nghiên cứu so sánh các quy trình tạo keo fibrin từ huyết tương người

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU SO SÁNH CÁC QUY TRÌNH TẠO
KEO FIBRIN TỪ HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: ThS.BS. Đặng Trần Quân

Tp. Hồ Chí Minh, 04/2018


BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU SO SÁNH CÁC QUY TRÌNH TẠO
KEO FIBRIN TỪ HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI

Mã số:

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)

Tp. Hồ Chí Minh, 04/2018

DANH SÁCH THÀNH VIÊN THAM GIA
1. ThS.BS. Đặng Trần Quân
2. ThS. Lưu Thị Thu Thảo
3. ThS. Cao Mộng Phi An


MỤC LỤC
Trang
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục bảng
Danh mục hình
Danh mục sơ đồ
Mở đầu .......................................................................................................................1
Chương 1. Tổng quan tài liệu...................................................................................3
1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..............................................................3
1.1.1. Trong lĩnh vực y học điều trị ...............................................................3
1.1.2. Trong lĩnh vực y học nghiên cứu .........................................................8
1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam ...............................................................9
1.3. Cơ chế hình thành cục máu đơng fibrin ......................................................10
1.3.1. Quá trình cầm máu ...............................................................................10
1.3.2. Cơ chế hình thành cục máu đơng fibrin ...............................................11
1.4. Các thành phần chính tham gia cấu tạo keo fibrin ......................................15
1.4.1. Fibrinogen ............................................................................................15
1.4.2. Thrombin ..............................................................................................17
1.4.3. Yếu tố XIII (FSF – Fibrin Stabilizing Factor) .....................................20
1.4.4. Calcium Chloride .................................................................................20
1.4.5. Muối NaCl............................................................................................20

1.4.6. Quá trình phân hủy fibrin .....................................................................21


1.5. Tính chất vật lý của keo ..............................................................................22
1.5.1. Cấu trúc sợi của keo fibrin ...................................................................22
1.5.2. Đặc tính cơ học keo fibrin....................................................................23
1.5.3. Đặc tính gắn kết của keo fibrin ............................................................24
1.6. Các hóa chất chống đơng tác động lên keo fibrin .......................................24
1.7. Các phương pháp tạo keo fibrin ..................................................................25
1.7.1. Đặc điểm fibrinogen và thrombin trong huyết tương người ................25
1.7.2. Các phương pháp thu nhận fibrinogen .................................................26
1.7.3. Các phương pháp thu nhận thrombin ...................................................27
1.8. Tiềm năng ứng dụng của keo fibrin ............................................................27
1.9. Tiêu chí đối với keo dán sinh học ...............................................................27
1.10. Các chỉ tiêu về an toàn đối với keo dán sinh học ......................................28
Chương 2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu................................................30
2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................30
2.2. Tiêu chuẩn chọn mẫu ..................................................................................30
2.3. Y đức ...........................................................................................................31
2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................31
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu..............................................................................31
2.4.2. Thiết lập quy trình thu nhận fibrinogen và thrombin...........................31
2.4.3. Đánh giá một số đặc điểm của keo fibrin ............................................35
Chương 3. Kết quả và bàn luận ...............................................................................37
3.1. Quy trình thu nhận fibrinogen và thrombin ................................................37


3.1.1. Định lượng nồng độ fibrinogen ...........................................................37
3.1.2. Phân tích điện di ...................................................................................39
3.1.3. Khảo sát hiệu quả tạo keo của 4 phương pháp ....................................40

3.1.4. Đặc điểm cấu trúc của keo fibrin .........................................................42
3.1.5. So sánh giữa các phương pháp để lựa chọn quy trình tạo keo fibrin
tối ưu ....................................................................................................45
3.2. Đánh giá một số đặc điểm của keo fibrin ....................................................46
3.2.1. Khảo sát độ an toàn sinh học ...............................................................47
3.2.2. Đánh giá khả năng gây độc tế bào .......................................................48
3.2.3. Đánh giá thời gian phân hủy keo (in vitro) ..........................................49
Chương 4. ...................................................................................................................52
Kết luận ..............................................................................................................52
Kiến nghị ............................................................................................................54
Tài liệu tham khảo ....................................................................................................55


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ADP:

Adenosin triphosphat

ALT:

Aspartate Amino Transferase

BN:

Bệnh nhân

CS:

Cộng sự

DMEM/F12:

Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12

DMSO:

Dimethyl sulfoxide

DPBS:

Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline

F:

Fibrinogen

GMP:

Good Manufacturing Practices

HBsAg:

Hepatitis B surface Antigen

HCV:

Hepatitis C virus

H&E:

Haematoxyline and Eosine

HIV:

Human Immuno-deficiency Virus

ISO:

International Organization for Standardization

NFB:

Neutral formalin buffer

SDS-PAGE:

Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide

SEM:

Scanning electron microscopy

PEG:

Polyethylene glycol

PP:

Phương pháp

T:

Thrombin

VDRL:

Venereal Diseases Research Laboratory


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. So sánh những điểm thuận lợi và hạn chế của hai loại keo thương
mại và tự thân ............................................................................................................... 7
Bảng 3.1. So sánh nồng độ fibrinogen từng phương pháp .......................................... 38
Bảng 3.2. So sánh thời gian tạo keo (giây) của từng phương pháp với từng tỉ lệ F :
T (v/v) khác nhau ........................................................................................................ 40
Bảng 3.3. So sánh thời gian tạo keo (giây) của các phương pháp theo tỉ lệ F:T
(v/v) là 1:1 ................................................................................................................... 41
Bảng 3.4. So sánh giữa nồng độ fibrinogen thu được, thời gian tạo keo và cấu
trúc khối keo giữa 4 phương pháp............................................................................... 45
Bảng 3.5. Kết quả đánh giá độ vô khuẩn của khối keo theo tiêu chí Dược điển
Việt Nam IV ................................................................................................................ 47
Bảng 3.6. Khảo sát khối lượng keo theo thời gian được ngâm trong dung dịch
PBS và huyết tương người .......................................................................................... 50


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Sơ đồ mơ tả sự polymer hóa tạo ra mạng fibrin dẫn đến hình thành cục
máu đơng. .................................................................................................................... 12

Hình 1.2. Sơ đồ mơ tả sự hình thành keo fibrin được tạo ra bằng phối trộn các thành
phần chính của keo. ..................................................................................................... 14
Hình 1.3. Mơ tả cấu trúc phân tử fibrinogen. .............................................................. 16
Hình 1.4. Hoạt động của enzyme thrombin trên fibrinogen. ...................................... 17
Hình 1.5. Cấu tạo phân tử thrombin. .............................................................................. 19
Hình 3.1. Biểu đồ đánh giá nồng độ fibrinogen thu nhận được qua từng phương
pháp ............................................................................................................................. 37
Hình 3.2. Phân tích điện di SDS- PAGE của PP thu nhận thrombin ......................... 39
Hình 3.3. Cấu trúc mơ học của keo fibrin được nhuộm H&E (10X và 40X) ............. 43
Hình 3.4. Khối keo fibrin quan sát dưới KHV điện tử quét (SEM) ............................ 44
Hình 3.5. Kết quả đánh giá khả năng gây độc in vitro của keo fibrin đối với nguyên
bào sợi ......................................................................................................................... 48
Hình 3.6. Đường cong thời gian phân hủy của keo fibrin được xử lý với dung dịch
PBS và huyết tương người .......................................................................................... 50


DANH MỤC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 1.1. Sơ đồ quá trình đông máu .......................................................................... 11
Sơ đồ 1.2. Cơ chế hoạt động của keo Tisseel (Baxter). .............................................. 15
Sơ đồ 1.3. Sơ đồ tóm tắt cơ chế chống đơng máu. ...................................................... 25
Sơ đồ 1.4. Sơ đồ quy trình sàng lọc máu người hiến và các chỉ tiêu đánh giá máu
trước khi sản xuất keo. ................................................................................................ 29
Sơ đồ 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát thực hiện đề tài .................................... 30


1

MỞ ĐẦU
Hiện nay, trong y khoa, nhu cầu sử dụng các sản phẩm có khả năng kết dính

mơ, xun mơ và nối thông mạch máu là rất lớn, đi kèm với nhu cầu thẩm mỹ trong
phẫu thuật ngày càng cao, nên những chất dán dính có nguồn gốc sinh học bắt đầu
được nghiên cứu một cách rộng rãi. Keo fibrin là một sản phẩm có nguồn gốc sinh
học dùng trong kết dính mơ và cầm máu trong phẫu thuật. Các nghiên cứu đã cho
thấy keo fibrin có hiệu quả tốt trong các nối thông dạ dày, thực quản, ruột non và
thần kinh, trong ghép da keo fibrin có tác dụng dùng để cầm máu và cố định mảnh
ghép, với các vết thương lớn và sâu có thể cho thêm vào keo fibrin các yếu tố tăng
trưởng để thúc đẩy mạnh quá trình làm liền vết thương tại chỗ.
Hiện tại, ở nước ta chưa sản xuất được keo fibrin có nguồn gốc tự thân hoặc
có nguồn đồng loại cũng như là từ nguồn dị loại mặc dù tiềm năng ứng dụng và giá
trị kinh tế mà keo fibrin mang lại là rất lớn. Tuy nhiên nhu cầu của người bệnh rất
cao, do đó khi có nhu cầu thì phải sử dụng nguồn keo thương mại (hiện rất phổ biến
và đa dạng, nổi tiếng nhất trong nguồn keo thương mại này là keo fibrin Tisseel,
Baxter) để sử dụng trong các phẫu thuật lâm sàng. Ngồi ra, chi phí để sử dụng các
loại keo thương mại cũng khá cao so với thu nhập chung của người dân nước ta.
Đứng trước nhu cầu thực tế và tiềm năng ứng dụng vô cùng đa dạng mà keo
fibrin mang lại, địi hỏi phải có một cơng trình nghiên cứu bài bản và chun sâu để
có thể sản xuất và cung cấp sản phẩm keo này đến tay người bệnh, để đáp ứng nhu
cầu và giảm bớt được gánh nặng tài chính mà người bệnh phải sử dụng.
Xuất phát từ những nhu cầu và tiềm năng ứng dụng mà keo fibrin mang lại,
nhóm nghiên cứu quyết định thực hiện đề tài nghiên cứu “Nghiên cứu so sánh các quy
trình tạo keo fibrin từ huyết tương người” với mục đích ban đầu là thiết lập một quy
trình hiệu quả để có thể tạo ra keo fibrin an tồn, nhanh chóng và có thể triển khai ứng
dụng sau này.
Mục tiêu nghiên cứu:
a. Mục tiêu tổng quát


2

b. Mục tiêu cụ thể
 Thiết lập quy trình thu nhận fibrinogen và quy trình thu nhận thrombin
+

So sánh các quy trình thu nhận fibrinogen và thrombin

+

Xác định cơng thức phù hợp để tạo keo fibrin từ fibrinogen và
thrombin

+

Đánh giá một số đặc điểm cấu trúc của keo fibrin bằng mô học và
SEM

 Đánh giá một số đặc điểm của keo fibrin (theo một số tiêu chí đối với keo
sinh học):
+

Đánh giá độ an toàn sinh học (Theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam
IV)

+

Đánh giá khả năng gây độc tế bào

+

Xác định thời gian đông và phân hủy của keo (in vitro)

3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
1.1.1. Trong lĩnh vực y học điều trị
Hiện nay, keo fibrin được xem là một vật liệu sinh học dán dính mơ có giá trị
thương mại. Lý do để keo fibrin có nhiều tiềm năng ứng dụng như vậy là chúng
được sử dụng rộng rãi trong các ứng dụng phẫu thuật, trong y học, trong công nghệ
mô, chẳng hạn như khả năng tương hợp sinh học, khả năng tự tiêu và trên hết là có
thể được sản xuất từ chính huyết tương người (đặc điểm này giúp cho keo fibrin có
thể được sử dụng để ghép tự thân) [3]. Ngồi ra, khối fibrin cịn chứa các yếu tố
giúp kích thích tế bào tăng sinh, tổng hợp và sửa chữa chất nền ngoại bào [38]. Đây
là đặc tính lý tưởng để sử dụng fibrin như một giá thể tạm thời để tái tạo và sửa
chữa mơ mới trong q trình lành hóa vết thương.
Ngày này, các phẫu thuật liên quan đến tim mạch rất phổ biến, trong đó việc
cầm máu và khâu kín lổ hỗng tốt ln là ưu tiên hàng đầu. Cầm máu thành cơng ở
những vị trí chảy máu sau phẫu thuật tim hở giúp làm giảm mất máu, giảm thời gian
phẫu thuật. Keo fibrin có hiệu quả cao như một keo dán sinh học trong những
trường hợp chảy máu lan tỏa như chảy máu tĩnh mạch vành, thất phải, động mạch
phổi. Các lỗ khâu, dòng chảy ổn định, chỗ nối, chỗ rò rỉ được điều trị hiệu quả với
keo fibrin. Cầm máu tốt là rất quan trọng trong phẫu thuật tim cho trẻ em vì tỷ lệ rối
loạn đông máu sau khi phẫu thuật mở tim rất cao và nguy cơ liên quan đến việc sử
dụng máu và các sản phẩm máu. Nó cũng được áp dụng trong nội soi điều trị loét dạ
dày tá tràng và phòng ngừa rò rỉ miệng nối trong phẫu thuật khâu nối dạ dày.
Để điều trị bệnh lý tổn thương xương dẫn đến khuyết hỗng xương, trong các
trường hợp này cần phải ghép xương khối hoặc xương xốp để bù đắp tại vị trí
khuyết hỗng xương, có thể sử dụng kết hợp giá thể xương, san hô và keo fibrin để

cố định mô ghép khi tiến hành ghép xương. Kết quả một số nghiên cứu cho thấy rất
hiệu quả và khả quan.


4

Việc sử dụng keo fibrin trong lâm sàng để cải thiện làm lành vết thương lần
đầu tiên được báo cáo vào năm 1909 bởi Bergel. Những nghiên cứu sau đó báo cáo
sử dụng các gạc vải có thấm với fibrin để cầm máu ở các mô mềm [41]. Tuy nhiên,
phải đến năm 1938, khi công nghệ tách protein đã được phát triển và thrombin tinh
khiết đã được sản xuất và thương mại hóa thì lĩnh vực này mới bắt đầu phát triển.
Sự kết hợp của thrombin và fibrinogen để tạo ra keo fibrin lần đầu tiên được sử
dụng vào năm 1944 để hỗ trợ khả năng kết dính ở mảnh da ghép trên những người
lính với những vết thương bỏng nặng [8].
Keo fibrin được sản xuất theo q trình mơ phỏng lại cơ chế đông máu ở
người. Hơn 2000 bài báo nghiên cứu đã được công bố và những nghiên cứu tổng
quan cũng như đánh giá về keo fibrin đã được nghiên cứu rất nhiều bởi các tác giả
Schlag và Redl [53-55].
Tuy nhiên, sau đó có một số nguy cơ đối với việc sử dụng fibrinogen từ người
vì có khả năng là một nguồn truyền bệnh (như viêm gan siêu vi) và nhiều người
trong số các bệnh nhân được điều trị bằng keo fibrin đã bị nhiễm bệnh. Ngoài ra,
chất lượng gắn kết của các chế phẩm fibrin này tương đối kém và nguyên nhân
được tìm ra là do nồng độ fibrinogen thấp. Do đó, trước khi mà các kỹ thuật dùng
để bất hoạt hoặc loại bỏ virus có trong mẫu keo có hiệu quả thì giới nghiên cứu
chuyển sang sử dụng mẫu thu nhận từ bò và thrombin bò được sử dụng trong keo
fibrin giảm nguy cơ lây truyền virus ở người. Tuy nhiên, việc sử dụng thrombin có
nguồn gốc từ động vật (bị) thay vì thrombin của người lại xuất hiện các mối nguy
cơ mới đó là các rủi ro gây ra hiện tượng đông máu do sự gia tăng của thrombin và
các yếu tố ức chế V. Do đó, trong giai đoạn đầu của sự phát triển, kết quả mà keo
fibrin mang lại chưa xứng tầm mong đợi so với những nguy cơ và rủi ro mà chúng

mang lại, vì thế ở giai đoạn này các nghiên cứu về keo fibrin ở Mỹ đã tiến triển rất
chậm hoặc thậm chí là dừng lại.
Năm 1972, Matras và cộng sự [40] đã ứng dụng thành công khi sử dụng keo
fibrin để tiến hành phẫu thuật trên các thần kinh ngoại biên ở thỏ và các quy trình


5

dụng phương pháp tủa lạnh, tạo ra một loại huyết tương thiếu yếu tố VIII, kết hợp
với dung dịch thrombin từ bò để sử dụng trong các liệu pháp điều trị. Các dịch tủa
lạnh có chứa nồng độ cao của fibrinogen, yếu tố XIII, fibronectin và các yếu tố khác
tạo ra khả năng kết dính cao cho keo.
Năm 1982, sau khi đã có những bước cải thiện đáng kể về các phương pháp
thu nhận và sản xuất keo, sản phẩm keo fibrin được thương mại hóa đầu tiên đã
được bán ra thị trường châu Âu, Nhật Bản và Canada. Đó là 2 sản phẩm Tissucol®
(Immuno A.G., Vienna) và Beriplast HS® (Centeon Pharma GmbH, Đức). Kể từ
thời điểm đó, các bác sĩ phẫu thuật châu Âu đã có nhiều kinh nghiệm trong việc sử
dụng các loại keo fibrin trên một loạt các ứng dụng lâm sàng. Tuy nhiên, ở Mỹ nhận
thấy các nguy cơ gây ra các bệnh lây qua đường máu nên mãi đến năm 1998, FDA
(The Food and Drug Administration tổ chức quản lý thực phẩm và thuốc của Mỹ)
mới công nhận sản phẩm Tisseel (Baxter Health Corp) được sử dụng trên người
[44]. Tisseel được chỉ định là một chất hỗ trợ cho quá trình cầm máu trong các phẫu
thuật như phẫu thuật tim, phổi, lách khi mà các kỹ thuật cầm máu khác không hiệu
quả. Thu nhận các thành phần của fibrin từ hỗn hợp máu người hoặc máu động vật
rất có thể mang lại những nguy cơ lây nhiễm virus cũng như là những nguy cơ gây
phản ứng miễn dịch từ các protein dị loại. Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm
(The Food and Drug Administration-FDA) của Hoa Kỳ đã không phê duyệt cấp
phép cho các sản phẩm keo này vì có nguy cơ cao liên quan đến bệnh viêm gan
được truyền từ huyết tương thu nhận từ nhiều người để sử dụng trong sản xuất
fibrinogen. FDA thu hồi giấy phép cho phép việc sử dụng các loại keo này trên lâm

sàng, ngừng phát triển và ngăn chặn việc nhập khẩu các loại keo fibrin từ thị trường
châu Âu [52].
Từ việc thiếu đi nguồn keo thương mại để sử dụng tại thị trường Mỹ cũng như
các báo cáo thành công trong các trường hợp ứng dụng keo fibrin trên lâm sàng ở
châu Âu, dẫn đến việc các bác sĩ phẫu thuật ở Mỹ tiến hành sản xuất các loại keo
fibrin từ chính bệnh nhân của họ (keo fibrin tự thân) và từ máu có nguồn gốc từ


6

Ngồi loại keo fibrinogen cơ đặc thu nhận từ phương pháp tủa lạnh từ nguồn
huyết tương gộp lại từ nhiều người khác nhau, keo fibrin cũng có thể được thu nhận
từ chỉ một người hiến duy nhất hoặc từ chính máu của bệnh nhân. Những loại keo
"sản xuất thủ công" thường có độ bền kém hơn keo thương mại [16], với nồng độ
fibrinogen thấp (protein tạo đơng), chỉ có chuỗi α tạo liên kết ngang do đó làm giảm
sức bền của keo [16].
Theo số liệu năm 2010, hiện có một số keo fibrin thương mại như: Tisseel®
(Baxter Healthcare, Illinois), Artiss® (Baxter Healthcare), Beriplast® (CSL Behring,
Pennsylvania), Evicel® (Omrix Biopharmaceuticals Ltd, NY & Ethicon Inc., New
Jersey ) và Quickseal® (Ethicon Inc., New Jersey). Một số loại keo fibrin khác đã và
đang được nghiên cứu phát triển.
Ngồi các sản phẩm keo có nguồn gốc thu nhận từ huyết tương, các loại keo
fibrin cũng có thể được sản xuất từ các thành phần tái tổ hợp được tạo ra từ các con
cừu biến đổi gien (fibrinogen được thu nhận từ trong sữa) và từ việc nuôi cấy tế bào
(prothrombin và FXIII).
Theo số liệu năm 2013, trên thị trường xuất hiện một số loại keo được sử dụng
khá phổ biến như: Tisseel (Human pooled plasma fibrinogen and thrombin) của
Baxter Inc, Evicel (Human pooled plasma fibrinogen and thrombin) của Ethicon
Inc. (Johnson & Johnson Co). Đây là hai loại keo thương mại được sản xuất từ
nguồn huyết tương đồng loại từ nhiều nguồn mẫu khác nhau. Bên cạnh đó, các loại

keo fibrin tự thân cũng có một số sản phẩm được sử dụng rộng rãi như: Vitagel
(Autologous plasma fibrinogen and thrombin) của Orthovita Inc. và Cryoseal
System (Autologous plasma fibrinogen and thrombin) của ThermoGenesis Corp
[43].
Keo fibrin tự thân (như Vivostat và CryoSeal) được tạo ra từ phương pháp
tủa lạnh hiện tại được chấp nhận sử dụng rộng rãi tại Mỹ. Keo fibrin này được thu
nhận từ chính máu của người bệnh thông qua một số phương pháp khác nhau như
tủa lạnh, sử dụng dung dịch ammonium sulfate, tủa lạnh bằng ethanol và tủa lạnh


7

các loại keo tự thân [28]. Tuy nhiên, bất lợi của những phương pháp này là do liên
quan trực tiếp đến nồng độ thấp của fibrinogen từ đó dẫn đến các đặc tính cơ học
kém của keo, lí do chính là lượng máu thu từ chính người bệnh khơng được nhiều
[57].
Ưu điểm chính của keo tự thân được phát triển rộng rãi tại thị trường Mỹ là do
giảm thiểu tối đa các nguy cơ truyền virus, các phản ứng dị ứng dẫn đến xuất huyết
nghiêm trọng khi so sánh với các loại keo được sản xuất thương mại có nguồn gốc
từ máu đồng loại hoặc liên quan đến các yếu tố có nguồn gốc từ động vật. Ngồi ra,
keo tự thân cịn được chứng minh có thể đáp ứng hiệu quả như các sản phẩm
thương mại trong các ứng dụng lâm sàng như các trường hợp dán mô trên thể tích
nhỏ hoặc cầm máu với áp lực máu thấp.
Tuy nhiên, một số quy trình mới đang được phát triển để cải thiện các tính
chất cơ học của keo như độ đàn hồi, độ bền kéo của các chế phẩm keo tự thân thông
qua một số phương pháp như kết hợp sử dụng các chất chống đơng, kiểm sốt tốt
hơn các điều kiện bảo quản huyết tương, hoặc các phương pháp tủa và ly tâm thu
nhận fibrinogen [15].
Theo tác giả M. Radosevich và cộng sự [52] đưa ra bản so sánh những thuận
lợi và hạn chế của hai loại keo tự thân và thương mại theo Bảng 1.1.

Bảng 1.1. So sánh những điểm thuận lợi và hạn chế của hai loại keo thương
mại và tự thân [52].
Keo thương mại
Ưu điểm
Nhược điểm
-Nồng độ F cao.
Đặc
-Lượng F tinh sạch
tính
70-90%.
sinh
-Độ co dãn, sức
học
căng, khả năng dán
dính hiệu quả cao.
-Lựa chọn người
Dùng
An
chung.
tồn vi hiến.
-Xét nghiệm sàng
sinh

Keo tự thân
Ưu điểm
Nhược điểm
Các quy trình
-Nồng độ F thấp.
được kiểm soát
-Lượng F tinh sạch

tốt và đang được <50%.
nghiên cứu phát
-Độ co dãn, sức
triển.
căng, khả năng dán
dính hiệu quả thấp.
Sử dụng độc lập
Phơi nhiễm với vi
mỗi cá thể.
khuẩn, vi rút không
được loại trừ nếu


8

-PP điều trị giảm
nhiễm siêu vi.
-Theo tiêu chuẩn
GMP.
-Tiêu chuẩn hóa.
Sản
-Thơng số kỹ thuật
xuất
thương được thiết lập.
-Kiểm soát chất
mại
lượng trên các
mẫu.

khuẩn.

Các quy trình
được kiểm sốt
tốt và đang được
nghiên cứu phát
triển.

-Khơng có thử
nghiệm kiểm tra
chất lượng.
-Không sản xuất
thương mại.

1.1.2. Trong lĩnh vực y học nghiên cứu
Máu đơng cịn đàn hồi hơn cao su. Phát hiện này làm cho chúng ta ngạc nhiên
nhưng thật sự nó đã được các nhà khoa học tại Mỹ chứng minh. Họ cũng phát hiện
máu đơng có thể kéo căng dài hơn và chắc hơn mạng nhện.
Những dữ kiện trên khiến cho cả các bác sĩ lẫn các nhà nghiên cứu vô cùng
hứng khởi và mở ra một cánh cửa mới trong việc điều trị, ngăn ngừa chứng máu
vón cục cũng như chứng máu khơng đơng.
Tình trạng máu vón cục một cách bất thường có thể giết chết BN, ngăn cản
dịng lưu thơng của máu trong các động mạch, từ đó gây ra đột quỵ, nhồi máu cơ
tim hoặc các chứng bệnh nguy hiểm khác.
Trong nghiên cứu kể trên, các nhà nghiên cứu tại trường đại học Duke (Mỹ)
nhận thấy các sợi fibrin có thể kéo căng gấp 4 lần chiều dài của nó và nếu thả ra, nó
sẽ ngay lập tức trở lại chiều dài ban đầu. Khả năng đàn hồi của fibrin còn “siêu”
hơn cao su.
Còn nếu so với mạng nhện, các nhà khoa học nhận thấy fibrin có thể kéo dài
hơn và bền chắc hơn. Cũng xin được nhắc lại rằng lâu nay giới khoa học vẫn không
ngừng nghiên cứu để tạo ra các loại sợi nhân tạo bắt chước đặc tính bền chắc như

mạng nhện, từ đó nâng cao chất lượng của những sản phẩm đại loại như áo chống
đạn.


9

Một khi phát hiện được độ bền chắc, đàn hồi của máu đơng, các nhà nghiên
cứu sẽ có nhiều thuận lợi hơn trong việc “chặt đứt” nó, giúp chữa trị cho những
người bị máu vón cục. Trước mắt, các nhà khoa học đã nói đến khả năng tạo ra một
thiết bị sử dụng sóng siêu âm để phá vỡ cấu trúc của máu vón cục.
1.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Mặc dù việc nghiên cứu và ứng dụng keo fibrin diễn ra trên thế giới từ rất
sớm (1910) [70], [75] nhưng cho đến nay ở Việt Nam chưa có hoặc chưa thấy các
cơng bố hoặc báo cáo nào có liên quan đến việc nghiên cứu và chế tạo các loại keo
fibrin để ứng dụng trong lâm sàng y học.
Năm 2008, Viện Trang thiết bị và Cơng trình y tế - Bộ Y tế đã sản xuất thành
công keo phẫu thuật Lepamed. Thành phần hóa học của keo Lepamed gồm N-Butyl
cyanoacrylate (99,99%), sulfua lưu huỳnh và axit acetic. Bên cạnh tác dụng cầm
máu, các keo sinh học cịn có tác dụng kết dính các mơ, khơng cần khâu, giúp bệnh
nhân rút ngắn thời gian nằm viện do chờ cắt chỉ. Keo cũng giúp cho các bác sĩ bịt
các lỗ thủng nhỏ mà không cần khâu, kể cả lỗ thủng giác mạc. Keo hỗ trợ các bác sĩ
nội soi dễ dàng thực hiện các thao tác trong phẫu thuật, kể cả những phẫu thuật.
Năm 2012, tác giả Nguyễn Hoàng Thụy Khanh và Trần Thị Phương Thu đăng
tải kết quả nghiên cứu trên tạp chí Y học Thành Phố Hồ Chí Minh với nghiên cứu
đánh giá hiệu quả của keo fibrin trong điều trị mộng nguyên phát. Kết quả thực hiện
trên 60 bệnh nhân, trong đó có 30 bệnh nhận được sử dụng keo fibrin thương mại
(Tisseel) để làm chất dán dính thay thế chỉ khâu. Kết quả nghiên cứu cho thấy keo
fibrin được sử dụng trong phẫu thuật mộng nguyên phát theo phương pháp ghép kết
mạc tự thân giúp cải thiện đáng kể cho người bệnh các triệu chứng khó chịu sau mổ,
đồng thời làm giảm tình trạng viêm, một yếu tố được cho là nguyên nhân của sự tái

phát. Keo cung cấp độ dính thích hợp giúp giữ tốt mảnh ghép lên giường củng mạc [2].
Như vậy, theo kết quả mà nhóm nghiên cứu thu thập thì hiện tại ở Việt Nam chỉ
có sản xuất keo sinh học (khơng phải nguồn gốc từ người) hoặc chỉ sử dụng keo
thương mại (như keo Tisseel) để ứng dụng trong các phẫu thuật lâm sàng, mặc dù tiềm


10

năng ứng dụng và giá trị kinh tế mà keo fibrin mang lại là rất lớn nhưng chưa có cơng
trình nào nghiên cứu về việc sản xuất keo fibrin có nguồn gốc từ người.
1.3. Cơ chế hình thành cục máu đông fibrin
Cơ thể phản ứng lại với việc mất máu sau khi bị tổn thương bằng cách tạo ra
một cục máu đơng dùng để ngăn chặn việc mất máu, đó là một q trình có sự
tương tác của nhiều yếu tố bao gồm tiểu cầu, huyết tương và các mô bị tổn thương.
Sự tương tác này gây nên một loạt các phản ứng của các enzyme, kích hoạt một
chuỗi các yếu tố đông máu (được ký hiệu bằng chữ La Mã) gồm có các yếu tố từ I
đến XIII. Giai đoạn cuối cùng của thác đông máu là sự hoạt động của các
glycoprotein gọi là fibrinogen (yếu tố I) bởi các enzyme prothrombin (yếu tố II). Sự
hoạt động của các protein này sẽ dẫn đến sản phẩm cuối cùng là các cục máu đông
(khối fibrin) để ngăn chặn sự mất máu.
Fibrin được tạo thành chủ yếu từ hai thành phần chính là fibrinogen và
thrombin, hiện diện trong các cục máu đơng ở các lồi động vật có xương sống
[19]. Trong khối fibrin tự nhiên, các sợi tạo thành một mạng lưới dày đặc bao xung
quanh các tế bào máu. Các sợi này có đường kính khoảng 20-22 nm [21], [78] và
tạo thành mạng lưới có độ dày khoảng từ vài phân tử fibrinogen (30Å) lên đến 300
nm. Các sợi liên kết và phân nhánh tạo thành một mạng lưới, có cấu trúc liên thơng
với nhau.
1.3.1. Q trình cầm máu [29]
Các giai đoạn của q trình đơng máu:
- Giai đoạn 1: Khi mạch máu bị vỡ, một chuỗi các phản ứng hóa học liên quan đến

các yếu tố đơng máu diễn ra. Kết quả là hình thành một phức hợp các chất kích hoạt
gọi là prothrombin activator.
- Giai đoạn 2: thành lập thrombin
Các prothrombin activator xúc tác chuyển đổi prothrombin thành thrombin
Prothrombin activator , Ca

Prothrombin

++

Thrombin

Hoạt hóa yếu tố XIII


11

- Giai đoạn 3: thành lập fibrin
Thrombin , Ca

Fibrinogen

++

XIII hoạt hóa

Fibrin S

Fibrin I

Thrombin thủy phân fibrinogen để tạo thành các monomer của fibrin và các
fibrinopeptit (A và B). Các monomer của fibrin tự trùng hợp tạo thành những phân
tử fibrin S (fibrin hòa tan). Cuối cùng yếu tố XIII hoạt hóa làm cho mạng lưới
polymer của fibrin S thành fibrin I ổn định (fibrin khơng hịa tan).
Có thể tóm tắt quy trình đơng máu trên bằng Sơ đồ 1.1

Sơ đồ 1.1. Sơ đồ q trình đơng máu [29]
1.3.2. Cơ chế hình thành cục máu đơng fibrin
Các phân tử fibrinogen bao gồm hai domain D ở phía ngồi và một lõi domain
E ở trung tâm. Mỗi domain D có ba chuỗi polypeptide: một chuỗi , một chuỗi  và
một chuỗi γ (Hình 1.1). Những polypeptid này nối với nhau bằng 29 liên kết
disulfide. Những polypeptid này định hướng cho sáu đuôi tận cùng N gặp nhau để
hình thành domain trung tâm E. Hai khu vực xoắn  cuộn lại căng ra hai bên của


12

domain D bao gồm tận cùng C của chuỗi  và chuỗi γ và một phần chuỗi . Tận
cùng C của  thò ra mỗi domain như một chuỗi dài, phần thị ra của chuỗi  có thể
tương tác với những phần khác và với domain E trong phản ứng liên kết chéo. Cả
domain E và D có những vị trí liên kết quan trọng cho sự chuyển hóa fibrinogen
thành fibrin, kết tập fibrin và cho kết tụ tiểu cầu.
Khi thrombin phản ứng với fibrinogen nó gây ra sự phân cắt các peptide từ các
chuỗi polypeptide và khởi đầu sự trùng hợp của các phân tử fibrin dẫn đến sự hình
thành của phân tử fibrin monomer. Các phân tử fibrin monomer này tiếp tục
polymer hóa với phân tử fibrin monomer khác và tạo thành một mạng lưới các sợi
fibrin không hịa tan mà kết quả cuối cùng là sự hình thành của các cục máu đơng.
Trong q trình đơng máu, sự hoạt động của các yếu tố XIII dẫn đến sự hình thành
của các liên kết ngang giữa các fibrin ở dạng monomer [52]. Chuỗi γ hoàn toàn tạo
ra các liên kết ngang trong vòng vài phút sau khi xảy ra sự polymer hóa. Chuỗi α

tạo ra các liên kết ngang phải mất đến hai giờ với khoảng 70% các liên kết ngang
xảy ra trong vòng 10 phút. Calcium rất cần thiết cho các phản ứng này và để có thể
thu được tỷ lệ tối ưu để tạo ra các liên kết ngang thì nồng độ CaCl2 phải có ít nhất từ
5 mmol/L. Theo thời gian, một cục máu đông ngày càng cứng chắc được tạo thành,
sau đó được hịa tan và hấp thu trong suốt quá trình làm lành vết thương của cơ thể.


13

Tầm quan trọng của của các liên kết ngang trong mạng lưới fibrin nằm ở chỗ
là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành của cục máu đơng [64]. Khả năng đàn hồi, độ
bền kéo và khả năng kết dính chủ yếu là do fibrinogen và phụ thuộc vào nồng độ
fibrinogen được sử dụng [33]. Sự hiện diện của yếu tố FXIII cũng có thể gây ra
phản ứng trên collagen để tạo ra các liên kết ngang với fibrin, đó là nguyên nhân
dẫn đến sự tạo thành một liên kết bền chặt để tạo ra một độ bền gắn kết khi fibrin
tiếp xúc với mơ.
Yếu tố XIII cũng hoạt hóa tạo ra các liên kết ngang giữa fibrin với các
fibronectin huyết tương, một glycoprotein rất quan trọng đối với sự gắn kết và tăng
trưởng của tế bào [13], tham gia vào q trình lành thương và tái tạo mơ. Hơn nữa,
2-antiplasmin và Plasmin activator inhibitor 2 (PAI-2) tham gia kiểm soát sự phân
hủy fibrin ở các cục máu đông trong quá trình hấp thu của cơ thể [2] cũng có thể tạo
ra được các liên kết ngang với fibrin bởi yếu tố XIIIa. Q trình tạo lập cục máu
đơng hồn tất trong vịng 2 tuần. Sau đó, cục máu đơng fibrin sẽ được cơ thể hấp
thu theo quá trình sinh lý của cơ thể [62].
Dựa trên sự mô phỏng lại cơ chế hình thành cục máu đơng trong cơ thể, hiện
tại chúng ta có thể tạo ra được khối đơng fibrin từ các sản phẩm thương mại, được
sử dụng để cầm máu hoặc chất kết dính để dán mơ. Mặc dù bản chất chung của
fibrin là một mạng sợi polymer hóa, nhưng cấu trúc này có thể khác nhau về kích
thước sợi, mật độ và tính đồng nhất. Cấu trúc của mạng lưới fibrin chịu trách nhiệm
về các đặc tính cơ học của cục máu đông như độ cứng, độ bền kéo, thời gian đơng

máu và thậm chí cả màu sắc của khối đơng (Hình 1.2).


14

Hình 1.2. Sơ đồ mơ tả sự hình thành keo fibrin được tạo ra bằng phối trộn các
thành phần chính của keo [7]
Các tiêu chí này ảnh hưởng đến cấu trúc chung của khối fibrin mà chủ yếu là
về mặt số lượng và tỷ lệ phối trộn giữa fibrinogen, thrombin và các thành phần bổ
sung. Ngoài ra, cấu trúc của keo cũng chịu ảnh hưởng rất lớn bởi nồng độ của
fibrinogen, độ pH và nhiệt độ [8].
Trong trường hợp của keo dán mô thương mại Tisseel [74]. Keo Tisseel mô
phỏng lại bước cuối cùng của cơ chế đông máu để tạo ra chức năng đặc biệt của nó
để làm keo dán mơ hoặc cầm máu. Theo đó, do tác dụng của thrombin, fibrinogen
bị chuyển đổi thành fibrin. Tốc độ chuyển đổi phụ thuộc vào nồng độ của thrombin.
Với thrombin 500UI, khối đơng hình thành trong vịng 10 giây, với thrombin 4UI là
60 giây. Thrombin cũng hoạt hóa yếu tố XIII (có trong thành phần fibrinogen của
keo), yếu tố làm ổn định cục máu đông, dưới sự hiện diện của ion Ca2+, giúp đẩy
nhanh quá trình trùng hợp và tạo liên kết chéo trong các chuỗi fibrin.