Nghiên cứu môi trường nhân giống in vitro lan hoàng thảo dendrobium sonia và giá thể đưa cây ra ngoài tự nhiên

..

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
-----------------

TRẦN THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU MƠI TRƢỜNG NHÂN GIỐNG
IN VITRO LAN HỒNG THẢO (DENDROBIUM SONIA)
VÀ GIÁ THỂ ĐƢA CÂY RA NGOÀI TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN, NĂM 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
-----------------

TRẦN THANH HUYỀN

NGHIÊN CỨU MƠI TRƢỜNG NHÂN GIỐNG
IN VITRO LAN HỒNG THẢO (DENDROBIUM SONIA)
VÀ GIÁ THỂ ĐƢA CÂY RA NGOÀI TỰ NHIÊN

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60.42.30

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. NGUYỄN THỊ TÂM

THÁI NGUYÊN, NĂM 2012

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




i

LỜI CẢM ƠN
Trong q trình thực hiện luận văn, tơi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ
của nhiều cá nhân và cơ quan đơn vị. Nay luận văn đã hồn thành, tơi xin bày tỏ
lịng biết ơn chân thành, sâu sắc tới:
PGS. TS. Nguyễn Thị Tâm, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều
kiện, giúp đỡ tơi nghiên cứu và thực hiện đề tài.
Các thầy giáo, cô giáo thuộc Khoa Sinh - KTNN, Khoa Sau đại học, trường
Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tình giảng dạy và tạo mọi điều
kiện cho tơi hồn thành khóa học.
Các cán bộ, kỹ thuật viên phòng Công nghệ tế bào thực vật –Trường Đại học
Sư phạm – Đại học Thái Nguyên đã nhiệt tì nh hướng dẫn , giúp đỡ và tạo mọ i điều
kiện cho tôi thực hiện luận văn . Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền
Nông nghiệp Việt Nam đã cung cấp mẫu vật nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình và
bạn vè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập.
Thái Nguyên, tháng 8 năm 2012

Học viên

Trần Thanh Huyền

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ii

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 3
1.1. Vài nét về phân loại và đặc điểm của phong lan ..................................... 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật học của họ lan....................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm thực vật học của chi lan HoàngThảo (Dendrobium) .......... 4
1.1.3. Đặc diểm thực vật học của lan Dendrobium Sonia ........................... 4
1.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật trong công tác
nhân giống cây trồng ........................................................................................ 5
1.2.1. Các hướng nghiên cứu ứng dụng...................................................... 5
1.2.2. Ưu thế của nhân giống in vitro ......................................................... 6
1.2.3. Các phương thức nhân giống in vitro ............................................... 6
1.2.4. Quy trì nh nhân giống in vitro ........................................................... 8
1.3. Một số nghiên cứu nhân giống lan bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro ...... 9
1.3.1. Các nghiên cứu trong nước............................................................... 9
1.3.2. Các nghiên cứu của nước ngoài...................................................... 11
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 13
2.1. Vật liệu ...................................................................................................... 13
2.2. Phƣơng pháp nghiên cƣ́u ........................................................................ 14

2.2.1. Phương pháp pha môi trường và nuôi cấy...................................... 15
2.2.2. Nghiên cứu môi trường nuôi cấy .................................................... 16
2.2.3. Phương pháp ra cây ........................................................................ 17
2.2.4. Phương pháp tính toán kết quả ....................................................... 18
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 19
3.1. So sánh ảnh hƣởng của môi trƣờng nuôi cấy MS và Phytamax tới sự
phát sinh chồi và tạo protocorm lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) .... 19
3.2. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm cytokinin
tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm lan Hoàng Thảo (Dendrobium
Sonia) ................................................................................................................ 20

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




iii

3.2.1. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm lan
Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ............................................................ 20
3.2.2. Ảnh hưởng của kinetin lên sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan
Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ............................................................ 23
3.3. Ảnh hƣởng của các chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm auxin tới
sự phát sinh rễ lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ................................. 26
3.3.1. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng α-NAA đến sự phát
sinh rễ của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) .................................... 26
3.3.2. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IAA đến sự phát sinh rễ
của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ................................................ 28
3.3.3. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng IBA đến sự hình thành
rễ của lan Hoàng thảo (Dendrobium Sonia) ............................................. 29

3.4. Ảnh hƣởng của tổ hợp các chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm
cytokinin và auxin đến sự sinh trƣởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium
Sonia) ................................................................................................................ 33
3.4.1. Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và α-NAA
đến sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ................. 33
3.4.2. Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IAA đến
sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia)........................ 34
3.4.3. Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IBA đến
sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia)........................ 36
3.4.4. Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và

α-

NAA đến sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ....... 38
.3.4.5. Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IAA
đến sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ................. 40
3.4.6. Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IBA
đến sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ................. 41
3.5. Ảnh hƣởng của giá thể đến sự sinh trƣởng của lan Hoàng Thảo
(Dendrobium Sonia) ........................................................................................ 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................ 46
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 47
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




iv

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS ................................................... 13
Bảng 2.2. Thành phần cơ bản của môi trường Phytamax ......................................... 14
Bảng 3.1. So sánh ảnh hưởng của môi trường MS và Phytamax tới sự phát sinh chồi
và tạo protocorm ở lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ....................................... 19
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Hoàng
Thảo (Dendrobium Sonia)......................................................................................... 22
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan
Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ............................................................................. 25
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của α-NAA tới sự phát sinh rễ ở lan Hoàng Thảo
(Dendrobium Sonia) .................................................................................................. 27
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của IAA tới sự phát sinh rễ ở lan Hoàng Thảo
(Dendrobium Sonia) .................................................................................................. 29
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của IBA tới sự phát sinh rễ ở lan Hoàng Thảo
(Dendrobium Sonia) .................................................................................................. 31
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và α-NAA tới sự
sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ............................................. 33
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IAA tới sự
sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ............................................. 34
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng BAP và IBA tới sự
sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ............................................. 37
Bảng 3.10. Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và α-NAA tới
sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ........................................ 39
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IAA ....... 40
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của tổ hợp chất kích thích sinh trưởng kinetin và IBA tới sự
sinh trưởng của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ............................................. 42
Bảng 3.13. Sự phát triển của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) trên một sớ giá
thể ngồi mơi trường ni cấy .................................................................................. 44

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

v

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Lan Hồng Thảo (Dendrobium Sonia)..................................................... 5
Hình 3.1. So sánh ảnh hưởng của mơi trường MS và Phytamax tới sự phát sinh chồi
và tạo protocorm ở lan Hồng Thảo (Dendrobium Sonia) ....................................... 20
Hình 3.2. Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Hồng
Thảo (Dendrobium Sonia)......................................................................................... 23
Hình 3.3. Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan
Hồng Thảo (Dendrobium Sonia) ............................................................................. 26
Hình 3.4. Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin tới sự
phát sinh rễ của lan Hoàng Thảo (Dendrobium Sonia) ............................................. 32
Hình 3.5. Ảnh hưởng của tổ hợp các chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin
và cytokinin tới sự sinh trưởng của lan Hồng Thảo (Dendrobium Sonia) .............. 43
Hình 3.6. Hình ảnh về sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo trên một sớ giá thể ...... 45

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




vi

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

α-NAA

α-naphthaleneacetic axit

ABA

Abscisic axit

BAP

Benzylamino purine

IAA

Indol axetic axit

IBA

Indol butyric axit

KC

Knudson C

MS

Murashige and Skoog

RE

Robert Ernst

VW

Vacin and Went

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1

MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật đã trải qua hơn một trăm năm hình
thành và phát triển, đem lại giá trị to lớn cho loài người. Hiện nay, hầu hết các cơ sở
nghiên cứu giống cây trồng trên thế giới đều áp dụng cơng nghệ này với các mục
đích khác nhau.
Ở Việt Nam, kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã được bắt đầu nghiên
cứu và ứng dụng từ giữa những năm 70 của thế kỷ XX. Những kết quả bước đầu
trong nghiên cứu và ứng dụng đã đạt kết quả khả quan đối với một số đối tượng cây
trồng như ch́i, khoai tây, mía, lúa…, đặc biệt là phong lan.
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm mưa nhiều, là điều
kiện lý tưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của hoa lan. Trong thế giới các loài
hoa, hoa lan được ưa chuộng hơn cả. Hoa lan có đặc điểm là cấu hình lạ, màu sắc
đẹp, độ bền hoa cao. Ngoài giá trị tinh thần thẩm mỹ, hoa lan cịn có ý nghĩa lớn trong
nền kinh tế q́c dân. Lồi hoa này từ lâu đã được con người thuần hoá, sưu tầm, nhập
nội, thuần dưỡng các giống ngoại và lai tạo để tạo ra hàng nghìn giớng có màu sắc và
hương thơm như ý ḿn phục vụ nhu cầu của con người.
Việt Nam có hàng trăm loài lan được trồng rộng rãi trên khắp đất nước. Hoa
lan như một loại cây quan trọng trong chuyển dịch cơ cấu cây trồng trong nông

nghiệp đô thị và ven đô. Một số loại lan nhập nội đã nhanh chóng khẳng định ưu thế
của nó và được phát triển với quy mơ đáng kể, trong sớ đó phải kể đến lan Hoàng
Thảo lai (Dendrobium hybrids). Lan Hoàng Thảo lai hấp dẫn người tiêu dùng bởi
màu sắc và độ bền hoa, dễ trồng và đặc biệt có giá trị kinh tế cao, cho thu nhập lớn
với ngành trồng hoa trong nước.
Song song với việc sưu tập, nhập nội các giớng lan Hồng Thảo lai
(Dendrobium hybrids) thì việc nghiên cứu, hoàn thiện các biện pháp kỹ thuật để tạo
điều kiện nâng cao năng suất, chất lượng là thực sự cần thiết. Đồng thời cần nhân rộng
các mô hình trồng lan Hoàng Thảo lai (Dendrobium hybrids) tại miền Bắc Việt
Nam nhằm phục vụ nhu cầu ngày càng lớn của thị trường. Trong nhóm lan
Dendrobium thì Dendrobium Sonia (Dendrobium Gracia Lewis × Dendrobium
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




2

Lady Constance) là loài chủ lực để trồng nhằm mục đích cắt cành. Chính vì vậy, đề
tài chọn Dendrobium Sonia là vật liệu nghiên cứu.
Xuất phát từ yêu cầu thực tế khách quan đó và để góp phần phát triển ngành
ni trồng lan Hồng Thảo có hiệu quả, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Nghiên cứu môi trường nhân giống

in vitro lan Hoàng Thảo (Dendrobium

Sonia) và giá thể đưa cây ra ngoài tự nhiên”
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
- Xác định được môi trường tối ưu trong nhân giống in vitro lan Hoàng Thảo
Dendrobium Sonia.

- Xác định được giá thể thí ch hợp để đưa cây lan Hoàng Thảo Dendrobium
Sonia từ trong ống nghiệm ra môi trường tự nhiên.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường cơ bản MS và Phytamax đến sự sinh
trưởng của lan Hồng Thảo
- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin
đến sự phát sinh chồi và sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo.
- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng thuộc nhóm auxin
đến phát sinh rễ và tạo cây hoàn chỉnh.
- Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp các chất kí ch thí ch sinh trưởn

g tḥc

nhóm auxin và nhóm cytokinin lên sự sinh trưởng của lan Hoàng Thảo.
- Nghiên cứu tìm ra loại giá thể thích hợp nhất cho ra cây lan Hồng Thảo (xơ
dừa, tảo, than củi …).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




3

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. VÀI NÉT VỀ PHÂN LOẠI VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA PHONG LAN
1.1.1. Đặc điểm thực vật học của họ lan
Họ lan (Orchidadeae) là họ phong phú, đa dạng và phức tạp, mọc ở nhiều môi
trường khác nhau và được chia làm 4 loại như sau:
Epiphytes: Phong lan bám vào cành hay thân cây

Teretrials: Địa lan mọc dưới đất
Lithophytes: Thạch lan mọc ở kẽ đá
Saprophytes: Hoại lan mọc trên lớp rêu hoặc gỗ mục.
Căn cứ vào cấu trúc, Pfitzer sắp xếp đa số lan tập trung vào hai nhóm: nhóm
đa thân (Sympodial) và nhóm đơn thân (Monopodial). Ngồi ra cịn có một sớ giớng
rất ít thuộc nhóm trung gian [6].
1.1.1.1. Rễ lan
Ở nhóm lan đa thân, rễ thường được hình thành từ căn hành, nhóm đơn thân
thì rễ mọc thẳng từ thân và thường xen kẽ với lá. Rễ trên khơng của các lồi lan phụ
sinh có một trục chính bao quanh bởi mơ khơng chặt, mô xốp bao quanh gọi là mạc
(Velamen), các tế bào khi khơ chỉ chứa khơng khí.
Khi sớng ở đất, chúng thường có củ giả, rễ to mập tương đới ít phân nhánh, nó
thuộc tổ chức có chất thịt. Cấu tạo của rễ lan chia làm 3 tầng: tầng ngoài, tầng giữa
và tầng trong. Tầng ngoài là lớp vỏ rễ, tác dụng chủ yếu là hút và giữ nước. Tầng
giữa là thịt rễ, phần lớn là tổ chức tế bào sống, chứa rất nhiều nấm rễ cộng sinh.
Tầng trong là gân rễ có sự liên kết tương đới dẻo dai [9].
1.1.1.2. Thân lan
Chiều cao thân của lan cũng thường biến động rất lớn từ 10 - 20cm, như với
các loài Ascocentrum miniatum, Aecides multiflora và có thể cao 3 - 4m như các loài
Papilionantheteres, Archinis hoặc khổng lồ như A campe, A. vanilla... Thân thường
mang rễ và lá. Ở nhóm đơn thân, rễ và lá thường mọc theo hai chiều thẳng góc với
nhau. Cành hoa cũng xuất hiện trên thân từ các nách lá, cành hoa thường mọc song
song với lá và thẳng góc với rễ [9].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




4

1.1.1.3. Lá lan
Lá của lan là lá đơn nguyên, dầy cứng hay cũng có dạng mềm có gân ở giữa
nổi rõ, có lồi lá biến đổi thành vẩy hoặc tiêu biến hoàn toàn. Lá mọc đơn độc hoặc
xếp dày đặc ở gốc, hay xếp cách đều đặn trên thân, củ giả... Hình dạng lá thay đổi
rất nhiều, từ loại lá mọng nước, nạc, dài hình kim, hình trụ dài, tiết diện dài hay có
rãnh đến loại lá hình phiến mỏng, dài màu xanh bóng đậm hay nhạt tuỳ theo vị trí
sớng của cây. Đặc biệt rất hiếm loại lá hình trịn thn dài thành bẹ ơm lấy thân.
Phiến lá trải rộng hay gấp lại theo các gân vòng cung [9].
1.1.1.4. Hoa lan
Hoa lan thuộc hoa lưỡng tính rất hiếm gặp lồi đơn tính, bao hoa có dạng cánh
xếp thành hai vịng. Hoa lan có 3 cánh đài, thường có cùng màu sắc và kích thước. Tuy
nhiên các lồi lan khác nhau thì cánh đài có hình dạng biến đổi rất khác nhau. Dạng
hình trịn như các giớng Vanda, Ascocentrum, nhọn như Cattleya, xoắn như các lồi
thuộc giớng Laelia. Có khi hai lá đài thấp nằm ở hai bên dính lại thành một như chi
Oncidium [1],[3].
1.1.2. Đặc điểm thực vật học của chi lan HoàngThảo (Dendrobium)
Hoàng Thảo là những loài lan sống bám trên cây hay đá, mọc thành bụi
nhiều hành giả. Các giả hành có thể phân thành các đớt như cây tre. Nhiều lồi có
rãnh dọc theo giả hành. Rễ thuộc loại rễ chùm, có màu trắng và nhỏ hơn rễ của một
sớ lồi lan khác, rễ có khả năng tái sinh mạnh, khả năng hút nước và dinh dưỡng tớt.
Rễ lan Hồng Thảo nhỏ, tập trung ở gớc do đó cần giữ ẩm cho rễ.
Hồng Thảo có thân dài, được tạo bởi các đớt, trên các đớt có bẹ lá bao bọc,
mỗi đớt có 1 mầm ngủ, mầm ngủ này có khả năng tái sinh tạo thành một cá thể mới.
Hoa của lan Hoàng Thảo cũng mang đặc trưng chung của các lồi lan. Thuộc hoa
mẫu 3, có 6 cánh hoa, trong đó có 3 cánh đài, ở giữa là cánh môi. Màu sắc của hoa
rất phong phú và độ bền dài. Cuống hoa mọc ở đỉnh sinh trưởng của cây. Một thân
có thể có từ 1 - 4 cành hoa, mỗi cành hoa mang từ 5-16 hoa tùy theo giống, độ tuổi
của cây và điều kiện chăm sóc. Hoa có khả năng đậu quả rất cao [6].
1.1.3. Đặc diểm thực vật học của lan Dendrobium Sonia
Dendrobium Sonia là kết quả của phép lai giữa Dendrobium Gracia Lewis và

Dendrobium Lady Constance. Dendrobium Sonia có các đặc điểm như sau:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




5

Rễ Dendrobium Sonia thuộc hệ rễ chùm , màu trắng , có một lớp mơ hút ẩm
dày bao quanh gồm những lớp tế bào chết chứa đầy khơng khí nên rễ ánh lên màu
xám bạc. Rễ lan Dendrobium Sonia không chịu được lạnh nên rễ tập trung ở gớc.

Hình 1.1. Lan Hồng Thảo (Dendrobium Sonia)
Dendrobium Sonia thuộc nhóm đa thân dạng cộng trụ , thân dà i, tạo bởi các
đốt. Lá Dendrobium Sonia to, dày, nạc dài, màu xanh đậm, mọc đối xứng nhau, ôm
lấy thân . Hoa màu trắng tí m , tổ chức theo kiểu tam phân (mẫu 3): 3 lá đài, 3 cánh
hoa, 3 tâm bì . Trụ hoa là bộ phận sinh dục của hoa , có đồng thời cả cơ quan sinh
dục đực và cái nên được gọi là trục

- hợp - nhụy. Hoa mọc thành chùm, cành hoa

dạng thẳng đứng. Quả thuộc loại quả nang. Khi hạt chín, các nang bung ra. Quả có
nhiều hạt. Một quả chứa từ 10000 đến 100000 hạt, đôi khi đến 3 triệu hạt nên kích
thước rất nhỏ, phơi hạt chưa phân hóa.
1.2. ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT
TRONG CÔNG TÁC NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG
1.2.1. Các hƣớng nghiên cứu ứng dụng
Nhân giống in vitro là một trong những ứng dụng c hính của công nghệ tế bào
thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các điểm sinh trưởng hoặc các mô
phân sinh của cây . Theo các công trì nh thí nghiệm của Amato (1977), chỉ có đỉnh

sinh trưởng của chồi mới đảm bảo sự ổn định về di truyền , tiếp đến là mô phân sinh
với kí ch thước nhỏ , kết hợp với xử lý nhiệt để làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho
nhân giống.
Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng nhằm phục vụ cho các

mục đích chính

như: duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm , làm vật liệu cho cơng tác chọn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




6

giống; duy trì và nhân nhanh các cá thể đầu dòng để cung cấp hạt giống cho các loại
cây trồng khác nhau như cây lương thực có củ , cây rau , cây cảnh ...; nhân nhanh ở
điều kiện vô trùng cách ly tái nhiễm kết hợp với việc làm sạch bệnh virut , rút ngắn
thời gian đưa các cây lai và các cây tự nhiên có đặc điểm tốt ; bảo quản tớt tập đồn
giớng vơ tí nh về các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen [2], [16].
1.2.2. Ƣu thế của nhân giống in vitro
Hệ số nhân cao , rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất . Từ mợt cây trong
vịng 1-2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây . Nhân được số lượng cây lớn trong
mợt diện tí ch nhỏ, trong 1m2 có thể để 18000 cây [16], [18].
Làm sạch bệnh cây trồng và cách ly chúng với nguồn bệnh
giống sạch bệnh ; thuận tiện trong vận chuyển và bảo quản

, vì vậ y đảm bảo

(cây giống giữ ở 40C

trong hàng tháng vẫn cho tỷ lệ sớng 95%). Đồng thời, có thể sản xuất quanh năm
mà không phụ thuộc vào mùa vụ , có tiềm năng cơng nghiệp hoá cao [18].
1.2.3. Các phƣơng thức nhân giống in vitro
1.2.3.1. Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉ nh sinh trưởng
Theo Lê Trần Bì nh (1997), mô phân sinh nuôi cấy là mẫu vật nuôi cấy được
tách từ đỉnh sinh trưởng có kích thước trong vịng 0,1mm tí nh từ chóp của chóp
đỉ nh sinh trưởng . Tuy nhiên trong thực tế việc nuôi cấy mẫu vật như vậy rất kh

ó

thành cơng, người ta chỉ tiến hành nuôi cấy khi mục đí ch là làm sạch virut cho cây
trồng. Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉ nh sinh trưởng được tiến hành phổ biến nhất ở
các đới tượng phong lan , dứa, mía... đỉ nh sinh trưởng đượ c tách với kí ch thước 510mm [2].
Trong nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉ nh sinh trưở ng cần chú ý tới tương quan
giữa độ lớn chồi , tỷ lệ sống và mức độ ổn định về mặt di truyền của chồi, vì thông
thường nếu độ lớn của chồi t ăng thì tỷ lệ sống và mức độ ổn đị nh di truyền tăng
nhưng hiệu quả kinh tế giảm và ngược lại . Do vậy phải kết hợp giữa các yếu tố để
tìm ra phương pháp lấy mẫu tối ưu . Một đỉ nh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thí ch
hợp sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hồn
chỉnh có rễ đầy đủ . Nếu xét về nguồn gốc các cây tái sinh từ nuôi cấy nguyên liệu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




7

ban đầu là mô phân sinh hoặc đỉ nh sinh trưởng thì có ba khả năng: cây phát triể n từ
chồi đỉ nh (chồi ngọn ); cây phát t riển từ chồi nách phá ngủ ; cây phát triển từ chồi

mới phát sinh. Tuy nhiên trong thực tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi
mới phát sinh [12].
Có 2 phương thức hì nh thành cây tái sinh từ nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉ nh
sinh trưởng . Cây tái sinh trực tiếp từ chồi đỉ nh hoặc chồi nách phá ngủ
thức này chủ yếu ở các đối tượng

. Phương

2 lá mầm như : khoai tây, thuốc lá , cam, chanh,

hoa cúc, nhưng có cả cây 1 lá mầm như dứa sợi , mía... cây tái sinh qua giai đoạn
hình thành dẻ hành (protocorm), chủ yếu gặp ở các đối tượng một lá mầm như
phong lan , dứa, hoa huệ ... Gần đây phương thức này cũng bắt
được áp dụng có kết quả ở các cây ăn quả và cây lâm nghiệp

:

đầu được bắt đầu

, trong đó có cây quý

như cà phê, táo, lê, cây thông, bồ đề ... Tổng số có trên 30 chi khác n hau được ni
cấy thành cơng [2].
1.2.3.2. Tái sinh cây hồn chỉnh từ các bộ phận khác của cây
Vì tế bào thực vật có tính tồn năng nên ngồi mơ phân sinh và đỉnh sinh
trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành cơng , các bộ phận cịn lại của cơ thể thực vật
đều có thể thực hiện cho việc nhân giớng in vitro được. Các bộ phận đó là : đoạn
thân ở các đối tượng như ở thuốc lá , cam, chanh,...; mảnh lá ở thuốc lá, cà chua, bắp
cải...; cuống lá ở Nacissus; các bộ phận của hoa như súp lơ , lúa mì... và nhánh củ ở
hành tỏi [2].

1.2.3.3. Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo
Trong khuôn khổ của mục đí ch nhân giống vô tí nh , nếu tái sinh được cây hoàn
chỉnh trực tiếp từ mẫu vật ban đầu thì khơng những nhanh chóng thu được cây mà
cũng khá đồng đều về mặt di truyền . Tuy nhiên , trong nhiều trường hợp mô nuôi
cấy không tái sinh ngay mà phát triển thành khối mô sẹo

. Tế bào mô sẹo khi cấy

chuyển nhiều lần sẽ không ổn đị nh về mặt di truyền . Do đó , nhất thiết phải sử dụng
mô sẹo v ừa phát sinh (mô sẹo sơ cấp ) thì mới thu được cây tái sinh đồng nhất . Vì
vậy, người ta chỉ tiến hành nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đối với những đối
tượng khó tái sinh cây trực tiếp . Thơng qua giai đoạn mơ sẹo có thể thu được những
cây sạch virus [2].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




8

1.2.4. Quy trì nh nhân giống in vitro
1.2.4.1. Chuẩn bị cây làm vật liệu gốc
Vì trong nuôi cấy in vitro cây con sẽ mang những đặc tí nh và tí nh trạng của
cây mẹ ban đầu nên trong giai đ

oạn này cần chọn lọc cây mẹ cẩn thận

, cây mẹ

thường là cây có nhiều đặc tí nh ưu việt , khoẻ, có giá trị kinh tế cao. Sau đó, chọn cơ

quan để lấy mẫu thường là mô non , đoạn thân có chồi ngủ , lá non hoặc hoa non ...
Mơ chọn để ni cấy thường là mơ có khả năng tái sinh cao trong môi trường nuôi
cấy sạch bệnh , giữ được các đặc tí nh sinh học quý của cây mẹ , ít nguy cơ biến dị .
Tuỳ theo điều kiện, giai đoạn này có thể kéo dài 3-6 tháng [16].
1.2.4.2. Thiết lập hệ thống cấy vô trùng
Là giai đoạn chủn mẫu vật từ ngồi vào mơi trường nuôi cấy để tạo nguyên
liệu sạch bệnh cho nhân giống, giai đoạn này được tiến hành theo các bước :
Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các môi trường nuôi cấy.
Cấy mẫu vật vào ống nghiệm hoặc bì nh nuôi cấy có sẵn môi trường nhân tạo
(giai đoạn này là giai đoạn cấy mẫu in vitro).
Các mẫu nuôi cấy nếu không bị nhiễm khuẩn , nấm, virus sẽ được ni trong
phịng ni cấy với điều kiện nhiệt độ ánh sáng phù hợp

. Sau một thời gian nhất

đị nh, từ mẫu nuôi cấy đã bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc các cơ quan hoặc
các phôi vô tính . Giai đoạn này phụ tḥc vào từng đới tượ

ng đem nhân giống ,

thông thường kéo dài từ 2-12 tháng hoặc ít nhất 4 lần cấy chuyển [16].
1.2.4.3. Nhân nhanh chồi
Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống quyết đị nh hiệu quả của quá trì nh
nuôi cấy mô , cây được nhân nhanh theo n hu cầu của người nuôi cấy . Khi mẫu cấy
sạch đã được tạo ra , từ đó nhận được các cụm chồi và các phôi vô tí nh sinh trưởng
tốt trong quá trì nh nuôi cấy sẽ bước vào giai đoạn sản xuất . Người ta cần tạo ra tốc
độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy . Thành phần và điều kiện môi
trường cần tối ưu hoá để tạo được mục tiêu nhân nhanh . Đối với môi trường nhân
chồi, người ta sử dụng các chất kí ch thí ch sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin (BAP,
kinetin) với nồng độ khác nhau tuỳ từng đối tượng cây

. Quy trì nh cấy chuyển để

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




9

nhân nhanh chời thường trong khoảng

1-2 tháng tuỳ lồi cây . Tỷ lệ nhân nhanh

khoảng 2-8 lần sau một lần cấy chuyển . Nhìn chung giai đoạn này thường kéo dài
10-36 tháng. Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài
quá lâu để tránh sự hình thành biến dị sôma [16].
1.2.4.4. Tạo rễ (tạo cây hồn chỉnh)
Các chồi hình thành trong quá trình ni cấy có thể phát triển rễ tự sinh, nhưng
thơng thường các chồi này phải cấy chuyển sang một môi trường khác để kí ch thí ch
tạo rễ . Đối với môi trường tạo rễ , người ta thường sử dụng chất kí ch thí ch sinh
trưởng thuộc nhóm auxin như α-NAA, IAA, IBA. Thông thường giai đoạn này kéo
dài 2-8 tuần tuỳ đối tượng. Khi cây có đủ các bộ phận thân , lá, rễ với kí ch thí ch nhất
đị nh đảm bảo cho sinh trưởng , phát triển bình thường ngoài tự nhiên , người ta mới
tiến hành giai đoạn tiếp theo là đưa cây ra ngoài môi trường tự nhiên [16].
1.2.4.5. Chuyển cây ra đất trồng
Đây là giai đoạn đầu cây được chuyển từ điều kiện vô trùng trong ống nghiệm
ra ngoài môi trường tự nhiên . Giai đoạn này quyế t đị nh khả năng ứng dụng của quy
trình nhân giống in vitro. Đa số các loài cây trồng chỉ sau khi chồi đã ra rễ tạo thành
cây hoàn chỉ nh với kí ch thước nhất đị nh mới được huấn luyện và chuyển ra ngoài

vườn ươm. Cây nuôi cấy in vitro được sinh trưởng và phát triển trong những điều
kiện tối ưu về nhiệt độ , độ ẩm , pH, dinh dưỡng ... Vì vậy , trước khi đưa ra trồng ,
người ta cần huấn luyện cây để thí ch nghi với điều kiện tự nhiên

. Quá trình thích

nghi với điều kiện bên ngoài của cây ở giai đoạn đầu yêu cầu cần được chăm sóc
đặc biệt . Vì vậy , cây được chuyển từ môi trường từ bão hoà hơi nước sang vườn
ươm với những điều kiện khó khăn hơn , nên vườn ươm cần phải đáp ứn g các yêu
cầu: che cây non bằng nilon và có hệ thống phun sương cung cấp đợ ẩm và làm mát
cây; giá thể trồng cây có thể là đất mùn , hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất ,
mùn cưa và bọt biển... Giai đoạn này đòi hỏi 4-16 tuần [16].
1.3. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG LAN BẰNG KỸ THUẬT NUÔI
CẤY IN VITRO
1.3.1. Các nghiên cứu trong nƣớc

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




10

Ngày nay phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật không chỉ được sử dụng
trong nghiên cứu mà còn được áp dụng rộng rãi vào thực tiễn chọn giống, khơng chỉ
ở cây ngũ cớc mà cịn ở cây rau , cây ăn quả , và đặc biệt là hoa cây cảnh.
Nuôi cấy mô và tế bào thực vật phục vụ nhân giống cây trồng đã triển khai
trên 20 năm ở nước ta. Nhân giống thương mại quy mô lớn đã đạt được ở một số
cây trồng như nhân nhanh chuối, nhân nhanh khoai tây sạch bệnh, nhân nhanh các
giống mía nhập nội… Quy trình cơng nghệ nhân nhanh giớng ch́i và giớng mía đã

được Bộ Nơng nghiệp và Phát triển Nông thôn công nhận và áp dụng để chuyển gen
kháng sâu đục thân [2].
Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi
trồng giống lan Hài P. hangianum perner Gurss (Hài Hằng). Kết quả nghiên cứu
cho thấy, môi trường nhân nhanh protocorm và tạo chồi là mơi trường RE có bổ
sung nước dừa 150ml/l và ch́i chín 100g/l cho hệ sớ nhân cao nhất (4,3 lần). Bổ
sung α-NAA 0,4mg/l - 0,6mg/l vào môi trường cho khả năng ra rễ tớt nhất. Các kết
quả thí nghiệm ngoài vườn ươm cho thấy, cây đạt tiêu chuẩn ra vườn ươm cao
3 - 4cm, có từ 3 - 4 lá, 4 - 5 rễ [4].
Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in
vitro lan Kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. Tác giả kết luận, môi
trường KC là phù hợp nhất để nhân nhanh chồi lan Kim tuyến in vitro. Thể chồi 8
tuần tuổi từ phơi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ 2-3cm là phù hợp nhất để nhân
nhanh trong mơi trường thích hợp KC, bổ sung BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l +
NAA 0,3mg/l + nước dừa 100ml/l + dịch chiết khoai tây 100g/l + saccharose 20g/l
+ agar 7,0g/l + than hoạt tính 0,5g/l [11].
Nguyễn Thái Hà và cộng sự (2003) nghiên cứu sự phát sinh củ in vitro các
giống hoa Lilium spp. Trên đối tượng giống hoa Lily nhập từ Mỹ được cấy trên mơi
trường MS cơ bản có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng đã đưa ra được quy
trình nhân giống củ in vitro các giống hoa Lilium spp [5].
Nghiên cứu nhân nhanh in vitro giống lan Kim điệp (Dendrobium
chrysotoxum), Nguyễn Văn Song (2011) đã tìm ra được mơi trường thích hợp cho
nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS cơ bản, bổ sung saccharose 20g/l,
agar 8g/l, nước dừa 15% và BAP 2,0mg/l. Môi trường nhân nhanh protocorm tớt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




11

nhất là MS cơ bản, bổ sung saccharose 20g/l, agar 8,0g/l, nước dừa 15% và BAP
2,0mg/l. Môi trường MS cơ bản, bổ sung saccharose 30g/l, agar 8,0g/l, than hoạt
tính 1,0g/l, nước dừa 15%, BAP 2,0mg/l và NAA 1,0mg/l thích hợp nhất cho tái
sinh chồi từ protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro. Môi trường MS cơ bản, bổ
sung saccharose 20g/l, agar 8,0g/l, nước dừa 15% và NAA 1,0mg/l là thích hợp cho
tạo rễ của chồi in vitro [13].
Nghiên cứu môi trường nhân giống in vitro giống lan Dendrobium
fimbriatum Hook. (Lan Hoàng Thảo Long nhãn), Nguyễn Thị Sơn (2011) đã khẳng
định mơi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là môi
trường MS, bổ sung nước dừa 100ml/l, saccharose 10g/l, agar 6,0g/l; Môi trường
nhân nhanh protocorm tốt nhất là môi trường Knud, bổ sung nước dừa 100ml/l,
saccharose 10g/l, khoai tây 60g/l, agar 6,0g/l; Môi trường MS, bổ sung nước dừa
100ml/l, saccharose 20g/l, ch́i chín 60g/l, agar 6,0g/l là thích hợp nhất cho nhân
nhanh chồi in vitro; Mơi trường tạo cây hồn chỉnh là mơi trường RE, bổ sung
saccharose 10g/l, than hoạt tính 1,0g/l, agar 6,0g/l [14].
Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2003) đã tiến hành nghiên cứu xây dựng
quy trình nhân giống và nuôi trồng phong lan Phalaenopsis (lan Hồ Điệp). Giống
lan Hồ Điệp được khử trùng bằng HgCl2, sau đó được cấy lên mơi trường nhân
nhanh. Kết quả đã đưa ra được quy trình nhân giống và nuôi trồng lan Hồ Điệp [15].
1.3.2. Các nghiên cứu của nƣớc ngoài
Wang (1997) đã nghiên cứu sự nở hoa của giống lan Dendrobium candidum
được tạo ra bằng phương pháp nuôi cấy in vitro. Kết quả cho thấy, việc bổ sung
spermidine, BAP, hoặc sự kết hợp của NAA và BAP mơi trường ni cấy có thể
tăng khả năng tạo protocorm và chồi hoa trong vòng 3-6 tháng với tần số 31,6% 45,8%. Tần số nở hoa tăng lên 82,8% trước khi bổ sung ABA vào môi trường nuôi
cấy, sau đó chủn protocorm vào mơi trường MS cơ bản có bổ sung BAP [37].
Xu, Liu và cộng sự (2001) nghiên cứu môi trường nuôi cấy in vitro giống lan
Dendrobium chrysotoxum và kết ḷn: phơi Dendrobium chrysotoxum có thể nảy
mầm được trong điều kiện có hoặc khơng có ánh sáng. Dựa trên môi trường MS, bổ
sung NAA 0,5mg/l, BAP 1mg/l cho hiệu quả nảy mầm cao [34].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




12

Nghiên cứu về môi trường nuôi cấy in vitro giống lan Dendrobium
macrostachyum, Pyati (2002) sử dụng môi trường MS cơ bản, bổ sung
BAP (2,22µM, 4,44µM, 8,88µM), Kinetin (2,32µM, 4,65µM, 9,29µM), 2,69µM
NAA và nước dừa 5%, 10%, 15%) [19]. Tác giả nhận định rằng, mơi trường MS có
bổ sung nước dừa 15%, mật độ 6 chồi/bình cấy cho hiệu quả tối ưu [27].
Cũng sử dụng môi trường MS cơ bản, Martin và cộng sự (2005) bổ sung
kinetin 6,97µM hoặc BAP 13,3µM, nước dừa 15%, than hoạt tính 2,0g/l sẽ tạo điều
kiện cho sự nảy chồi của giống lan Dendrobium Sonia. Tỷ lệ sống của cây con đạt
80% [24].
Nghiên cứu về sự cảm ứng ra hoa của giống lan Dendrobium Sonia trong
ống nghiệm, Tee (2008) đã kết luận: trong môi trường MS cơ bản, bổ sung BAP
20μM kích thích sự ra hoa và ức chế sự tạo rễ. Môi trường nuôi cấy với hàm lượng
P cao và N thấp kích thích sự ra hoa, trong khi môi trường nuôi cấy với hàm lượng
P thấp và N cao lại thúc đẩy hình thành của chồi [33].
Năm 2009, Huang Yong nghiên cứu bảo tồn giống lan Dendrobium
officinale, Dendrobium nobile và Dendrobium fimbriatum bằng phương pháp nuôi
cấy hạt giống in vitro. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hạt giống nảy mầm và sinh
trưởng tốt trong môi trường MS có bổ sung BAP 0,5mg/l, NAA 0,1mg/l + khoai tây
50g/l + chuốichí n 50g/l + than hoạt tính 5g/l + saccharose 25g/l [22].
Nghiên cứu về mơi trường nuôi cấy in vitro giống lan Dendrobium nobile
var. Emma white, Sana Asghar và cộng sự (2011) sử dụng BAP và kinetin có nồng
độ từ 0,5mg/l - 3,0mg/l, nước dừa 50ml/l - 300ml/l. Nghiên cứu cho thấy, mơi
trường có bổ sung BAP 2,0mg/l cho hiệu quả tạo chồi cao nhất (4,33 chồi); kinetin

1,5mg/l cho hiệu quả chiều cao chồi cao nhất (2,45cm); IBA 2,0mg/l cho số lượng
rễ và chiều dài gốc cao hơn so với NAA 1,5mg/l [30].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




13

CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Vật liệu thực vật
Giớng lan Hồng Thảo (Dendrobium Sonia) do phòng Công nghệ tế bào thực
vật - Viện Di trùn Nơng nghiệp cung cấp .
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
* Hóa chất
Các chất kích thích sinh trưởng, đường saccharose, agar, than hoạt tính, nước
dừa, khoai tây.
Ni cấy được tiến hành trên nền môi trường MS và môi trường Phytamax.
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trường MS
STT
MS1
1
MS2
2
3
4
5
MS3

6
7
8
9
10
11
12
MS4
13
14
MS5
15
16
17
18
19

Thành phần

Nồng độ (mg/l)

CaCl2

440

KH2PO4
KNO3
MgSO4.7H2O
NH4NO3

170
1900
370
1650

H3BO4
KI
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CoCl2.5H2O
CuSO4.5H2O
Na2MoO4.2H2O

6,2
0,83
22,3
8,6
0,025
0,025
0,25

FeSO4.7H2O
Na2EDTA

27,8
37,3

Glycine
Thiamine HCl
Pyridocine HCl

Nicotinic axit
Myo-inositol

2
0,1
0,5
0,5
100

(Nguồn: Lê Trần Bình, 1997) [2].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




14

Bảng 2.2. Thành phần cơ bản của môi trường Phytamax
STT
1
2
P1
3
P2
4
5
6
7
P3

8
9
10
11
12
13
14
P4
15
16
P5
17
18
19
20

Thành phần
Peptone
Mes

Nồng độ (mg/l)
2000
1000

CaCl2

166

KH2PO4
KNO3

MgSO4.7H2O
NH4NO3

85,5
950
90,35
825

H3BO4
KI
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CoCl2.5H2O
CuSO4.5H2O
Na2MoO4.2H2O

31
0,415
8,45
5,3
0,0125
0,0125
0,125

FeSO4.7H2O
Na2EDTA

27,8
37,26

Thiamine HCl
Pyridocine HCl
Nicotinic axit
Myo-inositol

0,1
0,5
0,5
100

(Nguồn: Lê Trần Bình, 1997) [2].
* Dụng cụ
Bình tam giác, pipet, cốc thủy tinh định mức.
Bơng, giấy làm nút, giấy thấm.
Bình tam giác 250ml.
Bộ đồ cấy gồm: dao cấy, que cấy, đĩa cấy…
Buồng cấy vô trùng (Biological Safety Cabinets) của hãng Nuarie, Mỹ.
Nồi khử trùng (Auto Clace) của hãng ToMy, Nhật bản.
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Quy trình nghiên cứu được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




15

Mẫu giớng
Tạo protocorm

Tạo đa chồi

Tạo đa chồi
Tạo rễ

Cây hồn chỉnh

Đưa cây ra mơi trường tự nhiên
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm
2.2.1. Phƣơng pháp pha môi trƣờng và nuôi cấy
2.2.1.1. Pha môi trường nuôi cấy
Pha môi trường đặc với thành phần và nồng độ các chất phù hợp. Mơi trường
có đầy đủ muối khoáng, các chất hữu cơ, vitamin… Tất cả các hóa chất phải được
tan đều, khơng kết tủa. Mơi trường có bổ sung chất độn là thạch làm giá đỡ không
quá rắn hay quá mềm để khi cấy mẫu vật được dễ dàng. Khử trùng môi trường theo
phương pháp Pasteur.
Sau khi xác định công thức môi trường cần pha, tính thể tích các hóa chất
cần sử dụng trong mơi trường ni cấy. Ví dụ pha một lít mơi trường nhân phong
lan có cơng thức: MS, saccharose 30g/l, agar 8,0g/l, BAP 0,5mg/l, than hoạt tính
1,0g/l, nước dừa 100ml/l thì tiến hành theo các bước sau:
 Đong 100ml nước dừa.
 Cân 50g khoai tây, nghiền nát.
 Đong 0,75l hỗn hợp nước cất, nước dừa, khoai tây, sau đó đun sơi.
 Dùng pipet hoặc ống đong để lấy các dung dịch MS cho vào một cốc thủy
tinh sạch.
 Bổ sung BAP vào cốc dung dịch trên.
 Cân saccharose 30g, agar 8,0g, than hoạt tính 1,0g.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

16

 Khi nước gần sôi (50-700C) thì đổ agar khuấy đều cho tan, sau đó cho
đường và than hoạt tính vào khuấy tan hết.
 Bổ sung dung dịch hóa chất đã chuẩn bị ở cốc thủy tinh khi nước sôi.
 Định lượng hỗn hợp dung dịch trên bằng nước cất cho đủ 1 lít.
 Chuẩn độ pH của hỗn hợp dung dịch trong khoảng 5,5 – 5,8.
 Chia đều hỗn hợp dung dịch nuôi cấy cho các bình tam giác, mỗi bình
50ml mơi trường. Sau đó nút bơng và làm nắp bằng giấy, đậy kín.
 Khử trùng trong nồi khử trùng ở nhiệt độ 1200C, áp suất 1-1,2atm, trong
thời gian 20 phút. Trong quá trình lấy môi trường ra khỏi nồi hấp thì lắc nhẹ bình
tam giác chứa môi trường ni cấy để than hoạt tính tan đều trong mơi trường. Sau
khi hấp khử trùng xong để môi trường 2-3 ngày thì bắt đầu sử dụng.
2.2.1.2. Phương pháp nuôi cấy
Trước khi tiến hành nuôi cấy, cần khử trùng box cấy bằng đèn UV trong thời
gian 30-60 phút, khử trùng bộ cấy bằng cách đốt trên ngọn lửa đèn cồn, sau đó để
nguội,
Cụm chồi lan được lấy từ bình giớng ra, tách thành từng cụm nhỏ đường
kính 0,5-1cm, các cụm chồi này được cấy bằng que cấy vào môi trường nhân giớng.
Bớ trí thí nghiệm với các cơng thức mơi trường tùy từng mục đích nghiên cứu. Bình
ni cấy được đặt trong nhà nuôi cấy với cường độ ánh sáng 2000lux, thời gian
chiếu sáng 10/24 giờ, nhiệt độ 25-270C.
2.2.2. Nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy
Để tìm ra môi trường nuôi cấy tối ưu cho nhân nhanh và tạo rễ lan
Dendrobium Sonia, chúng tơi bớ trí các thí nghiệm thăm dị mơi trường nuôi cấy.
Đầu tiên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu sự ảnh hưởng của môi trường MS
cơ bản và môi trường Phytamax đến sự sinh trưởng và phát triển của lan

Dendrobium Sonia. Các mô lan được cấy trên môi trường MS và Phytamax chỉ bổ
sung saccharose 30g/l + agar 8,0g/l + khoai tây 50g/l + than hoạt tính 1,0g/l + nước
dừa 100ml/l. Công thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần, kết quả
đánh giá sau 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần. Sau 12 tuần, kết quả đánh giá sẽ được sử dụng
vào các công thức thí nghiệm tiếp theo.
2.2.2.1. Mơi trường nhân giống
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




17

Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ BAP và kinetin đến khả năng nhân chồi
của lan Dendrobium Sonia. Các mô lan được cấy lên môi trường nhân chồi trên nền
môi trường MS cơ bản, bổ sung BAP với nồng độ 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l;
2,0mg/l; 2,5mg/l hoặc kinetin với nồng độ từ 0,5mg/l; 1,0mg/l; 1,5mg/l; 2,0mg/l;
2,5mg/l. Mỗi cơng thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3 lần. Kết quả
được đánh giá sau 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần ni cấy.
2.2.2.2. Mơi trường tạo cây hồn chỉnh (mơi trường tạo rễ)
Những chồi nhân được có kích thước từ 1,5 - 2,0cm được cấy chuyển sang
môi trường tạo rễ trên nền mơi trường MS cơ bản, bổ sung chất kích thích sinh
trường α-NAA riêng rẽ, nồng độ từ 0,2mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8mg/l; 1,0mg/l;
IAA riêng rẽ có nồng độ từ 0,2mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8mg/l; 1,0mg/l; IBA riêng
rẽ có nồng độ từ 0,2mg/l; 0,4mg/l; 0,6mg/l; 0,8mg/l; 1,0mg/l.
Phối hợp BAP nồng độ 0,5mg/l với α-NAA, IBA, IAA nồng độ từ 0,2mg/l
đến 0,8mg/l. Phối hợp kinetin nồng độ 2,0mg/l với α-NAA, IBA, IAA nồng độ từ
0,2mg/l đến 0,8mg/l. Mỗi cơng thức thí nghiệm được tiến hành trên 30 mô, lặp lại 3
lần. Theo dõi sự sinh trưởng, phát triển của cây thông qua sự phát sinh rễ, lá, kích
thước rễ, kích thước lá sau 4 tuần, 8 tuần, 12 tuần nuôi cấy.

2.2.3. Phƣơng pháp ra cây
Khi cây con có rễ dài trung bình từ 1,0cm đến 1,5cm, hoặc lá với chiều dài
trung bình từ 1,5cm đến 2,0cm, bộ rễ khỏe, lá xanh tốt được tiến hành huấn luyện
đưa cây trồng ngoài tự nhiên bằng cách để các bình cây ra nơi có ánh sáng khuếch
tán 2-3 ngày trước khi đưa cây ra khỏi bình.
Khả năng sống của cây khi chuyển từ trong ống nghiệm ra vườn ươm quyết
định hiệu quả kinh tế của phương pháp nhân giớng in vitro. Do đó, một quy trình ra
cây đạt hiểu quả cao có ý nghĩa rất lớn.
2.2.3.1. Đưa cây ra ngồi mơi trường
Các bình cây được mở nút, cho nước vào ngâm 10-15 phút, sau đó lắc nhẹ
cho thạch rời ra khỏi cây, dùng panh nhẹ nhàng gắp cây ra khỏi bình, cố gắng để
cây được nguyên vẹn không bị dập nát.
Ngâm cây trong chậu nước sạch, sau đó rửa dưới vịi nước chảy cho hết
thạch bám vào bộ rễ của cây.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên