giải trình tự thế hệ mới trong tìm và đánh giá các đột biến của hệ gen ung thƣ u nguyên bào thần kinh

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT (TỒN VĂN)

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG

GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM VÀ ĐÁNH
GIÁ CÁC ĐỘT BIẾN CỦA HỆ GEN UNG THƢ U
NGUYÊN BÀO THẦN KINH
Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: TS. BÙI CHÍ BẢO

Tp. Hồ Chí Minh, 11/2017


BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT (TỒN VĂN)

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG

GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI TRONG TÌM VÀ ĐÁNH
GIÁ CÁC ĐỘT BIẾN CỦA HỆ GEN UNG THƢ U
NGUYÊN BÀO THẦN KINH
Mã số:

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)

Tp. Hồ Chí Minh, 11/2017


DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ
PHỐI HỢP CHÍNH

Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu:
Chuyên ngành

Cơ quan công tác

STT

Họ và tên

1

Bùi Chí Bảo

ĐH Y Dƣợc TPHCM

2

Võ Văn Thành Niệm

ĐH Y Dƣợc TPHCM

3

Nguyễn Đức Thái

ĐH Y Dƣợc TPHCM

4

Trƣơng Đinh Kiều Diễm

ĐH Y Dƣợc TPHCM

5

Nguyễn Văn Linh

ĐH Cần Thơ

Đơn vị phối hợp chính:
-Nơi thực hiện đề tài: Đại học Y Dƣợc TP.HCM
-Nơi cung cấp bệnh phẩm:


MỤC LỤC
DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ 1
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................................... 3
A. MỞ ĐẦU ............................................................................................................................. 3
1.TỔNG QUAN ĐỀ TÀI......................................................................................................... 3
2. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................................... 13
B. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................................................. 20
KẾT LUẬN .................................................................................................................................. 29
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................................... 30

DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1. Thơng tin hóa chất dùng cho giải trình tự thế hệ mới ..................................................... 17
Bảng 2. Các chỉ số kiểm sốt chất lƣợng kết quả giải trình thế hệ mới ........................................ 18
Bảng 3. Các thông số để định lƣợng và đánh giá chất lƣợng DNA .............................................. 20
Bảng 4. Chất lƣợng DNA đầu vào ................................................................................................ 23
Bảng 5. Thống kê sơ bộ xuất ra thông tin tổng quan về dữ liệu ................................................... 25

DANH MỤC BẢNG HÌNH
Hình 1. Sự phát triển của các phân nhóm chính của UNBTK ........................................................ 4
Hình 2. Mối tƣơng quan giữa gen và giai đoạn bệnh UNBTK ....................................................... 4
Hình 3. Rudolf Virchow - ngƣời đầu tiên mơ tả một khối u trong bụng một đứa trẻ nhƣ một "u
thần kinh đệm" ................................................................................................................................ 5
Hình 4. U nguyên bào thần kinh có thể đƣợc tìm thấy trong các tuyến thƣợng thận và các mô
thần kinh paraspinal từ cổ xuống xƣơng chậu ................................................................................ 6
Hình 5. Phân giai đoạn bệnh u nguyên bào thần kinh .................................................................... 9
Hình 6. Hệ thống máy sử dụng cho phƣơng pháp giải trình tự thế hệ mới .................................. 14
Hình 7. Tổng quan quá trình chuẩn bị mẫu và tiến hành thực hiện giải trình tự thế hệ mới ........ 16
Hình 8. Quy trình phân tích kết quả NGS ..................................................................................... 16
Hình 9. Kiểm tra độ phân mảnh của gDNA trên gel agarose 1%, 100V trong 30 phút. .............. 21
Hình 10. Điện di kiểm tra DNA phân mảnh ................................................................................. 21
Hình 11. Kết quả kiểm tra chất lƣợng DNA . ............................................................................... 22
Hình 12. Đánh giá thƣ viện các mẫu NB chuẩn bị giải trình tự.................................................... 23
Hình 13. Biểu đồ đo kết quả phân cắt gDNA ............................................................................... 24
Hình 14. Quy trình kiểm tra thƣ viện ............................................................................................ 24
Hình 15. Đánh giá chất lƣợng dữ liệu giải trình tự. ...................................................................... 27

1

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt

Viết đầy đủ

Giải nghĩa

NB

Neuroblastoma

U nguyên bào thần kinh

SNS

Sympathetic nervous system

Hệ thần kinh giao cảm

INSS

International Neuroblastoma Staging

Hệ thống định giai đoạn u nguyên

System

bào thần kinh quốc tế

Next Generation Sequencing

Giải trình tự thế hệ mới

NGS

2


THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
A. MỞ ĐẦU
1. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
U nguyên bào thần kinh – Neuroblastoma (NB) là một khối u rắn phổ biến nhất ở trẻ em.
Gần một nửa số trƣờng hợp u nguyên bào thần kinh xảy ra ở trẻ em dƣới năm tuổi. Nó là một
khối u thần kinh nội tiết, phát sinh từ đỉnh thần kinh của hệ thần kinh giao cảm (SNS). Nó
thƣờng bắt nguồn từ một trong các tuyến thƣợng thận, cũng có thể phát triển trong các mơ thần
kinh ở cổ, ngực, bụng hoặc khung xƣơng chậu.
U nguyên bào thần kinh (UNBTK) là một loại ung thƣ có nguồn gốc từ các tế bào thuộc
mào thần kinh. Đây là loại u đặc, nằm ở ngoại vi não, thƣờng xuất phát từ tuyến thƣợng thận hay
ở hạch thần kinh giao cảm vùng cổ, ngực, bụng và cột sống. Bệnh lý thƣờng xảy ra ở trẻ sơ sinh
và trẻ em dƣới 15 tuổi. Đây là loại u ác tính đặc ngoại vi não phổ biến hàng thứ hai và là dạng u
đặc phổ biến nhất ở trẻ nhỏ(2). Trong trƣờng hợp u nguyên bào thần kinh, các tế bào phát triển từ
các tế bào thần kinh trong thời kỳ phôi thai hoặc bào thai. Các tế bào non liên tục phân chia và
phát triển bất thƣờng, tạo ra khối u. Một số khối u chuyển thành lành tính và đƣợc coi là u hạch
thần kinh.
U nguyên bào thần kinh là một trong các khối u ác tính, biểu hiện khơng đồng nhất và
đƣợc phân thành 3 loại nguy cơ: thấp, trung bình và cao. Bệnh có nguy cơ thấp thƣờng gặp ở trẻ
sơ sinh và có kết quả tốt bằng cách phẫu thuật, trong khi bệnh có nguy cơ cao thì khó để điều trị
thành công ngay cả với phƣơng pháp điều trị đa phƣơng thức chuyên sâu nhất.

So với hệ gen ung thƣ ngƣời lớn, các biến đổi di truyền đặc trƣng của UNBTK khá ít và
khu trú cho những gen có vai trò quan trọng trong quyết định yếu tố tiên lƣợng và điều trị nhƣ:
khuếch đại gen MYCN, khuếch đại hay đột biến hoạt hoá chức năng sin ung của ALK, đột biến
gây kéo dài đoạn telomere gây ra bởi ATRX(10). Bên cạnh đó, hiện tại ghi nhận nhiều cơng trình
cho thấy có thay đổi cấu trúc nhiễm sắc thể 1p, 3p, 11q và 17q(7,14).

3


Hình 1. Sự phát triển của các phân nhóm chính của UNBTK

Hình 2. Mối tƣơng quan giữa gen và giai đoạn bệnh UNBTK
4


Mặt khác, các đột biến làm thay đổi yếu tố thuộc ngoại di truyền cũng đƣợc báo cáo nhƣ:
methyl hóa DNA bởi CASP8, RASSF1A, các trình tự phiên mã khơng giải mã protein nhƣ
miRNA (let7a, miR-9, miR-17-92a) và đột biến trong phức hợp tái cấu trúc nhiễm sắc chất
SWI/SNF và tiểu đơn vị của nó nhƣ BRG1, ARID1A và BRN đóng vai trị quan trọng trong việc
trƣởng thành của tế bào mào thần kinh(3,11). Các thông tin về hệ gen của UNBTK kể trên đã
chứng minh có vai trị quan trọng trong tiên lƣợng, điều trị và hƣớng điều trị đích cho ung thƣ
này(13).

Hình 3. Rudolf Virchow - ngƣời đầu tiên mô tả một khối u trong bụng
một đứa trẻ nhƣ một "u thần kinh đệm"
Vào năm 1864, bác sĩ ngƣời Đức - Rudolf Virchow là ngƣời đầu tiên mô tả một khối u
trong bụng một đứa trẻ nhƣ một "u thần kinh đệm". Các đặc tính của những khối u của hệ thần
kinh giao cảm và tủy thƣợng thận sau đó đã đƣợc ghi nhận vào năm 1891 bởi nhà nghiên cứu
bệnh ngƣời Đức - Felix Marchand. Vào năm 1901, William Pepper đã mơ tả đặc tính của giai
đoạn 4S ở trẻ sơ sinh (ở gan, khơng có di căn xƣơng). Năm 1910, James Homer Wright hiểu rõ

đƣợc các khối u có nguồn gốc từ các tế bào thần kinh nguyên thủy và đặt tên nó là u nguyên bào
thần kinh. Ơng cũng lƣu ý các khối trịn của các tế bào trong các mẫu tủy xƣơng mà bây giờ
đƣợc gọi là "pseudorosettes Homer Wright"(1).

5


Các triệu chứng đầu tiên của u nguyên bào thần kinh thƣờng mơ hồ, gây khó khăn cho
việc chuẩn đốn. Ví dụ nhƣ mệt mỏi, chán ăn và đau nhức trong các khớp xƣơng. Những triệu
chứng khác phụ thuộc vào vị trí u nguyên bào thần kinh bắt đầu phát triển(4,5):


Nếu nhƣ khối u trong vùng bụng, bụng có thể bị sƣng phồng lên và bệnh nhân có thể có
biểu hiện táo bón hoặc khó đi tiểu. Đơi khi huyết áp cao.



Nếu nhƣ khối u ảnh hƣởng đến vùng ngực, có thể bị khó thở hoặc khó nuốt.



Nếu khối u xuất hiện ở cổ thì có thể nhìn thấy đƣợc nhƣ là một cục u, cũng ảnh hƣởng
đến việc thở và nuốt.



Đơi khi thấy chân mình yếu và đi khơng vững nếu nhƣ khối u đè ép lên tủy sống.



Nếu khối u trong xƣơng quanh mắt, có thể gây bầm tím và sƣng.



Nếu khối u xâm nhập tủy xƣơng có thể gây xanh xao do thiếu máu.
U nguyên bào thần kinh thƣờng lan truyền đến các bộ phận khác của cơ thể trƣớc khi có

triệu chứng rõ ràng và khoảng 50 – 60% trƣờng hợp di căn. Các vị trí phổ biến nhất của u
nguyên bào thần kinh là trên các tuyến thƣợng thận. Điều này xảy ra ở 40% các khối u khu trú và
60% lan rộng. U nguyên bào thần kinh có thể phát triển ở bất cứ đâu trong hệ thống thần kinh
giao cảm từ cổ xuống xƣơng chậu. Tần suất tại các vị trí khác nhau bao gồm: cổ (1%), ngực
(19%), vùng bụng (30% phi tuyến thƣợng thận) hoặc xung quanh xƣơng chậu (1%)(6).

6


Tƣơng tự các bệnh ung thƣ khác, nguyên nhân của u nguyên bào thần kinh không đƣợc
biết rõ. Bệnh này không lây nhiễm và không truyền bệnh sang ngƣời khác. Phần lớn là các
trƣờng hợp đơn lẻ. Khoảng 1-2% các trƣờng hợp di truyền trong gia đình và có liên quan đến đột
biến gen. U nguyên bào thần kinh di truyền trong gia đình thƣờng gặp ở đột biến gen PHOX2A
hoặc KIF1B và hiếm gặp ở gen anaplastic lymphoma kinase (ALK). Sự khuếch đại bất thƣờng
của gen tiền ung thƣ MYCN thƣờng gặp trong u nguyên bào thần kinh. Mức độ vào khoảng: từ 3
đến 10 lần hoặc từ 100 đến 300 lần. Sự hiện diện với mức độ cao này có liên quan chặt chẽ với
các giai đoạn của bệnh (13).
U nguyên bào thần kinh cũng có liên quan đến hội chứng mất đoạn ở cánh ngắn nhiễm
sắc thể số 1. Mất đoạn ở cánh ngắn nhiễm sắc thể số 1 đƣợc tìm thấy ở khoảng 35% số ca u
nguyên bào thần kinh. Các mất đoạn trên nhiễm sắc thể số 1 đƣợc tìm thấy nhiều hơn ở các bệnh
nhân u nguyên bào thần kinh giai đoạn sau, và mất đoạn dị hợp tử 1p rất hay kèm với sự khuyếch
đại MYCN. Ý nghĩa tiên lƣợng độc lập của mất đoạn dị hợp tử 1p vẫn còn đang đƣợc tranh luận,
nhƣng các bằng chứng hiện nay chỉ ra rằng mất đoạn dị hợp tử ở vị trí 1p36 dự báo cho sự tiến

triển của bệnh, chứ không phải là tỷ lệ sống sót tổng cộng của các bệnh nhân u nguyên bào thần
kinh.
Có một sự liên kết chặt chẽ giữa khuyếch đại MYCN và mất đoạn 1p. Đa số các ca có
khuyếch đại MYCN thì có mất đoạn 1p, trong khi không phải tất cả các ca mất đoạn 1p đều có
khuyếch đại MYCN. Điều này gợi ra giả thuyết là mất đoạn 1p có thể xảy ra trƣớc sự khuyếch
đại MYCN, có thể vì khi mất đoạn 1p xảy ra, một gen nào đó điều hịa hoạt động sao chép gen
MYCN bị mất đi, và kết quả là dẫn đến sự khuếch đại(7).
Một loạt các xét nghiệm có thể tiến hành để chuẩn đoán u nguyên bào thần kinh. Các xét
nghiệm nhƣ chụp X quang, chụp cắt lớp vi tính hoặc chụp cộng hƣởng từ (MRI), các xét nghiệm
tủy xƣơng và xét nghiệm máu đƣợc tiến hành để tìm ra vị trí chính xác của u ngun bào thần
kinh trong cơ thể và để biết liệu khối u có di căn chƣa. Việc này đƣợc tiến hành để xác định giai
đoạn bệnh.
Trong khoảng 90% các trƣờng hợp u nguyên bào thần kinh có nồng độ catecholamine
hoặc chất chuyển hóa của chúng đƣợc tìm thấy trong nƣớc tiểu hoặc máu. Các chất chuyển hóa
của catecholamine bao gồm dopamine, acid vanillyl mandelic (VMA) và acid homovanillic
(HVA).
7


Xét nghiệm nƣớc tiểu đặc biệt sẽ đƣợc làm. Gần nhƣ tất cả (9 trong 10) trẻ em với u
nguyên bào thần kinh sẽ có những chất đƣợc gọi là acid vanillyl mandelic (VMA) hoặc là acid
homovanillic (HVA) trong nƣớc tiểu. Nồng độ VMA và HVA trong nƣớc tiểu có thể giúp chuẩn
đoán bệnh. Bệnh nhân sẽ đƣợc kiểm tra nồng độ VMA và HVA trong suốt quá trình điều trị.
Nồng độ của các chất này giảm xuống khi đang tiến hành điều trị. Vì những chất hóa học này
đƣợc sản xuất ra bởi các tế bào ung thƣ và chúng có thể đƣợc sử dụng để đo mức độ hoạt động
của khối u.
Việc sàng lọc mIBG (meta-iodo-benzyl guanidine) cũng có thể đƣợc tiến hành. mIBG là
một chất bị các tế bào u nguyên bào thần kinh bắt giữ. Chất này đƣợc dùng bằng đƣờng tiêm.
Việc gắn một lƣợng nhỏ chất phóng xạ iodine với mIBG làm cho khối u có thể nhìn thấy đƣợc
bằng một máy qt chất phong xạ. mIBG cịn có thể đƣợc sử dụng nhƣ một biện pháp điều trị.

Một mẫu nhỏ các tế bào thƣờng đƣợc lấy ra từ khối u trong khi mổ có sự gây mê toàn thân. Điều
này đƣợc gọi là sinh thiết. Sau đó, các tế bào này đƣợc xét nghiệm dƣới kính hiển vi.
Các xét nghiệm khác đƣợc gọi chung là sinh học của khối u cũng đƣợc tiến hành trên các
tế bào này trong phịng thí nghiệm.
“Giai đoạn” của một bệnh ung thƣ là một thuật ngữ đƣợc sử dụng để mơ tả kích thƣớc
của khối u và liệu nó đã lan tràn ra ngồi vị trí ban đầu hay chƣa. Việc biết đƣợc giai đoạn của
bệnh giúp các bác sĩ quyết định đƣợc cách điều trị tốt nhất cho bệnh nhân.
Một hệ thống định giai đoạn thƣờng đƣợc sử dụng cho u nguyên bào thần kinh đƣợc mô
tả dƣới đây. Hệ thống định giai đoạn u nguyên bào thần kinh quốc tế (International
Neuroblastoma Staging System – INSS) đƣợc thành lập vào năm 1986 và đƣợc sửa đổi vào năm
1988, xác định giai đoạn theo mặt giải phẫu học:

8


Hình 5. Phân giai đoạn bệnh u nguyên bào thần kinh


Giai đoạn 1: Bệnh đƣợc giới hạn trong một vùng của cơ thể (khu trú) và khơng có dấu
hiệu của lan tràn bệnh. Khối u này có thể đƣợc lấy ra tồn bộ bằng phẫu thuật hoặc có thể
có một lƣợng rất nhỏ của khối u còn lại.



Giai đoạn 2A: Bệnh còn khu trú và vẫn chƣa bắt đầu lan tràn, nhƣng khối u khơng thể
đƣợc lấy ra hồn tồn bằng phẫu thuật.



Giai đoạn 2B: Bệnh còn khu trú và đã bắt đầu lan tràn vào các hạch bạch huyết gần đó.



Giai đoạn 3: Bệnh đã lan tràn vào các cơ quan và các cấu trúc xung quanh, nhƣng vẫn
chƣa lan tràn đến những vùng xa của cơ thể.



Giai đoạn 4: Bệnh đã lan tràn đến các hạch bạch huyết xa, xƣơng, tủy xƣơng, gan, da
hoặc các cơ quan khác.



Giai đoạn 4S: Bệnh còn khu trú (nhƣ là trong giai đoạn 1, 2A, hoặc 2B) và đã bắt đầu lan
tràn đến gan, da hoặc đến một phạm vi nhất định của tủy xƣơng. Giai đoạn này đƣợc tìm
thấy ở trẻ em dƣới 1 tuổi.
9


Nếu bệnh đã lan tràn đến các phần xa của cơ thể thì gọi là bệnh thứ phát hoặc ung thƣ di
căn. Nếu bệnh quay trở lại sau lần điều trị đầu tiên thì đƣợc gọi là ung thƣ tái phát. Việc điều trị
u nguyên bào thần kinh phụ thuộc vào độ tuổi của trẻ, kích thƣớc và vị trí của khối u, sinh thiết
khối u và khối u đã lan tràn chƣa.
Đối với những khối u chƣa lan tràn (những khối u còn khu trú), phƣơng pháp điều trị
thƣờng là phẫu thuật. Nếu khối u ở giai đoạn sớm và khơng có dấu hiệu đã lan tràn đến các hạch
bạch huyết hoặc các phần khác của cơ thể, một ca phẫu thuật để lấy bỏ khối u ở mức nhiều nhất
có thể sẽ đƣợc thực hiện.
Ở những trẻ em có những khối u cịn khu trú, thƣờng là có khả năng đƣợc chữa khỏi. Tuy
nhiên, tùy thuộc vào những kết quả sinh thiết, nếu khối u đƣợc xếp loại nhƣ là “nguy cơ cao” thì
việc điều trị thêm sẽ cần thiết. Nếu khối u ban đầu quá to, khó lấy ra đƣợc an tồn, việc điều trị

hóa chất sẽ đƣợc thực hiện để làm cho khối u co nhỏ lại trƣớc khi phẫu thuật.
Nếu nhƣ khối u đã lan tràn vào lúc chuẩn đốn, hoặc là có dấu hiệu nguy cơ cao dựa trên
kết quả sinh học của khối u thì việc điều trị hóa chất mạnh là cần thiết. Điều trị hóa chất là sử
dụng các thuốc chống ung thƣ (gây độc tế bào) để tiêu diệt các tế bào ung thƣ. Việc điều trị này
thƣờng đƣợc áp dụng qua đƣờng tiêm và đƣờng truyền vào tĩnh mạch.
Nếu u nguyên bào thần kinh đã lan tràn đến một vài vùng của cơ thể, hoặc là bệnh có nguy cơ
cao thì hóa trị liều cao với sự cứu thốt tế bào mầm sẽ đƣợc sử dụng (sau các tiến trình hóa trị
ban đầu).
Những liều hóa trị cao “làm sạch” tủy xƣơng của cơ thể (nơi mà các tế bào máu đƣợc sản
sinh). Để đề phòng những vấn đề do việc điều trị này gây ra, các tế bào mầm (các tế bào máu ở
thời kỳ phát triển sớm nhất) của bệnh nhi đƣợc thu thập lại trƣớc khi việc điều trị hóa chất đƣợc
tiến hành. Ngay sau đó, chúng đƣợc làm lạnh và bảo quản. Sau khi điều trị hóa chất, các tế bào
mầm đƣợc truyền trở lại cho bệnh nhi (qua đƣờng truyền nhỏ giọt). Các tế bào mầm tạo thành
các tế bào máu thuần thục trong khoảng 14 - 21 ngày.
Kháng thể đơn dịng có thể tiêu diệt các tế bào ung thƣ, khi đó cũng có thể gây một số tổn
hại đến các tế bào bình thƣờng. Một phƣơng pháp điều trị bằng kháng thể đơn mới gọi là anti –
GD2 hiện đang đƣợc thử nghiệm đối với u nguyên bào thần kinh nguy cơ cao. Trẻ em ở Anh với
u nguyên bào thần kinh nguy cơ cao đang đƣợc đang đƣợc điều trị với anti – GD2 nhƣ là một
phần của thử nghiệm lâm sàng. Có một thử nghiệm lâm sàng đƣợc tiến hành tại Mỹ vào năm
2009, đây có thể là một liệu pháp đầy hứa hẹn khi đƣa ra cùng với các phƣơng pháp điều trị khác
cho u nguyên bào thần kinh.
10


Nếu u nguyên bào thần kinh đã lan tràn đến một vài phần của cơ thể hoặc là có độ nguy
cơ cao, phƣơng pháp xạ trị bên ngồi có thể đƣợc áp dụng. Phƣơng pháp này sử dụng các tia
năng lƣợng cao để tiêu diệt các tế bào ung thƣ, trong khi có gây ra một chút tổn hại có thể có với
các tế bào bình thƣờng. Xạ trị ngồi đƣợc truyền từ một chiếc máy bên ngoài cơ thể.
Xạ trị trong đơi khi có thể sử dụng chất mIBG phóng xạ. mIBG phóng xạ cũng giống nhƣ
chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu để chuẩn đoán u nguyên bào thần kinh, nhƣng sử dụng

những liều phóng xạ cao hơn để giết chết các tế bào ung thƣ.
U nguyên bào thần kinh là một loại ung thƣ bất thƣờng bởi vì trẻ em nhỏ tuổi (dƣới 12
tháng tuổi) có thể có những khối u có “nguy cơ thấp”. Bệnh giai đoạn 4S có thể tự nó trở nên tốt
hơn. Đối với những trẻ em rất nhỏ tuổi này, việc điều trị tối thiểu hoặc thậm chí khơng cần điều
trị có thể đƣợc đặt ra. Bệnh nhi sẽ chỉ cần đƣợc theo dõi một cách cẩn thận trong vài năm sau đó.
Khối u sẽ thƣờng tự biến mất hồn tồn hoặc là có thể phát triển thành một khối u khơng phải
ung thƣ (lành tính) đƣợc gọi là u hạch thần kinh. Các u hạch thần kinh thƣờng là khơng có hại và
sẽ khơng gây ra bất cứ vấn đề gì hoặc không cần đến bất cứ loại điều trị nào.
Hầu hết trẻ em dƣới 12 tháng tuổi có u nguyên bào thần kinh đƣợc chữa khỏi.
Giải trình tự tồn bộ hệ gen (Whole genome sequencing - WGS) và giải trình tự hệ gen biểu
hiện (Whole exome sequencing - WES) là 2 xu hƣớng chính ứng dụng cơng nghệ NGS vào giải
trình tự ADN. WGS/WES cho phép tìm kiếm và xác định các biến dị di truyền SNP, InDel,
CNV, SV... có trong cá thể, quần thể đối với những loài đã có hệ gen tham chiếu. Việc phát hiện
các biến dị di truyền giúp phát hiện các biến dị gây ra bệnh di truyền đã biết, từ đó tiến hành
sàng lọc ung thƣ/bệnh di truyền sớm hoặc theo dõi đáp ứng điều trị; cung cấp các biến dị cho
nghiên cứu GWAS, chú giải...; đánh giá đa dạng quần thể bằng cách xác định tần số allen...
Những ƣu điểm vƣợt trội về công suất và giá thành đã khiến WGS trở thành phƣơng pháp thích
hợp nhất cho nhiều mục đích nghiên cứu. WGS ngày càng đƣợc sử dụng nhiều hơn cho các
nghiên cứu giải mã nhƣ khoa học pháp y, di truyền nơng nghiệp và các chẩn đốn lâm sàng
(chẩn đốn bệnh di truyền là một ví dụ).
Một trong những ứng dụng lâm sàng quan trọng khác là giải trình tự các chủng gây bệnh và
các bệnh truyền nhiễm quan tâm. Đối với nhiều ứng dụng, việc giải trình tự tồn bộ hệ gen là
không thực tế và không cần thiết. Do đó, giải trình tự hệ gen biểu hiện (WES) là phƣơng án tiếp
cận hợp lý đối với những vùng gen quan tâm, ví dụ Exon chỉ chiếm 2% trong hệ gen ngƣời
nhƣng biến đổi trong đó lại gây nên 85% các căn bệnh đã biết. Vì lý do này, WES đã đƣợc sử
dụng cho nghiên cứu lâm sàng trong những năm gần đây, cho ra nhiều cơng cụ chẩn đốn hứa
11


hẹn sẽ làm thay đổi đáng kể dịch vụ y tế và chăm sóc sức khỏe. Một hƣớng tiếp cận cao hơn mới

phát triển trong thời gian gần đây là giải trình tự các gen quan tâm đã đƣợc khuếch đại bằng
PCR. Phƣơng pháp này phù hợp với các kiểm tra bệnh, tập trung vào một lƣợng giới hạn các
bệnh có liên quan đến các biến thể hoặc ứng dụng trong giải trình tự gen 16S của rARN từ các
lồi khác nhau. Đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng rộng rãi trong hệ thống học và phát sinh
chủng loại, cụ thể là giữa các mẫu đa dạng về di truyền. Giải trình tự thế hệ mới đã trở thành một
cơng cụ thiết yếu trong phân tích di truyền và hệ gene.
Để xác định toàn bộ các biến đổi hệ gen trong UNBTK, phƣơng thức tiếp cận giải trình
tự thế hệ mới (Next Generation Sequencing -NGS) là cần thiết. NGS đã trở thành một cơng cụ
thiết yếu trong phân tích di truyền và hệ gene. Không giống nhƣ kỹ thuật PCR hay giải trình tự
Sanger, NGS có thể phát hiện hầu hết các biến đổi di truyền của hệ gen ung thƣ đồng thời chỉ 1
phản ứng. NGS ngày càng quan trọng đối với lâm sàng và đã đang phát triển rộng trong những
năm gần đây nhằm tìm kiếm gen mục tiêu và chỉ thị phân tử cho chẩn đoán tiên lƣợng bệnh. Các
nghiên cứu trên ung thƣ bằng NGS đã cho những bƣớc tiến trong việc đƣa ra bảng của nhóm gen
ứng cử viên thƣờng xuyên đột biến và hƣớng điều trị đích cho những nhóm gen này(12).
Để thực thi các kết quả NGS, các nhà khoa học thực nghiệm phải sử dụng các kỹ năng tin
sinh học phân tích khối lƣợng dữ liệu khổng lồ của hệ gen, để tìm ra những gen ứng cử viên đích
cho hƣớng điều trị mới. Vì thế nó đặt ra một thách thức trong việc thao tác chƣơng trình lƣu trữ
và phân tích dữ liệu, và cần hệ thống máy và nhóm làm việc chun các thuật tốn phân tích hiệu
quả(1). Trong phạm vi nghiên cứu của nhóm, chúng tơi đã có các ngân hàng mẫu UNBTK thu
nhận đƣợc từ 2012 – 2016. Từ ngân hàng mô ung thƣ, chúng tôi chọn ra những mẫu để thử
nghiệm chạy NGS để chuẩn hoá kĩ thuật từ khâu định lƣợng mẫu đến khâu phân tích sai số, phân
tích ban đầu bằng tin sinh học(12).
Giải trình tự thế hệ mới đã trở thành một công cụ thiết yếu trong phân tích di truyền và hệ
gene. NGS ngày càng quan trọng đối với các nhà khoa học thực nghiệm, để đạt đƣợc các kỹ năng
tin sinh học để đánh giá và phân tích khối lƣợng dữ liệu khổng lồ sau giải trình tự. Vì thế nó đặt
ra một thách thức trong việc lƣu trữ và phân tích dữ liệu, do đó địi hỏi máy tính phải có cấu hình
thật mạnh và các thuật tốn phân tích hiệu quả. Điều này gây khó khăn cho các nhà sinh học
khơng chỉ trong phân tích các dữ liệu quan trọng với kết quả NGS mà cịn ở khía cạnh hợp tác và
khả năng lặp lại(1). Một trong những bƣớc đầu tiên của quy trình phân tích dữ liệu kết quả NGS
đó là việc chuẩn bị và kiểm tra chất lƣợng dữ liệu.

12


Những bƣớc này thƣờng đƣợc thực hiện nhƣ sau: (i) bắt cặp trình tự đầu ra, (ii) tính tốn;
(iii) xem thống kê tóm tắt về điểm chất lƣợng và phân bố các nucleotide (iv) loại bỏ trình tự
đƣợc đọc khơng tốt nếu cầu thiết (v) lọc các trình tự dựa vào điểm chất lƣợng và nhiều thao tác
khác. Khác hẳn các cơng cụ phân tích dữ liệu NGS hiện nay, Galaxy là một dự án mã nguồn mở,
dựa trên nền tảng web để ngƣời dùng khơng có kiến thức lập trình cũng có thể tiếp cận và tiến
hành tính tốn cũng nhƣ phân tích y sinh học(1,5). Galaxy giúp cho q trình phân tích sinh học dễ
dàng hơn cho ngƣời sử dụng bằng cách tƣơng tác với các công cụ và quy trình có sẵn các thơng
số với giao diện chỉ cần nhấn di chuyển chuột (point-and-click). Mỗi bƣớc thực hiện và tính tốn
cũng nhƣ chỉnh sửa của ngƣời dung đều đƣợc hệ thống ghi chép một cách tự động để bất cứ
ngƣời sử dụng nào khác đều có thể lặp lại và hiểu một cách tƣờng minh, ngƣời dùng cũng có thể
chia sẻ và cơng bố quy trình riêng của mình với nhiều ngƣời khác thơng qua giao thức web một
cách đầy đủ. Các công cụ của Galaxy đều là miễn phí, truy cập tại . Ngồi ra,
cũng có sẵn phiên bản để cài đặt trên máy tính cá nhân tại (chỉ tối ƣu khi
máy tính cài đặt hệ điều hành Ubuntu hoặc MAC) hoặc sử dụng với giao diện đám mây thì truy
cập vào Khi các cơng cụ có sẵn trên hệ thống khơng có sẵn với
u cầu của ngƣời dùng, có thể tìm kiếm và cài đặt từ cửa hàng ứng dụng của Galaxy với tên gọi
là ToolShed, có sẵn tại />2. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Vật liệu
Yêu cầu về máy tính và phân tích dữ liệu NGS
Chỉ cần máy tính ngƣời dùng có một trình duyệt web hiện đại (hỗ trợ JavaScript và
HTML5) là đủ để sử dụng và tƣơng tác với Galaxy. Hiện nay, hầu hết các trình duyệt web đều
đƣợc hỗ trợ, chẳng hạn nhƣ Firefox, Chrome, Safari..., nhƣng phải chắc rằng plug-in của
JavaScript đã đƣợc bật lên. Truy cập Internet và đăng ký tài khoản ngƣời dùng để sử dụng máy
chủ Galaxy () hoặc cài đặt Galaxy hay sử dụng Galaxy cloud nếu cần thiết.
Dữ liệu NGS cần phân tích ở định dạng FASTQ.

13


Hình 6. Hệ thống máy sử dụng cho phƣơng pháp giải trình tự thế hệ mới
2.2 Phƣơng pháp
a. Tách chiết gDNA từ mô u tƣơi
Tách chiết DNA bộ gen (gDNA) từ mơ UNBTK theo quy trình “Genomic DNA PREP
from human tissue”. Mẫu mô đƣợc ly giải trong TES buffer và Proteinase K, ủ qua đêm. TES
buffer có vai trị hịa tan DNA và bảo vệ DNA tránh bị phân hủy; proteinase K đƣợc sử dụng để
loại bỏ protein. Sau đó, hỗn hợp này đƣợc cho vào ống Vacutainer (BD, Mỹ) và bổ sung
Phenol/Chloroform/isopropanol với tỷ lệ 25:24:1. Protein bị biến tính và tan trong lớp giữa, cịn
nucleic acid đƣợc giữ trong lớp nƣớc phía trên. Lớp trên có chứa nucleic đƣợc bổ sung với
chloroform một lần nữa để đảm bảo loại bỏ tạp chất và RNA. Ly tâm và chuyển dịch nổi vào ống
mới, thêm cồn tuyệt đối và đảo nhẹ ống. Ly tâm và thu nhận DNA và hòa tan trong nƣớc khử
ion. Bảo quản ở 4oC và kiểm tra chất lƣợng DNA trên gel agarose 1%.
b. Tách chiết DNA từ mô u trong paraffin
Đối với mẫu mô u trong paraffin, gDNA đƣợc tách chiết theo quy trình của bộ
ReliaPrepTM FFPE gDNA Miniprep System (Promega). gDNA sau khi thu nhận đƣợc bảo quản ở
-200C.
c. Kiểm soát chất lƣợng gDNA
Theo quy trình của nhà sản xuất DropSense96 (Agilent) hoặc Qubit 2.0. Cho 2 µL gDNA
sẽ đƣợc nạp vào 96 giếng và đo 3 lần lặp lại với 2 tỷ lệ OD: A260/230 và A260/280) theo hƣớng

14


dẫn của máy. Mẫu FFPE, mẫu tƣơi sau khi tách gDNA sẽ nạp 1 µL chạy trên gel 1% agarose để
đánh giá đứt gãy và suy thoái DNA.
2.3 Chuẩn bị thƣ viện Amplicon (TruSeq Custom Amplicon Index Kit,
Illumina)

a. Phân mảnh DNA
Các gDNA sẽ đƣợc cắt ngẫu nhiên để tạo ra phân mảnh nhỏ (~500 đến 1.000 bp). Đây là
quá trình chuẩn bị sự lai của hỗn hợp các mảnh nhỏ của từng mẫu với adapter và barcode. Sau
quá trình lai diễn ra, các mẫu sẽ tiến hành PCR với 2 mastermix thƣơng mại TDP1 và PMM2
trong index amplication plate (96 giếng). Sau phản ứng, thêm 25 µL 50 mM NaOH trƣớc khi cho
vào chu trình PCR. Chạy chƣơng trình PCR bao gồm một bƣớc biến tính nhiệt ở 95°C trong 3
phút; tiếp theo là 25 chu kỳ của 95°C trong 30 giây, 62°C trong 30 giây, 72°C trong 60 giây;
theo sau là một phần mở rộng cuối cùng của 72°C trong 5 phút; kết thúc ổn định mẫu ở 10°C.
Nếu khơng tiến tới giai đoạn tiếp theo sau khi hồn thành PCR, các mẫu có thể đƣợc bảo quản ở
2-8°C đến hai ngày.
b. Điểm chất lƣợng (Quality Scores)
Định dạng file giải trình tự thơ là FastQ sẽ cung cấp một phần mở rộng của định dạng
FastA, lƣu trữ một số điểm chất lƣợng ứng với mỗi trình tự. Mặc dù đây là định dạng chuẩn,
nhƣng FastQ cũng có một số biến thể, xuất phát từ nhiều các tính xác suất khác nhau mà một số
gọi là lỗi, những cách khác nhau trong bảng mã ASCII, sử dụng một ký tự cho mỗi base.
c. PHRED scores
Điểm chất lƣợng bắt đầu từ chƣơng trình PHRED đƣợc sử dụng để đọc trình tự DNA, và
liên kết với thơng số của nhiều trình tự khác. Chƣơng trình PHRED ghi nhận điểm chất lƣợng
của từng base, đƣợc tính theo cơng thức:
d. FastQ Quality Control
Có hai cách để kiểm tra chất lƣợng của dữ liệu FastQ trong Galaxy: sử dụng phƣơng
pháp Summary Statistics và phƣơng pháp FastQC. Trong bài này, chúng tôi sử dụng phƣơng
pháp FastQC. Trong giao diện của Galaxy chọn NGS: QC and manipulation → FASTQ
Summary Statistics.

15


Hình 7. Tổng quan quá trình chuẩn bị mẫu và tiến hành thực hiện giải trình tự thế hệ mới

Hình 8. Quy trình phân tích kết quả NGS
16


2.4 Hệ thống giải trình tự
Sử dụng giao thức MiniSeq của Illumina, bao gồm các bộ hóa chất giải trình tự:
Bảng 1. Thơng tin hóa chất dùng cho giải trình tự thế hệ mới
Tên
MiniSeq High Ouput Reagent Kit 300 cycles

Dữ liệu đầu ra
7.5 Gb

MiniSeq High Output Reagent Kit 150 cycles 3,8 Gb



MiniSeq High Output Reagent Kit 75 cycles

1.9 Gb

MiniSeq Mid Output Reagent Kit 300 cycles

2.4 Gb

2.5 Phản ứng giải trình tự
Trên màn hình cơng cụ MiniSeq: Mở 'Manage Instrument' và chọn 'Reboot' để khởi động
lại phần mềm. Mở lại'Manage Instrument' và chọn 'Sequence'. Trên màn hình đầu tiên Tùy chọn BaseSpace - chọn 'Sử dụng BaseSpace để lƣu trữ và phân tích' và nhấp vào
'NEXT'. Một dấu nhắc xuất hiện để tải các flowcell. Lấy flowcell từ kho lạnh ở 4 ° C.
Cẩn thận lấy ra flowcell từ container bằng cách sử dụng nhíp. Tránh chạm vào kính với

nhíp. Flowcell đƣợc rửa cẩn thận bằng nƣớc cấp phịng thí nghiệm. Flowcell sau đó đƣợc
làm khơ bằng các mơ làm sạch ống kính khơng có sƣơng. Khoang chứa flowcell đƣợc mở
ra.



Các flowcell đƣợc đặt cẩn thận tránh chạm vào kính và chốt đóng cửa để giữ các tế bào
cố định tại chỗ. Khoá các khoang 1, 2 và 3.



Một khi các flowcell đƣợc cố định tại chỗ, dấu nhắc tiếp theo trên màn hình cơng cụ
MiniSeq hƣớng dẫn ngƣời sử dụng để nạp các thuốc thử và hộp mực tinh khiết.



Chai thuốc thử PR2 đã đƣợc lấy ra khỏi kho lạnh và đảo ngƣợc nhẹ nhàng để trộn đều.
Khoang thuốc thử đƣợc mở ra.



Xơ đựng đƣợc nâng lên và khóa chặt vào vị trí R.



Chai PR2 đƣợc đặt ở phía bên phải của máy làm lạnh phản ứng thẳng đứng với nắp đƣợc
gỡ bỏ. Chai phế thải bên phải máy làm lạnh phản ứng thẳng đứng đã đƣợc làm sạch và
thay thế (3 tháng/lần). Đòn bẩy đã đƣợc hạ xuống để xem mực nƣớc bỏ.



Hộp chứa thuốc đã đƣợc đƣa vào không gian hộp đựng bên tay trái của máy làm lạnh và
lƣu ý đóng kín nhanh để tránh khơng khí ẩm.



Màn hình phải hiển thị hộp thơng tin RFID đã đƣợc đọc.
17




Mẫu đã đƣợc tải lên Trình quản lý thử nghiệm “Experiment manager”. Bạn có thể tạo
bảng mẫu trƣớc với ngƣời quản lý thử nghiệm hoặc cho ngƣời dùng có kinh nghiệm dƣới
dạng tệp .csv. Chạy các thông số đƣợc liệt kê trong bảng mẫu đƣợc hiển thị trong bảng.



Sau khi kiểm tra tất cả các tham số chạy là chính xác ngƣời sử dụng nói với các cơng cụ
để thực hiện một kiểm tra trƣớc khi chạy. Một khi kiểm tra này đƣợc hồn thành, chạy có
thể đƣợc bắt đầu.Nhiều bộ dụng cụ MiniSeq đƣợc sử dụng tùy theo tính sẵn có của chúng
và tính thực tế của mỗi bộ dụng cụ để thử nghiệm theo từng bƣớc. Bộ hóa chất tƣơng ứng
sẽ đƣợc sử dụng.



Tất cả dữ liệu trình tự đƣợc tạo ra từ MiniSeq đƣợc lƣu trữ trên BaseSpace, một mơi
trƣờng điện tốn đám mây do Illumina cung cấp. Có ba lần đọc đƣợc thực hiện của mỗi
cụm mảnh: một đoạn đọc xác định (đọc mã vạch lập chỉ mục), một đoạn đọc về phía
trƣớc của các đoạn DNA (chiều dài phụ thuộc vào bộ trình tự sắp xếp) và một lần đọc

ngƣợc các mảnh.



Có 2 tệp trình tự chính đƣợc tạo ra cho mỗi mẫu định dạng là FASTQ đọc xuôi và
FASTQ đọc ngƣợc lại. Định dạng FASTQ sử dụng một ký tự ASCII để biểu thị cả điểm
số nucleotide và chất lƣợng của mỗi vị trí trong một chuỗi đƣợc đọc.



Máy Illumina sản xuất dữ liệu ở định dạng FASTQ, bao gồm các mã nhận dạng chuỗi,
chẳng hạn nhƣ làn kênh dòng chảy và các tọa độ X-Y của cụm nguồn gốc trong tế bào
dịng chảy.



Xố bỏ chuyển đổi định dạng đọc ở đâu điểm chất lƣợng cho các lần đọc khơng đáp ứng
các tiêu chí do ngƣời dùng xác định. Thông tin về chất lƣợng sẽ bị xóa khỏi các chuỗi
cịn lại, chuyển chúng thành định dạng FASTA chỉ gồm thơng tin trình tự.

2.5 Kiểm sốt q trình giải trình tự
Bảng 2. Các chỉ số kiểm sốt chất lƣợng kết quả giải trình thế hệ mới
Các giá trị đo
lƣờng

Định nghĩa

Yield total

Tổng số base pair đƣợc giải trỉnh tự

Yield perfect

Tổng số lần đọc không báo lỗi khi chạy với chứng PhiX

18


Yield >=3 errors

Tổng số lần đọc có ít hơn 3 base pair bị báo lỗi khi có chứng PhiX

Aligned

Tỉ lệ số lần PhiX đƣợc đọc trên flowcell

Perfectly Aligned
(%)

Tỉ lệ số base trên PhiX đƣợc đọc chính xác

>=3 errors (%)

Tỉ lệ số lần đọc có ít hơn 3 base pair bị báo lỗi của PhiX

Error rate

Tỉ lệ thất bại chung của các phản ứng giải trình tự của PhiX

Q >=30 (%)

Tỉ lệ các base có chất lƣợng giải trình tự < 1/1000 base

Tiles

Các vùng nhỏ đƣợc phân định trên flowcell, có chức năng tƣơng tự nhau

Density

Sự phân bố của các mảng DNA trên flowcell

PF

Phas./Prephas

Reads

Reads PF

Q>=30

Yield

Phần trăm các phân mảng DNA đƣợc giải trình tự có kết quả 25 chu kỳ đầu đạt
chất lƣợng
Số lƣợng phân mảng DNA chạy trƣớc hoặc sau một số lƣợng chu kỳ so với chu
kỳ hiển thị trên máy
Số lƣợng các phân mảng DNA trên flowcell
Số lƣợng các phân mảng DNA trên flowcell có kết quả 25 chu kỳ đầu đạt chất
lƣợng

Số lƣợng base có kết quả giải trình tự sai sót ≤ 1/1000
Số lƣợng base vƣợt qua bộ lọc (bộ lọc lƣợc bỏ những kết quả có 25 chu kỳ đầu
khơng ổn định)

Cycles error rated

Số lƣợng chu kỳ sai sót dựa vào PhiX

Error rate

Tỉ lệ sai sót đƣợc xác định với PhiX

19


Error rated determined by PhiX alignment during cycles 1-35, 1-75 and 1-100
Intensity cycle 1
Cƣờng độ huỳnh quang của các base đƣợc phát hiện bởi MiniSeq
Intensity cycle 20

B. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1. Kết quả
a. Định lƣợng và đánh giá chất lƣợng DNA
Một số bƣớc quan trọng trong nghiên cứu NGS là phải kiểm tra bệnh học và có số liệu chính
xác nguồn mẫu. Chúng tơi có 140 mẫu UNBTK thu thập từ 2012 đến 2016. Trong đó kết quả
sinh thiết sẽ đƣợc đánh giá bởi nhóm bệnh học. Việc tách chiết DNA cho 3 nhóm mẫu: 10 mẫu
cố định bằng Paraffin, 4 mẫu mô sinh thiết tƣơi trữ lạnh -80oC và 2 mẫu DNA tách từ máu làm
đối chứng. Định lƣợng DNA phải đƣợc đánh giá dựa trên 2 hình thức: quang phổ và chạy điện di
trên gel 1% agarose. Quang phổ ở bƣớc sóng 260/230 trong khoảng 1,5 – 2,2 để đánh giá độ tạp
nhiễm hoá chất trong lúc tách chiết (phần lớn là ethanol). Quang phổ bƣớc sóng 1,6 – 2,2 để

đánh giá độ tạp nhiễm protein trong mẫu (Bảng 3, Bảng 4). Hình ảnh DNA chạy điện di trên gel
để đánh giá mức độ toàn vẹn cấu trúc DNA, mức độ đứt gãy của sản phẩm hệ gen. Mức tối ƣu là
50% băng DNA > 1.000bp. Trong Hình 1, mẫu từ số 2 đến 7 là cố định trong paraffin và phần
lớn cho thấy đứt gãy nhiều. Đặc biệt mẫu số 4 có lƣợng bp nhỏ hơn 1.000 bp theo thang chuẩn.
Ngƣợc lại, mẫu 8-11 cho bang DNA cố định gần đầu giếng và ít bị đứt gãy. Đây là mẫu DNA từ
nguồn sinh thiết tƣơi trữ lạnh -80oC. Từ kết quả phân lập DNA, chúng tôi tiến hành loại trừ mẫu
từ nguồn paraffin do DNA không đủ chuẩn để thực hiện các bƣớc làm thƣ viện.

Thiết bị

Bảng 3. Các thông số để định lƣợng và đánh giá chất lƣợng DNA
Kết quả
Dấu hiệu
Phạm vi lý tƣởng

DropSene96 A260/A230

Xác định mức độ nhiễm bẩn hóa chất (ví dụ: 1,5 – 2,2
ethanol)

DropSene96 A260/A280

Xác định mức độ nhiễm bẩn protein

1,6 – 2,2

DropSene96 Nồng độ

Định lƣợng DNA

> 1 ng/µL

TapeStation

DNA smear Xác định mức độ tồn vẹn của DNA (ví dụ: giảm 50% > 1.000bp
chất lƣợng/ đứt gãy của DNA đƣợc tách chiết)

Qubit2.0

Nồng độ

Mức độ định lƣợng DNA chính xác hơn

> 1 ng/µL
20


Hình 9. Kiểm tra độ phân mảnh của gDNA trên gel agarose 1%, 100V trong 30 phút.
Mẫu gDNA bị đứt gãy trên giếng 2, 3, 4,5 và 7.
gDNA máu ở giếng 6 và gDNA mô tƣơi trên giếng 8, 9, 10, 11 đạt chất lƣợng để tiến hành chạy NGS.

Hình 10. Điện di kiểm tra DNA phân mảnh
Sản phẩm DNA sau phân cắt sẽ đƣợc lựa chọn lại bằng SPRI Beads theo nồng độ thích hợp. Nồng
độ càng cao sẽ thu đƣợc càng nhiều các phân mảng DNA kích thƣớc nhỏ và ngƣợc lại.

21