Ứng dụng kỹ thuật metagenomics trong nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu tại một số tỉnh của việt nam

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

..

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HỒ MẠNH TƢỜNG

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT METAGENOMICS TRONG NGHIÊN CỨU HỆ
VI SINH VẬT VÙNG RỄ CÂY DÓ BẦU TẠI MỘT SỐ TỈNH CỦA VIỆT
NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)

HÀ NỘI, 2015
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
1




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

HỒ MẠNH TƢỜNG

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
(Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm)
Mã số: 60 42 01 14

Ngƣời hƣớng dẫn: PGS.TS. LÊ VĂN SƠN
Đơn vị: Viện Công nghệ sinh học

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
2




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Hà Nội, 2015

MỞ ĐẦU
Metagenomics là một nghành nghiên cứu mới, độc đáo và có thể áp dụng
rộng rãi trong lĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học. Công nghệ metagenomics
kết hợp với kỹ thuật gen, kỹ thuật protein sẽ cung cấp các hiểu biết sâu sắc về các
vấn đề trong tiến hóa gen hoặc thông tin về các sinh vật mà hiện nay vẫn đang là bí
ẩn vì chúng khó có thể đƣợc ni cấy trong các phịng thí nghiệm.
Mơi trƣờng đất rất phức tạp khi nghiên cứu số lƣơng và sự đa dạng các
loài trong hệ vi sinh vật. Dựa trên việc phân lập DNA từ một vài mẫu đất khác

nhau, số lƣợng các sinh vật nhân sơ đƣợc xác định từ khoảng 2000 đến 18000
bộ gen trên một gram đất. Số lƣợng này là rất thấp bởi vì các bộ gen của các loài
hiếm và chƣa đƣợc biết đến đã bị loại ra trong q trình phân tích. Do đó, số
lƣợng và sự đa dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1 gram đất phải lớn hơn rất
nhiều. Trong khi đó, phƣơng pháp nuôi cấy trực tiếp hoặc không trực tiếp để
khám phá và khai thác sự đa dạng của hệ vi sinh vật có trong đất. Ni cấy và
phân lập DNA của vi sinh vật là phƣơng pháp phổ biến nhƣng chỉ đƣợc từ 0,1
đến 1% vi sinh vật là có thể đƣợc ni cấy sử dụng các phƣơng pháp tiêu chuẩn,
vì vậy sự đa dạng của hệ vi sinh vật vẫn chƣa đƣợc khám phá hết.
Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm họ Trầm, bộ Bông là lớp Cây
gỗ lớn thuộc ngành Mộc Lan. Chi Trầm có tất cả 25 loài khác nhau phân bố chủ
yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam Á và miền Nam Trung Quốc.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
3




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Tại Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác trong rừng rậm nhiệt đới thƣờng xanh,
rừng ẩm nguyên sinh. Trầm hƣơng đƣợc sử dụng để chữa một số bệnh hiểm
nghèo, có tác dụng kháng khuẩn, có tính kháng sinh. Giá trị quan trọng nhất của
cây dó bầu là nguồn vật liệu sinh trầm hƣơng. Trầm hƣơng đƣợc coi là một loại
lâm sản ngồi gỗ có giá trị thƣơng mại quốc tế nhất. Trên thế giới, Trầm hƣơng
đƣợc sử dụng để chƣng cất tinh dầu trầm, một chất quan trọng cho ngành công
nghiệp mỹ phẩm cao cấp. Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, đƣợc dùng trong
công nghệ chế biến các loại chất thơm, các loại nƣớc hoa cao cấp, giá trị.

Hệ vi sinh vật vùng rễ đóng vai trị quan trọng trong sự sinh trƣởng và
phát triển của cây dó bầu. Tuy nhiên, vai trò của chúng chƣa đƣợc nghiên cứu
kỹ cũng nhƣ chƣa có một nghiên cứu nào về sự tác động của hệ vi sinh vật đến
khả năng tạo trầm. Vì vậy, nghiên cứu này tập trung vào sử dụng kỹ thuật mới
metagenomic để nghiên cứu hệ vi sinh vật vùng rễ cây dó bầu để phục vụ cho
các nghiên cứu tiếp theo.
Mục tiêu nghiên cứu
-

Xác định đƣợc thành phần giới, họ, chi, loài của các mẫu

nghiên cứu
-

So sánh sự giống và khác nhau của các mẫu nghiên cứu

Nội dung nghiên cứu
-

Phân lập DNA tổng số từ đất của các mẫu nghiên cứu

-

Gắn adapter với mỗi mẫu nghiên cứu

-

Xác định trình tự 16S của các mẫu nghiên cứu

-

Xác định độ đa dạng của các mẫu nghiên cứu

-

Xác định thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu

-

So sánh thành phần giới, họ, chi của các mẫu nghiên cứu.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
4




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

I.
1.1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Cây dó bầu và khả năng tạo trầm

1.1.1. Nguồn gốc, phân bố
Cây dó bầu (Aquilaria spp.) thuộc chi Trầm (Aquilaria), họ Trầm

(Thymelaeaceae), bộ Bông (Malvales), lớp Cây gỗ lớn thuộc ngành Mộc Lan.
Chi Trầm có tất cả 25 lồi khác nhau, tuy nhiên chỉ có 15 lồi có khả năng cho
trầm hƣơng gồm: Aquilaria crassna; A.baillonii; A.sinensis hoặc A.chinesis;
A.borneensis ; A.malaccensis ; A.gollocha ; A.hirta; A.rostrata; A.beccariana;
A.cummingiana;

A.filaria;

A.khasiana;

A.microcarpa;

A.grandiflora;

A.bancana; A.rugosa, trong đó lồi A rugosa đƣợc Kiet và cộng sự phát hiện
năm 2005 (Kiet et al., 2005).
Chi Trầm phân bố chủ yếu ở khu vực nhiệt đới từ Ấn Độ đến Đông Nam
Á và miền Nam Trung Quốc. Tại Việt Nam, dó bầu phân bố rải rác trong rừng
rậm nhiệt đới thƣờng xanh, rừng ẩm nguyên sinh thuộc các tỉnh Tuyên Quang,
Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh, đặc biệt là từ Quảng Bình, Quảng Trị, Thừa
Thiên Huế, Quảng Nam, Đà Nẵng, Quãng Ngãi, Bình Định, Ninh Thuận, Bình
Thuận đến Tây Nguyên, An Giang, Kiên Giang và đảo Phú Quốc (Hình 1, Danh
lục các lồi thực vật Việt Nam). Trầm hƣơng phân bố tại Việt nam có 4 lồi là:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
5




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Trầm hƣơng (A.crassna Pierre ex Lecomte); dó baillon (A. baillonii Pierre ex
Lecomte), dó bana (A. banaensae.Phamhoang.) (Phạm Hồng Hộ 1992) và dó
quả nhăn (A. rugosa L.C. Kiet & Krbler) (Lê Công Kiệt et al., 2005). Trong đó,
cây dó bầu A. crassna là lồi đƣợc trồng phổ biến nhất vì khả năng loại trầm tốt
nhất thế giới (Hồng Cảnh 2006). Các lồi dó baillon (A. baillon), dó bana (A.
banaensae) và dó quả nhăn (A. rugosa) đều là đặc hữu có thể bắt gặp tại một
vài địa điểm thuộc Quảng Trị, Thừa Thiên Huế và Quảng Nam. Trong kho đó,
dó quả nhăn (A. rugosa) là lồi mới đƣợc phát hiện tại Kon Tum.

Hình 1.1. Phân bố dó bầu tại Việt Nam
Hiện nay, các cá thể trƣởng thành của trầm hƣơng cơ bản bị tuyệt diệt
trong tự nhiên. Vùng trọng điểm gây trồng cây dó trầm hiện nay ở nƣớc ta là
Bán Trung Bộ, Nam Trung Bộ, Tây Ngun, Đơng Nam Bộ, và Tây Nam Bộ.
Trong đó, vùng Bắc Trung Bộ tập trung chủ yếu tại Hà Tĩnh,vùng Nam Trung
Bộ tập trung chủ yếu tại Quảng Nam, vùng Tây Nguyên chủ yếu tập trung tại
Kon Tum, Đông Nam Bộ tập trung chủ yếu tại Bình Phƣớc, Tây Nam Bộ tập
trung chủ yếu tại Kiên Giang và An Giang.
1.1.2. Giá trị kinh tế, dược liệu và sinh thái
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
6




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Giá trị kinh tế: Giá trị quan trọng nhất của cây dó bầu là nguồn vật liệu
sinh trầm hƣơng. Trầm hƣơng đƣợc coi là một loại lâm sản ngồi gỗ có giá trị
thƣơng mại quốc tế nhất. Trên thế giới, Trầm hƣơng đƣợc sử dụng để chƣng cất
tinh dầu trầm, một chất quan trọng cho ngành cơng nghiệp mỹ phẩm cao cấp.
Tinh dầu trầm có giá trị đặc biệt, đƣợc dùng trong công nghệ chế biến các loại
chất thơm, các loại nƣớc hoa cao cấp, giá trị. Theo công ƣớc về buôn bán quốc
tế những loài động thực vật hoang dã nguy cấp, khối lƣợng mua bán trầm hƣơng
trên thị trƣờng thế giới thời kỳ 1995 – 1997 khoảng 1.350 tấn. Giá mua bán
Trầm hƣơng đƣợc tính theo kg tùy thuộc vào chất lƣợng. Giá bán Trầm tại thị
trƣờng Dubai (Arabia Saudi) vào năm 1993 dao động từ 27 đô la Mỹ/kg (loại
thấp nhất) đến 10.000 đô la Mỹ/kg (loại tốt nhất) (Barden et al., 2000).
Giá trị dược liệu: Trong y học, trầm hƣơng còn đƣợc sử dụng để chữa
một số bệnh hiểm nghèo, chữa các bệnh đau bụng, đau ngực, nôn mửa, hen
suyển, lợi tiểu, giảm đau, trấn tĩnh, hạ sốt, cấm khẩu, thổ huyết, khó thở, kích
dục… Trầm hƣơng có tác dụng kháng khuẩn, đặc biệt là với các loại khuẩn
Mycobacterium tuberculosis và Shigella flexneri, có tính khánh sinh, tạo kháng
thể mạnh (diệt khuẩn, làm lành vết thƣơng), có tác dụng chữa một số bệnh nhƣ
bệnh về tim mạch (suy tim, đau ngực), bệnh về hô hấp (hen suyễn), bệnh về thần
kinh (an thần, mất ngủ, giảm đau, trấn tĩnh….), bệnh về tiêu hố (đau bụng,
buồn nơn, tiêu chảy), bệnh về tiết niệu (bí tiểu tiện). Đặc biệt có thể dùng trầm
hƣơng để chữa ung thƣ tuyến giáp.
Giá trị sinh thái: Đối với môi trƣờng sinh thái và phát triển bền vững, việc
đƣa dó bầu (Aquilaria sp.) vào cơ cấu cây rừng với mục tiêu 5 triệu hecta rừng
tại tỉnh Hà Tĩnh nói riêng và trong cả nƣớc nói chung đã góp phần thúc đẩy tăng
độ che phủ của rừng, chống xói mịn đất và bảo vệ mơi trƣờng. Cây gió bầu góp
phần bảo tồn và phát triển loài cây đặc hữu, qúy hiếm, có giá trị về khoa học và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
7

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

kinh tế của nƣớc ta, đây còn là giải pháp phù hợp với quy luật sản xuất đi đôi
với bảo vệ môi trƣờng, kết hợp lợi ích trƣớc mắt với lợi ích lâu dài, làm giàu
trên cơ sở khai thác và tái tạo lợi thế đặc hữu, ƣu việt của tài nguyên quốc gia.
Hơn nữa, cây dó bầu cịn có ý nghĩa tạo cơng ăn việc làm cho ngƣời lao động,
mở ra hƣớng phát triển kinh tế bền vững cho nông thôn, vùng sâu vùng xa (Thái
Thành Lƣợm 2009).
1.1.3. Khả năng sinh trầm của dó bầu
Sự tạo trầm trong tự nhiên của cây dó bầu là sự biến đổi của các phần tử
gỗ do tác động bệnh lý bởi vết nứt gãy, sự xâm nhập của các lồi nấm…Có 3 giả
thuyết tồn tại đến sự tạo trầm liên quan đến các tác nhân bệnh lý, thƣơng tích
bệnh lý hoặc thƣơng tích khơng bệnh lý (Ng et al., 1997). Kết quả của nghiên
cứu không cung cấp đƣợc bằng chứng thuyết phục là tác nhân nào trong số 3 tác
nhân trên tác động đến sự tạo trầm của cây. Ngoài ra, nghiên cứu của Oldfield
et al. (1998) cho rằng q trình tạo trầm có liên quan đến sự đáp ứng của cây với
nấm. Hơn nữa, Heuveling và Phillips (1999) cho rằng nó liên quan đến đáp ứng
với thƣơng tích. Nghiên cứu cho rằng sự xâm nhiễm của nấm có thể làm tăng sự
tạo trầm cũng nhƣ sự đáp ứng của tế bào chủ với vết sự phát triển của nấm xâm
nhiễm. Dó bầu có thể đƣợc xâm nhiễm tự nhiên bởi một vài các loại nấm nhƣ:
Aspergillus spp, Botryodyplodia spp, Diplodia spp, Fusarium bulbiferum, F.
laterium, F. oxysporum , F. solani, Penicillium spp, and Pythium spp. (Anon
1998; Soehartono and Mardiastuti 1997; Wiriadinata 1995). Sự tƣơng tác giữa tế
bào chủ với nấm hay các tác nhân khác để tạo thành trầm vẫn chƣa đƣợc nghiên
cứu kỹ. Sự tƣơng tác này xảy ra một cách tự nhiên năm này sang năm khác. Căn

cứ vào sự hóa nhựa nhiều hay ít mà có những sản phẩm nhƣ: Tóc, Trầm hƣơng
và Kỳ nam. Thực tế cho thấy những cây dó bầu sau khi chết rục thì lƣợng Kỳ
nam hoặc Trầm hƣơng thƣờng đƣợc phát hiện ở phần gốc rễ, nơi thƣờng tiếp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
8




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

xúc với hệ sinh vật đất. Đây cũng có thể là tác nhân sinh học gây bệnh tạo trầm
hƣơng.
Trên cơ chế hình thành trầm trong tự nhiên, 3 kỹ thuật cấy tạo trầm nhân
tạo phổ biến đƣợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu là: phƣơng pháp vật lý
(gây vết thƣơng cơ giới); phƣơng pháp hóa học (xúc tác hóa chất); phƣơng pháp
sinh học (xử lý với men vi sinh). Ngoài ra, một số cách tạo trầm khác nhƣ: kết
hợp một số phƣơng pháp trên với nhau. Kết quả mỗi phƣơng pháp tạo trầm
hƣơng khác nhau về số lƣợng, chất lƣợng, thời gian và chi phí, nhƣng hiệu quả
tạo trầm chƣa cao, nhƣ kỳ vọng của các nhà sản xuất. Hiệu quả tạo trần thấp là
do cơ chế và sự tƣơng tác các tác nhân (đặc biệt tác nhân sinh học) của việc
sinh tạo trầm trong tự nhiên vẫn chƣa đƣợc làm rõ. Hơn nữa, trong những năm
gần đây các nghiên cứu tạo các chromone invitro (thành phần chính trong tinh
dầu trầm) từ ni cấy huyền phù tế bào của dó bầu đã thu đƣợc các kết quả khả
quan ban đầu (Qi et al., 2005; Ito et al., 2005).
1.2.

Ứng dụng Công nghệ metagenomics trong nghiên cứu hệ vi

sinh vật
1.2.1. Vai trò của hệ vi sinh vật đối với môi trường và cây trồng
Các vi sinh vật đóng vai trị to lớn đối với các sinh vật sống trên trái đất.
Sự đa dạng của hệ vi sinh vật phản ánh sự phong phú về chức năng, cung cấp
các thành phần cần thiết cho tất cả các dạng sống tồn tại. Các vi sinh vật tham
gia vào hầu hết các chu trình sinh, hóa học trên tái đất từ xử lý rác thải tới thúc
đẩy sự tăng trƣởng và sinh sản của thực vật, động vật. Hơn nữa, vi sinh vật cung
cấp cho con ngƣời các sản phẩm nhƣ: thuốc, các loại sản phẩm lên men và góp
phần vào việc duy trì sức khỏe. Chỉ gần đây các nhà vi sinh vật học mới đánh
giá chính xác sự đa dạng trong hệ vi sinh vật do nhiều vi sinh vật không thể
đƣợc nuôi cấy trong điều kiện phịng thí nghiệm. Kết quả dẫn đến các nhà vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
9




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

sinh vật rất khó để tìm hiểu về các hệ vi sinh vật khơng thể phát hiện bằng các
phƣơng pháp truyền thống này. Vai trò của các vi sinh vật có thể đƣợc khái quát
nhƣ sau:
Microbial services: Các vi sinh vật là các sinh vật rất quan trọng trên trái
đất nhƣng vai trò của chúng ít đƣợc biết đến do chúng không thể đƣợc phát hiện
bằng mắt thƣờng. Vi sinh vật cung cấp cho con ngƣời khơng khí, thức ăn và
thực hiện hầu hêt các chức năng của cơ thể, trong khi đó rất ít ngƣời biết về vai
trị của chúng với cuộc sống. Có rất nhiều các ví dụ điển hình cho việc cung cấp

các thành phần thiết yếu của vi sinh vật cho các sinh vật khác (Madigan and
Martinko 2005).
Sự tạo thành oxi: Một bƣớc quan trọng trong lịch sử sống trên trái đất là
sự chuyển từ hơ hấp kỵ khí sang hiếu khí đƣợc tạo ra bởi vi sinh vật tự dƣỡng.
Khi sự sống trên trái đất bắt đầu, môi trƣờng sống là hơ hấp kỵ khí hoặc khơng
cần oxi. Khoảng 1 tỷ năm trƣớc đây, một vài vi sinh vật ngoài đại dƣơng tiến
hóa khả năng sử dụng năng lƣợng mặt trời để tham gia vào các phản ứng mà kết
quả là giả phóng oxi. Oxi trên trái đất tích tụ lại tạo thành khí quyển cho đến khi
lƣợng của chúng đủ để hình thành và ni dƣỡng các sinh vật hiếu khí. Trong
đó một dạng oxi phân tử cao đƣợc hình thành là O3 do các phân tử O2 va chạm
với nhau. Ozone là một phân tử rất đặc biệt, khơng giống nhƣ oxi, nó có thể hấp
thụ tia UV. Do đó, sự sống trên bề mặt trái đất có thể phát triển vì tầng ozone đã
lọc hết các tia UV và bảo vệ trái đất khỏi phóng xạ có thể phá hủy DNA và tế
bào. Ngay sau khi hình thành oxi và tầng ozone ở tầng bình lƣu, sự sống bắt đầu
bùng. Tầng oxi và ozone đƣợc hình thành đầu tiên hoàn toàn do vi sinh vật và
ngày nay đƣợc duy trì bởi các vi khuẩn tự dƣỡng và thực vật (Handelsman
2007).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
10




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Sự chuyển hóa nito: Một trong những vai trò quan trọng khác của vi
khuẩn là cung cấp nito dƣới dạng có thể hấp thu đƣợc đối với động vật và thực

vật. Một trong những điều thú vị là mặc dù khí quyển có tới 79% là nito, tuy
nhiên hầu hết các sinh vật đề không thể sử dụng chúng. Nito trong khí quyển tồn
tại dƣới dạng bền N2 nên các sinh vật không thể bẻ gẫy các liên kết này để sử
dụng đƣợc. Thực tế vi khuẩn là sinh vật duy nhất có thể bẻ gẫy các liên kết trong
N2 và cố định chúng (Handelsman 2007).
Duy trì sức khỏe con người: Các hệ vi sinh vật sống trong, trên cơ thể con
ngƣời rất cần thiết cho sức khỏe của vật chủ. Vi khuẩn trong hệ đƣờng ruột bảo
vệ con ngƣời khỏi sự tấn công của các mần bệnh, khi mà sự cân bằng của hệ vi
sinh vật đƣờng ruột bị phá vỡ thì sẽ kéo theo sự xuất hiện của rất nhiều bệnh
nhƣ: nhiễm trùng đƣờng ruột, ung thƣ ruột, béo phì và tiểu đƣờng những bệnh
này không gây ra bởi một sinh vật riêng lẻ mà liên quan tới các quá trình của hệ
vi sinh vật. Trong một số khía cạnh các chức năng của hệ vi sinh vật nhƣ là một
đơn vị trong đó mỗi vi sinh vật phụ thuộc vào các vi sinh vật khác cần thiết cho
cuộc sống và hiệu quả chức năng của hệ thống phụ thuộc vào sự tƣơng tác và
hợp tác giã mỗi thoành viên trong cộng đồng. Các hệ vi sinh vật liên quan tới cơ
thể con ngƣời là chủ đề của hai q trình tiến hóa. Đầu tiên, chúng đồng tiến hóa
với con ngƣời qua hàng ngàn năm cộng sinh, do đó gen của con ngƣời đã đƣợc
sự hỗ trợ và dựa vào những gen những vi sinh vật này. Thứ hai, mỗi vi sinh vật
trong hệ tiên hóa trong thời gian sống của chúng. Tiến hóa của các hệ vi sinh vật
với lồi ngƣời cũng nhƣ với sinh vật khác tạo ra sự phụ thuộc và giao tiếp giữa
chúng. Kết quả là cá vi sinh vật cần đƣợc nghiên cứu về cả hệ vi sinh vật mà
khơng chỉ ni cấy trong phịng thí nghiệm (Handelsman 2007).
Tổng hợp kháng sinh: Các vi sinh vật là nguồn cung cấp hầu hết các
kháng sinh để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn. Năm 1920, Alexander Fleming đã
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
11

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

tìm ra chất tiết penicillin của nấm có thể ngăn cản việc phát triển của vi khuẩn.
Phát hiện ra penicillin đã dẫn tới việc khám phá và thƣơng mại hóa kháng sinh
cho y học và nông nghiệp. Rất nhiều vi khuẩn tiết ra kháng sinh với nhiều tính
chất hóa học và chức năng khác nhau, cung cấp các loại thuốc chúng ta có ngày
nay. Nguyên nhân nấm và vi sinh vật sản sinh ra kháng sinh vẫn chƣa đƣợc biết
nhƣng khả năng phổ biến là chúng rất quan trọng trong đời sống của các sinh vật
này. Một giả thuyết đƣợc quan tâm là các sinh vật này sử dụng để hạn chế sự
phát triển của các vi sinh vật khác; một giả thuyết khác là chúng sử dụng kháng
sinh nhƣ là một tín hiệu để cảnh báo với các loài khác trong khu hệ
(Handelsman 2007).
Các vai trò khác: Vai trò của vi sinh vật với các q trình sinh hóa và tự
nhiên là vơ cung to lớn: tham gia vào các chu trình dinh dƣỡng, hoặc cải tiến y
học. Ngồi ra, chúng cịn tham gia vào các q trình chuyển hóa thức ăn: lên
men, cung cấp các enzyme hay polymers, làm sạch các rác thải độc hại và bảo
vệ sức khỏe của con ngƣời, thực vật và động vật. mặc dù vi sinh vật thƣờng liên
quan tới các bệnh nhƣng các tác nhân gây bệnh chỉ là một phần nhỏ của hệ vi
sinh vật trên trái đất và các vi sinh vật có ích sẽ giúp kiểm sốt các tác nhân gây
bệnh (Handelsman 2007).
Ngồi ra, các hệ vi sinh vật tồn tại trên và xung quanh cây trồng đóng vai
trị hết sức quan trọng lên năng suất và chất lƣợng cây trồng. Tuy nhiên, mới chỉ
một số lồi vi khuẩn có vai trị đã đƣợc biết đến. Nhiều lồi vi sinh vật khác có
khả năng sử dụng các chất từ xác động vật và thực vật phân hủy, hoặc chuyển
hóa một số nguyên tố nhƣ sắt và mangan, thành các hình thức mà thực vật có thể
hấp thụ đƣợc. Thực vật khơng thể tồn tại và phát triển nếu thiếu hệ vi sinh vật
đất. Trên một số môi trƣờng đất, cây trồng vẫn phát triển tốt ngay cả khi tồn tại
các tác nhân gây bệnh ở mật độ cao. Sau nhiều thập kỷ nghiên cứu, các nhà bệnh

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
12




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

lý học thực vật phát hiện các hệ vi sinh vật cực kỳ phức tạp đóng vai trị ức chế
tác nhân gây bệnh, các nghiên cứu chỉ ra rằng các phức hệ vi sinh vật này có thể
góp phần vơ cùng hữu ích cho sản xuất nông nghiệp. Không một vi sinh vật
riêng lẻ nào đƣợc phân lập lại có khả năng tƣơng tự, điều này cho thấy tác động
qua lại, hỗ trợ nhau trong quá trình ức chế tác nhân gây bệnh của các thành viên
trong hệ vi sinh vật đất. Các nghiên cứu trên cho thấy tiềm năng của hệ vi sinh
vật đất là rất lớn và nghiên cứu thành công hệ vi sinh vật này hứa hẹn mang lại
nhiều thành tựu to lớn trong lĩnh vực sản xuất các chế phẩm sinh học nhƣ phân
bón vi sinh hay tác động đến hệ vi sinh vật đất nhằm cải thiện và nâng cao chất
lƣợng cây trồng. Qua trên có thể thấy rằng Metagenomics là một bƣớc cách
mạng hóa ngành vi sinh vật vì nó đã mở ra một cửa sổ để nghiên cứu thế giới vi
sinh vật khổng lồ mà trƣớc đây chƣa đƣợc nghiên cứu.

1.2.2. Giới thiệu về công nghệ metagenomics
Thuật ngữ "metagenomics" lần đầu tiên đƣợc đƣa ra năm 1985 bởi
nhóm

nghiên

cứu

của

Handelsman

(Handelsman

et

al.,

1998).

“Metagenomics” là phƣơng pháp phân tích hệ vi sinh vật các loài vi sinh vật
trong các phức hệ vi sinh vật thu trực tiếp từ môi trƣờng tự nhiên mà không cần
ni cấy thơng qua phƣơng pháp đọc trình tự (Handelsman et al., 1998;
Handelsman and Sjoling, 2007, Chen and Patcher 2005; Riesenfeld et al.,
2004; Schloss et al., 2004; Susannah and Edwward 2005; Patrick et al., 2005).
Đây là một ngành khoa học mới nhằm cung cấp cho các nhà khoa học công cụ
tiếp cận với hầu hết các loài vi sinh vật khó ni cấy trên mơi trƣờng nhân tạo.
Do đó, metagenomics cho phép nghiên cứu sự đa dạng của hệ vi sinh vật mà
chƣa từng đƣợc nghiên cứu trƣớc đây, vì vậy cung cấp một nhận thức hồn tồn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
13




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

mới về cấu trúc và chức năng của hệ sinh thái cúng nhƣ sự đa dạng của đại
dƣơng và hệ tiêu hóa của con ngƣời. Nhƣ đã biết, chỉ có khoảng 0,1 đến 10%
trong tổng số lƣợng các loài vi sinh vật đã đƣợc quan sát trong tự nhiên là có thể
ni cấy trong điều kiện phịng thí nghiệm. Những sinh vật khơng thể ni cấy
trên môi trƣờng nhân tạo này đôi khi là độc nhất và có những tiềm năng độc đáo
nhƣ phân hủy rác thải hay tổng hợp các hợp chất có thể sử dụng nhƣ là thuốc
hay kháng sinh. Metagenomics là một công cụ mạnh mẽ trong việc tiếp cận với
các nguồn tài nguyên vi sinh vật mà chƣa đƣợc khai thác về đa dạng sinh học
trong các mẫu thu từ môi trƣờng. Metagenomics đƣợc sử dụng nhƣ một công cụ
của hệ thống điều tra, phân loại và thao tác toàn bộ vật liệu gen phân lập từ mơi
trƣờng. Q trình đa bƣớc này dựa vào 4 bƣớc chính: (1) phân lập các vật liệu
gen; (2) thao tác trên các vật liệu gen này; (3) xây dựng thƣ viện gen; (4) phân
tích các vật liệu gen trong các thƣ viện metagenomic.
Metagenomics là một nghành nghiên cứu mới và có thể áp dụng rộng rãi
trong lĩnh vực Sinh học và Công nghệ sinh học. Mặc dù đã có những bƣớc phát
triển trong biểu hiện các gen khác nhau, xây dựng thƣ viện gen , nhƣng việc thiết
kế vector cần phải cải tiến hơn nữa. Các kỹ thuật phân tử hiện nay đã đƣợc chứng
minh là có đủ khả năng giải quyết các vấn đề về sản phẩm nhƣ: khám phá ra các
loại kháng sinh và các loại enzime mới. Các nghiên cứu gần đây về tảo biển
(Sargasso Sea) (Venter et al., 2004), Acid mine drainage (AMD) (Tyson et al.,
2004), đất (Tringe et al., 2005) đã sử dụng phƣơng pháp giải trình tự đoạn ngắn
(shotgun-sequencing) để phát hiện và thống kê các mẫu trong các mẫu môi trƣờng
khác nhau. Trong mỗi nghiên cứu, các mẫu môi trƣờng đƣợc thu thập và DNA
đƣợc tách chiết trực tiếp từ các mẫu này, sau đó chúng đƣợc nhân dòng trong E.coli
và các dòng nhân ngẫu nhiên này đƣợc giả trình tự. Tuy nhiên, những thƣ viện gen
này khơng thể giả thích chức năng của các gen của mỗi sinh vật trong trong hệ vi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
14

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

sinh vật. Do đó, khi công nghệ metagenomics kết hợp với kỹ thuật gen , kỹ thuật
protein, phân tích dựa vào sự biểu hiện và kính hiển vi sẽ cung cấp các nhận thức
sâu sắc về các vấn đề nhƣ: tiến hóa gen hay các sinh vật mà hiện nay vẫn đang là bí
ẩn vì chúng khó có thể đƣợc ni cấy trong các phịng thí nghiệm (Allen et al.,
2005).
Những sự tiến bộ gần đây trong phân tích metagenomic bắt nguồn dựa vào
phân tích trình tự và chức năng của các mẫu từ nƣớc, đất và liên quan với các tế
bào vật chủ. Ý tƣởng nhân dịng DNA trực tiếp từ các mẫu mơi trƣờng đƣợc đƣa ra
đầu tiên bởi Pace (Pace et al., 1985), sau đó năm 1991 đã nhân dịng thành cơng
vector phage (Schmidt et al., 1991). Các bƣớc cải tiến tiếp theo đã đƣợc xây dựng
một thƣ viện metagenomic với DNA bắt nguồn từ hỗn hợp các sinh vật đƣợc nuôi
trên cỏ khơ trong phịng thí nghiệm (Healy et al., 1995). Cơng việc của nhóm
DeLong đã đƣa tiếp nối các thành cơng của lĩnh vực này khi nhóm đã thực hiện
thành cơng việc lập thƣ viện từ các loài nhân sơ từ nƣớc biển (Stein et al., 1996).
Mặt khác, một thách thức lớn để tiếp cận với việc phân tích metagenomic là việc
xác định các dịng gen chức năng. Sự thành cơng yêu cầu sự phiên mã và dịch mã
chính xác gen bao gồm phân tích năng của gen để xác định các loại kháng sinh mới
(Courtois et al., 2003; Gillespie et al., 2003), các loại gen kháng kháng sinh (Diaz
Torres et al., 2003; Riesenfeld et al., 2004), vẩn chuyển Na_Li/(H) (Majernik et al.,
2001) và các loại enzyme phân hủy (Healy et al., 1995; Henne et al., 1999; 2000).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

15




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

1.2.3. Ứng dụng công nghệ metagenomic trong nghiên cứu đa dạng của
các hệ vi sinh vật đất

Hình 1.2. Các bƣớc thực hiện phân tích, đánh giá nguồn gen vi sinh vật
bằng công nghệ metagenomics
Hệ vi sinh vật trong môi trường đất: môi trƣờng đất rất phức tạp khi
nghiên cứu số lƣơng và sự đa dạng các lồi trong hệ vi sinh vật. Một ví dụ nhƣ:
một gram của đất rừng có chứa khoảng 4x107 tế bào sinh vật nhân sơ, trong khi
đó 1 gram của đất trồng trọt và đồng cỏ có chứa khoảng 2x109 tế bào sinh vật
nhân sơ. Dựa trên việc phân lập DNA từ một vài mẫu đất khác nhau, số lƣợng
các sinh vật nhân sơ đƣợc xác định từ khoảng 2000 đến 18000 bộ gen trên một
gram đất. Số lƣợng này là rất thấp bởi vì các bộ gen của các loài hiếm và chƣa
đƣợc biết đến đã bị loại ra trong q trình phân tích. Do đó, số lƣợng và sự đa
dạng của các sinh vật nhân sơ trong 1 gram đất phải lớn hơn rất nhiều (16177
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
16




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

loài đã đƣợc xác định bởi National Center for Biotechnology Information vào
năm 2005).
Đất là một mơi trƣờng thích hợp của vi sinh vật vì nó có chứa các khống
chất với các kích cỡ, hình dạng và tính chất khác nhau kết hợp cùng với hệ vi
sinh vật đất và các hợp chất hữu cơ trong các quá trình phân hủy. Các dạng đất
sét hữu cơ phức tạp và sự ổn định của các phân tử đất sét, cát và phù sa thông
qua sự tập hợp là các tính chất cấu trúc nổi bật của hỗn hợp đất. Các khu hệ vi
sinh cho các vi sinh vất đất bao gồm bề mặt của các thành phần của đất và các
cấu trúc lỗ phức tạp có trong đất.
Trong khi đó, phƣơng pháp ni cấy trực tiếp hoặc không trực tiếp để
khám phá và khai thác sự đa dạng của hệ vi sinh vật có trong đất.
Kỹ thuật độc lập với nuôi cấy: Để vƣợt qua các hạn chế trong phƣơng
pháp nuôi cấy trực tiếp vi sinh vật đất, một phƣơng pháp phân tử dựa trên sự
phân lập và phân tích các nucleic acid trong đó chủ yếu là DNA từ các mẫu đất
mà không cần nuôi cấy trong phịng thí nghiệm đã đƣợc phát triển. Các khảo sát
phát sinh loài vẫn tiếp tục với việc sử dụng phƣơng pháp PCR với ở gen 16S
rRNA của vi sinh vật đất sử dụng các cặp mồi phổ biến cho vi khuẩn và cổ
khuẩn. Những khảo sát này cho phép liệt kê và so sánh sự đa dạng trong các mơi
trƣờng sống khác nhau, phân tích sự thay đổi trong cấu trúc hệ sinh thái do sự
thay đổi của các tác nhân. Các gen chỉ thị khác đƣợc sử dụng để nghiên cứu sự
đa dạng hệ vi sinh vật bao gồm dnaK (HSP-70-type molecular chaperone) và
amoA (ammonia monooxygenase). Tuy nhiên, các nghiên cứu về sự đa dạng của
môi trƣờng đất vẫn chỉ mới bắt đầu.
Xây dựng thư viện gen DNA: Mặc dù việc lập thƣ viện gen của vi sinh vật
đất là phụ thuộc vào kích cỡ của metagenome vi sinh vật đất và số lƣợng lớn các
dòng gen và yêu cầu hiểu biết đầy đủ về chúng là một nhiện vụ phức tạp và khó
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

17




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

khăn. Việc nghiên cứu metagenomic ở vi sinh vật đất phải thông qua việc xây
dựng thƣ viện DNA và xác định chức năng của các gen có trong thƣ viện này.
Những năm gần đây, các tiến bộ mới trong phƣơng pháp đọc trình tự đã mang
đến bƣớc đột phá mới trong việc xây dựng thƣ viện gen, giảm bớt đáng kể các
bƣớc thực hiện trong công nghệ metagenomics (Metzker 2010; Mardis 2008).
Công nghệ này đã góp phần xác định vai trị của các vi sinh vật khác nhau trong
phức hệ vi sinh vật đất, nghiên cứu phân tích hệ vi sinh vật của các mẫu đất khác
nhau và sản xuất các chế phẩm mới từ vi sinh vật đất. Trong các nghiên cứu gần
đây, nhiều gen mã hóa các enzyme có ích và kháng sinh đã đƣợc phát hiện nhờ
nghiên cứu phân tích thƣ viện gen của các vi sinh vật đất, việc xác định các gen
mới này đã nói lên tiềm năng to lớn của việc xây dựng và phân tích thƣ viện gen
của các vi sinh vật đất (Hardeman and Sjoling 2007; Lussier et al., 2011).
Nhƣ vậy mặc dù gặp phải những trở ngại khó khăn ban đầu nhƣ q trình
tách DNA khỏi các tạp chất, số lƣợng khổng lồ các vi sinh vật tồn tại trong môi
trƣờng đất, xây dựng thƣ viện metagenomic, xác định chức năng của các gen
mới v.v… nhƣng cùng với những bƣớc phát triển đột phá trong phƣơng pháp
đọc trình tự và cơng cụ tin sinh học cơng nghệ metagenomics hiện nay đã đạt
đƣợc những thành tựu đáng kể và ngày càng đƣợc quan tâm phát triển hơn. Ứng
dụng công nghệ metagenomics đã xác định đƣợc phần lớn các vi sinh vật có mặt
trong mơi trƣờng đất, so sánh mức độ đa dạng giữa các môi trƣờng khác nhau,
đánh giá sự thay đổi về cấu trúc thành phần của hệ vi sinh vật dƣới tác động của

các tác nhân khác nhau lên môi trƣờng. Ngày nay số lƣợng lớn dữ liệu thu đƣợc
từ công nghệ metagenomics đã đƣợc công bố rộng rãi, không những tạo điều
kiện thuận lợi cho các nhà khoa học nghiên cứu phân tích các gen mới mà cịn
mở ra những hƣớng mới góp phần cải thiện nâng cao sản xuất nơng nghiệp,
cơng nghiệp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
18




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật metagenomics và xây dựng thƣ viện
metagenom cho phép đánh giá đa dạng di truyền và phƣơng pháp trao đổi chất
của các vi sinh vật không thể nuôi cấy trong quần thể vi sinh vật (Handelsman
2004; Iqbal et al., 2012). Các vector tách dịng thích hợp cho nghiên cứu
metagenomics bao gồm BAC, cosmid và plasmid. Phân tích các dịng vơ tính ở
các bƣớc tiếp theo có thể thực hiện bằng cách đọc trình tự hoặc thơng qua các
cơng cụ sàng lọc chức năng. Việc phân tích dựa trên kết quả đọc trình tự có thể
tiến hành theo phƣơng pháp shotgun metagenome hoặc touchdown PCR với các
cặp mồi đặc hiệu cho các gen quan tâm (Iqbal et al., 2012).
1.3.

Ứng dụng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới trong nghiên cứu

metagenomics
1.3.1. Các thế hệ máy giải trình tự trên thế giới

Ngày nay, các công ty thƣơng mại trên thế giới đã cho ra đời các thế hệ
máy đọc trình tự dựa trên nhiều công nghệ mới (Next Generation Sequencing NGS). Các kỹ thuật đọc trình tự gen đã trở nên đơn giản và nhanh hơn nhờ sự
ứng dụng huỳnh quang phân tích tự động (Olsvik et al., 1993; Pettersson et al.,
2009). Các cơng nghệ đọc trình tự mới ln hƣớng tới làm tăng dung lƣợng
(throughput), làm giảm thời gian và giá thành (Schadt et al., 2010). Mặc dù vậy,
phƣơng pháp Sanger (dựa trên cơ sở kết hợp của các dideoxynucleotide
(ddNTP) bằng DNA polymerase trong quá trình khuếch đại DNA in vitro) đƣợc
sử dụng rộng rãi trong nhiều năm trƣớc đây vẫn đƣợc thực hiện xen kẽ khi cần
thiết (Sanger et al., 1977).
Đọc trình tự đƣợc thực hiện sau phản ứng khuếch đại DNA (nhƣ ở
phƣơng pháp Sanger) đƣợc thay thế bằng đọc trình tự thực hiện ngay trong giai
đoạn tổng hợp sợi DNA bổ sung cho sợi khuôn (phƣơng pháp pyrosequencing)
(Nyrén, 2007; Ronaghi et al., 1996, 1998). Đây là công nghệ khởi đầu cho kỹ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
19




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

thuật “đọc trình tự bằng tổng hợp”, nền tảng của kỹ thuật đọc trình tự bộ gen hay
cịn gọi là kỹ thuật đọc trình tự thế hệ mới sau này. Với ƣu thế thời gian đọc
nhanh, trình tự đọc đƣợc rất chính xác, cƣờng độ phát quang định lƣợng đƣợc
nên dù trình tự đọc đƣợc không dài (<100 bases) nhƣng pyrosequencing thể hiện
rõ ƣu thế hơn hẳn phƣơng pháp Sanger và trở thành một kỹ thuật khơng thể
thiếu trong các phịng thí nghiệm sinh học phân tử (Poehlmann et al., 2007).
Nguyên lý đọc trình tự gen thế hệ mới: theo 2 nguyên lý chính bao gồm

đọc trình tự bằng tổng hợp (sequencing by synthesis, SBS) đã đƣợc các thế hệ
máy Roche 454, Ion Torrent và Illumina sử dụng. SBS liên quan đến việc sử
dụng một hỗn hợp các dNTP đƣợc biến đổi tại vị trí 2’ bao gồm các dNTP bổ
sung tự nhiên và có đánh dấu huỳnh quang. Quá trình xác định trình tự sẽ diễn
ra tƣơng tự nhƣ phản ứng PCR. Về mặt lý thuyết, độ dài đoạn đƣợc đọc bằng
SBS có thể lên đến hàng trăm base. Nguyên lý thứ hai đó là đọc trình tự gắn nối
(sequencing by ligation, SBL) đƣợc sử dụng ở máy SOLiD do George Church
phát minh. SBL đã đƣợc sử dụng để xác định trình tự genome và là nền tảng cho
các thiết bị đọc trình tự thế hệ mới. SBL là một chu trình tuần hồn gồm 4 bƣớc.
SBL hoạt động trong cả hai chiều: chiều xuôi (5 'đến 3') và chiều ngƣợc (3 'đến
5') (Margulies et al., 2005; Schuster, 2008; Rusk, 2011, Mardis, 2008, Valouev
et al., 2008).
1.3.2. Cơng nghệ giải trình tự Illumina (Solexa) sequencing
Ngun lý cơng nghệ
Cơng nghệ giải trình tự của Illumina sử dụng các array đơn dịng và cơng
nghệ khóa dừng thuận nghịch cho việc giải trình tự trên diện rộng với độ chính
các cao. Hệ thống giải trình tự linh hoạt, hiện đại cho phép thực hiện một loạt
các ứng dụng nghiên cứu genomics, transcriptomics, và epigenomics. Các
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
20




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

template giải trình tự đƣợc cố đình trên bề mặt một flow cell (1 loại chip DNA)
đƣợc thiết kế để tạo ra 1 dạng DNA hỗ trợ hoạt động các enzyme trong khi đảm

bảo độ bền của các template bám trên bề mặt và mức độ bám trên bề mặt và
mức độ bám không đặc hiệu thấp của các nucleotide đánh dấu huỳnh quang.
Quá trình nhân bản trên pha rắn tạo ra tới 1000 bản copy giống hệt nhau của mỗi
template trong trạn thái đứng sát nhai (trong đƣờng kính < 1 µm). Vì q trình
này khơng bao gồm việc ghi ảnh, thực hiện thao tác cơ học, hay đặt các hạt bead
vào các giếng, nên mật độ của các cluster trên đơn vị diện tích đƣợc đảm bảo.
Cơng nghệ giải trình tự bằng tổng hợp (SBS) sử dụng 4 nucleotide đánh
dấu huỳnh quang để giải trình tự hàng chục triệu cluster đồng thời trên bề mặt
flow-cell. Trong mỗi chu trình giải trình tự, một deoxynucloside triphosphate
đánh dấu (dNTP) đƣợc thêm vào chuỗi acid nucleic. Nhãn huỳnh quang của
nucleotide đóng vai trị nhƣ một khóa dừng phản ứng polymer hóa, do đó sau
khi mỗi dNTP đƣợc tích hợp, dye huỳnh quang đƣợc ghi lại để xác định
nucleotide và sau đó bị cắt bỏ để tổng hợp nucleotide tiếp theo. Vì cả 4 loại
dNTP gắn khóa dừng tổng hợp thuận nghịch có mặt đồng thời dƣới dạng đơn
phân tử, sự cạnh tranh ngẫu nhiên giúp giảm thiểu việc tổng hợp mất cân đối.
Việc xác định các base dựa trực tiếp vào cƣờng độ tín hiệu đo đƣợc trong mỗi
chu trình, từ đó giảm thiểu các sai số thô so với công nghệ khác.
Ưu nhược điểm của hệ thống
Phƣơng pháp giải trình tự của Illumina dựa trên số lƣợng cực lớn các
đoạn đọc trình tự đồng thời. Khối lƣợng mẫu lớn và độ bao phủ đồng nhất đƣợc
sử dụng để tạo ra một tổng thể và một độ tin cậy cao đƣợc đảm bảo trong việc
xác định các biến dị di truyền. Khối lƣợng mẫu lớn cho phép sử dụng các công
cụ thống kê và cho điểm, tƣơng tự nhƣ các phƣơng pháp truyền thống trong việc
xác định thể đồng hợp, dị hợp và phân biệt các lỗi giải trình tự. Mỗi base đọc thơ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
21

Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

có một điểm số chất lƣợng do đó phần mềm có thể sử dụng một số công cụ định
lƣợng trong việc xác định sự sai khác và cho điểm số tin cậy.
Phần mềm thu nhận dữ liệu của Illumina cho phép ngƣời dùng xếp các
trình tự vào một vùng tham chiếu (mẫu) của các ứng dụng giải trình tự. Đƣợc
phát triển dựa trên sự hợp tác của các nhà nghiên cứu, phần mềm bao gồm các
module thu nhận dữ liệu, xử lý và phân tích tạo thành một chuỗi thu nhận và xử
lý dữ liệu với sự can thiệp ít nhất từ ngƣời sử dụng. Định dạng mở của phần
mềm cho phép dễ dàng truy nhập dữ liệu tại nhiều giai đoạn của quá trình xử lý
và phân tích dữ liệu sử dụng các giao duện chƣơng trình đơn giản.
Một quy trình một chiều, khả năng tự đơng hóa cao u cầu thời gian thao
tác ít nhất. Với khả năng tạo ra hàng Gb dữ liệu DNA trong một lần chạy, ngay
cả các genome lớn của các động vật có vú có thể giải trình tự trong một vài tuần
thay vì một vài năm nhƣ trƣớc kia. Khả năng chạy nhiều mẫu trên 1 flow cell
đồng nghĩa với việc có thể thực hiện nhiều ứng dụng trong một lần chạy.
Một nhƣợc điểm của hệ thống máy giải trình tự của Illumina đó là việc sử
dụng các hóa chất và các thiết bị có giá thành ở mức cao. Chính vì vậy, với
nhƣng nghiên cứu ở quy mơ nhỏ với kinh phí thấp sẽ ít có cơ hội đƣợc thực hiện
trên hệ thống này.
Ứng dụng của cơng nghệ Illumina
Ứng dụng của hệ thống giải trình tự Illumina là rất đa dạng, hệ thống này
cho phép các nhà khoa học nghiên cứu nhiều lĩnh vực trong ngành khoa học sự
sống. Illumina cho phép giải mã một hệ gen hoàn chỉnh trong thời gian ngắn, so
sánh với các công nghệ trƣớc đây. Cụ thể trong việc giải mã một hệ gen ngƣời
hồn chỉnh, với các cơng nghệ trƣớc đây chúng ta phải mất tới 10 năm, thì hiện
nay với công nghệ Illumina chúng ta chỉ mất tới 4 ngày. Công nghệ này cho
phép ứng dụng trong lĩnh vực y tế và bảo vệ sức khỏe cộng đồng, thông qua việc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
22




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

giải mã hệ gen của các vi sinh vật, các virus, các tác nhân gây bệnh; phân tích,
phát hiện các điểm đột biến; phân tích các hệ gen phiên mã. Bên cạnh đó, với
các nghiên cứu về biểu hiện gen phục vụ công nghiệp dƣợc đáp ứng thuốc,
nghiên cứu sự tác động của thuốc tới tế bào, Ứng dụng của Illumina cho phép
thay thế các cơng cụ trƣớc đây, cụ thể nhƣ microarray. Ngồi ra các công nghệ
hiện nay vẫn đang cải tiến liên tục, cho phép phát triển nhiều hơn nữa các ứng
dụng phục vụ trong đa dạng các lĩnh vực (Ayman and Weinbrecht 2013).
1.4.

Các nghiên cứu metagenomics trên thế giới và Việt Nam

Các nghiên cứu từ trƣớc cho thấy rằng phần lớn các vi sinh vật tồn tại
trong môi trƣờng xung quanh chúng ta không thể nuôi cấy trên môi trƣờng nhân
tạo trong phịng thí nghiệm và do đó khơng thể xác định trình tự DNA cũng nhƣ
nghiên cứu phân tích (Amann et al., 1995). Những nghiên cứu đầu tiên về
metagenomics đã tập trung phân tích trình tự 16S rRNA, những trình tự này
thƣờng ngắn, mang tính bảo thủ cao trong cùng một loài và khác nhau giữa các
loài (Woese 1987; Beja et al., 2002). Các nhà khoa học đã phát hiện nhiều trình
tự 16S rRNA đƣợc tìm thấy khơng thuộc về bất kỳ loài nào đã đƣợc phân lập
trƣớc đây. Điều này cho thấy rằng đã có rất nhiều lồi vi sinh vật bị bỏ sót

khơng đƣợc nghiên cứu đến. Phân tích trình tự các đoạn 16S rRNA thu trực tiếp
từ mơi trƣờng tự nhiên cho thấy rằng bằng phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống,
chúng ta chỉ có thể nghiên cứu đƣợc khoảng 1% số lƣợng các loài vi sinh vật tồn
tại trong mẫu tự nhiên thu đƣợc (Hugenholz et al., 2002). Theo Amann et al.
(1995) bằng các phƣơng pháp vi sinh truyền thơng chỉ có thể ni cấy khoảng
0.001–0.1% các lồi vi sinh vật biển, 0.25% loài vi sinh vật nƣớc ngọt, 0.25%
trong trầm tích và chỉ 0.3% sinh vật đất (Amann et al., 1995).
Công nghệ metagenomics ra đời đã khắc phục đƣợc những hạn chế của các
phƣơng pháp truyền thống, hƣớng sự tập trung nghiên cứu vào các vi sinh vật chƣa
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
23




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

đƣợc chú ý đến. Bằng cách phân lập và nghiên cứu trực tiếp genome của tồn bộ
các vi sinh vật tồn tại trong một mơi trƣờng nghiên cứu, ta có thể có thơng tin di
truyền của hệ vi sinh vật ở đó mà khơng cần phải phân lập và nuôi cấy từng tế bào
riêng lẻ.
Ngƣời đầu tiên đƣa ra ý tƣởng nhân bản trực tiếp các mẫu DNA từ môi
trƣờng là Pace và cộng sự, họ đã chứng minh sự tồn tại của một hệ sinh vật phức
tạp chƣa từng đƣợc nghiên cứu đến (Pace et al., 1986). Năm 1991, Pace and
Delong đã công bố nghiên cứu phân lập các gen cấu trúc từ thƣ viện gen của hệ
vi sinh vật phát triển trên cỏ khơ trong điều kiện phịng thí nghiệm (Pace and
Delong 1991). Năm 2002, Breitbart et al. (2002) sử dụng công nghệ
metagenomics cho thấy trong 200 lít nƣớc biển chứa hơn 5000 loại virus khác

nhau (Breitbart et al., 2002). Các nghiên cứu sau đó cho thấy rằng có hơn một
nghìn lồi virus trong phân của con ngƣời và khoảng một triệu loại virus khác
nhau cho mỗi kg trầm tích biển, bao gồm cả thể thực khuẩn (Torsvik et al.,
2002; Turnbaugh et al., 2007; Tringe et al., 2005; Rusch et al., 2007). Về cơ
bản tất cả các virus đã đƣợc phát hiện trong các nghiên cứu này đều là những
loài chƣa từng đƣợc phát hiện. Năm 2004, Tyson và các đồng nghiệp tại Đại học
California, Berkeley đã xác định trình tự DNA của hệ vi sinh vật có trong nƣớc
thải nhiễm acid (Tyson et al., 2004). Đây là một bƣớc tiến quan trọng xác định
đƣợc bộ gen hoàn chỉnh, hoặc gần nhƣ hoàn chỉnh của một số vi khuẩn mà trƣớc
đây chƣa nuôi cấy thành công (Hugenholz 2002).
Từ năm 2003, Venter đã đi vòng quanh trái đất bằng đƣờng biển nhằm thu
thập các mẫu và sử dụng cơng nghệ metagenomics với mục đích xác định các
genome (và theo đó là các sinh vật) mới. Dự án thí điểm, tiến hành trong vùng
biển Sargasso, phát hiện DNA của gần 2000 loài khác nhau, trong đó có 148 lồi
vi khuẩn chƣa bao giờ đƣợc xác định trƣớc đây (Venter et al., 2004). Phân tích
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
24




Luận văn Thạc sĩ

Hồ Mạnh Tường

hệ sinh vật đất sử dụng công nghệ metagenomics xuất hiện chậm hơn so với
những nghiên cứu phân tích hệ sinh vật biển do trong đất thƣờng tồn tại những
hợp chất liên kết với DNA hoặc ức chế phản ứng PCR, gây khó khăn cho việc
nhân bản các mẫu DNA từ đất (Daniel, 2005). Tuy nhiên trong những năm gần
đây những tiến bộ đáng kể trong nghiên cứu hệ vi sinh vật đất, xây dựng các thƣ

viện gen của các vi sinh vật này đã giúp các nhà khoa học hiểu rõ hơn về hệ sinh
vật phức tạp này (Kakirde et al., 2010; Parachin et al., 2011).
Các tiến bộ trong kỹ thuật đọc trình tự DNA đã mở ra phƣơng pháp tiếp
cận mới cho công nghệ metagenomics. Năm 2006, các nhà khoa học tại Đại học
Penn State đã cơng bố các trình tự thu đƣợc từ một mẫu môi trƣờng bằng
phƣơng pháp pyrosequencing sử dụng kỹ thuật đọc trình tự 454 – kỹ thuật cho
phép đọc tới 400-600 megabases DNA chỉ trong vòng 10 giờ (Poinar et al.,
2006). Kỹ thuật này ra đời cho phép đọc trình tự nucleotit của hệ sinh vật ở quy
mơ lớn trong một thời gian ngắn (Edwards et al., 2006). Gần đây công nghệ sinh
học đã thay đổi cách tiếp cận trong việc xác định các gen mới, nghiên cứu chức
năng của các gen, phân tích thành phần lồi và các hệ vi sinh vật... Kỹ thuật
metagenomics là một lĩnh vực nghiên cứu mới, đang phát triển mạnh mẽ trong
hơn một thập kỷ qua, đã giúp xác định hệ gen của các vi sinh vật không thể nuôi
cấy, một mặt hoàn thiện những hiểu biết của con ngƣời về các lồi vi sinh vật
trên trái đất, mặt khác góp phần giải quyết nhu cầu tìm kiếm các enzyme và hợp
chất sinh học có ích (Schmeisser et al., 2007; Bomar et al., 2011).
Các nghiên cứu phân tích thành phần và hoạt động của các hệ vi sinh vật
tự nhiên cho thấy tiềm năng sản xuất từ các vi sinh vật này các hợp chất sinh học
có giá trị cao sử dụng trong y tế nhƣ thuốc kháng sinh, các chất chống ung thƣ
và ức chế miễn dịch (Raaijmakers et al., 2002). Sử dụng kỹ thuật metagenomic
để đánh giá tiềm năng và hoạt tính sinh học của quần thể vi sinh vật khơng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN
25