Nghiên cứu nuôi cấy callus cà gai leo (solanum hainanense hance) và ảnh hưởng của chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

ĐỒN NGỌC HÂN

NGHIÊN CỨU NI CẤY CALLUS CÀ GAI LEO
(SOLANUM HAINANENSE HANCE) VÀ ẢNH HƯỞNG
CỦA CHẤT KÍCH ỨNG ĐẾN SỰ TÍCH LŨY
HỢP CHẤT THỨ CẤP TRONG CALLUS

Chuyên ngành:

Công nghệ sinh học

Mã số:

60 42 02 01

Người hướng dẫn khoa học:

PGS. TS. Nguyễn Thị Lý Anh

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2018


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan: Số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung
thực và chưa từng được cơng bố trong bất kỳ cơng trình nghiên cứu nào khác, các thơng
tin trích dẫn trong luận văn đều được ghi rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017
Tác giả luận văn

Đoàn Ngọc Hân

ii


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận
được rất nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các thầy cô, cán bộ kĩ thuật, bạn bè và
người thân.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy, cơ, cán bộ nhân viên Phịng
Cơng nghệ Sinh học Thực vật – Viện Sinh học Nông Nghiệp – Học viện Nông nghiệp
Việt Nam đã tạo điều kiện tốt nhất cho tơi hồn thành luận văn này.
Tơi xin cảm ơn ThS. Nguyễn Thị Thanh Phương - cán bộ của Viện Sinh học
Nông nghiệp, người đã luôn sát cánh bên tôi, nhiệt tình giúp đỡ, chỉ bảo tơi trong suốt
thời gian thực tập trên Viện.
Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Nguyễn Thị Lý Anh
– Viện trưởng Viện Sinh học Nơng nghiệp tận tình hướng dẫn giúp đỡ, động viên tơi
trong suốt q trình thực hiện luận văn.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn bè,
những người luôn bên cạnh động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và thực hiện
đề tài.
Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2017
Tác giả luận văn

Đoàn Ngọc Hân

iii

MỤC LỤC
Lời cam đoan .................................................................................................................... ii
Lời cảm ơn ....................................................................................................................... iii
Mục lục ........................................................................................................................... iv
Danh mục chữ viết tắt ..................................................................................................... vii
Danh mục bảng .............................................................................................................. viii
Danh mục hình .................................................................................................................. x
Trích yếu luận văn .......................................................................................................... xii
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2

1.3.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn ............................................................................ 2

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3
2.1.

Sản xuất các hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy mô tế bào thực vật ........................... 3

2.1.1.

Vai trò của hợp chất thứ cấp ở thực vật .............................................................. 3

2.1.2.

Tầm quan trọng của nuôi cấy tế bào thực vật đối với sản xuất các hợp
chất thứ cấp ......................................................................................................... 3

2.1.3.

Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để sản xuất các hợp chất thứ cấp................... 4

2.1.4.

Các nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy mô tế bào thực
vật ....................................................................................................................... 6

2.2.

Ứng dụng chất kích ứng để cải thiện tích lũy hợp chất thứ cấp trong nuôi
cấy tế bào thực vật .............................................................................................. 8

2.2.1.

Giới thiệu về chất kích ứng................................................................................. 8

2.2.2.

Cơ chế tác động .................................................................................................. 8

2.2.3.

Một số nghiên cứu ứng dụng chất kích ứng trong ni cấy tế bào thực vật..... 10

2.3.

Cây cà gai leo ................................................................................................... 11

2.3.1.

Giới thiệu chung về cây cà gai leo.................................................................... 11

2.3.2.

Một số nghiên cứu khác trên cà gai leo ............................................................ 13

2.4.

Đánh giá sự tích lũy hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học
của chiết xuất dược liệu .................................................................................... 14

iv


2.4.1.

Xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro thơng qua q trình peroxy hóa
lipit tế bào gan chuột ........................................................................................ 14

2.4.2.

Đánh giá tác dụng bảo vệ gan của chiết xuất dược liệu trên chuột bị
nhiễm độc CCl4 in vivo ..................................................................................... 15

2.4.3.

Một số nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của các chiết xuất cây dược liệu ....... 15

Phần 3. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu ....................................... 17
3.1.

Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................... 17

3.1.1.

Đối tượng nghiên cứu ....................................................................................... 17

3.1.2.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..................................................................... 17

3.2.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 17

3.2.1.

Xác định môi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo ................. 17

3.2.2.

Nhân sinh khối callus ....................................................................................... 18

3.2.3.

Đánh giá sự tích lũy các hoạt chất thứ cấp thơng qua thử nghiệm hoạt
tính sinh học dịch chiết callus, dịch chiết cây cà gai leo tự nhiên .................... 20

3.3.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 22

3.3.1.

Phương pháp nuôi cấy in vitro.......................................................................... 22

3.3.2.

Nuôi cấy cây in vitro ........................................................................................ 22

3.3.3.

Nuôi cấy callus, nhân sinh khối callus ............................................................. 23

3.3.4.

Đánh giá hoạt tính sinh học dịch chiết callus ................................................... 23

3.3.5.

Xử lý số liệu...................................................................................................... 24

Phần 4. Kết quả và thảo luận ....................................................................................... 25

4.1.

Kết quả .............................................................................................................. 25

4.1.1.

Xác định môi trường thích hợp nhất cảm ứng tạo callus cà gai leo ................. 25

4.1.2.

Nhân sinh khối callus ....................................................................................... 33

4.1.3.

Đánh giá sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh
học dịch chiết callus, dịch chiết cà gai leo tự nhiên ......................................... 45

4.2.

Thảo luận .......................................................................................................... 49

4.2.1.

Cảm ứng tạo callus ........................................................................................... 49

4.2.2.

Nhân sinh khối callus ....................................................................................... 50

4.2.3.

Đánh giá sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh
học dịch chiết callus ......................................................................................... 52

v


Phần 5. Kết luận và đề nghị ......................................................................................... 54
5.1.

Kết luận............................................................................................................. 54

5.2.

Đề nghị ............................................................................................................. 54

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 55
Phụ lục .......................................................................................................................... 59

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

αNAA

α- naphtyl axetic acid

BA

Benzyl adenine

CT

Cơng thức

DAM

Dialdehyt malonyl

ĐC

Đối chứng

HCTC

Hợp chất thứ cấp

HTCO

Hoạt tính chống oxy hóa

LED

Light emitting diode

LSD5%

Độ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5%

MS

Murashige and Skoog

NADCC

Sodium dichloroisocyanurate

POL

Q trình peroxyd hóa lipit

TB

Trung bình

TN

Thí nghiệm

YE

Yeast extract

2,4-D

2,4-Dichlorophenoxyscetic acid

vii


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ đoạn
thân cà gai leo .............................................................................................. 25

Bảng 4.2.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ
mảnh lá cà gai leo ........................................................................................ 26

Bảng 4.3.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn
thân cà gai leo .............................................................................................. 28

Bảng 4.4.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ mảnh
lá cà gai leo .................................................................................................. 29

Bảng 4.5.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn
thân cà gai leo .............................................................................................. 30

Bảng 4.6.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ mảnh
lá cà gai leo .................................................................................................. 31

Bảng 4.7.

Ảnh hưởng của môi trường đến nhân sinh khối callus từ đoạn thân cà
gai leo .......................................................................................................... 33

Bảng 4.8.

Ảnh hưởng của môi trường đến nhân sinh khối callus từ mảnh lá cà
gai leo .......................................................................................................... 34

Bảng 4.9.

Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus từ đoạn
thân cà gai leo .............................................................................................. 35

Bảng 4.10. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus từ
mảnh lá cà gai leo ........................................................................................ 36
Bảng 4.11. Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối
callus từ đoạn thân ....................................................................................... 37
Bảng 4.12. Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối
callus từ mảnh lá.......................................................................................... 38
Bảng 4.13. Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối........................ 40
Bảng 4.14. Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối callus trên
môi trường A2 .............................................................................................. 41
Bảng 4.15. Ảnh hưởng của chất chiết nấm men đến khả năng nhân sinh khối

callus trên môi trường A1 ............................................................................ 42
Bảng 4.16. Ảnh hưởng của chất chiết nấm men đến khả năng nhân sinh khối
callus trên môi trường A2 ........................................................................... 43

viii


Bảng 4.17. Tổng hợp kết quả các yếu tố ảnh hưởng đến nhân sinh khối callus .......... 45
Bảng 4.18. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết cà gai leo ...................................... 46
Bảng 4.19. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus nhân sinh khối trên môi
trường A2 ..................................................................................................... 46
Bảng 4.20. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus nhân sinh khối trên môi
trường A2 + 3 g/l nấm men .......................................................................... 47
Bảng 4.21. Hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus nhân sinh khối trên môi
trường A2 + 100µM acid salisylic ............................................................... 48
Bảng 4.22. So sánh hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus, dịch chiết cà
gai leo tự nhiên ............................................................................................ 49

ix


DANH MỤC HÌNH
Hình 4.1.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ
đoạn thân cà gai leo................................................................................... 26

Hình 4.2.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA đến khả năng tạo callus từ

mảnh lá cà gai leo...................................................................................... 27

Hình 4.3.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn
thân cà gai leo ........................................................................................... 28

Hình 4.4.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ mảnh
lá cà gai leo ............................................................................................... 29

Hình 4.5.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ đoạn
thân cà gai leo ........................................................................................... 31

Hình 4.6.

Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 2,4-D đến khả năng tạo callus từ
mảnh lá cà gai leo...................................................................................... 32

Hình 4.7.

Ảnh hưởng của môi trường A1 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D)
và A2 (MS + 0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) đến nhân sinh khối callus
từ đoạn thân cà gai leo .............................................................................. 33

Hình 4.8.

Ảnh hưởng của môi trường A1 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D)
và A2 (MS + 0,1 mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) đến nhân sinh khối callus
từ mảnh lá cà gai leo ................................................................................. 34

Hình 4.9.

Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus có
nguồn gốc đoạn thân cà gai leo ................................................................. 35

Hình 4.10.

Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến nhân sinh khối callus có
nguồn gốc mảnh lá cà gai leo .................................................................... 36

Hình 4.11.

Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối
callus từ đoạn thân .................................................................................... 38

Hình 4.12.

Ảnh hưởng của chiếu sáng đèn LED đến khả năng nhân sinh khối
callus có nguồn gốc mảnh lá ..................................................................... 39

Hình 4.13.

Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối callus
trên môi trường A1 .................................................................................... 40

Hình 4.14.

Ảnh hưởng của acid salisylic đến khả năng nhân sinh khối callus
trên môi trường A2 .................................................................................... 41

x


Hình 4.15.

Ảnh hưởng của nấm men đến khả năng nhân sinh khối callus trên
mơi trường A1 ........................................................................................... 43

Hình 4.16.

Ảnh hưởng của nấm men đến khả năng nhân sinh khối callus trên
môi trường A2 ........................................................................................... 44

xi


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Đồn Ngọc Hân
Tên luận văn: "Nghiên cứu nuôi cấy callus cà gai leo(Solanum hainanense Hance) và
ảnh hưởng của chất kích ứng đến sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus"
Ngành: Công nghệ sinh học

Mã số: 60 42 02 01

Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nơng Nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu

Tìm được mơi trường ni cấy thích hợp và nhân nhanh sinh khối callus cà gai
leo. Đánh giá được sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính sinh học
của dịch chiết callus cà gai leo.
Phương pháp nghiên cứu
Các thí nghiệm cảm ứng tạo callus cà gai leo được thực hiện trên đối tượng là
đoạn thân và mảnh lá cà gai leo in vitro. Môi trường nuôi cấy sử dụng là mơi trường MS
(Murashige and Skoog, 1962) có bổ sung thêm các chất điều tiết sinh trưởng . Các tổ hợp
BA + α-NAA và BA + 2,4-D được sử dụng để đánh giá khả năng cảm ứng tạo callus.
Callus có nguồn gốc đoạn thân và mảnh lá sau 4 tuần tuổi được sử dụng cho các thí
nghiệm nhân sinh khối callus, các nhân tố: môi trường nuôi cấy, chế độ chiếu sáng, các
elicitor được đánh giá ảnh hưởng đến khả năng nhân sinh khối callus. Callus được nhân
sinh khối trên các môi trường cho khả năng nhân callus tốt nhất sau 3 tuần tuổi được sấy
khô đến khối lượng khơng đổi, sau đó chiết bằng dung mơi cồn 700 và được đánh giá hoạt
tính chống oxy hóa cùng với dịch chiết của cây cà gai leo trồng tự nhiên thơng qua q
trình peoxy hóa lipit tế bào gan chuột theo phương pháp của Blagodorov (1987).
Kết quả chính và kết luận
1. Môi trường A1 (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D) và A2 (MS + 0,1 mg/l
BA + 1 mg/l 2,4-D) là thích hợp để cảm ứng tạo callus.
2. Khi chiếu sáng bằng đèn huỳnh quang, môi trường nuôi cấy A2 ưu thế hơn
khi nhân sinh khối callus mô thân và mô lá so với môi trường A1.
3. Chế độ chiếu sáng 16 giờ sáng/8 giờ tối thích hợp để nhân nhanh callus hơn
chế độ khơng chiếu sáng. Dưới điều kiện chiếu sáng đèn LED, tỉ lệ B/R: 30/70 thích hợp
nhất với nhân callus nguồn gốc từ mảnh lá trên môi trường A2. Đối với callus nguồn gốc
từ đoạn thân tỉ lệ B/R : 40/60 thích hợp hơn để nhân callus trên môi trường A1.
4. Môi trường A1 và A2 bổ sung 100 µM acid salisylic; mơi trường A1 và A2 bổ
sung 3 g/l nấm men kích thích sự tăng trưởng khối lượng khơ TB callus từ 1,81đến 3,35

xii

lần so với đối chứng không bổ sung elicitor.
5. Nồng độ 20 mg/100 ml dịch chiết callus có hiệu quả chống oxy hóa cao nhất
so với các nồng độ thử nghiệm khác. Ở nồng độ này HTCO của dịch chiết callus cao
gấp 1,83 lần so với dịch chiết của cây trồng tự nhiên.
6.Bổ sung elicitor vào môi trường nuôi cấy làm tăng hoạt tính chống oxy hóa của
dịch chiết callus từ 1,26-1,49 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor; tăng từ 2,312,73 lần so với dịch chiết cây tự nhiên.

xiii


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Doan Ngoc Han
Thesis title: “Study on callus culture on Solanum hainanense Hance and effect of some
elicitors on generating secondary compounds in callus”
Major: Biotechnology

Code: 60 42 02 01

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
To find a suitable culture medium, to multiply callus of Solanum hainanense
Hance and to analysis the generation of sencondary compounds by testing biological
activation of extracted callus from Solanum hainanense Hance.
Materials and Methods
Callus induction experiments are carried out on in vitro cells extracted from leaf
part and body part of Solanum hainanense Hance. The culture medium used in the
research is MS medium (Murashige and Skoog, 1962) which is provided growth
accomodating elements. The BA + α-NAA and BA + 2,4-D combinations are used to
analysis the callus induction. 4-week old callus cells from body and leaf part are used
for experiments. Culture medium, light regimen and elicitors affect the ability to

multiply living mass of callus. The best results are obtained after 3 weeks, which after
that is dried to fixed weight then extract with 70% alcohol liquid. They later are
analysised the antioxidant quality, which is compared to normal Solanum hainanense
Hance extracts by the Blagodorov method (1987).
Main findings and conclusions
1. A1 medium (MS + 0,5 mg/l BA + 1,5 mg/l 2,4-D) and A2 medium (MS + 0,1
mg/l BA + 1 mg/l 2,4-D) are suitable for the callus induction process.
2. When being lightened by fluorescent light, the A2 medium is more predominant
in multiplying living mass of leaf tissues and body tissues than the A1 medium.
3. In the 16-hour bright, 8-hour dark light regimen, the callus stem happens
faster than in normal condition. When being lightened by LED light, the 30/70 B/R ratio
is the best rate for multiplying callus from leaf part while 40/60 ratio is more suitable
for multiplying callus from body part.
4. Providing 100 µM acid salisylic into A1and A2 medium and 3 g/L yeast
extract into A1 and A2 medium help stimulate the dry weight of callus to increase from
1,81 to 3,35 times in comparision to not providing elicitors.

xiv


5. 20mg/100ml is the best callus extract concentration to be antioxidant. At this
concentration, the HTCO of callus extracts is 1,83 time higher than natural ones.
6. Providing elicitors into culture medium help increase the antioxidant quality
of callus extracts from 1,26 to 1,49 time compared to not providing elicitors and from
2.31 to 2.73 time compared to natural ones.

xv


PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cà gai leo cịn có tên khác là cà gai dây, cà vạnh, cà quýnh, cà lù, gai
cườm,... tên khoa học là Solanum hainanense Hance. Cà gai leo phân bố ở các
tỉnh miền Bắc cho đến Huế tại Việt Nam và một số nước như Lào, Campuchia,
Trung Quốc (Viện Dược liệu, 1993). Cà gai leo được đánh giá cao về tác dụng
giải độc gan. Theo kinh nghiệm từ dân gian, cây cà gai leo có tác dụng hiệu quả
đối với người bệnh mắc các bệnh lý về gan như: vàng da, vàng mắt, mụn nhọt,
mẩn ngứa... Trong cây cà gai leo có chứa các chất alkaloid, glycoalkaloid có tác
dụng ức chế sự sao chép và làm âm tính virus viêm gan B, chống oxy hóa, ngăn
ngừa xơ gan hiệu quả (Nguyễn Bích Thu và cs., 2000). Cà gai leo là cây thuốc
quý có tiềm năng lớn cho việc sản xuất dược phẩm chữa bệnh.
Tuy nhiên, hiện nay cà gai leo chủ yếu được khai thác từ nguồn tự nhiên
có chất lượng khơng đồng đều. Cà gai leo có thể được nhân giống bằng hạt
nhưng hệ số nhân giống không cao do cây ít quả, quả nhỏ và ít hạt. Hơn nữa, cây
nhân giống bằng hạt có chất lượng khơng đồng đều, gây khó khăn cho việc tiêu
chuẩn hóa ngun liệu.
Ni cấy mô và tế bào thực vật với những ưu điểm vượt trội và ứng dụng
để tăng thu sinh khối trong thời gian ngắn, hàm lượng hợp chất thứ cấp (HCTC)
cao, chủ động dễ điều khiển quy trình sản xuất trên quy mô công nghiệp, tạo
nguồn vật liệu ổn định và tập trung, góp phần giải quyết những khó khăn nói trên
(Misawa, 1994).
Chất kích ứng là một chất mà khi đưa với nồng độ nhỏ vào hệ thống tế
bào sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp các HCTC trong tế bào đó
(Namdeo, 2007). Chất kích ứng thực vật báo hiệu việc hình thành các HCTC, bổ
sung chất kích ứng vào mơi trường ni cấy là phương thức để thu được các sản
phẩm HCTC có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các chất kích
ứng sinh học và phi sinh học để kích thích hình thành các HCTC trong ni cấy
tế bào vừa có thể rút ngắn thời gian lại đạt năng suất cao (Discosmo et al., 1995).
Hiện nay đã có một số nghiên cứu về sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong
callus cà gai leo. Các nghiên cứu đều thu được kết quả là hàm lượng

glycoalkaloid toàn phần trong callus và tế bào đều cao hơn so với cây tự nhiên,

1


tuy nhiên hiệu suất vẫn chưa cao. Sử dụng các chất kích ứng thực vật có thể cải
thiện được vấn đề này. Ngồi ra chưa có nhiều nghiên cứu đánh giá hoạt tính
sinh học của các hợp chất thứ cấp tích lũy trong callus cà gai leo.
Xuất phát từ đó, chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu nuôi cấy callus
cà gai leo(Solanum hainanense Hance) và ảnh hưởng của chất kích ứng đến
sự tích lũy hợp chất thứ cấp trong callus.
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Tìm được mơi trường ni cấy thích hợp và nhân nhanh sinh khối callus
cà gai leo.
Đánh giá được sự tích lũy các hợp chất thứ cấp qua thử nghiệm hoạt tính
sinh học của dịch chiết callus cà gai leo.
1.3. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
1.3.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài nghiên cứu đã làm rõ được ảnh hưởng của các nhân tố : loại mô
nuôi cấy, chất điều tiết sinh trưởng, chế độ chiếu sáng... đến sự cảm ứng tạo
callus và nhân nhanh sinh khối callus cà gai leo. Đặc biệt, đã xác định được tác
động của một số chất kích ứng đến sự tăng trưởng và tích lũy hợp chất thứ cấp
của callus cà gai leo qua đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết callus.
Các kết quả đạt được sẽ bổ sung thêm nguồn tài liệu khoa học phục vụ
công tác nghiên cứu, giảng dạy về sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy tế bào
thực vật, một lĩnh vực còn chưa được phổ biến ở nước ta.
1.3.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đưa ra được giải pháp tạo nguồn dược liệu chủ động, dồi dào, có chất
lượng đồng đều, góp phần khắc phục những hạn chế về nguồn dược liệu cà gai
leo khai thác trong tự nhiên.

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. SẢN XUẤT CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP TỪ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO
THỰC VẬT
2.1.1. Vai trò của hợp chất thứ cấp ở thực vật
Ở thực vật, quá trình trao đổi chất tạo ra nhiều loại hợp chất hữu cơ hoặc
các chất chuyển hóa, được xếp thành nhóm các chất trao đổi sơ cấp và thứ cấp.
Các hợp chất sơ cấp được tìm thấy trong hầu hết các lồi trong khi đó các hợp
chất thứ cấp tìm thấy chỉ trong một số lồi thực vật (Taiz and Zeiger, 2006).
Những bằng chứng từ thực nghiệm và thực tế cho thấy, các hợp chất thứ cấp ở
thực vật có các chức năng cơ bản sau: bảo vệ cơ thể chống lại các loài động vật
ăn cỏ; kháng nấm, vi khuẩn, virus; chống lại sự cạnh tranh về ánh sáng, nước và
chất dinh dưỡng; thu hút các loài động vật trong quá trình thụ phấn và phát tán
hạt; tạo ra các tín hiệu trong giao tiếp giữa thực vật với các loài vi sinh vật cộng
sinh; chống lại tia tử ngoại và các tác nhân vật lý bất lợi khác (Wink, 1999).
Thực vật sản xuất hơn 80.000 hợp chất khác nhau thông qua con đường trao đổi
thứ cấp. Các sản phẩm thứ cấp được dự trữ chủ yếu trong các cấu trúc đặc biệt
hoặc các cơ quan dự trữ như rễ, các tế bào dự trữ, không bào, hệ thống
màng…(Arnason et al., 1995). Ngày nay các hợp chất thứ cấp ở thực vật được
dùng trong dược phẩm, hóa chất nông nghiệp, thuốc nhuộm, gia vị, chất tạo mùi,
thuốc trừ sâu; chúng đã đóng góp giá trị lớn trong sản xuất công nghiệp (Gautam
et al., 1998).
2.1.2. Tầm quan trọng của nuôi cấy tế bào thực vật đối với sản xuất các hợp
chất thứ cấp
Nuôi cấy tế bào thực vật đã được ứng dụng thành công để sản xuất lượng
lớn HCTC dưới các điều kiện cụ thể (Neumen et al., 2009). So với phương pháp
truyền thống sản xuất HCTC bằng ni cấy tế bào thực vật có nhiều ưu việt và

thuận lợi hơn như rút ngắn thời gian, giảm chi phí nhân cơng, giả quyết vấn đề
mặt bằng và nhất là có thể thu được một lượng lớn sản phẩm như mong muốn.
Ngày nay, phương pháp này đã được ứng dụng rộng rãi trên quy mơ lớn và ngày
càng có nhiều nghiên cứu nhằm để tăng hàm lượng các HCTC tích lũy trong tế
bào thực vật được ni cấy. Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng nuôi cấy tế bào thực
vật có khả năng sản xuất các sản phẩm thứ cấp với hàm lượng lớn hơn so với các
chất đó được chiết từ cây ngoài tự nhiên (Mulabagal and Tsay, 2004).

3


Ưu điểm của sản xuất HCTC bằng nuôi cây mô, tế bào in vitro là có thể
cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên cơ sở:
- Tổng hợp các HCTC có giá trị được thực hiện dưới sự điểu khiển các
yếu tố môi trường ni cấy, độc lập với khí hậu và thổ nhưỡng.
- Loại bỏ các ảnh hưởng sinh học đến sản xuất HCTC trong tự nhiên.
- Chọn được cây trồng cho nhiều loại HCTC với sản lượng cao hơn.
- Với việc tự động hóa, điều khiển sinh trưởng và điều hịa q trình
chuyển hóa của tế bào, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên.
- Kiểm soát chất lượng và hiệu suất của sản phẩm.
- Một số sản phẩm trao đổi chất từ dịch ni cấy huyền phù có chất lượng
cao hơn chiết rút từ cây tự nhiên (Mulabagal and Tsay, 2004).
2.1.3. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào để sản xuất các hợp chất thứ cấp
2.1.3.1. Nuôi cấy callus
Nuôi cấy tế bào thực vật được khởi đầu bằng việc hình thành các tế bào
khơng phân hóa, được gọi là callus. Các mẫu mô được tách từ thực vật trên mơi
trường dinh dưỡng cơ bản có chất làm rắn là agar hình thành nên callus. Mơi
trường dinh dưỡng cơ bản này chứa các chất dinh dưỡng khoáng đa lượng, vi
lượng, nguồn carbon và nhiều loại chất điều hòa sinh trưởng thực vật. Ảnh
hưởng của thành phần môi trường dinh dưỡng hoặc chất điều hòa sinh trưởng là

các chỉ tiêu quan trọng để xác định môi trường tối ưu cho nuôi cấy đến khả
năng sinh trưởng của callus. Các thông số phổ biến nhất dùng trong đánh giá
sinh trưởng trong nuôi cấy callus bao gồm khối lượng tươi, khối lượng khô và
chỉ số sinh trưởng (Loyola-Vargas and Vázquez-Flota, 2006). Do trong ni
cấy callus, các tế bào của callus có thể trải qua biến dị dịng soma trong q
trình cấy chuyển nên các dòng tế bào ổn định di truyền được lựa chọn để tránh
sự sản xuất thất thường các chất trao đổi thứ cấp. Thông thường, trên cùng một
loại môi trường nuôi cấy, sau một số lần cấy chuyển, callus có thể được xem là
dịng tế bào đồng nhất khi các thơng số sinh trưởng của dịng tế bào được lặp lại
trong quá trình cấy chuyển (Davey and Anthony, 2010). Bouque et al. (1998)
đã nghiên cứu ni cấy 217 dịng callus khác nhau từ các loài của chi Psoralea
nhận thấy, sau 16 lần cấy chuyển (48 tuần), có khoảng 90% số dòng callus sinh
trưởng ổn định.

4


2.1.3.2. Nuôi cấy huyền phù tế bào
Để nuôi cấy huyền phù tế bào, các khối callus được chuyển vào nuôi cấy
trong môi trường lỏng được khuấy bởi máy lắc, quay hoặc màng lọc xoay. Mô
callus nuôi cấy nên là loại mơ dễ vỡ vụn để có thể phân tán cao nhất thành dịch
huyền phù tế bào. So với nuôi cấy callus, nuôi cấy huyền phù sản xuất ra lượng
lớn sinh khối tế bào, có thể dễ dàng chiết tách các chất chuyển hóa thứ cấp
(Davey and Anthony, 2010). Trong quá trình ni cấy, nhờ những chuyển động
xốy của mơi trường, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi callus. Sau một thời gian
ngắn nuôi cấy, trong dịch huyền phù là hỗn hợp các tế bào đơn, các khối tế bào
với kích thước khác nhau và các tế bào chết. Dịch huyền phù tốt là dịch huyền
phù chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào. Có thể cải thiện
khả năng tách rời của các tế bào trong môi trường bằng cách thay đổi thành phần
môi trường nuôi cấy (Misawa, 1994). Sự kết khối của tế bào có thể được loại bỏ

bởi sự thay đổi điều kiện môi trường nuôi cấy, nhưng thường trong cuối pha lag
của q trình ni cấy, các tế bào trở nên kết dính với nhau. Để thu được dịch
huyền phù gồm phần lớn các tế bào đơn, người ta thường sử dụng các enzyme
phá hủy thành tế bào hoặc dùng các sàng (rây). Tuy nhiên, các dịch huyền phù
đồng nhất đã được thiết lập thường chúng có xu hướng quay trở lại tình trạng kết
khối ban đầu (Misawa, 1994).
Nuôi cấy huyền phù tế bào là tiến hành nuôi tế bào trong mơi trường
lỏng có dung tích nhất định để thiết lập hệ huyền phù tế bào. Nhìn chung, có ba
phương thức ni cấy huyền phù tế bào là ni cấy mẻ, ni cấy mẻ có bổ sung
chất dinh dưỡng và ni cấy liên tục. Trong q trình ni cấy, bình ni cấy
khơng chỉ thường xun có sự tăng lên của các sản phẩm trao đổi chất mà cịn
ln ln diễn ra sự trao đổi khơng khí với bên ngồi. Nhìn chung, mơi trường
thích hợp cho ni cấy callus thì cũng thích hợp cho ni cấy huyền phù tế bào.
Tuy nhiên, trong một số trường hợp, nồng độ của các auxin và cytokinin đòi hỏi
cao hơn (Davey and Anthony, 2010). Khi các chất dinh dưỡng của môi trường
nuôi cấy bị tiêu hao, cùng với sự tạo thêm một số sản phẩm trao đổi chất có hại,
thì sự phân chia và sinh trưởng của tế bào sẽ bị ức chế. Khi đó, thơng qua cấy
chuyển hoặc thay đổi mơi trường ni cấy sẽ kích thích sự sinh trưởng mạnh
mẽ trở lại của huyền phù tế bào (Nguyễn Quang Thạch và cs., 2009).

5


2.1.4. Các nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp bằng nuôi cấy mô tế bào
thực vật
2.1.4.1. Các nghiên cứu trong nước
Một số dược liệu ở nước ta như nghệ đen, dừa cạn, đinh lăng, cà gai leo,
sâm Ngọc Linh... cũng được nghiên cứu tách chiết hợp chất thứ cấp từ tế bào
thực vật nuôi cấy in vitro.
Cây dừa cạn (Catharanthus roseus) là một trong những loài cây dược liệu

chứa nhiều alkaloid. Từ dừa cạn người ta chiết được các chất chữa ung thư như
vinblastin, vincristin và chữa cao huyết áp như ajmalicin, serpentin. Tuy nhiên,
hàm lượng của những chất này trong cây tự nhiên rất thấp. Bùi Văn Lệ và
Nguyễn Ngọc Hồng (2006) đã nghiên cứu khảo sát sơ bộ ảnh hưởng của một số
chất kích thích sinh trưởng lên q trình tạo sinh khối tế bào và tích lũy alkaloid
tồn phần có trong dịch ni cấy.
Cây đinh lăng (Polyscias fruticosa) là một loài thực vật chứa nhiều
saponin. Phạm Thị Tố Liên và Võ Thị Bạch Mai (2007) đã tạo callus từ các mẫu
cây con trên môi trường MS bổ sung 2 mg/L 2,4-D. Callus tạo thành sau 14 tuần
được chuyển sang nuôi cấy trên môi trường lỏng bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D và 20%
nước dừa để thu sinh khối và chiết rút saponin.
Sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis) có tác dụng phòng chống ung thư,
bảo vệ tế bào gan, kích thích hệ miễn dịch, chống stress và trầm cảm, chống oxy
hóa, lão hóa. Thanh et al. (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần môi
trường lên sản xuất sinh khối và ginsenoside trong nuôi cây huyền phù tế bào cây
sâm Ngọc Linh. Kết quả cho thấy, môi trường ½MS và MS thích hợp cho cả sản
xuất sinh khối cũng như ginsenoside, sinh khối và ginsenoside đạt lần lượt là 9,8
g/L và 6,81 mg/g khối lượng khô. Nồng độ sucrose tăng từ 20-50 g/L đã tăng sản
xuất sinh khối, tuy nhiên khi sucrose tăng đến 70 g/L thì ức chế cả sinh trưởng và
tích lũy ginsenoside của tế bào. Nồng độ nitrogen thích hợp cho cả sinh trưởng
và tích lũy ginsenoside là 30 mM.
Củ cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) có chứa các hoạt chất sinh
học chủ yếu là curcumin, terpenoid và tinh dầu. Các nghiên cứu cho thấy,
curcumin có khả năng chống được sự phát sinh khối u; một số dạng ung thư ở
chuột như ung thư ruột kết, ung thư dạ dày, ung thư vú và ung thư buồng trứng .
Võ Châu Tuấn và cs. (2014) đã nghiên cứu thiết lập các điều kiện và môi trường

6

ni cấy thích hợp để sản xuất nhanh sinh khối tế bào, đồng thời xác định được
khả năng tích lũy và hoạt tính sinh học một số hợp chất trong tế bào nghệ đen
nuôi cấy huyền phù trong hệ lên men 10 L.Kết quả cho thấy môi trường cơ bản
MS có 20 g/L sucrose, 0,8% agar, bổ sung thêm 0,5 mg/L BA và 0,5 mg/L 2,4-D
thích hợp cho ni cấy callus từ bẹ lá cây nghệ đen in vitro. Môi trường cơ bản
MS có 30 g/L sucrose, bổ sung thêm 0,5 mg/L BA và 1,5 mg/L 2,4-D, tốc độ
khuấy 150 vịng/phút, tốc độ sục khí 2,5 L/phút thích hợp cho sinh trưởng của tế
bào nghệ đen trong hệ lên men 10 L. Sinh khối đạt cực đại là 603 g tươi (53,25 g
khô) sau 14 ngày nuôi cấy với cỡ mẫu là 200 g. Hàm lượng tinh dầu trong tế bào
đạt cao nhất là 2,57% khối lượng khô sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 1,6 lần
tinh dầu ở củ cây nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi. Hàm lượng curcumin trong tế
bào đạt cao nhất là 1,16% sau 14 ngày nuôi cấy, gấp khoảng 2,7 lần curcumin ở
củ cây nghệ đen tự nhiên 1 năm tuổi.
2.1.4.2. Các nghiên cứu ngoài nước
Rễ của cây nhân sâm (Panax ginseng) là một loại dược phẩm quý giá, có
tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể... Trong
rễ của nó chứa nhiều loại saponin và sapogenin khác nhau. Trong đó,
ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, cịn Rg có hoạt tính kích thích. Furuya et al.
(Đại học Kitasato, Nhật) đã nghiên cứu nuôi cấy mô callus Panax ginseng từ
những năm 1970. Kaisha (1990) đã nghiên cứu quy trình sản xuất trên quy mô
lớn, sử dụng nhiều kiểu hệ lên men khác nhau. Năm 1990, Staba (Đại học
Minnesota, Mỹ) cũng đã thu được các tế bào nuôi cấy Panax ginseng chứa
ginsenoside. Choi (1993) đã nghiên cứu nuôi cấy Panax ginseng trên quy mô
công nghiệp, tác giả nhận thấy 2,4-D và KIN ảnh hưởng tới hàm lượng saponin
trong callus và các tế bào nuôi cấy huyền phù; 3,62% saponin tổng số được tìm
thấy trong callus ni cấy trên mơi trường cơ bản MS bổ sung 5,00 mg/L 2,4-D
và 1,00 mg/L KIN, nhưng lại thu được 8,78% khi nuôi cấy trên mơi trường có
10,00 mg/L 2,4-D và 1,00 mg/L KIN (Misawa, 1994).
Callus Taxus mairei được tạo ra từ mảnh lá và thân trên môi trường B5 bổ
sung 2 mg/L 2,4-D hoặc NAA. Dịng tế bào được tạo ra từ callus có nguồn gốc từ

thân và lá. Một trong những dòng tế bào này sau khi bổ sung các tiền chất và
nuôi trong 6 tuần thì cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ sản xuất khoảng 200 mg
taxol (Mulabagal and Tsay, 2004).

7


Với việc sử dụng chất kích kháng polysaccharide của nấm men, Sarin
(2005) đã thành công trong việc sản xuất với mức tương đối cao của berberine
trong nuôi cấy tế bào cây Thalictrum rugosum. Ảnh hưởng của permidine lên sản
xuất berberine trong nuôi cấy tế bào cây Thalictrum minus cũng đã được công bố
bởi Hara et al. (1993).
2.2. ỨNG DỤNG CHẤT KÍCH ỨNG ĐỂ CẢI THIỆN TÍCH LŨY HỢP
CHẤT THỨ CẤP TRONG NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT
2.2.1. Giới thiệu về chất kích ứng
Chất kích ứng (elicitor) được định nghĩa là một chất mà khi đưa với nồng
độ nhỏ vào hệ thống tế bào sống thì khởi động hoặc cải thiện sự sinh tổng hợp
các HCTC trong tế bào. Sự kích kháng thực vật là quá trình cảm ứng hoặc tăng
cường sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp do sự bổ sung theo hàm lượng
của elicitor (Namdeo, 2007). Trên cơ sở bản chất tự nhiên, elicitor có thể được
phân thành 2 nhóm là: elicitor phi sinh học và elicitor sinh học.
- Elicitor phi sinh học là các chất có nguồn gốc không thuộc sinh vật học,
gồm các muối vô cơ, các kim loại nặng và các tác nhân vật lý như sóng siêu âm,
áp suất, nhiệt độ, và pH.
- Elcitor sinh học là các chất có nguồn gốc sinh vật học, bao gồm các
polysacharide có nguồn gốc từ thành tế bào thực vật (pectin hoặc cellulose), các
vi sinh vật (chitin hoặc glucan) và các glycoprotein, G-protein hay các protein
nội bào có chức năng là gắn với các receptor và tác động bằng cách hoạt hóa
hoặc bất hoạt một số enzyme hoặc các kênh ion.
Ngồi ra, có thể phân loại elicitor dựa trên nguồn gốc của chúng. Có 2 loại

elicitor là elicitor ngoại sinh và elicitor nội sinh
- Elicitor ngoại sinh là các chất có nguồn gốc bên ngồi tế bào như các
polysaccharide, polyamine và các acid béo.
- Elicitor nội sinh là các chất có nguồn gốc bên trong tế bào, được hình
thành thơng qua các phản ứng thứ cấp, được cảm ứng bằng tín hiệu sinh học hay
phi sinh học, chẳng hạn như galacturonide hoặc hepta-β-glucoside v.v...
(Namdeo, 2007).
2.2.2. Cơ chế tác động
Elicitor thực vật là các hóa chất có nguồn gốc khác nhau, có khả năng gây

8


nên các đáp ứng về mặt hình thái, sinh lý và tích lũy phytoalexin (chất được sinh
ra ở thực vật khi chịu tác động của các tác nhân gây bệnh). Việc thực vật bị xử lý
bằng chất kích ứng hoặc bị tấn công bằng mầm bệnh gây ra một loạt các phản
ứng phịng vệ, bao gồm sự tích lũy các HCTC bảo vệ ở cả trong cây tự nhiên
cũng như trong ni cấy in vitro. Mặc dù đã có những nghiên cứu sâu về cơ chế
ảnh hưởng của elicitor lên sự sản xuất HCTC trong các thực vật, tuy nhiên cơ chế
tác động của elicitor vẫn chưa được hiểu đầy đủ. Có nhiều giả thuyết đã được
đưa ra như cơ chế truyền tin bởi Ca2+, các yếu tố ảnh hưởng đến sự nguyên vẹn
của màng tế bào, các con đường ức chế hay hoạt hóa nội bào hoặc sự thay đổi áp
suất thẩm thấu (Namdeo, 2007).
Những nghiên cứu bước đầu về sự tác động của các elicitor sinh học ở hệ
thống thực vật được nghiên cứu dựa vào cơ chế cảm ứng trên tế bào động vật. Ở
tế bào động vật, các thụ quan (receptor) định vị ở màng tế bào sẽ hoạt hóa kênh
ion và protein kinase. Tương tự như thế, các bằng chứng chứng minh sự hiện
diện của các thụ quan ở màng tế bào thực vật đã được ghi nhận. Cơ chế cảm ứng
này dựa trên sự tương tác giữa elicitor-thụ quan. Khi tế bào thực vật được xử lý
với elicitor thì một loạt các phản ứng sinh hóa xảy ra, bao gồm:

- Elicitor gắn vào thụ quan ở màng tế bào.
- Thay đổi dòng ion vào thông qua màng tế bào thực vật như kênh Cl- ,
K+ , …, ở thực vật, Ca2+ hoạt động như chất truyền tin thứ hai với các đáp
ứng khác nhau từ tín hiệu của mơi trường kể cả mầm bệnh. Ví dụ, ở tế bào cây
ngị tây, người ta từng phát hiện ra kênh canxi đáp ứng cảm ứng và một kênh
vận chuyển vào của calci được tìm thấy trong vòng vài phút sau khi thêm vào
elicitor từ nấm.
- Gia tăng hoạt tính của phospholipase thực vật được tìm thấy ở một vài
mô thực vật và nuôi cấy tế bào thực vật sau khi xử lý với elicitor, tổng hợp các
tín hiệu thứ cấp như InsP3 và deacylglycerol (DAG), giải phóng tín hiệu nội bào
trung gian Ca2+, nitric oxyde và con đường tín hiệu octadecanoid.
- Sự thay đổi nhanh trong việc phosphoryl hóa protein được quan sát dựa
trên việc bổ sung elicitor của các nuôi cấy tế bào khác nhau. Những nghiên cứu
gần đây chứng minh rằng sự phosphoryl hóa đóng một vai trị quan trọng trong sự
chuyển tín hiệu thực vật chống lại mầm bệnh và stress, hoạt hóa protein kinase.
- Hoạt hóa protein G (là một phần trong việc đáp ng tín hiệu với elicitor).

9


- Hoạt hóa NADPH oxydase đáp ứng AOS (active oxide specie), acid
hóa cytosol.
- Tái sắp xếp lại bộ xương tế bào.
- Tạo các oxy hoạt động.
- Tích lũy các protein có liên quan đến mầm bệnh như chitinase và
glucanase, endopolygalacturonase… các nhân tố ngăn cản protease.
- Sự chết tế bào ở vị trí bị xâm nhiễm.
- Sự thay đổi cấu trúc ở màng tế bào (lignin hóa màng tế bào, tích tụ mơ sẹo).
- Hoạt hóa phiên mã các gen đáp ứng kháng.
- Các phân tử đề kháng của thực vật như tanin, phytoalexin được phát hiện

2- 4 giờ sau khi xử lý với elicitor.
- Tổng hợp jasmonic và acid salicylic như một thông tin thứ cấp.
- Đáp ứng tập nhiễm SAR (systemic acquired resistance). Không phải tất
cả các elicitor đều diễn ra theo chuỗi sự kiện phía trên, những nghiên cứu về trật
tự thời gian của những sự kiện này và sự kết nối bên trong giữa chúng còn nhiều
phức tạp và vẫn đang được nghiên cứu (Angelova et al., 2006).
2.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng chất kích ứng trong nuôi cấy tế bào thực vật
Lê Thị Thủy Tiên và cs. (2010) nghiên cứu ảnh hưởng metheyl jasmonate
đến tích lũy taxol trong mơ sẹo và dịch treo tế bào hình thành từ sự phân chia của
các tế bào nhu mô vỏ thân cây thông đỏ Lâm Đồng Taxus wallichiana Zucc. Kết
quả cho thấy methyl jasmonate hầu như không ảnh hưởng ñến sự tăng trưởng của
dịch treo tế bào. Tuy nhiên, hàm lượng taxol trong dịch treo tế bào tăng cao khi
methyl jasmonate được bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Hàm lượng taxol cao
nhất trong tế bào dịch treo với methyl jasmonate 10 mg/l là 0,74 mg/l.
Loc và Giang (2012) nghiên cứu ảnh hưởng của 2-hydroxybenzoic acid và
dịch chiết nấm men đến việc tăng khả năng sinh tổng hợp asiaticoside trong nuôi
cấy tế bào cây rau má (Centella asiatica). Kết quả nhận thấy khi bổ sung ở ngày
thứ 10 của ni cấy lần lượt 100 µM 2-hydroxybenzoic acid và 4 g/L dịch chiết
nấm men, hàm lượng asiaticoside tích lũy trong tế bào rau má tăng gấp 5 và 3,5 lần
so với đối chứng không cảm ứng.
Nuôi cấy tế bào huyền phù cây nghệ đen (Curcuma zedoaria Roscoe) có
bổ sung chất kích kháng là biện pháp có nhiều triển vọng trong việc tăng hiệu
quả sản xuất cucumin. Trần Vũ Ngọc Thi (2014) nghiên cứu bước đầu cho thấy

10