Nghiên cứu thu nhận enzyme α amylase từ trực khuẩn bacillus subtilis

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
BAN ðÀO TẠO SAU ðẠI HỌC
------

------

TRƯƠNG THỊ NGUYỆT

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME α - AMYLASE TỪ TRỰC
KHUẨN Bacillus subtilis.

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học
Mã số

: 60.42.02.01

Giảng viên hướng dẫn : 1. PGS.TS. LƯƠNG ðỨC PHẨM
2. TS. NGUYỄN VĂN GIANG

HÀ NỘI - 2013


LỜI CAM ðOAN
Tơi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là
hoàn toàn trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
Tơi xin cam đoan mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn ñã
ñược cảm ơn và các thơng tin trích dẫn luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc.
Tác giả luận văn

Trương Thị Nguyệt

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

i


LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tơi đã nhận được sự hướng dẫn,
giúp đỡ và góp ý nhiệt tình của q thầy cơ cùng tồn thể cán bộ bộ môn Sinh
học phân tử và Công nghệ vi sinh – khoa Công nghệ Sinh học – Trường ñại
học Nông nghiệp Hà Nội
Trước hết, tôi xin chân thành cảm ơn đến q thầy cơ trường Trường
đại học Nơng nghiệp Hà Nội, đặc biệt là những thầy cơ đã tận tình dạy bảo
cho tơi suốt thời gian học tập tại trường.
Tơi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến thầy giáo PGS.TS. Lương ðức Phẩm
và TS. Nguyễn Văn Giang ñã dành rất nhiều thời gian và tâm huyết hướng
dẫn nghiên cứu và giúp tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành
cảm ơn tới cùng các thầy cơ trong bộ mơn, các bạn sinh viên, gia đình và bạn
bè đã tạo rất nhiều điều kiện để tơi học tập và hoàn thành tốt luận văn tốt
nghiệp này.
Mặc dù tơi đã có nhiều cố gắng hồn thiện luận văn bằng tất cả sự nhiệt
tình và năng lực của mình, tuy nhiên khơng thể tránh khỏi những thiếu sót, rất
mong nhận được những đóng góp q báu của q thầy cô và các bạn.
Hà Nội, Ngày 24 tháng 06 năm 2013
Học viên

Trương Thị Nguyệt

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

ii


MỤC LỤC
Lời cam ñoan
Lời cảm ơn

i
ii

Mục lục

iii

Danh mục các chữ viết tắt

vii

Danh mục bảng

viii

Danh mục hình

ix

Danh mục biểu đồ

x

1

MỞ ðẦU

1

1.1

ðặt vấn ñề

1

1.2.

Nội dung ñề tài

2

2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1

Vi khuẩn Bacillus subtilis

3

2.1.1 ðặc ñiểm chung vi khuẩn Bacillus

3

2.1.2 Vi khuẩn Bacillus subtilis

4

2.1.3 Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên

8

2.2

Enzyme α - amylase

10

2.2.1 Cấu tạo α - amylase

10

2.2.2 Tính chất

11

2.2.3 Cơ chế xúc tác

12

2.2.4

14

Nguồn thu nhận enzyme α - amylase

2.2.5 Một số yếu tố ảnh hưởng ñến sinh tổng hợp α - amylase của vi
sinh vật

16

2.2.6 Tách và làm sạch enzyme

18

2.2.7 Ứng dụng enzyme α - amylase

18

3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

21

3.1

Vật liệu

21

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

iii


3.1.1 ðối tượng

21

3.1.2 Thiết bị và dụng cụ

21

3.1.3 Hóa chất

21

3.2

Các mơi trường được sử dụng

21

3.2.1 Mơi trường phân lập và nuôi Bacillus

21

3.2.2 Môi trường cảm ứng sinh tổng hợp amylase của Bacillus

22

3.2.3 Mơi trường thử hoạt tính amylase

22

3.3

22

Các phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp phân lập các chủng Bacillus từ ñất vườn qua
trung gian cỏ khô

22

3.3.2 Phương pháp giữ giống cấy chuyền

22

3.3.3 Phương pháp nuôi cấy bề sâu

23

3.3.4 Một số phương pháp nghiên cứu ñặc ñiểm sinh học của Bacillus 23
3.3.5 Thử các phản ứng sinh hố

26

3.3.6 Phương pháp đếm khuẩn lạc

29

3.3.7 Phương pháp ño ñộ ñục

29

3.3.8 Phương pháp xác ñịnh sự sinh trưởng của vi khuẩn theo mật ñộ
quang

30

3.3.9 Phương pháp nghiên cứu khả năng phân hủy tinh bột.

30

3.3.10 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase theo Heinkel, 1956

31

3.3.11 Phương pháp nghiên cứu xác ñịnh ñiều kiện ni cấy tối ưu

33

3.3.12 Phương pháp nhiên cứu động học

34

3.3.13 Phương pháp thu dịch chiết enzyme thô từ môi trường nuôi cấy 35
3.3.14 Phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme amylase từ dịch chiết
enzyme thô bằng các tác nhân kết tủa

35

3.3.15 Xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase của chế phẩm enzyme thu ñược
từ các tác nhân tủa

37

3.3.16 Xác ñịnh ñộ bền α - amylase thủy phân nguyên liệu nếp trắng. 37
3.3.17 Xác ñịnh ñường khử theo phương pháp acid initrosalicylic(DNS) 39
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

iv


4.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1

Phân lập và tuyển chọn các chủng trực khuẩn có hoạt tính
amylase cao

4.2

41
41

Xác định sự sinh trưởng và hoạt ñộ α - amylase của 3 chủng
LB ñã chọn

46

4.2.1 Xác ñịnh sự sinh trưởng của 3 chủng LB

46

4.2.2 Xác ñịnh hoạt ñộ α - amylase của 3 chủng LB

47

4.3

47

Một số ñặc ñiểm sinh học của chủng LB3

4.3.1 ðặc điểm hình thái tế bào chủng LB3

47

4.3.3 Khả năng hình thành bào tử của chủng LB3

48

4.3.4 Nghiên cứu khả năng sinh enzyme catalase

49

4.4

Khảo sát các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn LB3

50

4.5

Nghiên cứu các ñiều kiện ảnh hưởng tới khả năng sinh tổng
hợp α – amylase của chủng B. subtilis LB3.

51

4.5.1 Loại cơ chất

51

4.5.2 Ảnh hưởng nồng ñộ tinh bột tan.

53

4.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ.

53

4.4.4 Ảnh hưởng của pH ban ñầu

54

4.4.6 Ảnh hưởng của các loại muối.

55

4.4.7 Nồng ñộ NaCl cao nhất ức chế sinh trưởng.

56

4.5

Nghiên cứu ñộng học của quá trình lên men trong bình tam
giác 1 lít.

4.6

58

Tách enzyme từ dịch ni cấy, xác định hoạt ñộ và ñộ bền của
enzyme.

4.6.1 Tách enzyme từ dịch nuôi cấy với các tác nhân tủa khác nhau.

59
59

4.6.2 Hoạt ñộ α – amylase của CPE amylase thu ñược bởi các tác
nhân kết tủa.

59

4.6.3 Xác định nhiệt độ tối thích của α - amylase

60

4.6.4 Xác định pH tối thích của α - amylase

61

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

v


4.7 Thử nghiệm khả năng thủy phân enzyme α – amylase trên nguyên liệu gạo
nếp trắng.

62

5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

64

5.1

Kết luận

64

5.2

Kiến nghị

64

TÀI LIỆU THAM KHẢO

65

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

vi


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

B.

:

Bacillus

CPE

:

Chế phẩm enzyme

OD

:

Giá trị mật ñộ quang

dOD

:

Hiệu số giá trị mật ñộ quang

v/p

:

Vòng/phút

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

vii


DANH MỤC BẢNG

STT

Tên bảng

Trang

2.1

Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis

2.2

ðộ bền nhiệt của - amylase từ các nguồn khác nhau

12

3.1

ðặc điểm hình thái khuẩn lạc các chủng phân lập

41

3.2

ðặc điểm tế bào của khuẩn lạc ni cấy trên mơi trường

44

3.3

ðường kính vịng phân giải tinh bột của 3 chủng LB

45

3.4

So sánh hoạt ñộ α - amylase của 3 chủng LB

47

3.3

Tóm tắt một số đặc điểm của chủng LB3

49

3.4

Các phản ứng sinh hoá của LB3

50

3.5

Sự sinh trưởng của chủng LB3 trên các loại cơ chất

51

3.6

Nồng ñộ tinh bột tan ảnh hưởng ñến hoạt ñộ α - amylase

53

3.7

Ảnh hưởng của nồng ñộ muối NaCl ñến hoạt ñộ α - amylase

56

3.8

Ảnh hưởng của nồng ñộ muối CaCl2 ñến hoạt ñộ α - amylase

58

3.9

Hiệu suất thu nhận CPE α - amylase từ các tác nhân tủa

59

3.10

Hoạt ñộ α – amylase thu ñược bởi các tác nhân kết tủa

60

3.11

Nhiệt độ tối thích của CPE α - amylase

60

3.12

pH tối thích của CPE α - amylase

61

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

6

viii


DANH MỤC HÌNH

STT

Tên hình

Trang

2.1

Tế bào Bacillus subtilis....................................................................... 5

2.2

Cấu trúc khơng gian của α - amylase. ............................................... 11

2.3

Vị trí cắt của α - amylase trên phân tử tinh bột ................................. 14

4.1

Vòng phân giải tinh bột của 3 chủng LB3, LB4, LB8....................... 47

4.2

Hình thái tế bào chủng LB3 .............................................................. 48

4.3

Bào tử của chủng LB3 ...................................................................... 48

4.4

Hình ảnh thử catalase của chủng LB3............................................... 49

4.5

Một số phản ứng sinh hóa của chủng LB3 ........................................ 51

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

ix


DANH MỤC BIỂU ðỒ

STT

Tên biểu ñồ

Trang

3.1

Sự sinh trưởng của 3 chủng LB phân lập .......................................... 46

3.2

Ảnh hưởng loại cơ chất ñến hoạt ñộ α – amylase.............................. 52

3.3

Nhiệt ñộ ảnh hưởng ñến hoạt ñộ α - amylase ................................... 54

3.4

Ảnh hưởng pH ban ñầu ñến hoạt ñộ α - amylase.............................. 55

3.5

Nồng ñộ NaCl cao nhất ức chế sinh trưởng....................................... 57

3.6

ðộng học quá trình ni cấy B. subtilis LB3 sinh

α - amylase ....................................................................................... 59

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

x


1. MỞ ðẦU
1.1. ðặt vấn ñề
Vi sinh vật trong tự nhiên rất ña dạng và phong phú. Ngày nay vi sinh
vật mang lại cho con người nguồn lợi to lớn trong các lĩnh vực công nghiệp,
nông nghiệp, công nghệ sinh học… Các chủng vi sinh vật nói chung và vi
khuẩn Bacillus nói riêng đang được ứng dụng rộng rãi trong các ngành sản
xuất là nhờ khả năng sinh các loại enzyme thủy phân của chúng.
Enzyme là những chất xúc tác sinh học có hiệu suất xúc tác cao, đang
ngày càng ñược áp dụng rộng rãi trong thực tế với quy mơ ngày càng lớn.
Ngày nay α - amylase là nhóm enzyme được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh
vực cơng nghiệp như sản xuất rượu, bia, ñường glucose, lên men bánh mỳ,
làm thức ăn gia súc …Với khả năng ứng dụng rộng rãi như vậy nên nhu cầu
chế phẩm enzyme này hiện nay rất lớn (ðồng Thị Thanh Thu, 2004).
Amylase có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như vi
khuẩn, nấm mốc, thực vật và ñộng vật. Tuy nhiên, các chế phẩm α - amylase
thương mại ñược ứng dụng nhiều trong cơng nghiệp chủ yếu được sản xuất từ
Bacillus sp... ðã có nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu thu
nhận chế phẩm α - amylase từ Bacillus sp. Dharani Aiyer (2004) đã cơng bố
việc sản xuất α - amylase bởi B. licheniform. B. subtilis là lồi có tiềm năng
lớn về các enzyme ngoại bào. Nhiều trong số các enzyme ngoại bào này là
những enzyme thủy phân các phân tử hữu cơ lớn như amylase,
protease....Nguồn enzyme α - amylase sử dụng trong nước ta hiện nay chủ
yếu nhập khẩu của hãng NOVO ðan Mạch. Vấn ñề thu nhận và tinh sạch

enzyme α - amylase từ các lồi B. subtilis chưa được quan tâm đúng mức.
Có thể ứng dụng enzyme α - amylase sinh tổng hợp bởi lồi này sẽ làm giảm
đáng kể chi phí sản xuất.
Xuất phát từ thực tế đó chúng tơi đã tiến hành nghiên cứu đề tài "Nghiên
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

1


cứu thu nhận enzyme α - amylase từ Bacillus subtilis”.
1.2.

Nội dung ñề tài
1. Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn Bacillus từ đất có hoạt

tính amylase mạnh.
2. Xác ñịnh sinh trưởng, sinh tổng hợp enzyme α - amylase của các
chủng tuyển chọn.
3. Nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh học của chủng tuyển chọn.
4. Nghiên cứu một số ñặc ñiểm sinh hóa của chủng tuyển chọn.
5. Khảo sát các điều kiện ni cấy tối ưu để thu được dịch enzyme
α - amylase có hoạt độ cao.
5. Tách chiết enzyme α – amylase từ dịch lên men, nghiên cứu ñộ nhiệt
ñộ và pH tối thích của enzyme α – amylase.
6. Thử nghiệm khả năng thủy phân tinh bột của enzyme α – amylase
thu nhận trên nguyên liệu gạo nếp trắng.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

2

2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1. ðặc ñiểm chung vi khuẩn Bacillus
Bacillus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước, khơng khí do
chúng có khả năng hình thành bào tử và sống hiếu khí tùy tiện. Phần lớn các
chủng thuộc các loài của giống này ñều có khả năng sinh ra nhiều amylase và
protease kiềm, có một số chủng sinh ra cenlulase.
Bacillus là vi khuẩn Gram dương, hình que có kích thước khác nhau
(0,5-2,5) x (l,2-10) µm. Bacillus có chùm tiêm mao giúp chúng có khả năng
di động. Chúng sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện. Bacillus là vi khuẩn dị
dưỡng hóa năng, hoại sinh thu năng lượng nhờ oxi hóa các hợp chất hữu cơ,
chúng sống hiếu khí hay hiếu khí tùy tiện.
Bacillus có khả năng sinh bào tử. Thơng thường bào tử ñược tạo ra khi tế
bào ñã trải qua giai ñoạn phát triển mạnh nhất, hay do cạn kiệt chất dinh dưỡng.
Mỗi tế bào dinh dưỡng sinh ra một bào tử. Khi bào tử trưởng thành tế bào dinh
dưỡng tự phân giải, bào tử được giải phóng ra khỏi tế bào mẹ. Các tế bào
Bacillus ñặc trưng là sinh bào tử mà vẫn giữ hình dáng trực khuẩn khi mang bào
tử, trong một số trường hợp tế bào vi khuẩn chỉ phình to một ít khi chứa bào tử.
Tùy lồi mà bào tử có thể nằm chính tâm, lệch tâm hay gần đầu tế bào.
Bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia tử ngoại, phóng xạ và nhiều độc
tố, vì chúng có khả năng tồn tại ở trạng thái bào tử trong nhiều năm. Bào tử
của vi khuẩn không phải là một hình thức sinh sản mà chúng chỉ là một
hình thức thích nghi để giúp vi khuẩn vượt qua những ñiều kiện sống bất
lợi của môi trường. Bào tử ở dạng tự do khơng có q trình trao đổi chất,
khi gặp ñiều kện thuận lợi mỗi bào tử cho ra một tế bào sinh dưỡng
(www.answers.com/ topic/bacillus-1).
ða số Bacillus sinh trưởng tốt ở pH = 7, một số Bacillus phù hợp với
pH = 9 - 10 như B. alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH = 2 - 6 như

B. acidocaldrius.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

3


Nhiều chủng Bacillus ưa nhiệt ñộ cao (45°C - 75°C), hay ưa lạnh
(5°C - 25°C), nhưng thường gặp Bacillus sống ở nhiệt độ 34°C - 37°C.
Hầu hết Bacillus khơng gây bệnh cho người và ñộng vật. Một số loại gây
bệnh cho côn trùng như B.thuringiensis, B.polliae, B. lentimorrbus, B. cereus,
B. antharacis…đa số trong tự nhiên là có ích ( />Vi khuẩn thuộc chủng Bacillus có tiềm năng lớn về các enzyme ngoại
bào. Nhiều trong số các enzyme ngoại bào này là những enzyme thủy phân
các phân tử hữu cơ lớn như amylase, protease.... Vi khuẩn thuộc chi Bacillus
ñã, ñang và ngày càng trở thành những vi sinh vật hàng ñầu về mặt ứng dụng.
Các ứng dụng của chúng bao gồm hàng loạt lĩnh vực từ sản xuất thực phẩm
thủ công truyền thống đến cơng nghệ lên men hiện đại đến sinh học phân tử, y
– dược học, mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc từ các phế liệu.
2.1.2. Vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1.1. Lịch sử phát triển
B. subtilis ñược phát hiện lần ñầu tiên trong phân ngựa bởi Tổ chức y
học Nazi của ðức (1941). Lúc ñầu, chủ yếu được sử dụng để phịng bệnh lị
cho các bệnh nhân ðức chiến ñấu ở Bắc Phi.
Việc sử dụng ñể ñiều trị bệnh ñược áp dụng những năm 1949 - 1957
khi Henry, Albot và các cộng sự tách ñược các chủng thuần khiết của
B. subtilis. Từ đó, “subtilistherapie” có nghĩa là thuốc subtilin ra ñời trị các
chứng viêm ruột, viêm ñại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá.
Ngày nay, vi khuẩn B. subtilis ñược sử dụng rộng rãi trong chăn ni, y học,
thực phẩm….(www.biol.lu.se/cellorgbiol/ membprot/pop_sv.html).
2.1.1.2. ðặc điểm phân loại
Theo khoá phân loại của Bergey, vi khuẩn B. subtilis thuộc

Bộ:

Eubacteriales

Họ:

Bacillaceae

Giống: Bacillus
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

4


Lồi:

B. subtilis

2.1.1.3. ðặc điểm phân bố
Vi khuẩn B. subtilis thuộc nhóm vi sinh vật bắt buộc ở đường ruột, chúng
được phân bố hầu hết trong tự nhiên như: cỏ khô, bụi, ñất nước….
Phần lớn chúng tồn tại ở trong ñất, thơng thường đất trồng trọt
chứa khoảng 10 - 100 triệu CFU/g. ðất nghèo dinh dưỡng ở sa mạc, đất
hoang thì B. subtilis rất hiếm. Nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển
có sự tồn tại của bào tử và tế bào sinh dưỡng B. subtilis
(.www.microscopyconsulting.com/ Gallery/pages)
2.1.1.4. ðặc ñiểm hình thái
B. subtilis là trực khuẩn, Gram (+), có khả năng sinh catalase, hiếu khí
hay hiếu khí tùy tiện, thường được tìm thấy trong đất, cỏ khơ. Có khả năng di
động, sinh nội bào tử. Tế bào sinh dưỡng có dạng hình que, kích thước chiều

rộng từ 0,7 – 0,8 µm, chiều dài từ 2,0 – 3,0 µm, không kết thành chuỗi, bắt
phẩm nhuộm đồng đều, khơng tạo bao nang.

Hình 2.1. Tế bào Bacillus subtilis
(URL: />
Một trong những ñặc ñiểm quan trọng của B. subtilis là khả năng tạo bào
tử trong những điều kiện nhất định. B. subtilis có khả năng hình thành bào tử
trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi vi khuẩn gặp ñiều kiện bất lợi như
dinh dưỡng trong mơi trường bị kiệt quệ, nhiệt độ q cao…(Tơ Minh Châu,
2000). Bào tử B. subilis có dạng ellip đến hình cầu, kích thước chiều rộng
0,6 - 0,9 µm, chiều dài 1,0 – 1,5 µm, nằm giữa hay trong khoảng trung tâm đến
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
5


gần cuối tế bào, phần lớn ñược tạo thành sau 48 giờ. Mỗi cá thể chỉ tạo một bào
tử, bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn, chất hút ẩm.
Khi nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa khuẩn lạc trịn, khơng đều hay
phân tán. ðường kính khuẩn lạc từ 3 – 5 mm, màu trắng đục hoặc vàng xám,
rìa có hình răng cưa. Sau1 – 4 ngày bề mặt khuẩn lạc nhăn, màu hơi nâu.
2.1.1.5. ðặc điểm sinh hố
Trong mơi trường lỏng sinh khối tạo màng mỏng có lớp bao phủ. Do
bào tử chịu nhiệt cao nên B. subtilis có thể gây hư hỏng một số thực phẩm
hộp tạo mùi vị khó chịu. B. subtilis sinh acid từ xylose, arabinose, glucose,
sucrose và mannitol nhưng không tạo khí (sử dụng nguồn nitơ là muối
amonium). Có khả năng phân giải nitrate, sinh nitrit từ nitrate. Trong ñiều
kiện kỵ khí, khơng sinh khí từ mơi trường lỏng chứa nitrate.
Bảng 2.1. Một số phản ứng sinh hoá của B. subtilis
Phản ứng sinh hóa

Kết quả

Sinh Indol

-

MR

+

VP

+

Sử dụng citrate

+

Khử Nitrate

+

Saccharose

+

Mannitol

+

Glucose

+

Lactose

-

Maltose

+

(Nguyễn Lân Dũng, 1976).

Nhiệt độ tối thích của B. subtilis vào khoảng 36 – 50 oC. Nhiều lồi
vẫn phát triển được ở 60oC. Nồng ñộ muối ăn làm ngừng phát triển là
10 – 15% (Lương ðức Phẩm, 2010).
B. subtilis có tập tính “ăn lẫn nhau” (cannibalism). Chúng dùng cách
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

6


này như một phương pháp đơn giản để thốt khỏi những trường hợp điều
kiện sống giới hạn. B. subtilis có khả năng sinh tổng hợp hơn 20 loại
kháng sinh khác nhau như: subtilin, subtilosin A, sublancin, chlorotetain,
mycobacillin, rhizocticins, bacillanene, difficidin…
B. subtilis phân bố trong ñất, các chất hữu cơ bị phân hủy và là một
ñối tượng dùng trong nghiên cứu khả năng lây bệnh trong phịng thí
nghiệm. B. subtilis khơng ñược xem là mầm bệnh gây bệnh cho người.

Chúng thường có trong thực phẩm nhưng hiếm khi gây ngộ độc thực phẩm
(www.foodnews.ch/ Begriffsglossar_B.html ).
2.1.1.6 Ứng dụng của B. subtilis
Trong công nghiệp sản xuất amino acid, thức ăn gia súc, B. subtilis là
một trong những chủng vi sinh vật tổng hợp lysine có hàm lượng khá lớn
(15-20%) từ tinh bột.
Trong y dược, B. subtilis được đóng thành ống thuốc Subtilis 10 ml
trị bệnh tiêu chảy cho trẻ em do vi khuẩn Coliform gây ra, bệnh dường ruột
do lị trực tràng, ñắp các vết thương lở lt ngồi da.
B. subtilis được dùng sản xuất các kháng sinh thực vật, ứng dụng trong
phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoctonia solani, Fusarium sp,
Pylicularia oryzae,... Người ta thấy rằng sự phát triển của B. subtilis trong
cây làm tăng khả năng tổng hợp các peptide kháng nấm của vi khuẩn nốt rễ
(Rhizobacterium). Khả năng này được ứng dụng trong kiểm sốt sinh học.
B.subtilis ñược ứng dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học (probiotic)
bổ sung trong thức ăn nhằm cải thiện tiêu hóa, sức tăng trưởng; giảm sự tái
phát bệnh tiêu chảy trên gia súc; bổ sung vào ao ni nhằm duy trì chất lượng
nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi.
Hệ enzyme của B. subtilis ñược sử dụng nhiều trong sản xuất chất tẩy
rửa. Chúng có thể biến đổi các dạng chất thải độc hại thành những dạng hợp
chất vơ hại của nitrogen, carbon dioxide, và nước.
Một chủng B. subtilis ñược biết trước ñây là B. natto ñược dùng trong
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

7


sản xuất thực phẩm thương mại của Nhật tương tự như thực phẩm
cheonggukjang của Hàn Quốc.
B. subtilis

tái

tổ hợp ñược

sử dụng

trong

sản xuất

polyhydroxyalkanoates (PHA) và chúng có thể sử dụng malt phế thải như là
nguồn cacbon, nhờ vậy chi phí sản xuất PHA giảm.
2.1.3. Một số Bacillus thường gặp trong tự nhiên
2.1.3.1. Bacillus mesentericus
B. mesentericus cịn được gọi là trực khuẩn khoai tây do chúng có mặt
chủ yếu trên khoai tây. Chúng gần giống B. subtilis, khuẩn lạc ăn sâu và bám
chặt vào môi trường thạch, bề mặt nhăn, khô, không mọc lan ra môi trường,
màu xám nhạt – trắng, hoặc hơi vàng nâu, hoặc hồng như B. rubber hoặc ñen
như B. niger.
B. mesentericus sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở nhiệt ñộ 36 - 45
o

C, tối ña 50 – 55 oC, pH = 4,5 - 5 thì ngừng phát triển. B. mesentericus có

hoạt tính amylase và protease lớn hơn hẳn B. subtilis nhưng lên men ñường
lại kém hơn.
B. mesentericus và B. subtilis rất phổ biến trong tự nhiên, chúng lây
nhiễm làm hư hỏng thực phẩm, nhất là các loại thực phẩm chứa nitơ và các
sản phẩm giàu ñường (bánh kẹo, hoa quả…). Ngồi ra chúng cịn sinh một

loại hợp chất có tính kháng một số vi khuẩn khác gọi là bacterioxin, ở B.
subtilis gọi là subtilin.
2.1.3.2. Bacillus cereus
Vi khuẩn này có mối quan hệ gần gũi với vi khuẩn B. anthracis,
B. mycodes, B.thurigiensis. Bào tử của chúng có hình bầu dục, kích thước
khoảng 0.9 * (1.2 – 1.5) µm, nằm lệch tâm, phát tán khắp nơi, trong đất, trong
khơng khí… Chúng thường sinh sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể
sinh độc tố làm cho thực phẩm hư hỏng và gây ngộ ñộc thực phẩm.
Tế bào của B. cereus dầy, kích thước (1 – 1,5 * 3 – 5) µm có khi dài hơn,
đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi. Khuẩn lạc của B. cereus phẳng, hơi lõm, nề
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

8


mặt hơi xù xì (dạng bột, hoặc hạt nhỏ) trắng ñục, mép lồi lõm.
2.1.3.3. Bacillus megaterium
Tế bào B. megaterium khá lớn, kích thước (1,2 – 1,5) * (3 – 12) µm.
Tế bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dự trữ (hạt mỡ, glycogen). Bào tử lớn, hình
oval hay bầu dục, kích thước 1,5 * (0,7 – 1) µm, chúng nằm lệch tâm hướng
theo chiều ngang hoặc chiều xiên của tế bào.
Khuẩn lạc trịn đều, lồi nhẵn nhưng thường có vịng viền quanh khuẩn
lạc hoặc các vịng đồng tâm trên bề mặt, khơng thùy, khơng nếp, mép trịn đều
hay lượn sóng, màu trắng sữa hay đục, có khi có màu nâu nhạt.
B. megaterium sinh trưởng trên mơi trường dinh dưỡng đơn giản không
cần thêm bất cứ yếu tố dinh dưỡng nào khác.
2.1.3.4. Bacillus pumilus
Bào tử phát tán rộng, có mặt trong ñất nhiều hơn B. bacillus. Khuẩn
lạc nhỏ, xung quanh viền mờ lan khơng ranh giới. Tế bào của nó gần giống tế
bào B. subtilis.

2.1.3.5. .Bacillus polymyxa
Kích thước tế bào khoảng (0,6 - 1) * (2 - 7) µm, đứng riêng rẽ hoặc
xếp thành đơi, chuỗi ngắn. Khi hình thành bào tử tế bào sẽ phồng lên hình
quả chanh. Bào tử hình bầu dục kéo dài khoảng (1,7 – 2,6) µm, trên bề mặt
cắt ngang như hình sao, nằm giữa tế bào, chúng phát tán rộng.
Khuẩn lạc của B. polymyxa không màu, phẳng hoặc lồi, trơn, lan dần
ra xung quanh, mép đơi khi có thùy. Chúng thường sinh trưởng phát triển trên
thực vật đang bị hỏng. Vì vậy người ta thường phân lập chúng từ thực phẩm.
chúng là nguồn ñể sản xuất kháng sinh polymyxin.
2.1.3.6. Bacillus simplex
Tế bào B. simplex nhỏ bé, kích thước (2 - 5) * 0,6 µm, thường đứng
riêng rẽ, khơng xếp thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục có kích thước 0.6 * 0.9
µm, nằm lệch tâm. Khuẩn lạc B. simplex giống khuẩn lạc B. cereus, chỉ khác
là khuẩn lạc B. simplex có khả năng sinh sắc tố lục nhạt, vàng và tiết vào môi
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

9


trường.
2.1.3.7.Bacillus brevis
B. brevis là trực khuẩn có kích thước (0,7 - 1) * ( 3 - 5) µm, đứng riêng
rẽ, đơi khi xếp thành chuỗi. Bào tử hình bầu dục nằm cuối tế bào, làm cho tế
bào một đầu phình hơi to. Khuẩn lạc B. brevis có màu trắng, đơi khi có màu
vàng, lồi hoặc phẳng, lấp lánh, mép răng cưa.
2.1.3.8. Bacillus aslersporus
B. aslersporus có tế bào dày (1,0 – 1,2) * (3 - 7)µm, đứng riêng rẽ
hoặc xếp thành đơi. Bào tử hình trụ hay hình kéo dài, kích thước 1,0 * (1,5 2) µm, nằm giữa tế bào. Khi hình thành bào tử tế bào phồng lên một chút
trông giống Clostrdium. Khuẩn lạc của B. aslersporus nhỏ, màu trắng hay
màu lục nhạt, phẳng, mềm, nhày, ñồng nhất.

2.2. Enzyme α - amylase
2.2.1. Cấu tạo α - amylase
Enzyme α - amylase là enzyme thủy phân tinh bột ñược ứng dụng khá
rộng rãi trong công nghiệp, y học và các lĩnh vực khác đồng thời nó cũng là
một trong những enzyme đầu tiên được nghiên cứu. Mở đầu là cơng trình
nghiên cứu của Kirchoff, viện sĩ Saint Petercburg (1814) chứng minh nước
chiết từ hạt lúa mạch nảy mầm có tác dụng chuyển hóa tinh bột thành đường
ở nhiệt độ 40oC – 60oC.
Năm 1833, Payen và Perso (Pháp) thêm cồn vào dịch chiết này, thu
được kết tủa có khả năng phân giải tinh bột thành ñường, ñặt tên là Diastase
(xuất phát từ tiếng Hy Lạp, diastatics, có nghĩa là phân giải, đó là amylase.
Tiếp theo, Leuchs (1851) ñã phát hiện nước bọt cũng có khả năng phân giải
tinh bột thành đường. Enzyme α – amylase là endoenzyme xúc tác quá trình
thủy phân liên kết - 1,4 - glucoside
Tên hệ thống : 1,4 - D – glucanohydrolase.
Tên thường gọi : α - amylase
Mã số enzyme : EC 3.2.1.1.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

10


Hình 2.2. Cấu trúc khơng gian của α - amylase.
(URL: plaza.snu.ac.kr/~sewonsuh/home/structures.html)

2.2.2. Tính chất
• α - amylase của vi sinh vật có những đặc tính rất đặc trưng về cơ chế
tác dụng, khả năng chuyển hóa tinh bột và khả năng chịu nhiệt.
• Thể hiện hoạt tính trong vùng acid yếu: α - amylase của nấm mốc có
pH tối thích 4,5 – 4,9; α - amylase của vi khuẩn pH tối thích 5,9 – 6,1. Ở

pH < 3 enzyme bị vơ hoạt hoàn toàn trừ α - amylase của Aspergillus niger có
thể chịu được pH 2,5 – 2,8 (trong mơi trường sinh tổng hợp acid citric bằng
phương pháp lên men bề mặt).
• α - amylase dễ tan trong nước, trong các dung dịch muối, dung dịch
đệm và rượu lỗng.
• α - amylase hoạt động khơng cần chất hoạt hóa và cần ion Ca2+ với vai
trị là một đồng yếu tố để xúc tác sự thủy phân tinh bột. Ion Ca2+ có tác dụng
ổn định tốt α - amylase trong q trình thủy phân bằng nhiệt hay kiềm, tăng
ñộ bền của α - amylase trước các tác nhân gây biến tính và tác dụng phân hủy
của protease (Lương ðức Phẩm, 2010).
• α - amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần các amino acid
khác nhau, mỗi loại α - amylase ñược cấu tạo từ một tổ hợp amino acid ñặc
hiệu riêng. Tuy nhiên, hàm lượng tryptophan, tyrosine thường chiếm ưu thế.
Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng 1/4 tổng lượng amino acid
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

11


cấu thành phân tử enzyme.
• α - amylase của nấm mốc có khả năng dextrin hóa (dịch hóa) cao lại
vừa tạo ra một lượng lớn glucose và maltose. Amylase của vi khuẩn lại có hai
loại amylase dịch hóa và amylase đường hóa.
• Nhiệt độ hoạt động của α - amylase từ các nguồn khác nhau là khác
nhau. α - amylase của vi khuẩn thường bền nhiệt hơn α - amylase từ các loài
vi sinh vật khác và cây trồng, chúng vẫn có thể hoạt động ở nhiệt độ mà
α - amylase của nấm mốc và ngũ cốc bị bất hoạt . Nhiệt ñộ tối ưu của
α - amylase trong khoảng 54 – 63oC (Hopek, 2006). ðối với α - amylase của
B. subtilis nhiệt độ tối ưu có thể đạt đến 70 – 80 oC. α - amylase của vi khuẩn
có thể chịu được nhiệt độ cao, có thể giữ được hoạt lực ngay cả khi đun sơi

trong nước một thời gian ngắn. Tính bền nhiệt này là một ưu điểm lớn ñược
sử dụng ñể xử lý nguyên liệu ở các cơng đoạn phải dùng nhiệt độ cao, hoặc
mơi trường nhiệt ñới như ở nước ta. ða số các chế phẩm enzyme thương mại
thuộc nhóm α - amylase đều có tính chịu nhiệt cao.
Bảng 1: ðộ bền nhiệt của α - amylase từ các nguồn khác nhau
STT
1
2
3
4

Enzym

Nguồn

α - amylase vi
Bacillus subtilis
khuẩn
α - amylase vi
Bac. licheniformic
khuẩn chịu nhiệt
α - amylase nấm Aspergillus orizae
sợi
Aspergillus niger
Dich malt
α - amylase malt
Bột Malt

Khoảng pH
tối thích

4,5 – 9
(6,5 - 7,5)
5,8 – 8
(7,0)
4,0 – 7,0
(5,0 – 6,0)
3,5 – 6,5
4,5 – 7

Khoảng nhiệt
độ tối thích
70 - 85
90 – 105
80
70
85

(Nguyễn ðức Lượng, 2002)

2.2.3. Cơ chế xúc tác
α - amylase (1,4 – α – glucan - glucanhydrolase) từ các nguồn khác
nhau có nhiều điềm rất giống nhau, có khả năng phân cắt các liên kết
α - 1,4 - glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất (tinh bột hoặc
glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả α - amylase
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

12


khơng chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song

với tốc ñột rất chậm.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi α - amylase là q trình đa giai đoạn.
• Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): Chỉ một số phân tử cơ chất
bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α - dextrin), ñộ
nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa
nhanh).
• Sang giai đoạn 2 ( giai đoạn đường hóa ): Các dextrin phân tử thấp tạo
thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iod.
Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α - amylase cho tới disaccharide và
monosaccharide. Dưới tác dụng của α - amylase, amylose bị phân giải khá
nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng
α - amylase ln phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc glucopiranose 1).
Sau đó, các poliglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch
polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm ñến maltotetrose và
maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân
của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α - amylase
lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì khơng phân cắt được liên kết
α -1,6 - glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có
chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngồi các đường nói trên (72%
maltose và 19% glucose) cịn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%
(Nguyễn ðức Lượng, 2004).
Tóm lại, dưới tác dụng của α - amylase, tinh bột có thể chuyển thành
maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông
thường α - amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử
thấp không cho màu với Iod và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của
α - amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại
amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. Có thể xác định
hoạt tính enzyme bằng cách đo độ nhớt của dung dịch hồ tinh bột hoặc xác
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

13


ñịnh lượng tinh bột ñã bị phân giải dựa vào phản ứng màu với iod hoặc bằng
cách xác ñịnh ñường khử tạo thành (Nguyễn ðức Lượng, 2002, Lương ðức
Phẩm, 2009.
α - amylase
Tinh bột

Dextrin (chủ yếu) + Maltose + Glucose
H2O

Hình 2.3. Vị trí cắt của α - amylase trên phân tử tinh bột.
Theo những nghiên cứu mới trước ñây, do tinh bột có cấu trúc vững chắc nên
muốn để cho enzyme thủy phân tinh bột (ezyme công nghiệp, vi sinh vật ) hoạt
động hiệu quả thì ngun liệu chứa tinh bột ban đầu ít nhiều cần phải được
biến tính. Các hình thức biến tính tinh bột có thể kể đến như các tác ñộng
nhiệt (ép ñùn, sấy trống), tác ñộng cơ học (đồng hóa cao áp), tác động hóa
chất (acid hóa , este hóa, phosphat hóa)…

• Sự biến đổi của tinh bột gây ra bởi xử lý thủy nhiệt (hồ hóa)
Tinh bột được biến tính bằng phương pháp nghiền khơ ở nhiệt độ cao 120 –
150 OC có sản phẩm tạo thành gồm dextrin và pirodextrin. Khi hịa tan tinh
bột đã biến tính này vào nước do kích thước phân tử của tinh bột lớn nên ñầu
tiên các phân tử sẽ xâm nhập vào giữa các phân tử tinh bột. Tại ñây chúng sẽ
tương tác với nhóm hoạt ñộng của tinh bột, quay cực, các phổ hồng ngoại và
hàm lượng glucose, tạo ra lớp vỏ nước làm cho lực liên kết ở mắt xích nào đó
Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………

14