Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống ngô zea mays l

..

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
--------------------------------

TRẦN THỊ NGỌC DIỆP

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN
CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGễ (ZEA MAYS L.)

luận văn thạc sĩ sinh học

Thỏi Nguyờn: 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
------------------------------

TRẦN THỊ NGỌC DIỆP

NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA
MỘT SỐ GIỐNG NGÔ (ZEA MAYS L.)

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Ng-êi h-íng dÉn khoa häc: PGS.TS CHU HỒNG MẬU

Thái Ngun: 2009

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, chưa có ai cơng bố.

Tác giả

Trần Thị Ngọc Diệp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




LỜI CẢM ƠN
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới PGS. TS Chu Hồng Mậu đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Bộ môn Khoa học sự
sống - Trường Đại học khoa học – Đại học Thái nguyên đã tận tình giúp đỡ

tơi trong q trình thực hiện các thí nghiệm nghiên cứu của đề tài.
Tơi xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Trường Đại học Sư phạm - Đại
học Thái nguyên, Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN và các thầy cô giáo, cán
bộ trong khoa đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ tơi trong q trình học tập và hồn
thành luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn sự động viên, khích lệ và tạo mọi điều kiện
của Ban giám hiệu Trường Đại học Hùng Vương, Ban chủ nhiệm khoa Nông
– Lâm – Ngư, cùng các đồng nghiệp, gia đình và bạn bè đã tạo mọi điều kiện
và giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập và làm luận văn.
Tác giả

Trần Thị Ngọc Diệp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỤC LỤC
Trang
Lời cam đoan……………………………………………………….........

i

Lời cảm ơn………………………………………………………………

ii

Mục lục……………………………………………………………….....

iii

Những chữ viết tắt……………………………………………………….

vi

Danh mục các bảng………………………………………………...........

vii

Danh mục các hình………………………………………………...........

viii

MỞ ĐẦU…………………………………………………………..........

1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………....

3

1.1.CÂY NGƠ…………………………………………………..............

3

1.1.1.Nguồn gốc và phân loại cây ngơ…………………………………..

3

1.1.2.Đặc điểm nơng sinh học của cây ngơ……………………...............

3

1.1.3.Vai trị cây ngơ trong nền kinh tế………………………………….

5

1.1.4.Đặc điểm hóa sinh hạt ngơ………………………………...............

7

1.1.5.Tình hình sản xuất ngơ trên thế giới và ở Việt Nam………............

8

1.1.5.1.Tình hình sản xuất ngơ trên thế giới……………………….........

8

1.1.5.2.Tình hình sản xuất ngơ ở Việt Nam…………………………......

12

1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở
THỰC VẬT………………………………….........................................

13

1.2.1.Một số phương pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu

quan hệ di truyền thực vật……………………………….........................

13

1.2.1.1.Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms –
đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn)……………………………………

14

1.2.1.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




hình độ dài các đoạn được nhân bản chọn lọc)…………………………….

14

1.2.1.3. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat – trình tự lặp lại đơn
giản)……………………………………………………………………..

15

1.2.1.4.Bản đồ QTL (Quantiative Trait loci)…………………………

17

1.2.1.5. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)……...

17

1.2.2. Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở thực vật bằng kỹ thuật RAPD...............

20

1.2.3.Tình hình nghiên cứu sự đa dạng di truyền của ngô bằng kỹ thuật RAPD.......

22

1.3. NHẬN XÉT CHUNG……………………………………...............

24

Chƣơng 2 . VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP………………………......

25

2.1.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU………………………………………..

25

2.1.1.Vật liệu thực vật…………………………………………………...

25

2.1.2.Hoá chất…………………………………………………...............

25

2.1.3.Thiết bị……………………………………………………….........

26

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU………………………………...

26

2.2.1.Phương pháp hóa sinh……………………………………………..

26

2.2.1.1.Xác định hàm lượng lipid………………………………………..

26

2.2.1.2.Xác định hàm lượng protein…………………………….............

26

2.2.1.3.Xác định hàm lượng đường tan.....................................................

27

2.2.2.Phương pháp sinh học phân tử.........................................................

27

2.2.2.1.Phương pháp tách DNA từ lá non của ngô...................................

27

2.2.2.2.Phương pháp xác định hàm lượng và độ tinh sạch DNA tổng số.............

28

2.2.2.3.Phản ứng RAPD............................................................................

29

2.2.2.4.Phương pháp xử lý kết quả và tính tốn số liệu............................

30

Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................

31

3.1. ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI, HĨA SINH HẠT CỦA CÁC GIỐNG
NGƠ NGHIÊN CỨU....................................................................................

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

31




3.1.1.Đặc điểm hình thái của 14 giống ngơ nghiên cứu................................

31

3.1.2.Hàm lượng protein, lipid, đường của 14 giống ngô nghiên cứu..........

32

3. 2. PHÂN TÍCH TÍNH ĐA HÌNH DNA BẰNG KỸ THUẬT RAPD...

35

3.2.1.Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá ngô.......................................

35

3.2.2.Kết quả nghiên cứu đa hình DNA bằng kỹ thuật RAPD.................

37

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ..........................................................................

50

CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN..............

51

TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................

52

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

AFLP

Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều
dài các phân đoạn được nhân bản)

ASTT

Áp suất thẩm thấu

CS

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotit triphotphat

EDTA

Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid

ISSR

Inter Simple Sequence Repeats

Kb

Kilobase

LEA

Late Embryogeneis Abundant protein (Protein tổng hợp với lượng
lớn ở giai đoạn cuối của q trình phát triển phơi)

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RAPD

Random Amplified Polymorphism DNA (Phân tích ADN đa
hình được nhân bản ngẫu nhiên)

RFLP

Restriction Fragment Length Polymorphism (Phân tích chiều dài
các phân đoạn ADN cắt hạn chế)

SDS

Sodium Dodecyl Sulphat

SDS-PAGE Phương pháp điện di trên gel polyacrylamid có chứa SDS
SSR

Simple Sequence Repeats

STS

Sequense Tagged Site

TBE

Tris - Boric acid - EDTA

TAE

Tris - Acetate - EDTA

TE

Tris - EDTA

Tris

Trioxymetylaminometan

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng

Tên bảng

Trang

1.1

Thành phần hoá học của hạt ngơ và gạo (Phân tích trên 100)…

8

1.2

Dự báo nhu cầu ngơ thế giới đến năm 2020………………..

9

1.3

Tình hình sản xuất ngơ của một số khu vực trên thế giới
giai đoạn 2005 – 2007……………………………………...

1.4

10

Tình hình sản xuất ngơ của một số quốc gia trên thế giới
năm 2007…………………………………………………

11

1.5

Tình hình sản xuất ngơ ở Việt Nam từ năm 2004 đến năm 2006

13

2.1

Đặc điểm 14 giống ngơ nghiên cứu………………………...

25

2.2

Trình tự các nucleotide của 10 mồi RAPD sử dụng trong
nghiên cứu………………………………………………….

29

2.3

Thành phần phản ứng RAPD……………………………….

30

3.1

Đặc điểm của 14 giống ngô nếp địa phương……………….

31

3.2

Hàm lượng protein, lipid, đường trong hạt của 14 giống ngô...

33

3.3

Phổ hấp thu DNA ở bước sóng 260nm và 280nm………….

36

3.4

Số phân đoạn DNA xuất hiện ở từng giống ngô nghiên cứu…..

38

3.5

Tỷ lệ phân đoạn đa hình khi sử dụng 10 mồi RAPD……….

47

3.6

Hệ số tương đồng di truyền của 14 giống ngơ nếp…………

48

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình

Tên hình

Trang

3.1

Hình dạng hạt của 14 giống ngơ…………………………..

32

3.2

Hình ảnh điện di DNA tổng số của 14 giống ngô…………

35

3.3

Phổ hấp thụ DNA của giống SLV đo ở bước sóng 260 nm.

37

3.4

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M1 của 14
giống ngơ………………………………………………….

3.5

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M2 của 14
giống ngơ………………………………………………….

3.6

3.12

43

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi RA159 của 14
giống ngơ………………………………………………….

3.11

43

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M9 của 14
giống ngơ………………………………………………….

3.10

42

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M8 của 14
giống ngơ………………………………………………….

3.9

41

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M6 của 14
giống ngơ………………………………………………….

3.8

40

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi M4 của 14
giống ngơ………………………………………………….

3.7

39

44

Hình ảnh điện di sản phẩm RAPD với mồi UBC23 của 14
giống ngô………………………………………………….

46

Biểu đồ mô tả quan hệ di truyền của 14 giống ngô………

49

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Cây ngơ có tên khoa học là Zea mays L. và có nguồn gốc từ Trung Mỹ.
Ngô là cây lương thực quan trọng trong nền kinh tế toàn cầu. Ở các nước
thuộc Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi, người ta sử dụng ngô làm lương thực
chính. Khơng những thế, ngơ cịn là cây cung cấp thức ăn chăn nuôi quan
trọng nhất hiện nay: 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp của gia súc là từ
ngơ (Ngơ Hữu Tình, 2003) [18]. Ngơ khơng chỉ cung cấp lương thực cho con
người, phát triển chăn ni, ngơ cịn là ngun liệu cho ngành cơng nghiệp
chế biến trên tồn thế giới. Hiện nay, diện tích ngơ trên thế giới vào khoảng
135 - 140 triệu ha, với sản lượng trung bình là 600 - 700 triệu tấn.
Ở Việt Nam, ngô là cây lương thực quan trọng thứ hai sau lúa của nông
dân vùng trung du và miền núi phía Bắc nói chung và cây lương thực chính
của đồng bào dân tộc thiểu số vùng cao nói riêng [1]. Trong những năm gần

đây sản xuất ngô ở Việt Nam tăng lên nhanh nhờ sự thúc đẩy của ngành chăn
nuôi và công nghiệp chế biến. Đặc biệt từ những năm 1990 trở lại đây, diện
tích, năng suất và sản lượng ngô tăng liên tục là nhờ ứng dụng những tiến bộ
khoa học kỹ thuật mới vào sản xuất mà tiêu biểu là đưa ngơ lai vào trồng trên
diện tích rộng. Các giống ngô ở nước ta hiện nay rất phong phú gồm các
giống ngô nhập nội, giống lai tạo, giống tổng hợp, giống đột biến và các
giống ngô địa phương [20].
Bên cạnh các giống ngơ lai có năng suất cao đang được trồng phổ biến ở
nhiều vùng trong cả nước, thì các giống ngơ địa phương tuy có năng suất thấp
nhưng chất lượng hạt cao, chất lượng ngô dẻo, thơm, ngon và chống chịu sâu
bệnh tốt.
Hiện nay, có rất nhiều phương pháp để nghiên cứu sự đa dạng di truyền
của các giống cây trồng nói chung và cây ngơ nói riêng như RFLP, AFLP,
1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




SSR, STS, RAPD,... Các phương pháp này khắc phục được nhược điểm của
các phương pháp chọn giống truyền thống bởi đánh giá được hệ gen của cây
trồng.
Những năm gần đây, diện tích trồng các giống ngơ địa phương ngày
càng có xu hướng giảm, nhiều giống ngô nếp quý hiếm sẽ bị mất dần. Như
vậy, việc sưu tập và nghiên cứu các giống ngơ nếp địa phương góp phần bảo
tồn nguồn gen cây ngô là rất cần thiết.
Nghiên cứu sự đa dạng di truyền ở mức DNA và đặc điểm hóa sinh ở
giai đoạn hạt là cơ sở khoa học để đề xuất việc chọn những giống ngơ có năng
suất cao và chất lượng tốt góp phần bảo tồn, phát triển nguồn gen cây ngơ. Từ
đó tuyển chọn giống ngơ thích hợp làm vật liệu chọn giống là những vấn đề rất

được quan tâm nghiên cứu. Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực
hiện đề tài: “Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống ngơ (Zea
mays L.)”
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Đánh giá chất lượng hạt của một số giống ngô nếp địa phương (Zea mays L.)
- Khảo sát sự đa dạng và mối quan hệ di truyền của 14 giống ngô bằng kỹ thuật
RAPD.
3. Nội dung nghiên cứu
- Phân tích đặc điểm hình thái, khối lượng và kích thước hạt của một số
giống ngơ nếp địa phương.
- Xác định hàm lượng lipid, protein, đường trong hạt của các giống ngơ
nghiên cứu.
- Phân tích sự đa hình DNA được nhân bản ngẫu nhiên, xác định mức sai
khác trong cấu trúc DNA hệ gen của các giống ngô nghiên cứu.
- Thiết lập mối quan hệ di truyền của 14 giống ngơ.

2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÂY NGÔ
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại cây ngô
Cây ngô (Zea mays L.) thuộc chi Maydeae, họ hịa thảo Gramineae,
có nguồn gốc từ Trung Mỹ. Ngơ có bộ nhiễm sắc thể (2n=20). Có nhiều
cách để người ta phân loại ngơ, một trong các cách đó là dựa vào cấu trúc
nội nhũ của hạt và hình thái bên ngồi của hạt. Ngơ được phân thành các

lồi phụ: ngô đá rắn, ngô răng ngựa, ngô nếp, ngô đường, ngô nổ, ngô bột,
ngô nửa răng ngựa. Từ các lồi phụ dựa vào màu hạt và màu lõi ngơ được
phân chia thành các thứ. Ngồi ra ngơ cịn được phân loại theo sinh thái
học, nông học, thời gian sinh trưởng và thương phẩm [12].
Có rất nhiều giả thuyết về nguồn gốc của ngô tại châu Mỹ như ngô là
sản phẩm thuần dưỡng trực tiếp từ cỏ ngô (Zea mays ssp. parviglumis) một
năm ở Trung Mỹ, có nguồn gốc từ khu vực thung lũng sông Balsas ở miền
nam Mexico. Cũng có giả thuyết khác cho rằng ngơ sinh ra từ q trình lai
ghép giữa ngơ đã thuần hóa nhỏ (dạng thay đổi không đáng kể của ngô dại)
với cỏ ngô thuộc đoạn Luxuriantes. Song điều quan trọng nhất nó đã hình
thành vơ số lồi phụ, các thứ và nguồn dị hợp thể của cây ngô, các dạng
cây và biến dạng của chúng đã tạo cho nhân loại một loài ngũ cốc có giá trị
đứng cạnh lúa mì và lúa nước [12].
1.1.2. Đặc điểm nông sinh học của cây ngô
Cơ quan sinh dưỡng của ngô gồm rễ, thân và lá làm nhiệm vụ duy trì
đời sống cá thể. Hạt được coi là cơ quan khởi đầu của cây.
Sau khi gieo hạt, ngô phát triển thành mầm. Cây mầm chủ yếu sử
dụng nguồn dinh dưỡng chứa trong nội nhũ hạt. Bộ phân phía trên hạt phát
triển lên mặt đất gồm có trụ giữa lá mầm. Phần đỉnh trụ lá mầm có mấu bao
3
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




lá mầm, từ đó phát sinh bao lá mầm và bên trong bao lá mầm là thân lá
mầm. Trên trục của cây mầm, một đầu hình thành rễ cây mầm, sau đó phát
triển thành rễ chính, từ rễ chính hình thành các rễ phụ. Ngơ là cây có rễ
chùm tiêu biểu cho bộ rễ cây hịa thảo. Hệ rễ có ba loại: rễ mầm, rễ đốt và
rễ chân kiềng. Rễ đốt giúp cho cây hút nước và các chất dinh dưỡng. Rễ

chân kiềng mọc xung quanh các đốt phần thân sát gốc trên mặt đất, rễ này
giúp cây chống đổ, đồng thời cũng tham gia vào hút nước và thức ăn cho
cây. Số lượng rễ, số lông rễ và chiều dài rễ khác nhau ở mỗi giống.
Thân ngô thường phát triển mạnh, thẳng cứng dạng bền chắc. Thân
chia làm nhiều gióng, các gióng nằm giữa các đốt, các gióng dài và to dần
từ dưới lên.
Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ nhau. Độ lớn và
số lá ngô dao động từ 6 đến 22 là tùy thuộc vào giống và điều kiện tự
nhiên. Lá ngô trưởng thành bao gồm các bộ phận: bẹ lá, phiến lá và thìa lá.
Bắp ngơ phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách lá trên cây
ngô nhiều, nhưng chỉ 1-3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Tuỳ
thuộc vào giống, điều kiện sinh thái, chăm bón, mật độ, mùa vụ… mà tỷ lệ
cây 2-3 bắp, số hạt trên bắp, vị trí đóng bắp, thời gian phun râu, trỗ cờ…có
khác nhau.
Hạt ngơ thuộc loại quả dĩnh gồm 4 bộ phân chính: vỏ hạt, lớp alơron,
phơi và nội nhũ. Phía dưới hạt có gốc hạt gắn liền với lõi ngô. Vỏ hạt bao
bọc xung quanh, màu sắc vỏ hạt tùy thuộc vào từng giống, nằm sau lớp vỏ
hạt là lớp alơron bao bọc lấy nội nhũ và phôi. Nội nhũ là thành phần chính
70-78% trọng lượng hạt, thành phần chủ yếu là tinh bột, ngồi ra cịn có
protein, lipid, vitamin, khống và enzyme để ni phơi phát triển. Phôi ngô
lớn (chiếm 8-15%) nên cần chú trọng bảo quản [12]

4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Mỗi một giai đoạn sinh trưởng, cây ngô yêu cầu về điều kiện sinh thái
khác nhau. Trong điều kiện đảm bảo về ẩm độ, ơxy và nhiệt độ thích hợp

cho ngô nảy mầm nhanh sau khi gieo. Nhiệt độ tối thiểu cho hạt nảy mầm
từ 8 – 120C, nhiệt độ tối đa cho hạt nảy mầm từ 40 – 450C, nhiệt độ tối
thích từ 25 – 280C. Ở các thời kỳ sinh trưởng khác nhau thì sự hút chất
dinh dưỡng cũng như yêu cầu về dinh dưỡng của ngô cũng khác nhau: Ở
thời kỳ đầu cây ngô hút chất dinh dưỡng chậm, thời kỳ từ 7 - 8 lá đến sau
trỗ 15 ngày toàn bộ các bộ phận trên mặt đất cũng như các bộ phận dưới
mặt đất của cây ngô tăng trưởng nhanh, các cơ quan sinh trưởng phát triển
mạnh, lượng tinh bột và chất khô tăng nhanh. Đây là giai đoạn cây ngô hấp
thu chất dinh dưỡng tối đa (bằng 70 - 90% dinh dưỡng cả vòng đời cây
hút). Ở thời kỳ này nếu cây thiếu nước và chất dinh dưỡng sẽ làm giảm
năng suất từ 10 - 20%. Trong các yếu tố dinh dưỡng thì đạm là nguyên tố
dinh dưỡng quan trọng bậc nhất của cây ngô (Lê Đức Biên,1986) [2].
1.1.3. Vai trị cây ngơ trong nền kinh tế
Ngô làm lương thực cho con người: Ngô là cây lương thực ni sống
gần 1/3 dân số trên tồn thế giới, tất cả các nước trồng ngơ nói chung đều
ăn ngơ ở mức độ khác nhau. Tồn thế giới sử dụng 21% sản lượng ngô làm
lương thực cho người. Các nước ở Trung Mỹ, Nam Á và Châu Phi sử dụng
ngơ làm lương thực chính. Các nước Đơng Nam Phi sử dụng 85% sản
lượng ngô làm lương thực cho người, Tây Trung Phi 80%, Bắc Phi 42%,
Tây Á 27%, Nam Á 75%, Đơng Nam Á và Thái Bình Dương 39%, Đông Á
30%, Trung Mỹ và các vùng Caribe 61%... Nếu như ở Châu Âu khẩu phần
ăn cơ bản là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; Châu Á: cơm (gạo), cá, rau xanh
(canh) thì châu Mỹ La Tinh là bánh ngơ, đậu đỗ và ớt. Vì vậy, trên phạm vi
thế giới, ngơ vẫn cịn là cây lương thực rất quan trọng, vì ngơ rất phong
phú các chất dinh dưỡng hơn lúa mỳ và gạo.
5
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Ngô làm thức ăn gia súc: Ngô là thức ăn gia súc quan trọng nhất hiện
nay. Hầu như 70% chất tinh trong thức ăn tổng hợp là từ ngô, điều đó phổ
biến trên tồn thế giới. Ngồi việc cung cấp chất tinh, cây ngơ cịn là thức
ăn xanh và ủ chua lí tưởng cho đại gia súc.
Những năm gần đây cây ngơ cịn là cây thực phẩm, người ta dùng bắp ngô
bao tử làm rau cao cấp. Sở dĩ, ngô rau được dùng vì nó sạch và có hàm lượng
dinh dưỡng cao. Các thể loại ngô nếp, ngô đường (ngô ngọt) được dùng làm
thức ăn tươi (luộc, nướng) hoặc đóng hộp làm thực phẩm xuất khẩu.
Ngơ là ngun liệu chính cho các nhà máy thức ăn gia súc tổng hợp,
ngô còn là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất rượu, tinh bột, bánh
kẹo… Người ta đã sản xuất ra các mặt hàng khác nhau cho các ngành công
nghiệp lương thực - thực phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp nhẹ.
Ngơ cũng là hàng hố xuất khẩu. Hàng năm lượng ngơ xuất khẩu
khoảng 70 triệu tấn. Đó là nguồn lợi lớn của các nước xuất khẩu. Các nước
xuất khẩu chính là Mỹ, Pháp, Argentina, Trung Quốc, Thái Lan. Các nước
nhập chính là Nhật Bản, Hàn Quốc, Liên Xơ cũ, Châu Phi, Mexico… [13].
Ngô vừa là cây lương thực, vừa là cây thức ăn cho gia súc. Chính vì
vậy diện tích trồng ngô trên thế giới tăng không ngừng. Năm 1979 diện tích
trồng ngơ chỉ đạt khoảng 127 triệu ha với tổng sản lượng là 475,4 triệu tấn,
đến năm 2007 diện tích trồng ngơ đạt 145,1 triệu ha với sản lượng 705,3
triệu tấn (theo số liệu thống kê của FAO, 2008).
Ở Việt Nam, cây ngô đã được trồng cách đây khoảng 300 năm và
được trồng trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả nước. Hàm
lượng chất dinh dưỡng của ngô tùy thuộc vào từng giống, đặc biệt là các
giống ngô nếp địa phương tuy năng suất không cao nhưng chất lượng của
hạt ngô tốt phù hợp với thị hiếu của người tiêu dùng. Vì vậy, việc nghiên

6
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

cứu đặc điểm hình thái, hóa sinh của các giống ngơ giúp chọn được các
giống ngơ có năng suất cao và chất lượng tốt đáp ứng cho công tác giống
và nhu cầu sử dụng của con người.
1.1.4. Đặc điểm hóa sinh hạt ngô
Các chất trong hạt ngô dễ bị đồng hóa nên có giá trị dinh dưỡng cao.
Hạt ngơ chứa tinh bột, lipid, protein, đường (chiếm khoảng 3,5%), chất
khoáng (chiếm khoảng 1 – 2,4%), vitamin (gồm vitamin A, B1, B2, B6, C
và một lượng rất nhỏ xenlulo (2,2%).
Hạt ngô chứa phần lớn tinh bột, hàm lượng tinh bột trong hạt thay
đổi trong giới hạn 60 - 70%. Hàm lượng tinh bột ở ngô tẻ nhiều hơn ngô
nếp (68% so với 65%). Tinh bột tập trung chủ yếu ở nội nhũ và được chia
thành hai dạng tinh bột là tinh bột mềm (tinh bột bột) và tinh bột cứng (tinh
bột sừng hay tinh bột phalê).
Hàm lượng lipid cao thứ hai trong các loại ngũ cốc sau lúa mạch, nó
chiếm khoảng (3,5 – 7%) và phụ thuộc vào từng giống, điều kiện tự nhiên.
Lipid được tập trung nhiều ở phôi và màng alơron. Dầu ngô chứa đến 50%
acid linoleic liên kết với glyxerit, acid oleic, panmitic, ricinic. Hàm lượng
lipid là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá chất lượng hạt [9].
Protein của ngơ được chia thành 3 dạng chính: protein hoạt tính (chủ
yếu là emzyme), protein cấu tạo và protein dự trữ, trong đó protein dự trữ
chiếm tỉ lệ cao nhất. Hàm lượng protein dao động từ 4,8 đến 16,6,% tùy
vào mỗi giống. Lợi dụng tính chất hịa tan của protein trong các dung mơi,
người ta có thể tách triết protein tan từ ngơ phục vụ cho nhiều mục đích
nghiên cứu như đánh giá chất lượng hạt, khả năng chịu hạn…
Thành phần hố học của hạt ngơ vàng đều cao hơn so với gạo trắng.
Ngoài thành phần tinh bột, protein, lipid, ở ngơ cịn chứa nhiều loại

vitamin, trong đó vitamin C cao nhất. Về nhiệt lượng của ngô cao hơn gạo

7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




trắng là 10%. Qua đó cho thấy, ngơ là cây lương thực có giá trị dinh dưỡng
tương đối cao (bảng 1.1).
Bảng 1.1. Thành phần hố học của hạt ngơ và gạo (Phân tích trên 100g)
Thành phần hóa học
Gạo trắng
Ngơ vàng
Tinh bột (g)
65,00
68,20
Protein (g)
8,00
9,60
Lipid (g)
2,50
5,20
Vitamin A (mg)
0
0,03
Vitamin B1 (mg)
0,20
0,28
Vitamin B2 (mg)

0
0,08
Vitamin C (mg)
0
7,70
Nhiệt lượng (Kalo)
340
350
(Cao Đắc Điểm, 1988) [8]
1.1.5. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam
1.1.5.1. Tình hình sản xuất ngơ trên thế giới
Trong những năm gần đây diện tích ngơ trên tồn thế giới đã tăng lên
gấp rưỡi, năng suất tăng gấp 2,5 lần. Diện tích ngơ hàng năm khoảng 139
triệu ha, năng suất bình quân khoảng 3,8 triệu tấn/ha, tổng sản lượng ngô
trên 525 triệu tấn/ ha. Ngơ là cây có địa bàn phân bố vào loại rộng nhất thế
giới, trải rộng hơn 90 vĩ tuyến: Từ 40 0N lên gần đến 55 0B, từ độ cao 1 - 2
m đến 400 m so với mực nước biển [13]. Do đó, ngơ được trồng ở hầu hết
các nơi trên thế giới như Châu Mỹ, Châu Âu, Châu Úc, Châu Phi.
Theo dự báo của Viện nghiên cứu chương trình lương thực thế giới
(IPRI, 2003), vào năm 2020 tổng nhu cầu ngô thế giới là 852 triệu tấn,
trong đó 15% dùng làm lương thực, 69% dùng làm thức ăn chăn nuôi, 16%
dùng làm nguyên liệu cho công nghiệp. Ở các nước phát triển chỉ dùng 5%
ngô làm lương thực nhưng ở các nước đang phát triển sử dụng 22% ngô
làm lương thực (IPRI, 2003) Đến năm 2020, nhu cầu ngô thế giới tăng 45%
so với nhu cầu năm 1997, chủ yếu tăng cao ở các nước đang phát triển
8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

(72%), riêng Đông Nam Á nhu cầu tăng 70% so với năm 1997 (Bảng 1.2),
sở dĩ nhu cầu ngô tăng mạnh là do dân số thế giới tăng, thu nhập bình quân
đầu người tăng, nên nhu cầu thịt, cá, trứng, sữa tăng mạnh, dẫn đến địi hỏi
lượng ngơ dùng cho chăn nuôi tăng. Nhưng thách thức lớn nhất là 80% nhu
cầu ngô thế giới tăng (266 triệu tấn), lại tập trung ở các nước đang phát
triển. Hơn nữa chỉ khoảng 10% sản lượng ngơ từ các nước cơng nghiệp có
thể xuất sang các nước đang phát triển. Vì vậy, các nước đang phát triển
phải tự đáp ứng nhu cầu của mình (IPRI, 2003).
Bảng 1.2. Dự báo nhu cầu ngơ thế giới đến năm 2020
Năm 1977

Năm 2020

(Triệu tấn)

( Triệu tấn)

Thế giới

586

852

45

Các nước đang phát triển

295

508

72

Đông Á

136

252

85

Nam Á

14

19

36

Cận Sahara – Châu Phi

29

52

79

Mỹ Latinh

75

118

57

Tây và Bắc Phi

18

28

56

Vùng

% thay đổi

(Nguồn: Viện nghiên cứu chương trình lương thực thế giới IPRI, 2003)
Theo Đại học Tổng hợp Iowa (2006), trong những năm gần đây khi thế
giới cảnh báo nguồn dầu mỏ đang cạn kiệt, thì ngơ đã và đang được chế biến
ethanol, thay thế một phần nhiên liệu xăng dầu chạy ô tô tại Mỹ, Braxin,
Trung Quốc,... Riêng ở Mỹ, năm 2002 - 2003 đã dùng 25,2 triệu tấn ngô để
chế biến ethanol, năm 2005 - 2006 dùng 40,6 triệu tấn và dự kiến năm 2012
dùng 190,5 triệu tấn ngơ (Oxfarm, 2004). Diện tích, năng suất, sản lượng ngơ
giữa các châu lục trên thế giới có sự chênh lệch tương đối lớn được thể hiện
bảng 1.3

9
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Bảng 1.3. Tình hình sản xuất ngơ của một số khu vực trên thế giới
giai đoạn 2005 – 2007
Khu vực

Diện tích

Năng suất

Sản lƣợng

(Triệu ha)

(Tạ/ha)

(Triệu tấn)

2005

2006

2007 2005 2006 2007

2005

2006

2007

Châu Âu

11,9

15,6

13,9

46,5

61,3

59,1

69,1

96,1

82,6

Châu Á

43,7

45,0

46,4

38,3

40,7

39,9

167,3 183,3 185,4

41,3

72,6

81,6

75,7

289,6 333,7 312,0

147,0 44,5

49,9

41,7

642,5 724,2 692,0

Bắc

và

Trung Mỹ
Thế giới

39,9

40,9

144,3 146,9

(Nguồn: Số liệu thống kê của FAOSTAT, 2008)
Qua bảng 1.3 cho thấy: Diện tích trồng ngơ giữa các Châu lục có sự
chênh lệch nhau trong đó Châu Á là khu vực có diện tích trồng ngơ lớn
nhất, năm 2005 là 43,7 triệu ha đến năm 2007 là 46,4 triệu ha, chiếm
khoảng 31,6% diện tích ngơ tồn thế giới. Đứng ở vị trí thứ hai là khu
vực Bắc và Trung Mỹ chiếm khoảng 28% diện tích trồng ngơ thế giới.
Châu Âu là khu vực có diện tích trồng ngơ thấp, chiếm khoảng 9,5%
diện tích trồng ngơ thế giới. Nhìn chung diện tích trồng ngô của các khu
vực trên thế giới biến động giữa các năm không đáng kể, nếu lấy 2007
làm mốc so sánh thì Châu Âu có giảm về mặt diện tích, cịn Châu Á cùng
với Bắc và Trung Mỹ thì diện tích tăng. Bắc và Trung Mỹ là khu vực có
năng suất cao nhất đạt 75,70 tạ/ha, đứng thứ hai là khu vực Châu Âu:
59,10 tạ/ha, và thấp nhất là Châu Á 39,91 tạ/ha (năm 2007). Sở dĩ Châu
Á có năng suất thấp chủ yếu là do khu vực này có điều kiện thời tiết bất
thuận như: hạn hán, lũ lụt, đất canh tác chưa thuận lợi. Giai đoạn 2005 2007, Châu Á và khu vực Bắc và Trung Mỹ năng suất tăng mạnh, Châu

10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Á tăng 2,4 tạ/ha, Bắc và Trung Mỹ tăng 9 tạ/ha, đến năm 2007 do nhiều lý do
khác nhau hai khu vực này đều có năng suất giảm. Bắc và Trung Mỹ là khu
vực dẫn đầu về sản lượng ngô trên toàn thế giới, năm 2005 đạt 289,6 triệu tấn,
chiếm 44,45% tổng sản lượng ngơ tồn thế giới. Đứng thứ hai là khu vực Châu
Á đạt 167,3 triệu tấn, chiếm 25,87%% tổng sản lượng ngơ tồn thế giới. Năm
2007 khu vực Bắc và Trung Mỹ đạt 312,0 triệu tấn, chiếm 45,08% tổng sản
lượng ngơ tồn thế giới, Khu vực Châu Á đạt 185,43 triệu tấn, chiếm 26,79%
tổng sản lượng ngô toàn thế giới.
Như vậy, trong giai đoạn từ năm 2005 đến 2007 diện tích trồng
ngơ trên thế giới tăng khơng đáng kể, nhưng do áp dụng các thành tựu
khoa học kỹ thuật tiên tiến đặc biệt là việc mở rộng diện tích trồng ngơ
lai nên thế giới có sự nhảy vọt về năng suất và sản lượng ngô, nhất là các
nước có nền kinh tế phát triển có điều kiện thâm canh cao và sử dụng
100% giống ngô lai trong sản xuất. Trên thế giới có một số nước như
Trung Quốc, Mỹ, Braxin chủ yếu là sử dụng ngô lai trong gieo trồng và
cũng là những nước có diện tích trồng ngơ lớn. Tình hình sản xuất ngơ
của một số quốc gia trên thế giới được thể hiện qua bảng 1.4.
Bảng 1.4. Tình hình sản xuất ngơ của một số quốc gia trên thế giới năm 2007
Tên nƣớc

Diện tích

Năng suất

Sản lƣợng

(Triệu ha)

(Tạ/ha)

(triệu tấn)

Italy

1,06

93,15

10,62

Mỹ

30,08

100,64

280,22

Hy lạp

0,84

80,95

6,80

Canada

1,08

77,43

8,39

Trung Quốc

26,22

50,01

131,15

Ấn Độ

7,40

19,60

14,50

(Nguồn: Số liệu thống kê của FAO, 2008)

11
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




Qua bảng 1.4 cho thấy, Mỹ là nước có diện tích, năng suất, sản lượng

lớn nhất đạt 30,08 triệu ha, với tổng sản lượng đạt 280,22 triệu tấn, năng suất
bình quân đạt 100,64 tạ/ha. Có thể nói, Mỹ và Trung Quốc là hai cường quốc
có diện tích trồng ngơ lớn nhất và cao gấp nhiều lần so với các quốc gia khác.
Theo số liệu của tổ chức Nông nghiệp và Lương thực Liên hợp quốc (FAO)
việc sản xuất và tiêu thụ ngơ trên thế giới đang có sự mất cân đối giữa cung
và cầu dẫn đến tình trạng các nước nhập khẩu ngơ tăng dần, cịn các nước
xuất khẩu ngơ thì lại có xu hướng giảm. Nước xuất khẩu ngơ nhiều là Mỹ,
Trung Quốc, Braxin,... các nước nhập khẩu ngô chính là Nhật Bản, Nam
Triều Tiên, Malayxia,... Đối với các nước chậm phát triển, do điều kiện kinh
tế còn gặp nhiều khó khăn, đầu tư thấp, sử dụng các giống ngơ địa phương,
ngơ thụ phấn tự do là chính, cho nên mặc dù trồng với diện tích lớn (trên 93,5
triệu ha) gấp 2 lần các nước phát triển nhưng sản lượng lại thấp hơn nhiều,
hiện nay chỉ có 20 nước năng suất ngơ vượt mức bình qn của thế giới. Sản
lượng ngô trên thế giới trong những năm gần đây có chiều hướng giảm nhẹ,
do diện tích ngơ có phần bị thu hẹp nhưng sản lượng chỉ giảm ở những nước
phát triển, còn đối với những nước đang phát triển sản lượng ngô lại tăng.
Như vậy, trên thế giới trong những năm qua về năng suất ngô đã tăng
nhanh ở một số nước phát triển và các nước đang phát triển. Hiện nay, thị
trường ngô trên thế giới được đánh giá là một thị trường tương đối khả quan.
Chính vì vậy mà sản xuất ngơ trên tồn cầu sẽ tăng trưởng mạnh trong những
năm tới (theo USDA 1/2003).
1.1.5.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam
Ở Việt Nam, cây ngô đã được trồng cách đây khoảng 300 năm và được
trồng trên những điều kiện sinh thái khác nhau của cả nước. Là cây lương
thực quan trọng thứ hai sau cây lúa, là cây trồng chính để phát triển ngành
chăn ni. Năng suất ngô ở nước ta trước đây rất thấp so với năng suất ngơ
12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

thế giới, do sử dụng giống ngô địa phương và áp dụng khoa học kỹ thuật vào
sản xuất còn hạn chế. Phải tới năm 1991 cây ngô lai mới bắt đầu được đưa
vào sản xuất ở nước ta, tỷ lệ trồng giống lai từ 0,1% năm 1990, năm 2006 đã
tăng lên 80% và đưa Việt Nam trở thành nước sử dụng giống lai nhiều và có
năng suất cao của khu vực Đơng Nam Á.
Bảng 1.5. Tình hình sản xuất ngơ ở Việt Nam từ năm 2004 đến năm 2006
Năm

Diện tích

Năng suất

Sản lƣợng

(1000 ha)

(Tạ/ha)

(1000 tấn)

2004

991,10

34,6171

343,09

2005

1052,60

35,6859

375,63

2006

1031,60

37,024

381,94

Ở nước ta ngô được trồng ở hầu hết các địa phương có đất cao dễ thốt
hơi nước. Những vùng trồng ngô lớn là Đông Nam Bộ, Tây Ngun, miền núi
phía Bắc, Trung du đồng bằng Sơng Hồng, Duyên hải Miền Trung [7] . Trong
đó, khu vực miền núi phía Bắc trồng chủ yếu là các giống ngô địa phương.
Năng suất của các giống ngô địa phương thường thấp, tuy nhiên các giống
ngô địa phương vẫn tiếp tục được quan tâm nghiên cứu vì các ưu điểm như
khả năng chịu hạn, kháng sâu bệnh tốt và có thể gieo trồng trên nhiều loại đất
khác nhau. Đặc biệt, những năm gần đây do kỹ thuật canh tác, do môi trường,
do sự xuất hiện các giống ngô lai và nhiều nguyên nhân khác dẫn đến sự cạn
kiệt về nguồn gen giống ngơ địa phương. Vì vậy việc sưu tập, nghiên cứu và
đánh giá nguồn gen các giống ngô địa phương là hết sức cần thiết.
1.2. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN Ở THỰC VẬT

1.2.1. Một số phƣơng pháp sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu

quan hệ di truyền thực vật

13
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




1.2.1.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms –
đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn)
Kỹ thuật RFLP là kỹ thuật sử dụng các endonuclease giới hạn cắt DNA
hệ gen ở trình tự nhận biết đặc trưng tạo ra hàng loạt đoạn DNA có độ dài xác
định, số lượng các đoạn này phụ thuộc vào số điểm nhận biết trong hệ gen.
Đa hình độ dài này được phát hiện bởi đánh dấu phóng xạ các mẫu dị DNA
bổ sung tạo ra từ cùng một locus. RFLP là chỉ thị đồng trội. Ưu điểm của
RFLP là: chỉ thị tin cậy trong phân tích liên kết và chọn giống vì chúng có thể
xác định được một tính trạng ở trạng thái đồng hợp hoặc dị hợp trong một cá
thể, tận dụng được biến dị tự nhiên, phát hiện tính biến dị của DNA trong các
giai đoạn phát triển ở cơ quan khác nhau và xây dựng quan hệ di truyền,
nghiên cứu quan hệ họ hàng. Nhược điểm của RFLP là kỹ thuật phức tạp, tốn
kém và mất thời gian. Phương pháp này đòi hỏi một lượng DNA lớn (50 –
200ng từ mỗi cá thể) [6].
Ignjatovic-Micic D. và cs (2003) đã sử dụng kỹ thuật RFLP kết hợp với
kỹ thuật RAPD để xác định quan hệ di truyền của 2178 giống ngô địa
phương. Kết quả xác định khoảng cách di truyền dao động từ 0,1311 đến
0,5075. Tác giả kết luận, dữ liệu phân tích RAPD và RFLP đều cho kết quả
giống nhau nên có thể dùng cả hai phương pháp này để xác định đa hình di
truyền [33].
Moretti A và cs (2008) đã sử dụng RFLP để xác định quan hệ di truyền
của Fusarium subglutinans gây bệnh ở ngô [37].

1.2.1.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa
hình độ dài các đoạn đƣợc nhân bản chọn lọc)
Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật kết hợp của RFLP và PCR. AFLP phát hiện
một cách có chọn lọc các đoạn DNA hệ gen được cắt bởi enzyme giới hạn và
gắn với adaptor (đoạn tiếp hợp). AFLP hoạt động dựa trên nhiều nguyên tắc

14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên




tương tự như RAPD, tuy nhiên có điểm khác biệt là mồi bao gồm hai phần:
phần cố định dài khoảng 15 bp chứa điểm nhận biết của enzyme giới hạn,
phần thay đổi dài khoảng 2-4 bp. Phân tích sản phẩm PCR được điện di trên
gel polyacryamide có độ phân giải cao. Sự đa hình được xác định bởi sự có
mặt hay khơng có mặt của một phân đoạn DNA. AFLP rất có hiệu quả trong
xác định quan hệ di truyền và lập bản đồ. Hiện nay, phân tích AFLP sử dụng
phương pháp nhuộm bạc nên dễ áp dụng, tuy giá thành cao hơn với phương
pháp RAPD. Kỹ thuật AFLP có ưu điểm là phân tích đa hình trong khoảng
thời gian ngắn, địi hỏi lượng DNA ít, cho sự đa hình cao, tuy nhiên việc thiết
kế mồi rất phức tạp.
Kỹ thuật AFLP được Miranda Oliverira K. và cs, (2004) sử dụng để đánh
giá mối quan hệ di truyền của 96 dòng ngơ lai cùng dịng, kết quả thu được
638 băng DNA trong đó có 569 băng DNA đa hình, hệ số tương đồng di
truyền dao động trong khoảng 0.345 tới 0.891, sơ đồ quan hệ di truyền chia
96 dịng ngơ nghiên cứu thành 17 nhóm [36].
Hartings H. và cs (2008) cũng sử dụng kỹ thuật này để xác định khoảng
cách di truyền của 54 giống ngô Italy [32].
Garcia và cs (2004) đã kết hợp các kỹ thuật RAPD, RFLP, AFLP và SSR

để nghiên cứu đa dạng di truyền của 18 dòng ngô lai. Sử dụng kỹ thuật AFLP
thu được 774 băng đa hình, kỹ thuật RAPD khuếch đại được 262 băng DNA,
kỹ thuật RFLP thu được 185 băng và SSR nhận được 68 băng đa hình [30].
Thomas Lübberstedt và cs (2000) đã xác định quan hệ di truyền của một
số giống ngô lai bằng kỹ thuật AFLP với việc sử dụng 8 mồi AFLP thu được
462 băng DNA đa hình [48].
1.2.1.3. Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeat – trình tự lặp lại đơn giản)
Kỹ thuật SSR còn được gọi là kỹ thuật microsatellies (vi vệ tinh). Kỹ thuật
này được Litt và Luty phát triển năm 1989 dựa trên nguyên tắc của PCR [36].

15
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên