để phát hiện Hib trong chẩn đốn viêm màng nóo. Tuy nhiên, hầu hết
các phương pháp hiện đại có thể giúp chẩn đốn nhanh Hib gây bệnh, nhưng
lại gặp hạn chế là không xác định được mức độ nhạy cảm với kháng sinh. Vì


14
vậy, phương pháp nuôi cấy phân lập truyền thống vẫn song hành cùng những
phương pháp chẩn đoán hiện đại.
1.1.6.1. Phương pháp ni cấy phân lập và xác định Hib
Chẩn đốn Hib từ bệnh phẩm dịch não tủy [12], [14], [127]
- Bệnh phẩm: lấy bệnh phẩm dịch não tủy (DNT) phải được thực hiện
bởi bác sĩ chuyên khoa có kinh nghiệm trong điều kiện và thủ thuật vô trùng.
Những trường hợp nghi ngờ bệnh nhân mắc viêm màng nóo, DNT là bệnh
phẩm tốt nhất được sử dụng cho phân lập hoặc phát hiện căn nguyên gây
bệnh. Lấy dịch não tủy nên chỉ sử dụng cho việc chẩn đoán và được cấy trực
tiếp vào cả hai đĩa thạch nuôi cấy (01 đĩa thạch máu và 01 đĩa thạch
chocolate). Ngay sau khi được lấy, bệnh phẩm nên được đưa ngay đến phòng
xét nghiệm vi sinh để tiến hành các kỹ thuật chẩn đoán càng sớm càng tốt
(trong vòng 1 giờ sau khi lấy bệnh phẩm). Không được để DNT bị ánh sáng
trực tiếp chiếu vào hoặc để nhiệt độ quỏ núng hay quá lạnh. Nếu bệnh phẩm

khơng thể vận chuyển sớm về phịng xét nghiệm thì có thể bơm bệnh phẩm
DNT vào mơi trường T-I (Trans-Isolate medium) và để qua đêm ở nhiệt độ
35oC. T-I là môi trường hai pha, rất thuận tiện cho nuôi cấy nguyên thủy
N.meningitidis và các loại vi khuẩn gây bệnh khỏc cú trong bệnh phẩm DNT
hay bệnh phẩm máu.
- Nhuộm Gram bệnh phẩm DNT:
Đõy là một phương pháp chẩn đoán sơ bộ Hib cũng như các vi khuẩn
khỏc gõy viêm màng nóo. Có thể thực hiện bởi kỹ thuật nhuộm Gram từ cặn
dịch não tủy hoặc bằng cách phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của Hib trong
DNT bởi kỹ thuật ngưng kết hạt latex (sẽ đề cập ở phần 1.1.6.2). Kết quả
dương tính của một trong hai kỹ thuật này đều cho thấy bằng chứng nhiễm
trùng, thậm chí ni cấy có thể thất bại.
+ Tiến hành ly tâm dịch não tủy 20 phút với tốc độ 2000 vũng/ phỳt.


15
+ Dùng pippett nhỏ giọt sạch vô trùng hút nước nổi chuyển sang một
ống nghiệm sạch vơ trùng có nắp đậy.
+ Tiến hành nhuộm Gram một tiêu bản từ cặn bệnh phẩm DNT vừa ly
tâm. Để khô tiêu bản.
+ Soi tiêu bản ở vật kớnh ì 100 để tìm vi khuẩn gây bệnh. Nếu trên tiêu
bản xuất hiện các trực khuẩn Gram (-) nhỏ, đa hình thái (có thể ở dạng cầu
trực khuẩn, trực khuẩn hoặc mảnh dài như sợi chỉ) thì đõy là dấu hiệu gợi ý
quan trọng định hướng chẩn đốn viêm màng nóo do Hib.
- Ni cấy:
+ Lấy đầy một ăng cặn bệnh phẩm nuôi cấy vào mụt trường thạch
chocolate có bổ sung IsoVitalex.
+ Ủ ở 37oC với khí trường 5 - 10% CO 2 khoảng 18 - 24 giờ. Nếu có
khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch chocolate sau khi ủ, quan sát hình thái khuẩn lạc
của Hib thường có đặc điểm: khuẩn lạc có kích thước 1,0 - 1,5mm, vồng nhẹ,

sáng bóng, nhày ướt, óng ánh khi ánh sáng chiếu vào và khụng gõy tan máu.
Ngoài ra, môi trường nuôi cấy vi khuẩn thuần nhất thường có mùi hăng đặc
biệt (hăng indol).
- Xác định
+ Nhuộm Gram: nhuộm vi khuẩn từ khuẩn lạc mọc được trên đĩa thạch
chocolate sau khi nuôi cấy từ dịch não tủy, nhận thấy trên tiêu bản có các trực
khuẩn Gram (-) nhỏ, đa hình thái.
+ Tiến hành thử nghiệm xác định nhu cầu đòi hỏi 2 yếu tố phát triển X
và V: thử nghiệm X, V dương tính hoặc thử nghiệm “vệ tinh” với chủng
S.aureus ATCC dương tính.
+ Tiến hành xác định Hib bằng kháng huyết thanh mẫu typ b [43], [89].


16
+ Tiến hành xác định biotype (typ sinh học) các chủng Hib phân lập
được bằng thanh xác định tính chất sinh vật hóa học Api 10s (bioMộrieux)
[12].
Chẩn đốn vi khuẩn Hib từ bệnh phẩm máu
Trong chẩn đốn viêm màng nóo, ngoài bệnh phẩm dịch não tủy
thường được sử dụng trong chẩn đốn thì bệnh phẩm máu cũng được sử dụng
với tỷ lệ dương tính khá cao [12], [127].
- Quy trình cấy máu gồm các bước như sau: [127]
+ Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, bao gồm: găng tay, bơm kim tiêm vô
khuẩn, dây garo, gạc vuụng, bụng vờ trũn vô khuẩn, băng vết thương nhỏ,
môi trường cấy máu và dung dịch sát khuẩn (cồn iod hoặc povidone-iodine,
có thể dùng cồn 70o). Kích thước của kim phụ thuộc vào vị trí lấy bệnh phẩm
và kích thước của tĩnh mạch. Kim cỡ 23, tức là dài 20 - 25mm hoặc kim
bướm thường được dùng cho trẻ em.
+ Bằng kỹ thuật vô trùng, dùng bơm kim khi hút đủ lượng máu cần
thiết (1 - 2 ml để cấy vào 20ml môi trường canh thang dinh dưỡng).

(Chú ý: khơng để cho khơng khí lọt vào trong tĩnh mạch)
+ Bơm máu vào môi trường dùng để cấy máu theo nguyên tắc vô trùng
(thông thường nên sử dụng chai cấy máu có mơi trường pha chế sẵn của Hãng
Becton – Dickinson) [12].
+ Ngay lập tức vận chuyển bình cấy máu về phịng xét nghiệm vi sinh.
Bình cấy máu có thể được giữ ở nhiệt độ phịng (20 o - 25oC) khoảng 4 - 6 giờ
trước khi ủ ấm ở 35o - 37oC, thơng khí với khí trường 5 - 10% CO2.
(Chú ý: Bình cấy máu khơng được giữ trong tủ lạnh. Ủ ấm trong quá
trình vận chuyển có thể sử dụng nhiệt độ 25o - 35oC).
+ Trong một số trường hợp cần lấy máu để thực hiện phương pháp chẩn
đoán khỏc, nờn lấy vào các ống nghiệm chân không vô trùng.


17
- Theo dõi và chẩn đốn bình cấy máu [127]
Bình cấy máu được kiểm tra sau 14 - 17 giờ ủ trong tủ ấm và sau đó là
theo dõi hàng ngày cho hết 7 ngày. Bất cứ có xuất hiện đục hay tan máu trong
mơi trường đều có thể cho thấy là cấy máu (+), do đó lập tức lắc đều bình cấy
máu và cấy chuyển sang đĩa thạch chocolate theo các bước như sau:
+ Sát khuẩn nút cao su chai cấy máu bằng cồn 70o và povidone-iodine.
+ Hút 0,5 ml từ môi trường cấy máu bằng bơm kim tiêm vơ trùng và
nhỏ lờn gúc (gần rìa đĩa Petri) đĩa môi trường chocolate.
+ Sử dụng que cấy vô trùng ria cấy theo phương pháp phân vùng. Ủ đĩa
thạch ở 37oC với khí trường 5% CO2 khoảng 18 - 24 giờ. Nếu trên đĩa thạch
có khuẩn lạc Hib mọc, tiến hành xác định Hib và typ sinh học (như phần chẩn
đoán dịch não tủy)
1.1.6.2. Phương pháp ngưng kết hạt latex phát hiện kháng nguyên đặc hiệu
của Hib trong DNT [12], [43]
Nguyên lý: Phát hiện kháng nguyên vỏ polysaccharide của Hib trong
dịch não tủy bằng kháng thể (đơn giá) kháng vỏ đặc hiệu với Hib được gắn

lên bề mặt gắn hạt latex. Kết quả phản ứng dương tính khi hỗn dịch làm phản
ứng trên lam kính hoặc phiến giấy xuất hiện các hạt ngưng kết; phản ứng âm
tính khi khơng có hiện tượng ngưng kết xảy ra.
Thực hiện kỹ thuật:
- Dụng cụ, hóa chất:
+ Pasteurex Meningitis Hib (KHT đa giá)
+ Bio Merieux Slidex meningite KIT (HT đa giá)
- Tiến hành kỹ thuật:
+ Tiến hành ly tâm dịch não tủy 20 phút với tốc độ 2000 vũng/ phỳt.
+ Dùng pippett nhỏ giọt sạch vô trùng hút nước nổi chuyển sang một
ống nghiệm sạch vơ trùng có nắp đậy.


18
+ Đun nước nổi DNT trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 100oC/5 phút.
+ Lắc đều lọ kháng thể mẫu có gắn hạt latex cho đến khi có huyền dịch
thuần nhất.
+ Nhỏ một giọt của mỗi loại kháng thể mẫu gắn hạt latex lên lam kính
ở giữa vịng trịn đã được khoanh bằng bút viết kính hoặc phiến giấy dùng
một lần để thực hiện các phản ứng ngưng kết.
+ Nhỏ 30 - 50 àl dịch não tủy vào từng loại kháng thể mẫu đã được nhỏ
lên lam kính hoặc phiến giấy.
+ Xoay trịn lam kính hoặc phiến giấy làm phản ứng 2 - 10 phút (hoặc
dựng mỏy lắc tròn với tần số 100 vũng/ phỳt)
- Đọc kết quả:
+ Phản ứng âm tính khi huyền dịch làm phản ứng vẫn đục đều và có
màu sữa nhạt.
+ Phản ứng dương tính khi xuất hiện các hạt ngưng kết xảy ra trong
vòng 2 phút sau khi thực hiện phản ứng và huyền dịch trở nên trong.
1.1.6.3. Phương pháp điện di đối lưu phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của

Hib trong DNT [12], [14]
Nguyên lý: Đõy là loại phản ứng kết tủa dựa trên nguyên lý khỏng
nguyên tích điện âm từ giếng ở phía cực âm và kháng thể tích điện dương từ
giếng ở phía cực dương (các Ig ở pH 8,4 di chuyển về cực âm của hệ mao dẫn
theo lực điện thẩm thấu nội) sẽ di chuyển ngược chiều nhau, khi gặp nhau sẽ
hình thành đường tủa đặc hiệu trong gel (thạch điện di).
Thực hiện kỹ thuật:
- Dụng cụ, hóa chất:
+ Dụng cụ:
Phiến kính 7 ì 7cm, bàn mức phẳng ngang, bộ đục lỗ thạch, máy điện
di, nguồn cung cấp điện, lò vi sóng.


19
+ Hóa chất:
/ Kháng huyết thanh thỏ kháng Hib.
/ Kháng nguyên chuẩn polysaccharide của Hib (NIH – Mỹ).
/ Thạch điện di (Sigma); hóa chất pha thạch và đệm điện di (đệm
Bacbital - Sigma). Trong đó, thạch nền: agarose thường được pha 3% trong
nước cất. Thạch điện I (type I - Sigma): 1% trong đệm bacbital pH 8,4.
- Tiến hành kỹ thuật:
+ Phủ một lớp mỏng thạch nền lên phiến kính, phơi khô.
+ Đặt phiến kớnh lờn bàn mức ngang và đổ thạch 1% lên (6ml cho
phiến kính 7 ì 7cm).
+ Để khơ, đục giếng trên thạch với kích thước như sau: đường kính
giếng khoảng 2 - 3mm; khoảng cách từ giếng kháng thể đến giếng bệnh phẩm
là 5mm.
+ Nhỏ hàng trên là kháng thể (kháng huyết thanh) 5àl/ giếng; hàng dưới
nhỏ 5àl bệnh phẩm (dịch não tủy); chứng dương là 5àl polysaccharide typ b
của Hib + 1àl thuốc nhuộm bromophenol.

+ Đặt vào bể điện di, chạy với tốc độ 8mA/30 phút.
+ Đọc kết quả sau 1 - 3 giờ dừng chạy điện di, nếu dương tính sẽ thấy
vạch tủa trắng gần phía giếng kháng thể (cực dương).
1.1.6.4. Phương pháp phát hiện đoạn ADN đặc hiệu của Hib trong DNT bằng
kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR được biết là kỹ thuật chẩn đoán cho kết quả nhanh, nhạy và đặc
hiệu với vi khuẩn Hib ở DNT. Hơn thế nữa, kỹ thuật này cũng góp phần nâng
cao tối đa khả năng quản lý các trường hợp viêm màng não nhằm giảm tỷ lệ
trầm trọng, tỷ lệ chết và những phức tạp trong điều trị các bệnh nhiễm trùng
xâm hại do Hib. Tại những cơ sở xét nghiệm lâm sàng, kỹ thuật PCR truyền
thống thường được dùng nhất trong chẩn đoán vi khuẩn Hib. Tuy nhiên, hiện


20
nay kỹ thuật Realtime-PCR cũng đã được sử dụng trong phân loại và xác định
vi khuẩn H. influenzae nói chung và Hib nói riêng với độ nhạy, độ đặc hiệu
rất cao [12], [71], [74], [90].
Kỹ thuật PCR truyền thống [90]
- Hóa chất và sinh phẩm:
+ Enzym Taq ADN Polymerase 2.5U.
+ dNTPs gồm : ATP, TTP, GTP, CTP.
+ Cặp mồi được sử dụng để xác định Hib là Haem Right:
/ Primer 1: 5’ CAGTAAATACACCTGTTGCCCCTG 3’.
/ Primer 2: 5’ GCCATTCATCAAATA 3’.
Cặp mồi này tương tự và bổ sung với trình tự acid nucleic của vùng bảo
tồn gen “hpD” đặc hiệu cho typ huyết thanh b của H. influenzae. Cả hai mồi
bao gồm khoảng 24 cặp base (base pair).
+ Thang ADN mẫu, đệm, nước khử ion và MgCl2 25mM.
- Các bước tiến hành PCR:
+ Tách chiết ADN của Hib trong dịch não tủy:

/ Bằng kỹ thuật vô trùng lấy 100àl DNT cho vào một ống ly tõm sạch,
vô trùng.
/ Cho ống nghiệm chứa DNT cho vào nồi cách thủy đun 100o/15 phút.
/ Ly tõm ống nghiệm bệnh phẩm DNT (sau khi đã đun cách thủy) với
tần số 10.000 vịng/ phút ì 5 phút.
/ Lấy 10àl nước nổi sau khi ly tõm sử dụng để làm mẫu ADN.
+ Tiến hành kỹ thuật:
/ Phản ứng PCR được thực hiện với tổng thể tích là 50àl, trong đó chứa:
1,5àl (1,5mM) MgCl2; 1àl (0,2 mM) dNTP; 5àl (1X) 10X PCR buffer (KCl,
Tris-HCl, Mg); 0,5àl (2,5U) Taq ADN polymerase; 10àl ADN mẫu


21
Haemophilus influenzae (ATCC 35056 Difco làm chứng dương), 40àl nước
khử ion và cặp mồi (mồi 1,2: 2 àl hoặc 40pm) cho mỗi ống.
/ Hỗn hợp phản ứng được chạy theo chương trình cài đặt của máy điều
nhiệt (Eppendorf, Germany) khoảng 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ cú cỏc thông số
dưới đây: giai đoạn biến tính khoảng 2 phút ở 94 oC; giai đoạn gắn mồi
khoảng 2 phút ở 56oC; giai đoạn kéo dài khoảng 2 phút ở 72 oC. Trong đó, giai
đoạn biến tính đầu tiên cần 10 phút ở 94oC và giai đoạn kéo dài cuối cùng là 8
phút ở 72oC. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu ADN sau khi khuếch đại có thể
được giữ ở 4oC cho đến khi phân tích. Sản phẩm của phản ứng PCR để chẩn
đoán Hib được phát hiện bởi kết quả điện di trên thạch agarose.
Kỹ thuật Real-time PCR [12], [74]
- Hóa chất và sinh phẩm:
+ QIAamp blood kit (Qiagen, Hilden, Germany)
+ Mồi (primer):
/ Mồi xi: 5’-CAAGATACCTTTGGTCGTCTGCTA-3’ (vị trí 5481
đến 5504).
/ Mồi ngược: 5’-TAGGCTCGAAGAATGAGAAGTTTTG-3’ (vị trí

5631 đến 5607).
+ Probe đặc hiệu: 5’-ATGATATGGGTACATCTGTT -3’ (vị trí 5563 đến
5582).
- Các bước tiến hành Realtime-PCR [74]:
+ Tách chiết ADN của Hib từ dịch não tủy dựa vào QIAamp blood kit
(Qiagen, Hilden, Germany) theo quy trình của nhà sản xuất.
+ Tiến hành kỹ thuật:
Phản ứng khuếch đại được thực hiện với hỗn hợp phản ứng có thể tích
tổng là 25àl, chứa 2ìTaqMan universal master mix (Perkin-Elmer-Biosystems),
mỗi primer với nồng độ 400nM, 200nM probe, và 1àl ADN tách chiết.


22
Q trình khuếch đại PCR có thể được thực hiện trên nhiều mẫu giống
nhau dựa trên hệ thống phát hiện trình tự ABI PRISM 7700. Các thơng số
chuẩn cho q trình khuếch đại: 2 phút ở 50 oC, và 10 phút ở 95oC cho 40 chu
kỳ; trong đó với một chu kỳ gồm 15 giây ở 95oC và 1 phút ở 60oC.
Kết quả của phản ứng Realtime-PCR được phân tích phần mềm cho hệ
thống phát hiện trình tự, phiên bản 1.7.
1.1.6.5. Đánh giá các kỹ thuật phát hiện Hib trong chẩn đốn viêm màng nóo
Giá trị chẩn đốn của các kỹ thuật phát hiện Hib gây viêm màng nóo
được giới thiệu ở trên đó cú một số nghiên cứu, đánh giá và cho thấy độ nhạy,
độ đặc hiệu của từng phương pháp.
- Phương pháp ni cấy chẩn đốn Hib thường có độ nhạy khơng cao
(khoảng 50 - 55%), nhưng độ đặc hiệu là 100%. Ngoài ra, phương pháp này
cũn giỳp cho những nhà vi sinh lõm sàng xác định được mức độ nhạy cảm với
kháng sinh của những chủng Hib gây bệnh phân lập được mà các phương
pháp khác thường không thể thực hiện [12].
- Phương pháp ngưng kết hạt latex phát hiện kháng nguyên đặc hiệu
của Hib trong dịch não tủy là phương pháp thực hiện rất đơn giản nhưng có

độ nhạy và độ đặc hiệu khá cao (độ nhạy 95%, độ đặc hiệu 99,6%) [12].
- Phương pháp điện di đối lưu phát hiện kháng nguyên đặc hiệu của
Hib trong dịch não tủy có độ nhạy 97%, độ đặc hiệu 100% [12], [14].
- Phương pháp phát hiện đoạn ADN đặc hiệu của Hib trong dịch não
tủy bằng kỹ thuật PCR có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 99% [12], [74].
1.2. Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi mang Hib, tình hình viêm màng não
do Hib ở trẻ dưới 5 tuổi trong nước và trên thế giới
1.2.1. Tỷ lệ trẻ khỏe mạnh dưới 5 tuổi mang Hib
1.2.1.1. Khái niệm về người khỏe mạnh mang vi khuẩn (Hib)


23
Người khỏe mạnh mang vi khuẩn (carriers) là những người mang vi
khuẩn gây bệnh trong cơ thể mà khơng có biểu hiện triệu chứng hoặc không
phát hiện thấy dấu hiệu đáp ứng miễn dịch của cơ thể [28].
Trạng thái mang vi khuẩn của cơ thể có thể tồn tại với thời gian ngắn
hoặc dài, có thể gián đoạn hoặc liên tục. Những người mang vi khuẩn thường
có khả năng lây truyền cho người khác. Vì vậy, người lành mang Hib đồng
nghĩa với vi khuẩn này định cư trên cơ thể và xác định được sự xuất hiện của
vi khuẩn Hib sống ở màng nhày họng. Tuy nhiên, kết quả xác định này cũn
phụ thuộc vào độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp xét nghiệm tìm vi
khuẩn Hib cịn sống ký sinh ở màng nhày họng người khỏe mạnh [28].
1.2.1.2. Phương pháp xác định
Trong hầu hết các nghiên cứu điều tra về người khỏe mạnh mang Hib,
khó khăn xảy ra trong việc phân lập vi khuẩn này có thể dẫn đến kết quả tỷ lệ
mang Hib thu được thường thấp hơn so với thực tế. Qua một số nghiên cứu,
cho thấy phương pháp sử dụng tăm bông lấy bệnh phẩm từ họng miệng
(oropharyngeal swabs) dùng để nuôi cấy xác định người khỏe mạnh mang
Hib thường có kết quả tương tự hoặc cao hơn so với nuôi cấy từ tăm bông lấy
bệnh phẩm ở họng mũi (nasopharyngeal swabs) [77].

Hốc mũi
Họng mũi
Lưỡi

Thanh quản

Họng miệng
Thanh quản-hầu
(vùng dưới hầu)
Thực quản


24
Hình 1.6: Hình ảnh giải phẫu đường hơ hấp trên
Trạng thái người khỏe mạnh mang Hib thường được xác định bằng các
kỹ thuật ni cấy. Vì vậy, tất cả các bước thực hiện trong kỹ thuật xét nghiệm
dùng cho nghiên cứu điều tra vi sinh này cần phải đạt được độ chuẩn xác tối
đa. Những sai số có khả năng xảy ra trong quá trình xác định tỷ lệ Hib ký sinh
ở họng người khỏe mạnh, bao gồm: kỹ thuật ngốy họng lấy bệnh phẩm (đây
là kỹ thuật khó duy trì ổn định), sự sống sót của vi khuẩn trong q trình vận
chuyển bệnh phẩm cho đến khi ni cấy vào môi trường; và sự xuất hiện
nhiều vi khuẩn khác nhau có trong bệnh phẩm nhưng lại có sự tương đồng về
hình thái khuẩn lạc, nên có thể dẫn đến chọn khuẩn lạc nhầm. Sự khác biệt
của các phương pháp nuôi cấy được sử dụng trong phân lập Hib từ tăm bơng
bệnh phẩm ngốy họng là yếu tố chính dẫn đến những khó khăn và phức tạp
trong việc giải thích các số liệu từ các nghiên cứu khác nhau [28].
1.2.1.3. Dịch tễ học của trẻ khỏe mạnh mang Hib và một số yếu tố ảnh hưởng
Những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến dịch tễ học của Hib, đó là
yếu tố xã hội học (soccial) và nhân khẩu học (demographic). Khả năng mang

Hib ở trẻ nhỏ dường như có liên quan rất gần đến khả năng, mức độ phơi
nhiễm đối với vi khuẩn này [28].
H. influenzae là thành viên của hệ vi khuẩn bình thường ký sinh ở
đường hơ hấp trên. Trong đó, Hib có ở 1 - 5% trẻ em khoẻ mạnh và khơng có
biểu hiện bệnh [89]. Tỷ lệ mang vi khuẩn thấp nhất ở người lớn, cao nhất ở
lứa tuổi mẫu giáo [69], [120], [124]. Hầu hết các điều tra đều đưa ra kết quả
nuôi cấy từ tăm bơng bệnh phẩm ngốy họng miệng hay họng mũi phát hiện
thấy Hib có khoảng 3 - 5% trẻ dưới năm tuổi [69], [120], đây là lứa tuổi có tỷ
lệ mang Hib được xem là nổi trội nhất [58]. Một số nghiên cứu trong nước và
trên thế giới đã cho thấy:


25
+ Tại Việt Nam, hiện nay hầu hết những nghiên cứu chỉ dừng lại ở xác
định về tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang H. influenzae, kết quả cho thấy tỷ lệ này
khoảng 15 - 30% [7], [8]. Tuy nhiên, vẫn cũn rất ít nghiên cứu xác định tỷ lệ trẻ
khỏe mạnh mang vi khuẩn Hib. Điển hình một nghiên cứu gần đõy (2003) của
Phạm Văn Ca và Lê Đăng Hà cho thấy tỷ lệ mang Hib ở trẻ khỏe mạnh chiếm
khoảng 15,0 - 17,5% [7].
+ Trên thế giới, phần lớn những nghiên cứu về trẻ khỏe mạnh mang
H.influenzae đều được định typ huyết thanh. Trong đó, tỷ lệ trẻ khỏe mạnh
dưới 5 tuổi mang Hib khác nhau tuỳ theo địa điểm nghiên cứu. Một số nghiên
cứu thực hiện ở một số nước châu Á, châu Âu, châu Mỹ và châu Phi cho thấy
tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang Hib chiếm khoảng 4 - 12,5% [36], [52], [87], [104].
Qua hầu hết các nghiên cứu đều cho thấy tỷ lệ mang Hib ở những trẻ
được chăm sóc tại các nhà trẻ thường rất cao. Trong đó, tỷ lệ mang Hib thấp ở
lứa tuổi dưới 6 tháng, tỷ lệ cao nhất trong lứa tuổi từ 6 tháng - 5 tuổi (đặc biệt
là 6 - 11 tháng) và giảm dần cho đến tuổi trưởng thành [28], [36], [45], [52].
Tuy nhiên, còn một số yếu tố khác có thể làm tăng hoặc giảm tỷ lệ trẻ
khỏe mạnh mang vi khuẩn Hib.

- Ảnh hưởng của điều kiện sống lên tỷ lệ trẻ khỏe mạnh mang Hib
Điều kiện sống đông đúc như ở các căn hộ, trung tâm chăm sóc trẻ ban
ngày cũng góp phần làm cho tỷ lệ mang vi khuẩn Hib ở trẻ nhỏ có thể cao lên
một cách đáng kể. Mặc dù trên thực tế cho thấy tỷ lệ trẻ mang Hib thường ít
hơn 5%, nhưng tỷ lệ mang vi khuẩn Hib tại các trung tâm chăm sóc trẻ ban
ngày được báo cáo chiếm khoảng 15 - 25% [52], [69], [120]. Trong một gia
đình khi có một trường hợp bị nhiễm bệnh nhiễm trùng do Hib xảy ra, tỷ lệ
nhiễm vi khuẩn này đã được khảo sát là 60 - 70% giữa các anh em ruột và
20% ở các bậc cha mẹ [28], [69].