Nghiên cứu tạo đột biến in vitro và đánh giá sinh trưởng phát triển sai khác di truyền của các dòng đột biến giống hoa cẩm chướng quận chúa dianthus caryophyllus l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ HỒNG HIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO ĐỘT BIẾN IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ SINH
TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN, SAI KHÁC DI TRUYỀN CỦA CÁC
DÒNG ĐỘT BIẾN GIỐNG HOA CẨM CHƯỚNG QUẬN CHÚA
(DIANTHUS CARYOPHYLLUS L.)

CHUYÊN NGÀNH : KHOA HỌC CÂY TRỒNG
MÃ SỐ

: 62.62.01.10

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ

HÀ NỘI – 2014


Cơng trình hồn thành tại:
HỌC VIỆN NƠNG NGHIỆP VIỆT NAM

Người hướng dẫn: PGS.TS. NGUYỄN THỊ LÝ ANH

Phản biện 1:

PGS.TS. Nguyễn Thị Phương Thảo

Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Phản biện 2:

PGS.TS. Lê Huy Hàm
Viện Di truyền Nông nghiệp

Phản biện 3:

TS. Đặng Văn Đông
Viện Nghiên cứu Rau quả

Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp Học viện họp tại:
Học viện Nơng nghiệp Việt Nam
Vào hồi

, ngày

tháng

năm 2014

Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
-

Thư viện Quốc gia Việt Nam

-

Thư viện Học viện Nông nghiệp Việt Nam

M

Đ U

1. Tính c p thi t c a đ tài
Cẩm chướng là một trong bốn loài hoa cắt cành được trồng phổ
biến trên thế giới, chiếm 17% tổng sản lượng hoa cắt (Nguyễn Thị
Kim Lý, 2012). Đây cũng là loại hoa có nhiều triển vọng trong sản
xuất nội tiêu cũng như xuất khẩu c a Việt Nam. nước ta hiện nay,
ch yếu trồng các giống cẩm chướng nhập nội từ nước ngồi do đó
khơng ch động và chi phí sản xuất cao, đặc biệt là không thể m
rộng sản xuất và xuất khẩu b i khơng có bản quyền giống. Vì vậy,
việc nghiên c u chọn tạo những giống hoa cẩm chướng mới đáp ng
được nhu cầu thị trư ng, phù hợp với điều kiện sinh thái và có bản
quyền c a Việt Nam là yêu cầu b c thiết.
Đối với cây hoa việc chọn tạo giống tập trung ch yếu là tạo
giống có màu sắc mới. Điều này được thực hiện thông qua con
đư ng lai xa và gây tạo đột biến. Tuy nhiên đối với cây hoa cẩm
chướng nước ta việc lai xa rất khó thực hiện b i khả năng thụ phấn
thụ tinh rất khó. Vì vậy việc tạo giống có màu sắc mới chỉ có thể
thực hiện thông qua con đư ng gây tạo đột biến. Phương pháp chọn
tạo giống bằng gây tạo đột biến được phát triển từ giữa thế kỷ 20 và
ngày càng phát triển rộng rãi mang lại những thành tựu to lớn trong
công tác chọn tạo giống cây trồng. Hơn thế nữa, việc gây tạo đột
biến nhân tạo kết hợp với nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro đã tr
thành cơng cụ hữu hiệu giúp giảm thiểu chi phí và th i gian chọn tạo
giống cây trồng mới. Kỹ thuật này đã làm tăng tần số xuất hiện đột
biến với các tính trạng có giá trị kinh tế các lồi thực vật nói chung

và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc cải tiến giống cây
trồng. (Okamura, 2006; Shu, 2009; IAEA, 2009, 2013). Xuất phát từ
những vấn đề nêu trên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên c u t o
đ t bi n in vitro vƠ đánh giá sinh tr ng, phát triển, sai khác di
truy n c a các dòng đ t bi n gi ng hoa cẩm ch ớng Qu n Chúa
(Dianthus caryophyllus L.)”.
1


2. Mục tiêu c a đ tài
Nghiên c u phương pháp xử lý đột biến in vitro nhằm xác định
được phương pháp xử lý đột biến hiệu quả và tạo được các dòng biến
dị di truyền làm nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống hoa
cẩm chướng mới.
3. Yêu cầu của đề tài
- Xác định khả năng nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng
giống Quận Chúa, làm cơ s cho việc tái sinh và tạo cây hoàn chỉnh
các mẫu xử lý đột biến in vitro bằng tác nhân gây đột biến.
- Xác định hiệu quả xử lý gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm
chướng trong nuôi cấy mô mang lại hiệu quả cao:
+ Xác định nồng độ, th i gian xử lý EMS thích hợp cho chồi nhân
in vitro cây hoa cẩm chướng.
+ Xác định liều lượng xử lý tia gamma nguồn 60Co thích hợp cho
chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng.
+ Xác định hiệu quả c a xử lý phối hợp EMS và tia gamma
nguồn 60Co cho chồi nhân in vitro cây hoa cẩm chướng.
- Phân lập các thể đột biến qua các thế hệ nhân chồi in vitro.
- Sàng lọc các dạng biến dị c a cây cẩm chướng sau xử lý trong
điều kiện tự nhiên.
- Đánh giá sự sai khác di truyền c a một số dịng đột biến có triển

vọng đã phân lập bằng chỉ thị SSR.
- Xác định phương pháp khử trùng mẫu, môi trư ng nhân nhanh,
môi trư ng ra rễ và giá thể ra cây thích hợp cho một số dịng đột biến
có tiềm năng được tuyển chọn.
4. Ý nghĩa khoa học và thực ti n c a đ tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên c u c a đề tài đã cung cấp các dẫn liệu khoa học
có giá trị về việc ng dụng nhân giống in vitro và phương pháp tạo
giống mới thông qua xử lý đột biến in vitro c a cây hoa cẩm chướng.
Các kết quả nghiên c u c a đề tài là cơ s để tiếp tục nghiên c u
tạo dòng đột biến làm nguồn nguyên liệu di truyền cho việc chọn tạo
giống cẩm chướng mới. Đồng th i là tư liệu có giá trị cho việc
nghiên c u lĩnh vực cơng nghệ sinh học và chọn tạo giống cây trồng.

2


4.2. Ý nghĩa thực ti n
Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho một số
dịng, giống hoa cẩm chướng, góp phần giải quyết khó khăn trong
thực tiễn về nhân giống hiện nay; ng dụng thành công phương pháp
xử lý đột biến in vitro và xây dựng được quy trình xử lý gây tạo đột
biến kết hợp nuôi cấy in vitro cho cây hoa cẩm chướng bằng tác nhân
EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co; tạo được các vật liệu kh i
đầu phục vụ cho công tác nghiên c u chọn tạo giống hoa cẩm
chướng mới và chọn lọc được một số dòng đột biến có triển vọng.
5. Những đóng góp mới c a lu n án
Các kết quả nghiên c u đã xác định được tác nhân gây đột biến EMS
và tia gamma cho hiệu quả cao trong việc gây tạo biến dị có tiềm năng
có thể làm vật iệu cho cơng tác chọn tạo giống hoa cẩm chướng mới.

Đề tài đã tạo ra các dịng đột biến có tiềm năng và đánh giá được
đặc điểm sinh trư ng phát triển c a các dòng đột biến mới về mầu
sắc hoa trong điều kiện tự nhiên. Các dòng đột biến này cũng đã
được đánh giá sự sai khác di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR và xác
định mối quan hệ di truyền với cây mẹ.
Đề tài đã xây dựng được quy trình nhân giống in vitro cho 2 dịng
đột biến có triển vọng (dòng H6 và dòng H7) trong số các dòng đột
biến nêu trên, phục vụ cho các nghiên c u tiếp theo để phát triển hai
dòng này thành giống hoa cẩm chướng mới.
6. Giới h n c a đ tài
- Th i gian nghiên c u từ năm 2009 – 2013.
- Địa điểm nghiên c u: Viện Sinh học Nông nghiệp – Học viện
Nông nghiệp Việt Nam.
7. B cục c a lu n án
Nội dung chính c a luận án được thể hiện trong 130 trang, gồm: 4
trang m đầu, 34 trang tổng quan, 17 trang vật liệu nội dung và
phương pháp nghiên c u, 73 trang kết quả và thảo luận, 2 trang kết
luận và kiến nghị. 126 tài liệu tham khảo, trong đó 32 tài liệu tiếng
Việt, 94 tài liệu tiếng Anh. Kết quả nghiên c u có 34 bảng số liệu và
41 hình. Phần phục lục hình ảnh minh họa và kết quả xử lý số liệu.
3


Ch ng 1
T NG QUAN TÀI LI U
Cẩm chướng là loại hoa có giá trị kinh tế cao, chiếm tỷ lệ lớn trong các
loài hoa cắt cành trên thế giới (chiếm 17%) và trong các loài hoa xuất
khẩu nước ta. Việc đẩy mạnh sản xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm
hoa cẩm chướng Việt Nam còn nhiều hạn chế, trong đó đề bản quyền
giống đang là khó khăn trong việc tiếp cận thị trư ng hoa thế giới.

Đột biến đóng vai trị quan trọng trong chọn giống cây trồng, nh vào
quá trình đột biến mà chúng ta đã tạo ra nhiều giống hoa mới, đặc sắc có
năng suất cao, khả năng chống chịu tốt, kháng sâu bệnh,... trên lĩnh vực hoa
cảnh nói riêng và trong ngành chọn giống nói chung. Xử lý gây tạo đột biến
kết hợp nuôi cấy in vitro có nhiều ưu điểm so với phương pháp chọn giống
truyền thống: tần số đột biến cao và khả năng thu nhận những thể đột biến
đồng nhất về kiểu gen dễ dàng hơn; có thể xử lý một số lượng lớn tế bào,
mơ, cây con mà khơng địi hỏi diện tích lớn; có thể sử dụng nhiều bộ phận
khác nhau c a cây (tế bào, mô sẹo, chồi in vitro, đoạn thân, hạt, …); có khả
năng rút ngắn th i gian so phương pháp truyền thống (chỉ cần 3 - 6 thế hệ).
Các kết quả nghiên c u c a các tác giả về chọn tạo giống đột biến
hoa cẩm chướng cho thấy việc ng dụng kỹ thuật gây tạo đột biến
nhân tạo đối với cây trồng nói chung và cây hoa cẩm chướng nói riêng
mang lại hiệu quả rất lớn. Có rất nhiều giống hoa cẩm chướng mới với
những tính trạng mới được tạo ra nh xử lý gây tạo đột biến. Vì vậy,
có thể nói rằng, phương pháp chọn giống cẩm chướng và các loại hoa
nói chung bằng xử lý đột biến là một phương pháp đầy triển vọng
trong công tác chọn tạo giống hoa mới cho sản xuất.
Ch ng 2
Đ IT
NG, N I DUNG VÀ PH
NG PHÁP NGHIÊN C U
2.1. V t li u nghiên c u
- Mắt ng c a chồi in vitro cây hoa cẩm chướng thơm giống Quận
Chúa (Tên khoa học Dianthus caryophyllus “Princess”; tên thương
mại Princess).
- Các thiết bị dụng cụ hóa chất trong nuôi cấy mô tế bào.
4

- Phản ng PCR-SSR được tiến hành 20 mồi SSR c a hãng Bioneer
(theo Smulders et al., 2003, Tetsuya et al., 2009).
- Hóa chất dùng trong nghiên c u sinh học phân tử như Tris bazơ,
agarose, isopropanol, Ethanol, chloroform, isoamylalcohol, CH3COONa,
SDS, CTAB, Nacl, ETDA,…
- Các hóa chất cho phản ng PCR gồm deoxynucleotit triphosphat
(dNTPs) c a Sigma, Taq-DNA polymeraza c a Fermentas.
2.2. N i dung nghiên c u.
2.2.1. Nghiên cứu nhân giống in vitro cho cây cẩm chướng giống
Quận Chúa
- Nghiên c u ảnh hư ng c a phương pháp khử trùng đến tỷ lệ
sống c a mẫu.
- Nghiên c u ảnh hư ng c a môi trư ng nuôi cấy đến hệ số nhân,
sự sinh trư ng c a chồi in vitro:
+ Nghiên c u ảnh hư ng c a BA và kinetin trong môi trư ng MS
đến hệ số nhân, sự sinh trư ng c a chồi in vitro.
+ Nghiên c u ảnh hư ng c a tổ hợp cytokinin và auxin đến
hệ số nhân, sự sinh trư ng c a chồi in vitro.
- Nghiên c u ảnh hư ng c a α-NAA và than hoạt tính trong môi
trư ng MS tới khả năng ra rễ c a chồi in vitro.
- Nghiên c u ảnh hư ng c a giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh
trư ng c a cây in vitro ngoài vư n ươm.
2.2.2. Nghiên cứu các phương pháp xử lý gây t o đột biến in vitro
cho cây cẩm chướng
- Nghiên c u xử lý EMS cho cây hoa cẩm chướng in vitro.
- Nghiên c u xử lý tia gamma nguồn 60Co cho cây hoa cẩm
chướng in vitro.
- Nghiên c u xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co cho cây
cẩm chướng in vitro.
2.2.3. Nghiên cứu phân lập các d ng chồi in vitro biến dị sau xử lý

và đánh giá sự sinh trưởng phát triển của các d ng chồi
- Nghiên c u phân lập các dạng chồi biến dị về mặt hình thái.
- Nghiên c u khả năng ra rễ c a các dạng chồi phân lập sau xử lý.
- Nghiên c u khả năng sinh trư ng phát triển c a các dạng chồi

5


trong điều kiện vư n ươm.
2.2.4. Nghiên cứu sự sinh trưởng phát triển và phân lập các d ng
biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện tự nhiên
Cây cẩm chướng sau xử lý được đưa ra trồng tại nhà lưới, theo
dõi phân lập các dạng biến dị.
2.2.5. Nghiên cứu đánh giá sự sai khác di truyền của một số dịng
biến dị có triển vọng đ̃ phân lập bằng chỉ thị SSR
Chọn lọc một số dòng biến dị có tiềm năng đánh giá sự sai khác
di truyền m c độ phân tử bằng chỉ thị SSR.
2.2.6. Nghiên cứu quy trình nhân giống in vitro cho một số dòng
đột biến được tuyển chọn
- Nghiên c u ảnh hư ng c a th i gian khử trùng đến tỷ lệ sống c a mẫu
- Nghiên c u ảnh hư ng c a môi trư ng nuôi cấy đến hệ số nhân,
sinh trư ng c a chồi in vitro.
- Nghiên c u ảnh hư ng c a auxin trong môi trư ng MS tới khả
năng ra rễ c a chồi in vitro.
- Nghiên c u ảnh hư ng c a giá thể ra cây đến tỷ lệ sống và sinh
trư ng c a cây in vitro ngoài vư n ươm.
2.3. Ph ng pháp nghiên c u.
2.3.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Các thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với 3 lần nhắc lại.
2.3.2. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.

Sử dụng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trư ng cơ bản
MS (Murahige and Skoog, 1962) với 6,5 g/l agar, 30 g/l saccarose và
100 mg/l innositol) có bổ sung các chất điều tiết sinh trư ng.
Các thí nghiệm nhân nhanh, tạo cây hồn chỉnh mẫu được nuôi cấy
nhiệt độ 20 – 220C, cư ng độ chiếu sáng 2.000 lux, th i gian chiếu sáng
16 gi /ngày. Các cơng th c thí nghiệm được bố trí hồn tồn ngẫu
nhiên, mỗi cơng th c thí nghiệm bố trí 150 mẫu, chia làm 3 lần nhắc lại.
2.3.3. Phương pháp gây t o đột biến in vitro
Phương pháp gây tạo đột biến được tiến hành theo quy trình c a
Novak and Brunner (1992) có cải tiến. Mỗi cơng th c thí nghiệm xử
lý 3 lần nhắc lại mỗi lần 60 mẫu với liều lượng xử lý như sau:
- Xử lý gây t o đột biến bằng tác nhân EMS: Mẫu được xử lý
6


các m c nồng độ EMS 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0% với 3 m c th i gian 1,
2 và 3 gi .
- Xử lý gây t o đột biến bằng tia gamma nguồn 60Co: Mẫu được
xử lý với các liều hấp thụ 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 Gᵧ.
- Xử lý gây t o đột biến bằng EMS kết hợp tia gamma nguồn
60
Co: Mẫu được xử lý EMS với nồng độ 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% trong
th i gian 2 gi kết hợp tia gamma nguồn Co60 với liều hấp thụ 10,
20, 30 Gᵧ.
2.3.4. Phương pháp đánh giá sự sai khác di truyền của các dòng
đột biến bằng chỉ thị phân tử SSR
Để tiến hành phân tích và đánh giá sự sai khác di truyền c a các
giống hoa cẩm chướng m c độ phân tử, DNA c a 7 mẫu hoa cẩm
chướng được nhân bản bằng phương pháp PCR với 20 mồi SSR. Các
sản phẩm được điện di trên gel agarose 3,5%.

2.3.4.1. Phương pháp chiết tách DNA
Trong thí nghiệm này chúng tôi chiết tách DNA tổng số c a các
mẫu cẩm chướng dựa theo phương pháp c a Obara – Okeyo P. and
Kako (1998) có cải tiến.
2.3.4.2. Phương pháp PCR – SSR
Phản ng PCR được thực hiện với nhiều chu kì, nhiệt độ biến
tính DNA 950C, nhiệt độ gắn mồi 37- 550C tuỳ theo từng mồi, nhiệt
độ tổng hợp chuỗi DNA 720C.
2.3.4.3. Phương pháp điện di trên gel agarose
Sản phẩm c a phản ng PCR-SSR được kiểm tra trên gel agarose
1% và soi gel dưới ánh sáng đèn UV, nhận biết sản phẩm khuếch đại
dựa vào thang chuẩn DNA 1Kb.
2.3.4.4. Phương pháp phân tích số liệu
Các số liệu này được đưa vào xử lý theo chương trình NTSYSpc
2.1 c a Rohlf (2002) để tính ma trận tương đồng giữa các cặp mẫu.
ảệ số PIC - Chỉ số thông tin đa hình (Nei, 1973).
��� = 1 − ∑ ��2

Trong đó: pi là tần số xuất hiện alen th i.
7


Tỷ lệ dị hợp tử (ả%)
Số mồi xuất hiện ≥2 alen/ 1locus SSR
H%=
x 100
Tổng số mồi sử dụng-Số mồi khuyết số liệu
2.3.5. Phương pháp theo dõi, đánh giá đặc điểm nơng, sinh học
Các chỉ tiêu đánh giá ngồi đồng ruộng theo Quy phạm khảo
nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định c a Hiệp hội

Quốc tế về bảo hộ giống cây trồng mới (Hiệp hội Quốc tế về bảo hộ
giống cây trồng mới, 2008).
2.4. Ph ng pháp xử lý s li u
Số liệu được xử lý theo phương phân tích phương sai (ANOVA)
theo chương trình Irristat 5.0S và Excel. Số liệu phân tích SSR được
xử lý bằng phần mềm NTSYS pc2.1. Sử dụng thuật toán nội suy
lagrange để xây dựng mơ hình tốn học. Sử dụng phương pháp Reed
and Muench (1983), Behrens and Karber (1935) để xác định liều gây
chết 50% mẫu thí nghiệm (LD50).
Ch ng 3
K T QU NGHIÊN C U VÀ TH O LU N
3.1. Nghiên c u nhân gi ng in vitro cho cây cẩm ch ớng gi ng
Qu n Chúa
3.1.1. Nghiên cứu t o vật liệu khởi đầu
Kết quả nghiên c u cho thấy, đối với cây cẩm chướng giống
Quận Chúa sử dụng hóa chất HgCl2 0,1% để khử trùng mẫu có hiệu
quả tốt hơn so với NaOCl (5%). Trong các công th c thí nghiệm
được nghiên c u cơng th c 2 (sử dụng HgCl2 0,1% trong th i gian 7
phút) cho hiệu quả tốt nhất.
3.1.2. Nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro
3.1.2.1. nh hưởng của BA và kinetin trong môi trường MS đến hệ số
nhân, sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng
Kết quả nghiên c u cho thấy: các cơng th c có bổ sung kinetin
hoặc BA đều cho sự phát sinh chồi cao hơn đối ch ng. Tuy nhiên,
mỗi nồng độ BA hoặc kinetin bổ sung khác nhau thì số chồi phát
8


sinh và sự sinh trư ng thân lá c a các chồi cũng có sự khác nhau
khác nhau. Trong các cơng th c thí nghiệm cơng th c CT6 (MS + 1,0

mg/l kinetin) cho hệ số nhân chồi cao nhất.
3.1.2.2. nh hưởng của của tổ hợp kinetin và auxin đến hệ số nhân,
sinh trưởng của chồi in vitro cây cẩm chướng
Số liệu cho thấy, khi cố định nồng độ kinetin thay đổi nồng độ
IAA và α-NAA với các m c 0,25; 0,50; 0,75 và 1,0 mg/l thì chiều
cao và hệ số nhân chồi có xu hướng giảm dần (hệ số nhân chồi đạt từ
2,11 đến 2,72 chồi/tháng), thấp hơn so với đối ch ng.
Từ kết quả thí nghiệm 1 và thí nghiệm 2 cho thấy mơi trư ng
MS bổ sung 1,0 mg/l kinetin cho hệ số nhân chồi cao chất lượng chồi
tốt nhất cho giống Quận Chúa.
3.1.3. Nghiên cứu t o cây hồn chỉnh
Các cơng th c thí nghiệm khác nhau cho tỷ lệ mẫu phát sinh rễ,
số lượng, chiều dài rễ, chiều cao cây, số cặp lá trên cây các cơng
th c thí nghiệm rất khác nhau. Tỷ lệ mẫu phát sinh rễ các cơng
th c thí nghiệm đều cao hơn so với đối ch ng (đạt 92,22 đến 100%).
Cơng th c thí nghiệm MS bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính và 0,25 mg/l
α-NAA cho tỷ lệ phát sinh rễ, số rễ và chiều dài rễ cao hơn và th i
gian ra rễ sớm hơn so với các cơng th c thí nghiệm khác.
3.1.4. Nghiên cứu nh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ
sống và sinh trưởng của cây in vitro ngoài vườn ươm
Qua kết quả nghiên c u chúng tôi thấy công th c cho tỷ lệ sống
cao thì đồng th i cây cũng sinh trư ng phát triển tốt. Trong các loại
giá thể được sử dụng giá thể đất cho tỷ lệ sống thấp (83,33%), giá thể
đất + trấu hun (1:1) cho tỷ lệ sống cao và chất lượng tốt.
3.2. Nghiên c u xử lý gây t o đ t bi n cho cây hoa cẩm ch ớng
in vitro bằng EMS và chi u x tia gamma ngu n 60Co
3.2.1. Nghiên cứu xử lý gây t o đột biến cho cây hoa cẩm chướng
nuôi cấy in vitro bằng EMS
3.2.1.1. Nghiên cứu nh hưởng của EMS tới sự sinh trưởng của chồi
in vitro cây hoa cẩm chướng

EMS đã có ảnh hư ng đến khả năng sống c a mẫu. các công
9


th c xử lý EMS, tỷ lệ mẫu sống giảm mạnh khi tăng nồng độ EMS
và th i gian xử lý. Tỷ lệ mẫu sống đạt cao nhất tại công th c xử lý
nồng độ 0,2% trong th i gian 1 gi (91,11%) và tỷ lệ mẫu sống thấp
nhất tại công th c xử lý nồng độ 1,0% trong th i gian 3 gi
(18,89%). Trong các công th c xử lý EMS m c th i gian 1 và 2
gi tỷ lệ phát sinh chồi đạt cao nhất khi xử lý m c nồng độ 0,4%.
Bằng thuật toán nội suy chúng tơi đã xây dựng được mơ hình tốn
học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS xử lý và tỷ lệ mẫu chết
với các m c th i gian 1, 2 và 3 gi như sau:
Y = - 62,16x + 1157,07x2 – 4145,10x3 + 5626,30x4 – 2508,33x5
Y = 1,17 + 52,91x-57,06x2+563,85x3-1107,81x4+581,77x5
Y = 2,22+195,48x-997,26x2+2299,84x3-2109,11x4+689,48x5

Trong đó: x là nồng độ EMS xử lý ; Y là tỷ lệ mẫu chết.
Từ kết quả nghiên c u đã xác định được liều gây chết 50% mẫu
thí nghiệm (LD50) với các m c th i gian 1, 2 và 3 gi như sau:
LD50, EMS,1 gi = 0,79%; LD50, EMS,2 gi = 0,76%; LD50, EMS, 3 gi = 0,71%.
3.2.1.2. nh hưởng của EMS đến sự phát sinh hình thái và kh năng
sinh trưởng của các d ng chồi in vitro của cây cẩm chướng
Sau xử lý chúng tôi đã phân lập được 5 dạng chồi (Dạng A, dạng
b, dạng C, dạng D và dạng E).

Dạng A

Dạng B

Dạng C
Dạng D
Dạng E
Hình 3.1. Các d ng ch i thu đ c sau xử lý EMS
EMS có ảnh hư ng rất lớn đến khả năng sinh trư ng phát triển

10


c a chồi cũng như sự biến đổi hình thái c a chồi. các cơng th c thí
nghiệm, tỷ lệ chồi biến dị tăng dần theo sự tăng c a nồng độ và th i
gian xử lý EMS. Sự phân bố c a các dạng chồi các công th c
không giống nhau. Khi xử lý nồng độ 0,2% xuất hiện 4 dạng chồi:
A, B, C và D. Khi tăng nồng độ EMS lên 0,4; 0,6; 0,8% thì kết quả
cho cả 5 dạng chồi A, B, C, D, E. nồng độ xử lý 1,0 % số dạng
chồi xuất hiện lại giảm chỉ có 4 dạng: A, B, C và D.
B ng 3.1. nh h ng c a EMS đ n sự phát sinh hình thái
c a ch i in vitro cây cẩm ch ớng với th i gian xử lý 1 gi
Tỷ lệ các dạng chồi (%)
Nồng độ
Công
Tỷ lệ
EMS
Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng
th c
chồi
(%)
A
B
C

D
E
biến dị
ĐC
0,0
97,76
2,24
0,00
0,00
0,00
2,24
CT1.1
0,2
86,75
8,10
2,16
3,00
0,00 13,20
CT1.2
0,4
74,40 17,32 2,54
4,19
1,55 15,60
CT1.3
0,6
64,91 22,32 4,78
4,28
3,70 34,75
CT1.4
0,8

54,62 33,25 6,12
3,82
2,19 45,72
CT1.5
1,0
47,50 34,72 15,45
2,33
0,00 52,50
B ng 3.2. nh h ng c a EMS đ n sự phát sinh hình thái c a
ch i in vitro cây cẩm ch ớng với th i gian xử lý 2 gi
Tỷ lệ các dạng chồi (%)
Nồng
độ
Công
Tỷ lệ
Dạng Dạng
Dạng Dạng Dạng
th c EMS
chồi biến
A
B
C
D
E
(%)
dị
ĐC
0,0
95,81
4,19

0,00
0,00
0,00
4,19
CT2.1
0,2
81,82 10,08
3,13
3,29
1,69
18,51
CT2.2
0,4
70,24 17,55
3,75
4,64
3,81
28,25
CT2.3
0,6
61,36 27,11
5,42
3,69
2,41
38,53
CT2.4
0,8
51,15 32,51
10,63
3,47

2,25
49,53
CT2.5
1,0
42,12 36,42
21,46
0,00
0,00
57,88

11


Khi xử lý nồng độ cao và th i gian dài cho tỷ lệ chồi biến dị
nhiều tuy nhiên số dạng chồi biến dị xuất hiện lại giảm, đa số các
chồi bị chết. Dạng biến dị tăng ch yếu dạng biến dị B, C, trong đó
dạng chồi C có khả năng sinh trư ng phát triển kém. Nồng độ EMS
thích hợp cho xử lý gây tạo đột biến in vitro đối với cây cẩm chướng
giống Quận Chúa là 0,4% trong th i gian 2 gi .
B ng 3.3. nh h ng c a EMS đ n sự phát sinh hình thái c a
ch i in vitro cây cẩm ch ớng với th i gian xử lý 3 gi
Tỷ lệ các dạng chồi (%)

Công
th c

Nồng
độ
EMS
(%)

Dạng
A

Dạng
B

Dạng
C

Dạng
D

Dạng
E

ĐC
CT3.1
CT3.2
CT3.3
CT3.4
CT3.5

0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0

94,13
69,71
66,33
53,59
44,71
34,76

5,87
19,71
21,73
31,46
38,06
35,44

0,00
4,69
5,39
9,31
14,33
29,80

0,00
3,50
4,36
3,57
2,90
0,00

0,00
2,39

2,20
2,08
0,00
0,00

Tỷ lệ
chồi
biến dị
5,87
29,93
33,33
46,01
56,33
64,49

Từ kết quả thu được, chúng tôi đã xác định được hệ số tương
quan giữa nồng độ EMS xử lý và tỷ lệ chồi biến dị và xây dựng được
mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ EMS và tỷ lệ
biến dị c a chồi với các m c th i gian xử lý 1, 2 và 3 gi như sau:
Y = 2,24 + 266,34x-1823,63x2+4983,33x3-5431,25x4+2061,46x5
Y = 4,19+99,15x-192,33x2+311,72x3-201,04x4+36,20x5
Y = 5,87+327,25x-1665,40x2+3870,73x3-3865,10x4+1391,15x5
Trong đó : Y là tỷ lệ chồi biến dị; x là Nồng độ EMS xử lý.
3.2.2. Nghiên cứu xử lý gây t o đột biến cho cây hoa cẩm chướng
nuôi cấy in vitro bằng chiếu x tia gamma nguồn 60Co
3.2.2.1. Nghiên cứu nh hưởng của xử lý chiếu x tia gamma nguồn
60
Co tới sự phát sinh và sinh trưởng của cây hoa cẩm chướng in vitro
Kết quả nghiên c u cho thấy, các cơng th c thí nghiệm cho
12

thấy có sự phụ thuộc tuyến tính giữa liều lượng xử lý chiếu xạ tia
gamma nguồn 60Co và tỷ lệ mẫu chết, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi. Khi
liều lượng xử lý tăng, tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi giảm. Trong
các cơng th c thí nghiệm, tỷ lệ mẫu sống và phát sinh chồi đạt cao
nhất tại CT1 (tỷ lệ sống đạt 91,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt
91,99%), khi xử lý liều hấp thu 70 Gᵧ thì 100% mẫu bị chết.
Từ kết quả thu được, bằng thuật tốn nội suy Lagrange chúng tơi
đã xây dựng mơ hình tốn học biểu diễn mối quan hệ giữa liều lượng
xử lý gamma với tỷ lệ mẫu chết.
Y= 57,83.10-10 x7 + 1,42.10-6 x6 - 1,38.10-4 x5 + 6,65.10-3 x4
- 0,166x3 + 1,995x2 - 8,096x + 2
Trong đó: Y : Tỷ lệ mẫu chết (%); x: Liều lượng xử lý gamma (Gᵧ)
Bằng phương pháp Behrens and Karber (1935), đã xác định được
liều lượng gây chết 50% mẫu thí nghiệm LD50= 38,57Gᵧ
3.2.2.2. nh hưởng của chiếu x tia gamma nguồn 60Co đến sự phát
sinh biến dị hình thái chồi in vitro cây cẩm chướng
Sau xử lý chúng tôi đã phân lập được 6 dạng chồi (Dạng A, dạng
F, dạng G, dạng H, dạng I và dạng K).

Dạng A

Dạng F

Dạng G

Dạng H
Dạng I
Dạng K

Hình 3.2. Các d ng chồi thu được sau xử lý tia gamma nguồn 60Co
Số liệu thực nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính c a tỷ lệ
các chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng càng cao
tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. Sự phân bố c a các dạng chồi các công
th c thí nghiệm khơng giống nhau. Khi xử lý liều hấp thu 20Gᵧ đến
13


50Gᵧ xuất hiện 6 dạng chồi: A, F, G, H, I và K. liều hấp thu thấp
10Gᵧ chỉ thu được 3 dạng chồi A, F, H. Đặc biệt khi tăng liều lượng
xử lý lên 60Gᵧ chỉ thu được 2 dạng chồi I và K. liều lượng xử lý
cao, tỷ lệ chồi biến dị cao tuy nhiên số dạng chồi biến dị lại giảm.
Đặc biệt dạng chồi G, H (chồi có khả năng sinh trư ng phát triển tốt)
có xu hướng giảm mạnh.
B ng 3.4. Tỷ l ch i bi n d vƠ các d ng ch i sau xử lý tia gamma
ngu n 60Co
Liều
Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng
Tỷ lệ
hấp thu
A
F
G
H
I
K
biến
(Gᵧ)
(%)
(%)

(%)
(%) (%)
(%)
dị (%)
0
10
20
30
40
50
60
70

96,20
89,68
64,04
52,99
41,54
22,34
0,00
0,00

3,80
6,53
9,53
10,72
18,00
25,12
0,00
0,00

0,00
0,00
7,39
13,69
8,92
8,37
0,00
0,00

0,00
3,79
7,39
8,93
6,77
8,37
0,00
0,00

0,00
0,00
6,35
6,54
10,16
13,71
16,67
0,00

0,00
0,00

5,29
7,14
14,61
22,09
83,33
0,00

3,80
10,32
35,96
47,01
58,46
77,66
100,0
0,00

Từ kết quả nghiên c u chúng tôi cũng đã xây dựng được mơ hình
tốn học biểu diễn mối quan hệ giữa liều lượng xử lý tia gamma
nguồn 60Co và tỷ lệ chồi biến dị.
Y= 7,255.10-8 x6 - 15,533.10-6 x5 + 12,865.10-4 x4 - 5,05.10-2 x3
+ 0,92x2 - 4,639x + 3,80
Trong đó: Y là tỷ lệ chồi biến dị (%); X liều hấp thu (Gᵧ).
3.2.3. Nghiên cứu xử lý kết hợp EMS và chiếu x tia gamma
ngu n 60Co cho cây hoa cẩm chướng in vitro
3.2.3.1. Nghiên cứu nh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma
nguồn 60Co tới sự sinh trưởng của chồi in vitro cây hoa cẩm chướng
Kết quả thí nghiệm cho thấy khi tăng liều xử lý lên thì tỷ lệ mẫu
sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi giảm dần. Trong các công th c thí
14

nghiệm, tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi đạt cao nhất tại
công th c CT1 (Tỷ lệ mẫu sống 87,33%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi
89,33%), tỷ lệ mẫu sống thấp nhất tại công th c CT12 (Tỷ lệ mẫu
sống 24,67%, tỷ lệ mẫu phát sinh chồi 60,00%).
3.2.3.2. nh hưởng của xử lý kết hợp EMS và tia gamma nguồn 60Co
đến sự phát sinh biến dị hình thái chồi in vitro
Sau xử lý chúng tôi đã phân lập 8 dạng chồi (Dạng A, dạng F,
dạng G, dạng L, dạng M, dạng N, dạng O và dạng P).

Dạng A

Dạng E

Dạng G

Dạng L

Dạng M

Dạng N

Dạng O

Dạng P

Hình 3.3. Các d ng ch i sau xử lý k t h p EMS vƠ tia gamma
ngu n 60Co
Số liệu thực nghiệm cho thấy có sự phụ thuộc tuyến tính c a tỷ lệ
các chồi biến dị hình thái vào liều lượng xử lý, liều lượng càng cao

tỷ lệ chồi biến dị càng lớn. Sự biến động về số dạng chồi biến dị
cũng có xu hướng tương tự như khi xử lý riêng rẽ EMS hoặc chiếu
xạ tia gamma. Khi tăng liều xử lý thì tỷ lệ chồi biến dị có xu hướng
tăng lên, tuy nhiên số dạng chồi lại có xu hướng giảm các công
th c xử lý với liều lượng cao. Đặc biệt dạng chồi G (chồi có khả
năng sinh trư ng phát triển tốt) chỉ xuất hiện công th c CT4 đến
CT10. Công th c CT5 xuất hiện nhiều dạng chồi, trong đó dạng chồi
tiềm năng có tỷ lệ cao (Dạng G: 9,12%). Xử lý kết hợp EMS và tia
gamma xuất hiện nhiều dạng chồi biến dị hơn hơn so với xử lý riêng
rẽ hai tác nhân này (Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009).
15


16

B ng 3.5. Tỷ l ch i bi n d vƠ các d ng ch i in vitro sau xử lý k t h p EMS vƠ tia gamma ngu
Nồng
Liều
Dạng Dạng
Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng Dạng
Công
độ
hấp thụ
A
F
G
L
M
N
O

P
th c
EMS gamma
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(%)
(Gᵧ)
ĐC
0,0
0,0
95,92
0,00
0,00
0,00
4,08
0,00
0,00
0,00
CT1
0,1
10
86,79
4,73
0,00

0,00
8,50
0,00
0,00
0,00
CT2
0,1
20
79,65
5,33
0,00
0,00
10,18
4,84
0,00
0,00
CT3
0,1
30
71,26 11,63
0,00
0,00
10,95
6,17
0,00
0,00
CT4
0,2
10
72,66

8,48
3,26
0,00
8,36
7,26
0,00
0,00
CT5
0,2
20
57,50
7,98
9,12
0,00
11,30
8,72
0,00
5,37
CT6
0,2
30
37,89 18,40
6,90
0,00
9,20
6,90
6,90
13,80
CT7
0,3

10
45,96 13,27
6,60
0,00
9,32
11,18 11,18 2,49
CT8
0,3
20
34,34 15,48
7,16
4,78
9,39
11,13 11,45 6,26
CT9
0,3
30
29,49 18,49
5,44
6,54
9,95
12,04 12,04 6,02
CT10
0,4
10
39,62 16,36
4,36
7,38
8,90
12,26 11,12 0,00

CT11
0,4
20
28,90 25,52
0,00
7,82
7,82
3,91
10,36
15,65
CT12
0,4
30
27,77 27,87
0,00
8,96
0,00
8,62
8,62
18,15
16

n 60Co
Tỷ lệ
chồi
biến dị
(%)
4,08
13.21
20,35

28,74
27,34
42,50
62,11
54,04
65,66
70,51
60,38
71,10
72,23


3.3. Nghiên c u kh năng sinh tr ng c a các d ng ch i in vitro
3.3.1. Nghiên cứu kh năng ra rễ của các d ng chồi in vitro cây
cẩm chướng sau xử lý
Trong môi trư ng ra rễ, trừ dạng chồi G, các dạng chồi biến dị có
khả năng ra rễ thấp hơn so với dạng chồi bình thư ng. Khả năng ra
rễ cao nhất là dạng G (100%) thấp nhất là dạng chồi C (37,78%), đặc
biệt dạng chồi I và dạng chồi M khơng có khả năng sống khi cấy
sang môi trư ng ra rễ.
3.3.2. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các d ng chồi
in vitro cây cẩm chướng sau xử lý trong điều kiện khí canh
Các dạng chồi biến dị có khả năng sống và sinh trư ng thân lá
thấp hơn rất nhiều so với dạng chồi bình thư ng. Tỷ lệ sống c a các
dạng chồi rất khác nhau, cao nhất là chồi dạng G (100%) sau đó là
chồi dạng A, B, H, D, E, F, L, P, K,. Chồi dạng C, K có khả năng
sống rất thấp (Dạng C: 3,33%; dạng K: 13,33%). Chồi dạng I, M, O
khơng có khả năng sống ngay cả trong điều kiện vư n ươm.
3.3.3. Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của các d ng chồi
in vitro cây cẩm chướng sau xử lý giai đo n ngoài đồng ruộng

Hầu hết các dạng chồi khả năng trong điều kiện vư n ươm kém
(dạng C, K, P) đều bị chết sau khi trồng ra ngoài ruộng. Khả năng
sống và sinh trư ng c a các dạng chồi giai đoạn ngồi đồng ruộng
cũng có sự tương đồng với giai đoạn trong phịng thí nghiệm và giai
đoạn khí canh. Cụ thể dạng chồi G, A có khả năng sinh trư ng phát
triển tương đối tốt, cho tỷ lệ sống cao trên 80%, thân lá phát triển tốt.
Các dạng chồi D, E, F, H, L, N có tỷ lệ sống thấp.
3.4. Nghiên cứu nh hưởng của xử lý gây t o đột biến đến sự phát
sinh biến dị của cây cẩm chướng giai đo n ngoài đồng ru ng
Để đánh giá hiệu quả c a sự tác động c a các tác nhân gây đột
biến chúng tôi đã tiến hành phân lập các dạng biến dị về mặt hình
thái và khả năng sinh trư ng phát triển c a cây cẩm chướng giai đoạn
ngoài đồng ruộng. Qua theo dõi chúng tôi đã phân lập được một số
dạng biến dị về th i gian sinh trư ng, hình thái lá và màu sắc hoa và
được phân thanh 3 nhóm như sau:
17


Nhóm 1: Biến dị về hình thái lá: lá cuộn, lá hình ống.
Nhóm 2: Chồi nách phát triển.
Nhóm 3: Biến dị về màu sắc hoa: H1: Hoa màu tím; H2: Hoa màu
phấn hồng viền tím; H3: Hoa màu trắng viền đỏ; H4: Hoa màu trắng sọc
tím; H5: Hoa màu trắng viền tím nhẹ, một số cánh hoa khơng có viền tím;
H6: Hoa trắng viền phấn hồng; H7: Hoa màu tím nhạt viền tím đậm.

Đối ch ng
Lá hình ống
Đầu lá cuộn Chồi nách phát triển
Hình 3.10. M t s d ng bi n d v hình thái thơn lá

Đối ch ng

H1

H2

H3

H4
H5
H6
H7
Hình 3.4. Hình nh m t s d ng bi n d v màu sắc hoa
3.4.1. nh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh biến dị của cây
cẩm chướng giai đo n ngoài đồng ruộng
Khi xử lý EMS xuất hiện cả 3 nhóm biến dị, trong đó có 5 dạng
biến dị về màu sắc hoa (H1, H2, H4, H5, H7), dạng H3, H6 không
xuất hiện khi xử lý EMS. các công th c xử lý nồng độ cao và th i
gian dài, các biến dị về hình thái thân lá xuất hiện nhiều hơn, biến dị
về hoa tăng ch yếu dạng H5 (dạng biến dị khơng có lợi). Trong
các cơng th c thí nghiệm cơng th c CT7 (xử lý EMS nồng độ 0,4%
trong th i gian 2 gi ) cho biến dị về màu sắc hoa nhiều nhất. Đặc
biệt là dạng hoa H7 chỉ xuất hiện công th c này.

18


3.4.2. nh hưởng của xử lý chiếu x tia gamma nguồn 60Co đến tỷ lệ
biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai đo n ngoài đồng ruộng

Kết quả nghiên c u cho thấy khi xử lý chiếu xạ gamma xuất hiện
2 nhóm biến dị (biến dị về hình thái lá và biến dị về màu sắc hoa),
biến dị khả năng phát triển chồi nách mạnh không xuất hiện. Trong
nhóm biến dị về màu sắc hoa chỉ thu được 3 dạng (H4, H5, H6), dạng
H1, H2, H3 và H7 không xuất hiện khi xử lý chiếu xạ gamma riêng
rẽ. Trong các cơng th c thí nghiệm cơng th c CT3 (xử lý liều 30Gᵧ)
cho biến dị về màu sắc hoa nhiều nhất. Đặc biệt là dạng hoa H7 chỉ
xuất hiện công th c này.
3.4.3. nh hưởng của xử lý kết hợp EMS và chiếu x tia gamma
nguồn 60Co đến tỷ lệ biến dị của cây cẩm chướng sau xử lý giai
đo n ngoài đồng ruộng
Kết quả nghiên c u cho thấy việc xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ
gamma đã làm tăng tỷ lệ biến dị lên rất nhiều so với xử lý riêng rẽ
EMS hoặc gamma. Tỷ lệ biến dị đạt cao nhất tại công th c CT5
(24,66%) và thấp nhất tại công th c CT1 (4,0%). Xử lý kết hợp EMS
và chiếu xạ gamma cho kết quả xuất hiện cả 3 nhóm biến dị (biến dị
về hình thái lá, biến dị về phát triển chồi nách và biến dị về màu sắc
hoa). Tuy nhiên, trong nhóm biến dị về màu sắc hoa chỉ thu được 5
dạng (H1, H3, H4, H5 và H7), dạng H2 và H6 không xuất hiện. Kết
quả nghiên c u cho thấy khi xử lý kết hợp làm xuất hiện thêm một
dạng mới (H3). Kết quả thực nghiệm cho thấy, các dạng biến dị về
màu sắc tập chung ch yếu dạng chồi A (dạng chồi bình thư ng),
một số ít xuất hiện dạng chồi B, F, G, H. Dạng biến dị H5 chiếm tỷ
lệ cao dạng chồi F. Các dạng chồi D, E, L chỉ xuất hiện các biến dị
về hình thái lá và khả năng phát triển chồi nách mạnh.
3.4.4. Đặc điểm hình thái một số d ng biến dị về màu sắc hoa sau
xử lý giai đo n ngoài đồng ruộng
Về đặc điểm hình thái c a một số dạng biến dị về màu sắc hoa
các chỉ tiêu khác nhau có sự khác nhau.
Trong các giai đoạn phát triển khác nhau, các cá thể trong các

dịng đột biến có tốc độ tăng trư ng tương tự nhau. Trong giai đoạn
19


chuyển sang giai đoạn sinh trư ng sinh thực các dịng bắt đầu có tốc
độ phát triển khác nhau dẫn đến chiều cao trung bình c a các dịng
bắt đầu có sự thay đổi. Chiều cao cây c a các dạng H1, H3, H4, H6,
H7 và dạng đối ch ng tương đối đồng đều. Dạng H5 có chiều cao
cây trung bình thấp hơn (98 ± 9,23cm).
Kích thước hoa khi n dao động từ 5,2 đến 7,1 cm. Dạng H2, H3,
H4 có kích thước lớn hơn dạng đối ch ng và các dạng cịn lại. Cấu
trúc cánh hoa có sự khác biệt, bề mặt cánh hoa dạng đối ch ng, H4
và H5 gấp nếp, dạng H1, H2, H3, H6, H7 bề mặt cánh hoa phẳng;
Rìa cánh hoa dạng H2 và dạng H7 có sự khác biệt so với đối ch ng
và các dạng cịn lại (rìa cánh hoa răng cưa nhẹ, nơng). Độ rộng c a
cánh hoa ngồi cùng c a các dạng đột biến cũng có sự khác nhau, các
dạng H2, H3 và H4 có độ rộng trên 3 cm, các dạng còn lại biến động
từ 2,1 đến 2,8 cm. Số lượng vịi nhụy các dạng khơng có sự khác
nhau tuy nhiên độ dài c a vòi nhụy c a dạng H1 và dạng H3 vòi
nhụy dài hơn.
3.5. Nghiên c u đánh giá sự sai khác di truy n c a m t s dòng
cẩm ch ớng bằng kỹ thu t SSR
3.5.1. Kết qu phân tích sự nhân b n DNA với các cặp mồi
Kết quả phân tích và đánh giá sự sai khác di truyền c a các giống
hoa cẩm chướng m c độ phân tử, DNA c a 7 mẫu hoa cẩm chướng
(gồm 6 dòng đột biến H1, H2, H3, H4, H6, H7 và giống Quận Chúa)
được nhân bản bằng phương pháp PCR với 20 mồi SSR thu được
tổng số 150 băng với kích thước chiều dài nhỏ nhất khoảng 100bp và
băng có kích thước lớn nhất khoảng 1200bp.
Kết quả nghiên c u cho thấy: Các dòng đột biến đều có sự khác

biệt về mặt di truyền so với giống gốc, trong đó sự sai khác lớn nhất
là dòng H3 (hệ số tương đồng di truyền H3-H1: 0,5098) và thấp nhất
là dòng H4 (hệ số tương đồng di truyền H4-ĐC: 0,8293).
Trong 20 cặp mồi SSR được lựa chọn để nghiên c u, mồi
CB001a, CDB221 không phân biệt được sự sai khác về mặt di truyền
giữa các dòng, giống hoa cẩm chướng được nghiên c u. Mồi CB016a

20


chỉ cho sự sai khác giữa mẫu đối ch ng và các dịng khác, khơng có
sự sai khác giữa các dịng biến dị được nghiên c u. Mồi DCA221,
CB047a, có thể sử dụng để phân biệt dòng H7 với các dòng khác và
đối ch ng. Cặp mồi cho kết quả đa hình cao nhất là CB004a, CB026a
với tổng số băng thu được tương ng là 13 và 11.
3.5.2. Kết qu phân tích hệ số PIC với các cặp mồi
Kết quả cho thấy hệ số PIC dao động từ 0,0 (các cặp mồi chỉ có đơn
hình) đến giá trị cao nhất là 0,83 cặp mồi CB004a. Hệ số PIC trung
bình c a 20 cặp mồi trên 7 dòng cẩm chướng nghiên c u là 0,26 cho
thấy các locus gen khá đa dạng.
3.5.3. Đánh giá độ thuần di truyền của các dòng cẩm chướng
nghiên cứu
Các dòng, giống cẩm chướng nghiên c u có tỷ lệ dị hợp tử (H%)
thay đổi từ 14,29% đến 29,41%. Tỷ lệ dị hợp tử cao nhất dòng đột
biến H3 (29,41%) tiếp theo là dòng H2, H6, H1, H4, ĐC và H7. Tỷ lệ
dị hợp tử thấp nhất dòng H7 (14,29%). Kết quả này cho thấy các
dòng, giống cẩm chướng nghiên c u có độ thuần di truyền rất cao.
3.5.4. ảệ số đồng d ng và mối quan hệ di truyền giữa các dòng,
giống cẩm chướng
Kết quả nghiên c u cho thấy hệ số tương đồng di truyền c a 6

dòng đột biến và giống Quận Chúa dao động trong khoảng 0,5098
đến 0,8293. M c sai khác di truyền lớn nhất là dòng H1-H3 (khoảng
cách di truyển là 0,4902). Cặp giống ĐC và dịng H4 có sự tương
đồng di truyền cao nhất (khoảng cách di truyền 0,1707)
Từ sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu giống
cẩm chướng cho thấy m c độ sai khác di truyền giữa các giống có sự
khác nhau. m c tương đồng 0,75 có thể chia 7 dịng, giống cẩm
chướng thành 6 nhóm: Nhóm 1: Gồm giống ĐC và dịng H4; Nhóm
2: Dịng H1; Nhóm 3: Dịng H2; Nhóm 4: Dịng H3; Nhóm 5: Dịng
H6; Nhóm 6: Dịng H7.
Kết quả phân tích DNA hồn tồn phù hợp với sự khác biệt giữa
các dòng, giống được nghiên c u về mặt hình thái như đặc điểm thân
lá, màu sắc, cấu trúc cánh hoa.
21


Hình 3.5. Mối quan hệ di truyền giữa các dịng, giống cẩm chướng
3.6. Nghiên c u nhân gi ng in vitro m t s dòng đ t bi n đ c
tuyển chọn
3.6.1. nh hưởng chế độ khử trùng đến tỷ lệ sống của mẫu
cả 2 dòng H6 và H7, trong các cơng th c thí nghiệm, cơng th c
sử dụng HgCl2 0,1% trong th i gian 7 phút cho hiệu quả tốt nhất (tỷ
lệ mẫu sống đạt 76,33%; tỷ lệ mẫu nhiễm chỉ có 7,67%; th i gian
phát sinh chồi sớm).
3.6.2. Đánh giá kh năng nhân nhanh in vitro của các dòng cẩm
chướng đột biến đ̃ chọn lọc sau xử lý in vitro.
Kết quả cho thấy trong đối với dòng H6, công th c bổ sung 0,5
mg/l kinetin + 0,5 mg/l BA thích hợp cho việc nhân nhanh in vitro.
Đối với dịng H7, cơng th c bổ sung 1,0 mg/l kinetin là thích hợp
cho việc nhân nhanh in vitro.

3.6.3. Nghiên cứu nh hưởng của auxin đến kh năng t o cây in
vitro hồn chỉnh của hai dịng cẩm chướng H6 và H7
Môi trư ng tạo rễ tối ưu c a 2 dịng H6 và H7 có sự khác nhau.
Đối với dịng H6 cơng th c 1 (MS + 0,5 g/l than hoạt tính + 0,25
mg/l α-NAA) là tốt nhất đối với sự ra rễ c a dòng đột biến này, cịn
với dịng H7 mơi trư ng tốt nhất cho sự ra rễ in vitro là MS + 0,5 g/l
than hoạt tính + 0,75 mg/l α-NAA. Trên các mơi trư ng này chồi in
vitro không chỉ ra rễ thuận lợi mà chồi sinh trư ng phát triển tốt.
22


3.6.4. Nghiên cứu nh hưởng của phương pháp ra cây đến tỷ lệ
sống và sinh trưởng của cây in vitro ngồi vườn ươm
Qua kết quả nghiên cho thấy cơng th c cho tỷ lệ sống cao thì
đồng th i cây cũng sinh trư ng phát triển tốt. Trong các loại giá thể
được nghiên c u trong phương pháp địa canh sử dụng giá thể đất +
trấu hun (1:1) cho cả 2 dòng H6 và H7 cho kết quả tốt nhất.
K T LU N VÀ Đ NGH
1. K t lu n
1) Để nhân giống in vitro cho cây hoa cẩm chướng giống Quận
Chúa sử dụng quy trình ni cấy như sau: Khử trùng mẫu dùng
HgCl2(0,1%) trong th i gian 7 phút; giai đoạn nhân nhanh dùng mơi
trư ng MS có bổ sung 1,0 mg/l kinetin; giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh
dùng mơi trư ng dinh dưỡng MS có bổ sung 0,5 g/l than hoạt tính +
0,25 mg/l α-NAA; khi thích ng cây in vitro trong điều kiện tự nhiên
bằng phương pháp địa canh sử dụng giá thể đất + trấu hun (1:1) sẽ
cho hiệu quả tốt nhất.
2) Xử lý gây tạo đột biến in vitro bằng tác nhân gây đột biến EMS và
tia gamma làm giảm khả năng sống, khả năng phát sinh chồi, sự sinh
trư ng c a đoạn thân mang mắt ng cây cẩm chướng giống Quận Chúa

(tỷ lệ sống giảm so với đối ch ng từ 8,89 đến 78,89% khi xử lý bằng
EMS; từ 6,67 đến 98,0% khi xử lý bằng chiếu xạ tia gamma; từ 8,00 đến
70,66% khi xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co.
3) Xử lý gây tạo đột biến in vitro bằng tác nhân gây đột biến EMS
và tia gamma nguồn 60Co làm làm tăng tỷ lệ biến dị cho cây cẩm
chướng nuôi cấy in vitro (từ 2,0 đến 18,66 lần so với đối ch ng khi xử
lý bằng EMS; từ 2,67 đến 16,67 lần so với đối ch ng khi xử lý bằng
chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co; từ 1,5 đến 9,24 lần so với đối ch ng
khi xử lý kết hợp EMS và chiếu xạ tia gamma nguồn 60Co).
4) Để gây tạo đột biến cho cây hoa cẩm chướng in vitro giống
Quận Chúa đạt hiệu quả cao đối với phương pháp xử lý bằng hóa chất
EMS, nồng độ và th i gian xử lý thích hợp là 0,4% trong th i gian 2
gi ; đối với phương pháp xử lý tia gamma nguồn 60Co, xử lý với liều
23