sử dụng kỹ thuật microsatellite để phát hiện mất đoạn trên nhiễm sắc thể 11 của tế bào u nguyên bào thần kinh

BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT (TỒN VĂN)

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG

SỬ DỤNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE ĐỂ PHÁT HIỆN
MẤT ĐOẠN TRÊN NHIỄM SẮC THỂ 11 CỦA TẾ BÀO U
NGUYÊN BÀO THẦN KINH
Mã số:

Chủ nhiệm đề tài: CN. NGUYỄN NHẬT QUỲNH NHƢ

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05/2018
1


BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƢỢC TP. HỒ CHÍ MINH

BÁO CÁO TỔNG KẾT (TỒN VĂN)

ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG

SỬ DỤNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE ĐỂ PHÁT HIỆN
MẤT ĐOẠN TRÊN NHIỄM SẮC THỂ 11 CỦA TẾ BÀO U
NGUYÊN BÀO THẦN KINH

Chủ nhiệm đề tài
(ký, họ tên)

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 05/2018
2


THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƢỜNG

1. Thơng tin chung:
Tên đề tài: Sử dụng kỹ thuật Microsatellite để phát hiện mất đoạn trên nhiễm sắc
thể 11 của tế bào u nguyên bào thần kinh
Mã số:
- Chủ nhiệm đề tài:
Nguyễn Nhật Quỳnh Như Điện thoại: 0937327294
Email:
Đơn vị quản lý về chuyên môn (Khoa, Tổ bộ môn): Trung tâm Y sinh học Phân tử
Thời gian thực hiện:
2. Mục tiêu: Khảo sát mất đoạn trên cánh ngắn NST 1 (1p) và cánh dài NST 11 (11q)
trong các khối u của bệnh nhân UNBTK.
3. Nội dung chính:
Tách DNA bộ gen (gDNA) từ 17 mẫu khối u và mẫu máu đối chứng của bệnh
nhân UNBTK.
Phát hiện mất đoạn 1p và 11q bằng phương pháp PCR sử dụng microsatellite
marker và điện di SDS-PAGE. 7 mẫu được kiểm tra lại bằng phương pháp MLPA.
Phân tích kết quả

-

4. Kết quả chính đạt đƣợc (khoa học, đào tạo, kinh tế-xã hội, ứng dụng, ...):
 Về đào tạo: 2 cử nhân

 Công bố trên tạp chí trong nước và quốc tế (tên bài báo, tên tạp chí, năm xuất
bản): khơng
 Sách/chương sách (Tên quyển sách/chương sách, năm xuất bản): không
 Patent, Giải pháp hữu ích (tên; trình trạng nộp đơn đối với giải pháp chưa đăng
ký sở hữu trí tuệ; mã số, ngày cấp, thời gian bảo hộ đối với patent và giải pháp đã
đăng ký sở hữu trí tuệ): khơng
5. Hiệu quả kinh tế - xã hội do đề tài mang lại:


Kết quả nghiên cứu được chuyển giao (Tên sản phẩm, tên đơn vị nhận
chuyển giao, giá trị chuyển giao): không

 Phạm vi và địa chỉ ứng dụng kết quả nghiên cứu (tên đơn vị ứng dụng kết quả
nghiên cứu/tên bài giảng được trích dẫn kết quả NC sử dụng trong giảng dạy đại
học và sau đại học): các kết quả được sử dụng làm cơ sở cho công tác chẩn đoán,

3


quản lý và tư vấn cho các bệnh nhân và gia đình người mắc bệnh u nguyên bào
thần kinh.

MỤC LỤC
MỤC LỤC .................................................................................................................1
DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH ...........................................................................5
DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................6
THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ..............................................................7
A. MỞ ĐẦU .............................................................................................................7
I. TỔNG QUAN ĐỀ TÀI ...................................................................................7

1. Giới thiệu chung: .........................................................................................7
2. Phân chia giai đoạn bệnh ............................................................................7
3. Biến đổi cấu trúc NST 11q ........................................................................10
II.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................11

B. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................................15
TÀI LIỆU THAM KHẢO .....................................................................................23
PHỤ LỤC ................................................................................................................24

4


DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI
VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
Danh sách những thành viên tham gia nghiên cứu:
STT

Họ và tên

Chuyên ngành

Cơ quan công tác

1

Lê Thị Kim Hịa

Cơng nghệ sinh học

ĐH Khoa học Tự Nhiên
TP.HCM

2

Nguyễn Nhật Quỳnh Như

Y sinh học phân tử

ĐH Y Dược TP.HCM

3

Nguyễn Đồn Phương
Un

Cơng nghệ sinh học

Đại học Quốc tế- ĐH Quốc
gia TP. HCM

4

Trần Thị Bích Thủy

Cơng nghệ sinh học

Đại học Quốc tế- ĐH Quốc
gia TP. HCM

Bệnh viện Nhi Đồng 2

Hồ Trần Bản
Bùi Chí Bảo

Y sinh học phân tử

Đơn vị phối hợp chính: Bệnh viện Nhi Đồng 2
-Nơi thực hiện đề tài: ĐH Y Dược TP.HCM
-Nơi cung cấp bệnh phẩm: Bệnh viện Nhi Đồng 2

5

ĐH Y Dược TP.HCM


DANH MỤC BẢNG BIỂU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1: Phân loại giai đoạn U NBTK theo hệ thông INSS được điều chỉnh (Brodeur,
1993)
Bảng 2. Giai đoạn U NBTK theo hệ thống INRGSS
Bảng 3. Kết quả đo mật độ quang của gDNA mẫu mô và máu
Bảng 4. Kết quả phát hiện LOH 11q bằng microsatellite marker
Bảng 5. Đối sánh kết quả MLPA với microsatellite marker

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Viết tắt
UNBTK

Viết đầy đủ

U nguyên bào thần kinh

Giải nghĩa

LOH

loss of heterozygosity

Mất đoạn dị hợp

MLPA

Multiplex Ligation-dependent Probe
Amplification

6


THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
A. MỞ ĐẦU
I.

TỔNG QUAN ĐỀ TÀI
1. Giới thiệu chung:

U nguyên bào thần kinh (U NBTK) là khối u đặc nằm ngoài hộp sọ và là u ác tính phổi
biến nhất ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ. c nguồn gốc từ các tế ào c đặc tính giống nguyên
ào thần kinh trong giai đoạn phát triển ph i thai. Các tế ào này tham gia vào quá trình
hình thành hệ thần kinh giao cảm. Do đ , U NBTK c thể xuất hiện ở ất kì vị trí nào
thuộc hệ thần kinh giao cảm như tuyến tủy thượng thận, các hạch thần kinh giao cảm ở

cột sống và ổ ụng.
U nguyên bào thần kinh (UNBTK) là ung thư phổ biến nhất ở trẻ em dưới 15 tuổi, chiếm
15% số trường hợp tử vong trong các loại ung thư ở trẻ em Khối u phát sinh trong quá
trình phát triển hệ thống thần kinh giao cảm và hầu hết các khối u nguyên phát nằm vùng
bụng, trong đ phổ biến nhất là vị trí tủy thường thận (trên 50%) [1-3]. Bệnh nhân
UNBTK ở thường được điều trị bằng phương pháp đa m thức kết hợp phẫu thuật, hóa
trị, xạ trị; tuy nhiên, hiệu quả điều trị khơng cao, tình trạng tái phát cịn cao. UNBTK có
đặc điểm mô học khá phức tạp gây kh khăn trong việc tiên lượng bệnh, chính vì vậy
nghiên cứu UNBTK mở rộng nghiên cứu sinh học phân tử của bệnh – cơ sở giúp tiên
lượng và điều trị bệnh hiệu quả hơn. MYCN là một gen sinh ung (oncogene) đ ng vai trò
quan trọng trong phát triển thần kinh và sự khuếch đại MYCN được xem là yếu tố tiên
lượng xấu (nhóm nguy cơ cao) xảy ra ở khoảng 20% các trường hợp UNBTK. Tuy nhiên,
khoảng 50% bệnh nhân UNBTK ở tình trạng di căn lúc chẩn đốn và gần 65% trường
hợp di căn này kh ng c sự khuếch đại MYCN [4]. Do đ , phân tích yếu tố di truyền khác
liên quan đến sự phát triển UNBTK thuộc nh m nguy cơ cao là cần thiết.
2. Phân chia giai đoạn bệnh
Phân chia giai đoạn U NBTK là một quá trình có nhiều tranh luận, cho nên hiện tại có hai
hệ thống phân giai đoạn U NBTK. Đầu tiên, hệ thống phân giai đoạn U NBTK quốc tế
(International Neuroblastoma Staging System - INSS) được phát triển vào năm 1971 dựa
trên chẩn đốn hình ảnh và được sử dụng đầu tiên ởi Nh m Nghiên Cứu Ung Thư ở trẻ
7


em (Children’s Cancer Study Group). INSS được chia làm các giai đoạn: 1, 2, 3, 4 và 4S.
Năm 1993, hệ thống phân loại này được điều chỉnh thành 6 nh m dựa theo phẫu thuật cắt
ỏ khối u và tình trạng lan rộng của khối u, ao gồm: giai đoạn 1, 2A, 2B, 3, 4 và 4S
(10.1200/JCO.1993.11.8.1466). Chữ “S” nghĩa là đặc iệt (special) và 4S chỉ ệnh đã lây
lan với các vị trí di căn xác định như gan, tủy xương, da ở trẻ dưới 12 tháng tuổi. Đây là
hệ th ng phân loại được FDA chấp nhận và được sử dụng rộng rãi trên thế giới.
Bảng 1: Phân loại giai đoạn U NBTK theo hệ thông INSS được điều chỉnh (Brodeur,

1993)
Giai đoạn
1

Đặc điểm
Khối u khu trú được loại ỏ hoàn toàn ằng phẫu thuật, c hoặc
kh ng c dư lượng khối u dưới kính hiển vi; hạch lympho kh ng
chứa tế ào khối u mặc dù hạch trong khối u c chứa nguyên ào
thần kinh.

2A

Khối u vẫn khu trú ở một ên của cơ thể, nhưng kh ng phải tất cả
khối u c thể nhìn thấy được đều ị loại ỏ ằng phẫu thuật. Hạch
lympho kh ng chứa tế ào khối u mặc dù hạch trong khối u c chứa
nguyên ào thần kinh.

2B

Khối u nằm một ên của cơ thể và c hoặc kh ng thể ị loại ỏ hoàn
toàn ằng phẫu thuật. Gần hạch lympho ngoài khối u c chứa
nguyên ào thần kinh nhưng ung thư kh ng lan đến hạch lympho ở
phía ên kia của cơ thể hoặc nơi nào đ .

3

Khối u chưa di căn xa nhưng c một số đặc điểm sau:
-

Khối u kh ng thể được loại ỏ hoàn toàn ằng phẫu thuật và

lan sang phía ên kia của cơ thể. N c thể hoặc kh ng thể
lan đến hạch lympho gần đ .

-

Khối u vẫn khu trú ở vị trí nguyên phát và nằm một ên của
cơ thể. N

ắt đầu lan sang hạch lympho gần đ nhưng kh ng

nằm phía ên khác của cơ thể.

8


-

Khối u nằm ở giữa cơ thể và phát triển lan sang hai ên và
kh ng thể loại ỏ hoàn tồn ằng phẫu thuật.

4

Khối u lan sang vị trí xa như hạch lympho ở xa, xương, gan, da, tủy
xương, hoặc cơ quan khác

4S (“special”
neuroblastoma)

Trẻ dưới 1 tuổi. Khối u nằm một ên cơ thể. N c thể lây lan sang
hạch lympho ở cùng một phía của cơ thể nhưng kh ng lan sang hạch

lympho ở phía khác. U NBTK di căn sang gan, da, và/hoặc tủy
xương. Tuy nhiên, kh ng quá 10% tế ào tủy xương là ung thư, và
chuẩn đốn hình ảnh như MIBG scan kh ng cho thấy ung thư lan
sang xương và tủy xương.

Vì giai đoạn khối u khu trú được phân loại dựa vào mức độ phẫu thuật cắt ỏ khối u nên
hệ thống phân loại này kh ng phù hợp với hệ thống phân nh m nguy cơ U NBTK quốc tế
(International Neuroblastoma Risk Group – INRG) tiền điều trị. Mặc dù nhiều nước trên
thế giới chấp nhận INSS nhưng c nhiều kh khăn phải đối mặt như: khối u kh phân loại
nếu chỉ dựa vào phạm vi phẫu thuật, việc so sánh các thử nghiệm lâm sàng dựa vào INSS
cũng kh khăn, hơn nữa ệnh nhân c khối u khu trú vì dự đốn c sự suy thoái khối u
kh ng phân giai đoạn đúng nếu dựa vào các tiêu chí của INSS. Nhận ra nhiều giới hạn
của INSS, các chuyên gia từ nước Úc, Trung Quốc, châu ÂU, Nhật và Bắc Mỹ đã phát
triển một hệ thống phân loại mới dựa trên INRG (INRG staging system – INRGSS) dựa
trên tiêu chí lâm sàng và các yếu tố nguy cơ được xác định ởi hình ảnh (image-defined
risk factors –IDRF). Các giai đoạn theo INRGSS như sau:

9


Bảng 2. Giai đoạn U NBTK theo hệ thống INRGSS
Giai đoạn
L1 (Localized tumor)

Mô tả
Khối u khu trú, kh ng c

ất kỳ yếu tố IDRF nào. (Phụ

lục 1). Khối u phải nằm trong 1 khoang của cơ thể như

cổ, ngực, ụng hoặc xương chậu.
L2 (Locoregional tumor)

Khối u khu trú với sự hiện diện của một hoặc nhiều hơn
IDRF (Phụ lục 1). Khối u nằm liên tục một ên trong các
khoang cơ thể (ví dụ, khối u nằm ở ên trái của ụng và
cũng nằm ên trái của ngực).

M (metastatic disease)

Bệnh di căn xa (ngoại trừ giai đoạn MS), kh ng liền kề
với khối u nguyên phát, ngoại trừ xác định thuộc giai
đoạn MS. Khối u di căn đến hạch ạch huyết và các ộ
phận khác của cơ thể.

MS (Specific metastasis)

Giai đoạn di căn ở trẻ em nhỏ hơn 18 tháng và khối u di
căn đến da, gan và/hoặc tủy xương. Kh ng quá 10% tế
bào ung thư trong tủy xương.

3. Biến đổi cấu trúc NST 11q
Mất đoạn dị hợp (loss of heterozygosity – LOH) trên cánh dài NST 11 (11q) thường xảy
ra trong UNBTK. Tấn suất đột biến mất đoạn 11q khác cao trong UNBTK. Mất đoạn
11p, có khoảng 21% bệnh nhân UNBTK có LOH 11p và vị trí thường xảy ra nhất là
11q23. LOH 11p liên quan đến hiệu quả điều trị kém với tỷ lệ sống sót khoảng 45% và là
yếu tố mới nhất được sử dung trong phân loại nh m nguy cơ. Những vùng bị mất có
chứa các gen ức chế khối u (gene suppressor gene) nhưng chưa xác định rõ [3, 5]. Việc
phát hiện LOH 11q - các yếu tố tiên lượng đắc lực cho các trường hợp không khuếch đại
MYCN hỗ trợ cho việc phân loại nh m nguy cơ trong UNBTK.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng các microsatellite marker chuyên biệt để phát
hiện LOH 11q trong 17 mẫu UNBTK bằng phương pháp PCR và điện di SDS-PAGE.
10


Bên cạnh đ chúng t i cũng sử dụng thêm microsatellite marker phát hiện LOH 1q để so
sánh sự tương quan ở những bệnh nhân có xảy ra đột biến mất đoạn đồng thời trên nhiễm
sắc thể 1p và 11q. Sau đ , kết quả này được kiểm tra lại bằng phương pháp MLPA – có
thể phát hiện các trường hợp mất đoạn hoặc lặp đoạn nhỏ với độ chính xác cao.
II.

ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu

Mẫu m và máu UNBTK được thu nhận sau khi phẫu thuật tại bệnh viện Nhi Đồng II;
mô u được trữ trong m i trường DMEM, 10% FBS, 1% Penicillin-Steptomycin và mẫu
máu được giữ trong ống có chứa EDTA để tránh đ ng máu. và vận chuyển về trung tâm
Y Sinh Học phân tử - Đại học Y Dược TP HCM. Mẫu được bảo quản trong tủ -80oC.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
Tách chiết DNA từ mô u
Tách chiết DNA bộ gen (gDNA) từ mơ UNBTK theo quy trình “Genomic DNA PREP
from human tissue”. Mẫu m được ly giải trong TES buffer và Protease K, ủ qua đêm.
TES buffer có vai trò hòa tan DNA và bảo vệ DNA tránh bị phân hủy; proteinase K được
sử dụng để loại bỏ protein. Sau đ , hỗn hợp này được cho vào ống Vacutainer (BD, Mỹ)
và bổ sung Phenol/Chloroform/isopropanol với tỷ lệ 25:24:1. Protrein bị biến tính và tan
trong lớp giữa, cịn nucleic acid được giữ trong lớp nước phía trên. Lớp trên có chứa
nucleic acid được bổ sung với chloroform: isopropanol một lần nữa để đảm bảo loại bỏ
tạp chất và RNA. Ly tâm và chuyển dịch nổi vào ống mới, thêm cồn tuyệt đối và đảo nhẹ
ống bằng tay. Ly tâm và thu nhận DNA và hòa tan trong nước khử ion. Bảo quản ở 4oC
và kiểm tra chất lượng DNA trên gel agarose 1%.

Tách chiết DNA từ máu
Đối với máu, gDNA được tách chiết bởi bộ Illustra-blood genomic Prep Mini Spin Kit
(GE Healthcare). Quy trình tách máu gồm các ước sau:
-

Thêm 20 ml dung dịch Proteinase K vào 200 µl máu toàn phần, votex trên máy.

-

Thêm 400µl dung dịch Lysis, votex trên máy.

-

Ủ mẫu ở 56oC trong 10 phút.
11


-

Thêm 200 ml ethanol 100% và votex.

Rửa DNA.
-

Chuyển hỗn hợp đã chuẩn bị vào cột quay. Máy ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 60
giây.

-

Bỏ ống thu chứa dung dịch chảy qua. Đặt cột vào một ống thu mới.

-

Thêm 500 µl Wash Buffer I. Máy ly tâm ở 10000 vòng / phút trong 60 giây, loại
bỏ dung dịch chảy qua.

-

Thêm 500 µl Wash Buffer II. Máy ly tâm ở tốc độ 14000 vòng / phút trong 3 phút,
loại bỏ dung dịch chảy qua.

-

Ly tâm ở tốc độ tối đa để loại bỏ phần còn lại của dung dịch.

-

Chuyển sang ống microcentrifuge vơ trùng 1.5 mL

DNA pha lỗng.
-

Thêm 200 µl đệm Elution vào giữa màng cột.

-

Ủ mẫu ở RT trong 2 phút, và ly tâm ở 10000 vòng / phút trong 1 phút.

DNA sau khi thu nhận được bảo quản ở -20oC.
Định lƣợng và đánh giá chất lƣợng DNA

Định lượng và kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp đo quang phổ sử dụng máy
Nanodrop (Thermo Scientific, Vietnam). Các ước thao tác trên máy Nanodrop như sau:
-

Khởi động máy tính đã gắn kết nối sẵn với máy Nanodrop.

-

Mở phần mềm Nonadrop hiển thị trên máy tính.

-

Chọn tính năng đo Nucleic Acid để đo mẫu DNA.

-

Làm sạch máy trước khi tiến hành đo mẫu bằng thao tác “ lank” được hiển thị trên
phần mềm.

-

Thêm 2ul nước cất (DNA free water) hoặc dung dịch pha loãng DNA Elution để
rửa máy.

-

Kiểm tra lại việc rửa máy bằng cách đo nồng độ của dung dịch rửa cho tới khi số
hiển thị nồng độ trên máy là 0.

-

Thêm 2ul DNA cần đo vào máy và tiến hành đo các mẫu.
12


-

Sau mỗi lần đo mẫu mới là thực hiện ước rửa để đảm bảo độ chính xác và khác
biệt giữa các mẫu DNA, tránh trùng mẫu.

Các mẫu có tỷ lệ mật độ quang ở ước s ng 260/280 nm đạt từ 1,8-2,0 mới được sử dụng
để tiến hành phản ứng MLPA. Kiểm tra độ phân mảnh của DNA trên gel agarose 1%.
Microsatellite marker
Microsatellite là đoạn DNA ngắn có trình tự lặp lại và thường nằm trên vùng intron hoặc
vùng không mã hóa khác của bộ gen, vì vậy khi thay đổi số lượng trình tự lặp lại khơng
thay đổi chức năng của gen. Microsatellite được sử dụng làm chỉ thị (marker) để xác định
vị trí chuyên biệt trên nhiễm sắt thể (NST).
-

Các microsatellite marker được sử dụng để phát hiện LOH 11q: D11S908,
D11S4094, D11S925, D11S4127, D11S1338*, D11S4090, D11S1760* (*: primer
của hai marker được sử dụng để phát hiện LOH 11p)

-

Các microsatellite marker được sử dụng để phát hiện LOH 1p: D1S2143, D1S468,
DS2145, D1S164, GGAA30B06

Phản ứng PCR (polymerase chain reaction)
Thiết lập phản ứng PCR với thành phần phản ứng bao gồm: 1X HotMaster Taq Buffer;

100ng gDNA, 50 µmol dNTP; 0,2µ mỗi primer và 1U HotMaster Taq DNA polymerase
(Takara, Nhật Bản). gDNA của mẫu máu làm đối chứng. Chương trình nhiệt: 3 phút
98oC để biến tính DNA, 30 phút ở 57oC để bắt cặp và kéo dài ở 72oC trong vòng 1 phút
và chảy trên máy Mastercycler@ProS (Eppendorf, Đức).
Điện di SDS-PAGE
Điện di sản phẩm PCR trên gel Polyacryamide 10% với dung dịch nạp mẫu (Eppendorf,
Đức) trong 2 giờ, chạy 85V bằng máy chạy điện di của Bio-Rad ở nhiệt độ phòng. Sau
khi điện di, gel được nhuộm với dung dịch 1000x SYBR Green I (Molecular Probes, Mỹ)
với độ pha loãng 1:10000 trong 30 phút. Hình ảnh điện đi được chụp dưới ánh sáng UV
bằng VisionWorks®LS Software.
MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification)
13


DNA tách chiết sau khi kiểm tra độ tinh sạch được sử dụng cho phản ứng MLPA và điện
di mao quản. Sử dụng SALA® MLPA® probemix P251 (MRC-Holland) chuyên biệt cho
UNBTK để phát hiện thay đổi số bản sao ở các vị trí NST khác nhau. Probemix này chứa
46 probe chuyên biệt cho NST 1 (1p36.2-1p36.3), 3, 11 (11q23) và khuếch đại vùng trình
tự 130 -490bp. Kết quả được phân tích bằng phần mềm GeneMaker v1.97 (Softgenetics,
State College, PA). Phương pháp MLPA c độ tin cậy cao nên phù hợp để kiểm chuẩn
phát hiện mất đoạn 1p và 11q trong UNBTK.
Các giai đoạn thực hiện phản ứng MLPA:
-

Giai đoạn biến tính DNA: lấy 5,0 µl DNA (có nồng độ 50 – 250 ng) cho vào
tube 0,2 ml, biến tính DNA ở 98oC trong 5 phút.

-

Giai đoạn lai: bổ sung 3,0 µl hỗn hợp hybridization master mix vào mỗi tube

phản ứng (gồm 1,5 µl SALSA MLPA Buffer và 1,5 µl probemix), ở 98oC
trong 1 phút, sau đ lai ở 60oC từ 16 giờ - 20 giờ.

-

Giai đoạn nối 2 đoạn của probe: thêm 32,0 µl hỗn hợp Ligase-65 master mix
(gồm 25,0 µl nước; 3,0 µl Ligase buffer A; 3,0 µl Ligase buffer B và 1,0 µl
enzyme Ligase-65) vào mỗi tube phản ứng, trộn đều, ủ ở 54oC trong 15 phút
để nối các probe gắn huỳnh quang, sau đ tăng nhiệt độ lên 98oC trong 5 phút
để phá hủy các enzyme Ligase-65 sau phản ứng nối.

-

Giai đoạn khuyết đại số lượng các probe: thêm 10,0 µl hỗn hợp polymerase
master mix (gồm 7,5 µl nước; 2,0 µl SALSA PCR primer và 0,5 µl SALSA
polymerase) vào mỗi tube và tiến hành phản ứng PCR với chương trình nhiệt
như sau: 35 chu kỳ gồm 98oC trong 30 giây; 60oC trong 30 giây; 72oC trong
60 giây, và giai đoạn kết thúc ở 72oC trong 20 phút.

-

Giai đoạn phân tách đoạn: sản phẩm sau khi kết thúc phản ứng MLPA được
phân tách đoạn trên hệ thống điện di mao quản GenomeLab GeXP với thể tích
gồm 32,0 µl Hi-di formamide; 2,0 µl Beckman D1-labeled CEQ size standard
600 và 2,0 µl sản phẩm MLPA. Điều kiện phân tách: nhiệt độ mao quản là
50oC, biến tính 90oC trong 2 giây, điện thế ơm mẫu là 2 kV trong 30 giây,
điện thế phân tách đoạn 4,8 kV trong 60 giây.
14

Sau khi kết thúc điện di, kết quả sẽ được phân tích bằng phần mềm GeneMarker
ver 1.91 (Softgenetics) để phát hiện đột biến ở NST 11q. Kết quả MLPA của các mẫu sẽ
được hiển thị dưới dạng bảng và biểu đồ sóng. Mỗi đỉnh tín hiệu (peak) là sản phẩm của
một pro e. Kích thước của mỗi peak được xác định nhờ so sánh với thang kích thước và
mẫu đối chứng để tính ra tỉ lệ DQ (Dosage quotients). Nh m đối chứng được thực hiện
phản ứng MLPA đồng thời với mẫu bệnh nhân và cho kết quả tỷ lệ các đỉnh sóng là 1.
Đối với người ình thường, tỷ lệ đỉnh sóng so với nhóm chứng sẽ là 1±0.3. Nếu tỷ lệ đỉnh
sóng < 0,7 chứng tỏ bệnh nhân mang đột biến mất đoạn dị hợp tử. Tỷ lệ đỉnh sóng >1,3
chứng tỏ bệnh nhân mang đột biến lặp đoạn dị hợp tử. Trường hợp tỷ lệ đỉnh sóng =0,
bệnh nhân mang đột biến mất đoạn đồng hợp tử.

B. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Đánh giá chất lƣợng gDNA tách chiết
gDNA tách chiết được đo mật độ quang và kiểm tra độ phân mảnh bằng phương pháp
điện di trên gel agarose. Kết quả cho thấy nồng độ gDNA từ mô u (trung bình 213.9
ng/µl) cao hơn gDNA từ mẫu máu (trung bình 37.7 ng/µl). Hầu hết các mẫu (mơ và máu)
đều c độ tinh sạch cao, ngoại trừ hai mẫu NB75 và NB98 c độ tinh sạch khá thấp
(Bảng 1).

Bảng 3. Kết quả đo mật độ quang của gDNA mẫu mơ và máu
No.

Sample

Concentration(ng/µl)

Purity of DNA
260/280

Tumor

Blood

Tumor

Blood

1

NB75

214,8

12,1

17,8

1,43

2

NB82

69,8

58,3

1,79

1,87

3

NB87

24,8

43,1

1,79

1,89

4

NB89

75,8

58,5

1,82

1,9

15


5

NB96

329,8

42,1

1,86

1,94

6

NB97

470,8

31,6

1,81

1,82

7

NB98

213,9

13,5

1,81

1,21

8

NB99

168,8

37,7

1,84

1,84

9

NB100

162,9

44,3

1,78

1,82

10

NB102

524,3

47,5

1,80

1,85

11

NB103

335,1

36,3

1,82

1,76

12

NB104

156,4

51,0

1,79

1,75

13

NB107

88,0

31,0

1,78

1,82

14

NB109

254,0

25,0

1,75

1,75

15

NB110

321,2

28,7

1,85

1,86

16

NB111

50.8

31,1

1,72

1.86

17

NB112

386.9

62,0

1,78

1.93

Kết quả điện di (hình 1) cho thấy hầu hết các mẫu đều kh ng c smear, ăng điện di sáng
rõ, trừ gDNA mẫu máu của NB75 (giếng 20), NB98 (giếng 8) và NB102 (giếng 2) ăng
điện di hơi mờ (tương quan với nồng độ DNA trên Bảng 1); điều này chứng tỏ kết quả
tách chiết DNA tốt, DNA không bị đứt gãy.

16


1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Hình 1 Kết quả điện di gDNA mẫu mơ và máu UNBTK.
1: Mô NB102, 2: Máu NB102, 3: Mô NB100, 4: Máu NB100, 5: Mô NB99, 6: Máu NB99,
7: Mô NB98, 8: Máu NB98, 9: Mô NB97, 10: Máu NB97, 11: Mô NB96, 12: Máu NB96,
13: Mô NB89, 14: Máu NB89, 15: Mô NB87, 16: Máu NB87, 17: Mô NB82, 18: Máu
NB82, 19: Mô NB75, 20: Máu NB75.

Phát hiện mất đoạn 11q bằng microsatellite marker
Phản ứng PCR được tối ưu h a nhiệt độ bắt cặp của mồi từ 50oC đến 58oC để tìm ra điều
kiện nhiệt độ tối ưu cho cặp mồi microsatellite marker. Nhiệt độ bắt cặp tối ưu của tất cả
cặp mồi của các marker phát hiện LOH 1p là 58oC; trong khi đ , ở các marker phát hiện
LOH 11q, nhiệt độ tối ưu của cặp mồi cho D11S908 là 50oC và các marker còn lại là 57oC.
Với nhiệt độ tối ưu này, mồi của các marker được chạy PCR trên các mẫu UNBTK và sau
đ điện di SDS-PAGE phát hiện mất đoạn 1p và 11q. Kết quả cho thấy rằng trong 17 mẫu
UNBTK, c 8 trường hợp (41,2%) mất đoan trên cánh ngắn NST 1; trong đ 62,5% mất
marker D1S164 ở vị trí 1p36.23, ngồi ra cịn mất ở vị trí 1p36.3 (D1S468) và 1p36.1
(GGAA30B06). Đối với LOH 11q, 11trường hợp (64,7%) mất đoạn trên cánh dài NST 11;
trong đ 91% xảy ra ở vị trí 11p23 (D11S4127, D11S4090, D11S925). Đặc biệt có tổng
cộng 6 trường hợp (29,4%) vừa mất đoạn trên cánh ngắn NST 1p vừa mất đoạn trên cánh
dài NST 11 (Bảng 2).

17


Bảng 4. Kết quả phát hiện LOH 11q bằng microsatellite marker
Tên mẫu

Tuổi

Giai đoạn

Khuếch đại MYCN

NB75

24

M

+

-

-

NB82

12

M

-

+

+

NB87

48

ND

-

+

-

NB89

12

L2

-

+

-

NB96

48

M

+

-

+

NB97

48

L2

-

+

+

NB98

48

ND

-

-

-

NB99

24

ND

-

+

+

NB100

60

ND

-

-

+

NB102

36

L2

-

-

-

NB103

2

ND

-

+

+

NB104

60

ND

-

+

+

NB107

48

M

-

-

+

NB109

24

L2

-

+

+

NB110

48

L2

-

-

+

NB111

108

ND

-

-

-

NB112

12

L1

-

-

+

Kết quả phân tích MLPA

18

LOH 1p LOH 11q


Sau khi chạy MLPA, kết quả phân tích tổng quát được biểu thị qua biểu đồ tỷ lệ đỉnh
sóng (Height Radio Plot – HRP). Các điểm xanh lục biểu thi các gen ình thường của

Hình 2. Biểu đồ tỷ lệ đỉnh sóng HRP.
(A) Đối chứng - ở người ình thường; (B) Đột biến mất đoạn;

(C) Đột biến lặp đoạn/ khuếch đại; (D) kh ng c đột biến

bệnh nhân, các điểm màu đỏ biểu thị các gen có số lượng bất thường. Nếu các điểm dưới
vạch ngưỡng dưới, tức là những probe tại điểm này kh ng được khuếch đại do gen mục
tiêu bị mất đồng hợp hoặc dị hợp; còn những điểm màu đỏ trên vạch ngưỡng trên, nghĩa
là các probe tại điểm này được khuếch đại hay c đột biến lặp đoạn (Hình 2). Hơn nữa,
các đỉnh sóng của các probe của bệnh nhân UNBTK được đối sánh với đỉnh sóng của
người ình thường và kết quả đột biến dựa vào sự tương quan giữa các đỉnh sóng, cụ thể
hơn dựa vào thương số liều lượng DQ (Dosage Quotient)
7 mẫu UNBTK (NB82, NB89, NB97, NB99, NB100, NB104, NB109) được chạy MLPA
để phát hiện sự biến đổi bất thường của NST 1p và 11q. Kết quả phân tích MLPA được
đối sánh với kết quả sử dụng microsatellite marker được trình bày ở Bảng 3, cho thấy

19


rằng hai kết quả này tương đồng với nhau là c 6 trường hợp LOH 1p và 6 trường hợp
LOH 11q.
Bảng 5. Đối sánh kết quả MLPA với microsatellite marker

STT

Tên

1p

mẫu

11q

Microsatellite MLPA

1

NB82

+

+

2

NB89

+

+

3

NB97

+

+

4

NB99

+

+

Vị trí
mất
1p36.22
1p35.3
1p13
1p36.23
1p36.22
1p36.23
1p35.3

Microsatellite MLPA

+

+

-

-

+

+

+

+

Vị trí
mất
11q23

11q23

11q22
11q23
11q22.3

5

NB100

-

-

+

+

11q23.3
11q22.1

6

NB104

+

+

1p36

+

+

1p36.23
7

NB109

+

+

1p35.3

11q23
11q23.3

+

+

11q22.3

1p13.3

BÀN LUẬN
Tình hình diễn tiến của bệnh UNBTK khá phức tạp do đ các ác sĩ lâm sàng kh kiểm
soát được bệnh nếu chuẩn đoán và tiên lượng bệnh chỉ dựa trên các yếu tố lâm sàng như
tuổi tác, giai đoạn và mô học. Do đ , việc phát hiện các yếu tố tiên lượng dựa trên cơ sở
20


sinh học phân tử c ý nghĩa v cùng quan trọng trong việc tiên lượng bệnh cũng như điều
trị bệnh hiệu quả hơn. Nghiên cứu của chúng t i đã phát hiện các mẫu UNBTK được thu
nhận từ bệnh viện Nhi Đồng II có ra sự mất đoạn trên cánh ngắn của NST 1 và cánh dài
của NST 11. Theo hệ thống phân loại nh m nguy cơ quốc tế (INRG – International
Neuroblastoma Risk Group) (2009), ngoài việc đánh giá nh m nguy cơ cao dựa vào độ
tuổi trên 18 tháng, giai đoạn M và đặc biệt là sự khuếch đại của gen MYCN có tỷ lệ sống
sót thấp dưới 50% thì các trường hợp khơng khuếch đại MYCN được xem xét đánh giá
dựa trên sự biến đổi NST. Cụ thể, bệnh nhân thuộc giai đoạn L1 có LOH 1p tỷ lệ sống sót
là 75-85%, khơng có LOH 1p có tỷ lệ sống trên 85%; bệnh nhân thuộc giai đoạn L2 nếu

có LOH 11q thì tỷ lệ sống sót là 50-75%, ngược lại nếu khơng có LOH 11q thì tỷ lệ sống
là 75-85% [6]. Điều này mang ý nghĩa đáng kể giúp ác sĩ phân loại nh m nguy cơ cụ thể
và rõ ràng hơn nhằm đưa ra liệu pháp điều trị hiệu quả hơn.
Kết quả nghiên cứu của chúng t i đã phát hiện tần số đột biến LOH 1p là 62,5% và LOH
11qlà 64,7%. Con số này cao hơn gần gấp đ i so với các nghiên cứu của Edward F.
Attiyeh và cộng sự năm 2005. Họ đã phát hiện 23% (209/915) trường hợp UNBTK có
LOH 1p36 và 34% (307/915) trường hợp có LOH 11q23. Ngồi ra nghiên cứu này cũng
cho biết có mối tương quan giữa LOH 1p với giai đoạn 4 (theo INSS) và sự khuếch đại
của MYCN và LOH 11p được phát hiện ở hầu hết các trường hợp khơng có sự khuếch
đại của MYCN [3]. Sự khác biệt này có thể do sự chênh lệch cỡ mẫu của hai nghiên cứu.
Chính vì vậy, chúng tôi sẽ tăng số lượng mẫu để đánh giá LOH 1p và 11q trong thời gian
tới, đồng thời tìm hiểu mối tương quan giữa biến đối NST này với các đặc điểm lâm sàng
như tuổi, giai đoạn, mô học và sự khuếch đại của MYCN ở các bệnh nhân UNBTK Việt
Nam.
KẾT LUẬN- KIẾN NGHỊ
Kết luận
Với phương pháp PCR dựa trên microsatellite marker và MLPA chúng t i đã phát hiện
62,5% trường hợp mất đoạn trên cánh ngắn NST 1 và 64,7% trường hợp mất đoạn trên

21


cánh dài của NST11 ở các bệnh nhân UNBTK tại bệnh viện Nhi Đồng II. Một lần nữa,
nghiên cứu này góp phần phân loại nhóm nguy cho các bệnh nhân UNBTK.

Kiến nghị
Mặc dù nghiên cứu này đã đạt được kết quả nhất định trong việc đánh giá mất đoạn dị
hợp của NST 11q trong nhóm bệnh nhân U NBTK nhưng cịn một số hạn chế mang tính
khách quan. Trong nghiên cứu, thiếu th ng tin giai đoạn của 17 mẫu nên số lượng mẫu
đựa đưa vào đánh giá mối tương cịn thấp. Hơn nữa, các nhóm mẫu thuộc các yếu tố lâm

sàng khách nhau chưa cân đối về mặt số lượng nên có khả năng dẫn đến đánh giá mối
tương quan giữa biểu hiện LOH 11q với các đặc điểm lâm sàng và khuếch đại MYCN
mang tính tương đối. Nghiên cứu còn hạn chế về số lượng mẫu U NBTK để khảo sát biểu
hiện mất đoạn dị hợp 11q nên chưa thể đánh giá mối liên hệ giữa sự biểu hiện LOH 11q
với các yếu tố lâm sàng.
Tiếp theo, chúng tơi sẽ tăng cỡ mẫu nghiên cứu và tìm mối tương quan giữa LOH 1p và
11q với các đặc trung lâm sàng và khuếch đại MYCN nhằm tiên lượng và lựa chọn cũng
như tìm ra phương pháp điều trị tốt hơn.

22


TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.

Schleiermacher, G., I. Janoueix-Lerosey, and O. Delattre, Recent insights into the
biology of neuroblastoma. Int J Cancer, 2014. 135(10): p. 2249-61.

2.

Mueller, S. and K.K. Matthay, Neuroblastoma: biology and staging. Curr Oncol
Rep, 2009. 11(6): p. 431-8.

3.

Attiyeh, E.F., et al., Chromosome 1p and 11q deletions and outcome in
neuroblastoma. N Engl J Med, 2005. 353(21): p. 2243-53.

4.

Schmidt, M.L., et al., Favorable prognosis for patients 12 to 18 months of age
with stage 4 nonamplified MYCN neuroblastoma: a Children's Cancer Group
Study. J Clin Oncol, 2005. 23(27): p. 6474-80.

5.

Thorner, P.S., The molecular genetic profile of neuroblastoma. MINISYMPOSIUM: PATHOLOGY OF PAEDIATRIC NEOPLASMS, 2014: p. 20.

6.

Cohn, S.L., et al., The International Neuroblastoma Risk Group (INRG)
classification system: an INRG Task Force report. J Clin Oncol, 2009. 27(2): p.
289-97.

23


PHỤ LỤC
Phụ lục 1. Bảng các yếu tố nguy cơ đƣợc xác định thơng qua hình ảnh ở các khối u
nguyên bào thần kinh
Khối u lan trong hai khoang cơ thể
cổ - ngực, ngực – ụng, ụng – xương chậu
Cổ
Khối u bọc động mạch và/hoặc động mạch đốt xương sống và/hoặc tĩnh mạch cảnh
Khối u nén khí quản và/hoặc phế quản
Khối u trung thất thấp hơn, xâm nhập vào chỗ nối đốt sống T9 và T12
Chỗ nối cổ-ngực
Khối u ọc đám rối ở cánh tay
Khối u ọc mạch máu dưới xương đòn, hoặc động mạch đốt xương sống
Khối u đè nén khi quản

Khoang ụng – ngực
Khối u ọc động mạch chủ và/hoặc tĩnh mạch chủ
Bụng/xương chậu
Khối u xâm nhập vào cửa gan hoặc dây nối gan với tá tràng
Khối u xâm nhập một hoặc cả hai bên cuống thận
Khối u vùng xương chậu đi qua khe h ng.
Khối u lan vào bên trong cột sống
Khối u di căn đến các cơ quan/cấu trúc: thận, gan, màng tim, cơ hoành, tuyến tụy

24