Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng progesterone ở bò

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƯƠNG VĂN CƯỜNG

NGHİÊN CỨU TẠO KHÁNG THỂ ĐƠN DỊNG
KHÁNG PROGESTERONE Ở BỊ

Ngành:

Chăn ni

Mã số:

8620105

Người hướng dẫn khoa học: 1. TS Cù Thị Thiên Thu
2. PGS.TS Nguyễn Bá Mùi

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo
vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm
ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày

tháng 11 năm 2019

Tác giả luận văn

Dương Văn Cường

i


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận văn, tơi đã nhận
được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn
bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hồn thành luận văn, cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết
ơn sâu sắc tới TS Cù Thị Thiên Thu và PGS-TS Nguyễn Bá Mùi đã tận tình hướng dẫn,
dành nhiều cơng sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề
tài luận văn.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,
Bộ mơn Sinh lý - Tập tính động vật, Khoa Chăn Nuôi - Học viện Nông nghiệp Việt
Nam đã tạo điều kiện, giúp đỡ tơi trong q trình học tập, thực hiện đề tài và hồn thành
luận văn.
Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Khoa Thú y, Bệnh
viện Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam, đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tơi
trong suốt q trình thực hiện đề tài.
Tơi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi
điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hồn thành
luận văn./.
Hà Nội, ngày...... tháng 11 năm 2019
Tác giả luận văn

Dương Văn Cường

ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ ii
Mục lục ........................................................................................................................... iii
Danh mục chữ viết tắt ...................................................................................................... vi
Danh mục bảng ............................................................................................................... vii
Danh mục hình ............................................................................................................... viii
Trích yếu luận văn ........................................................................................................... ix
Thesis abstract................................................................................................................... x
Phần 1. Mở đầu ............................................................................................................... 1
1.1.

Tính cấp thiết của đề tài ...................................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu nghiên cứu ........................................................................................... 2

1.3.

Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn......................................... 2

Phần 2. Tổng quan tài liệu ............................................................................................. 3
2.1.

Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài trong và ngồi nước ....... 3

2.1.1.

Tình hình nghiên cứu trên thế giới ..................................................................... 3

2.1.2.

Tình hình nghiên cứu trong nước ....................................................................... 3

2.2.

Quá trình hình thành và chức năng của Hormone Progesterone ........................ 4

2.2.1.

Tổng quan về Hormone ...................................................................................... 4

2.2.2.

Sự điều hoà hoạt động sinh dục tuyến nội tiết .................................................... 5

2.3.

Một số hiểu biết về miễn dịch học .................................................................... 13

2.3.1.

Miễn dịch và đáp ứng miễn dịch ...................................................................... 13

2.3.2.

Các cơ quan và tế bào tham gia vào đáp ứng miễn dịch ................................. 16

2.3.3.

Kháng nguyên (Antigen) .................................................................................. 17

2.3.4.

Kháng thể .......................................................................................................... 18

2.3.5.

Sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể .................................................... 20

2.3.6.

Kháng thể đơn dòng và ứng dụng ..................................................................... 21

2.4.

Kỹ thuật ELISA ................................................................................................ 30

Phần 3. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu .......................................... 32
3.1.

Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................... 32

3.2.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu .................................................................... 33

iii


3.3.

Nội dung nghiên cứu ........................................................................................ 33

3.3.1.

Gây miễn dịch cho chuột thuần chủng BALB/c bằng các kháng nguyên
khác nhau .......................................................................................................... 33

3.3.2.

Thu số lượng tế bào lympho B ở chuột gây miễn dịch ..................................... 33

3.3.3.

Đánh thức và nuôi cấy tế bào Myeloma Sp2/0 dùng để dung hợp với tế
bào Lympho B .................................................................................................. 33

3.3.4.

Sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng bằng phản ứng ELISA ................. 33

3.3.5.

Nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu progesterone ................. 33

3.3.6.

Xác định nồng độ kháng thể đơn dòng được tạo ra trong dịch báng của
chuột BALB/c .................................................................................................. 33

3.3.7.

Kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa kháng thể đơn
dòng với các kháng nguyên .............................................................................. 33

3.4.

Phương pháp nghiên cứu .................................................................................. 33

3.4.1.

Phương pháp gây miễn dịch cho chuột thuần chủng BALB/c bằng các
kháng nguyên khác nhau .................................................................................. 33

3.4.2.

Phương pháp thu số lượng tế bào lympho B ở chuột gây miễn dịch ................ 35

3.4.3.

Phương pháp đánh thức và nuôi cấy tế bào Myeloma Sp2/0 dùng để dung
hợp với tế bào Lympho B ................................................................................. 36

3.4.4.

Sàng lọc dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dịng bằng phương pháp
ELISA ............................................................................................................... 37

3.4.5.

Phương pháp ni cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu
progesterone...................................................................................................... 38

3.4.6.

Phương pháp xác định nồng độ kháng thể đơn dòng được tạo ra trong
dịch báng của chuột BALB/c........................................................................... 38

3.4.7.

Kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa kháng thể đơn
dòng với các kháng nguyên .............................................................................. 41

Phần 4. Kết quả và thảo luận ...................................................................................... 42
4.1.

Kết quả đáp ứng miễn dịch của chuột với các kháng nguyên .......................... 42

4.2.

Kết quả thu số lượng tế bào Lympho B ở chuột gây miễn dịch ....................... 44

4.3.

Kết quả dung hợp tế bào Myeloma SP2/0 với tế bào Lympho B ..................... 45

4.4.

Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng bằng phản ứng
ELISA ............................................................................................................... 47

iv


4.5.

Kết quả nuôi cấy tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng ........................................ 52

4.6.

Xác định nồng độ kháng thể đơn dòng được tạo ra trong dịch báng của
chuột BALB/c ................................................................................................... 53

4.6.1.

Kết quả xác định hiệu giá kháng thể bằng phương pháp ELISA ..................... 53

4.6.2.

Kết quả tinh chế kháng thể từ dịch nước báng ................................................. 54

4.6.3.

Kết quả chạy điện di kháng thể IgG thu được trên gel SDS-PAGE ................. 55

4.7.

Kết qủa kiểm tra khẳ năng bắt cặp đặc hiệu, bắt cặp chéo giữa kháng thể
đơn dòng với các kháng nguyên ....................................................................... 55

Phần 5. Kết luận và kiến nghị...................................................................................... 58
5.1.

Kết luận............................................................................................................. 58

5.3.

Kiến nghị .......................................................................................................... 58

Tài liệu tham khảo .......................................................................................................... 59

v


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

BSA

Bovine Serum Albumin

Cs

Cộng sự

DMEM

Dulbeco Modified Eagl Medium

ĐƯMD

Đáp ứng miễn dịch

EIA

Enzyme Immuno Assay

ELISA

Enzyme Linkied Imumuno Sorbent Assay

FBS

Fetal Bovine Serum

FCA

Freund complete Adjuvant

FIA

Freund’s Incomplete Adjuvant

FSH

Follicle Stimulating Hormone

GnRH

Gonadotropin Realising Hormone

HAT

HypoxanthineAminopterinThimidine

HPRT

Hypoxathin Phospho Ribosyl Transferase

HT

Hypoxanthine Thimidine

KN

Kháng nguyên

KT

Kháng thể

KTĐD

Kháng thể đơn dòng

LH

Luteinizing Hormone

PBS

FetalBovineSerum

PEG

Polyethylene glycol

PGF2α

Progesterone F2α

RIA

Radio Immuno Assay

vi


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1. Giá trị OD450 mẫu huyết thanh chuột ở các nồng độ gây miễn dịch
khác nhau đối với từng loại kháng nguyên .................................................. 42
Bảng 4.2. Số lượng tế bào Lympho B ở chuột có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt
nhất với 3 kháng nguyên khác nhau............................................................. 45

Bảng 4.3. Kết quả lai giữa tế bào Myeloma Sp2/0 và tế bào lymphoB của chuột
BALB/c được gây miễn dịch với các kháng nguyên khác nhau .................. 46
Bảng 4.4. Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng
nguyên Progesteron Antigen bằng phản ứng ELISA .................................. 48
Bảng 4.5. Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng
nguyên Progesterone-3-BSA Antigen bằng phản ứng ELISA .................... 49
Bảng 4.6. Kết quả sàng lọc tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng
nguyên Progesterone -3- CMO:BSA Antigen bằng phản ứng ELISA ........ 51
Bảng 4.7. Số lượng tế bào sau khi phục hồi ................................................................. 53
Bảng 4.8. Hàm lượng kháng thể đặc hiệu progesterone sau tinh chế........................... 54
Bảng 4.9. Tính đặc hiệu của các kháng thể đơn dòng tạo ra với các kháng
nguyên tương ứng ........................................................................................ 56
Bảng 4.10. Khả năng bắt cặp chéo giữa các kháng thể đơn dòng đặc hiệu với các
kháng nguyên khác bằng phản ứng ELISA ................................................. 57

vii


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Cơ chế tác dụng của hormone ........................................................................ 5
Hình 2.2. Điều hồ tiết các hormone và vị trí tác động của chúng trong kỳ động
dục của bị ...................................................................................................... 6
Hình 2.3. Cơng thức cấu tạo progesterone ..................................................................... 9
Hình 2.4. Biến thiên nồng độ progesteron sau khi thụ tinh có kết quả và thời
điểm lấy mẫu chẩn đốn có thai ................................................................... 10
Hình 2.5. Cơng thức cấu tạo của kháng thể (Đỗ Ngọc Liên, 1999)............................. 20
Hình 2.6. Kháng thể đơn dịng liên kết với một epitope đặc hiệu .............................. 22
Hình 2.7. Qui trình sản xuất kháng thể đơn dịng ........................................................ 28
Hình 2.8. Kỹ thuật ELISA ........................................................................................... 31
Hình 3.1. Gây miễn dịch cho chuột BALB/c ............................................................... 35

Hình 3.2. Thu hạch bẹn chuột ...................................................................................... 35
Hình 3.3. Thu lách chuột.............................................................................................. 35
Hình 3.4. Nghiền nhỏ hạch bẹn và lách chuột ............................................................. 35
Hình 3.5. Chuột BALB/c trước khi tiêm .................................................................... 39
Hình 3.6. Tiêm tế bào lai vào xoang phúc mạc chuột .................................................. 39
Hình 3.7. Thu dịch báng trong xoang phúc mạc chuột ............................................... 39
Hình 3.8. Dịch báng thu được sau khi ly tâm loại bỏ cặn ............................................ 39
Hình 4.1. Tế bào lai sau 24h phục hồi ......................................................................... 52
Hình 4.2. Tế bào lai sau 72h phục hồi ......................................................................... 52
Hình 4.3. Kết quả ELISA dịch nước báng ở các độ pha lỗng khác nhau................... 53
Hình 4.4. Đồ thị biểu diễn các phân đoạn thu được khi tinh chế kháng thể đơn
dịng từ dịch nước báng................................................................................ 54
Hình 4.5. Dịch thu được ở các phân đoạn 2-9 ............................................................. 55

viii


TRÍCH YẾU LUẬN VĂN
Tên tác giả: Dương Văn Cường
Tên luận văn: Nghiên cứu tạo kháng thể đơn dòng kháng progesterone ở bị
Ngành : Chăn ni

Mã số: 8620105

Cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
Mục tiêu nghiên cứu
Tạo được các dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng kháng progesterone, làm cơ
sở cho việc ứng dụng sản xuất que thử thai nhanh trên bò tại Việt Nam.
Phương pháp nghiên cứu
- Gây miễn dịch trên chuột BALB/c bằng ba kháng nguyên chuẩn: Progesterone

Antigen (Mã code MBS238011, hãng Mybiosource, Mỹ); Progesterone-3-BSA Antigen
(Mã code LA330, hãng EastCoast Bio, Mỹ); Proesterone-3-CMO:BSA Antigen (Mã
code ND-R0752, hãng Novateinbio, Mỹ).
- Tế bào lympho B mẫn cảm với kháng nguyên được thu từ lách và hạch của
chuột BALB/c
- Đánh thức và nuôi cấy tế bào Myeloma dùng để dung hợp với tế bào Lympho
B để tạo dịng tế bào lai hybrydoma có khả năng tiết kháng thể đơn dòng.
- Bằng phản ứng ELISA sàng lọc được các dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn
dòng đặc hiệu với Progesterone.
- Kiểm tra khả năng bắt cặp đặc hiệu và khả năng bắt cặp chéo giữa kháng thể
đơn dòng với các kháng nguyên bằng phương pháp ELISA.
Kết quả chính và kết luận
- Chuột có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt nhất đối với các kháng nguyên
progesterone ở nồng độ 200 µg/lần/con.
- Đã tạo được 5 dịng tế bào lai (đặt tên là: E4, E3, C6, H3, F10) có khả năng tiết
kháng thể đơn dịng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone Antigen.
- Đã tạo được 3 dòng tế bào lai (đặt tên là: C12, D7, F11) có khả năng tiết kháng
thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-BSA antigen.
- Đã tạo được 3 dòng tế bào lai (đặt tên là: G5, H3, A7) có khả năng tiết kháng thể
đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên Progesterone-3-CMO:BSA Antigen.

ix


THESIS ABSTRACT
Master candidate: Duong Van Cuong
Thesis title: Production of monoclonal antibodies specific for progesterone in cows
Major: Animal science

Code: 8620105

Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives: Create hybridoma cell lines secreting monoclonal antibody
against progesterone hormone which can be used, in order to produce Quick pregnancy
test on cows in Vietnam.
Methodology
- To immunize BALB/c mice with three standard antigens: Progesterone
Antigen (Code code MBS238011, Mybiosource, USA); Progesterone-3-BSA Antigen
(Code LA330, EastCoast Bio, USA); Proesterone-3-CMO: BSA Antigen (Code NDR0752, Novateinbio, USA).
- Antigen-sensitive lymphocytes B collected from spleen and lymph nodes of
BALB/c mice.
- Awakening and culturing Myeloma cells then fusing with Lympho B cells to
create hybrydoma hybrid cell lines capable of secreting monoclonal antibodies.
- By the ELISA reaction, the cell lines secreting progesterone specific monoclonal antibody were screened.
- Test the specific pairing ability and the ability to cross between monoclonal
antibodies and antigens by ELISA method.
Main findings
- The mouse has the best immune response to progesterone antigens at a
concentration of 200 µg / time / head.
- 5 hybrid cell lines have been created (named: E4, E3, C6, H3, F10) capable of
secreting monoclonal antibodies with Progesterone Antigen.
- 3 hybrid cell lines (named C12, D7, F11) are capable of secreting monoclonal
antibodies with Progesterone-3-BSA antigen.
- 3 hybrid cell lines (named G5, H3, A7) are capable of secreting monoclonal
antibodies specific to the antigen Progesterone-3-CMO: BSA Antigen.

x


PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi ở nước ta đã và đang phát
triển cả về qui mơ lẫn tính chun hóa. Sản phẩm chăn ni nội địa đã phần nào
đáp ứng được nhu cầu ngày càng tăng về thực phẩm có nguồn gốc động vật của
người dân trong nước. Trước sức ép nhu cầu thịt, sữa bò ngày càng cao của
người dân, hiện nay Chính Phủ, Bộ Nơng nghiệp và Phát triển nơng thơn đã có
chiến lược định hướng phát triển đàn bò nhằm nâng cao khả năng cung cấp sản
phẩm, cải thiện nhu cầu dinh dưỡng cho người tiêu dùng nội địa. Giai đoạn 20082018, số lượng bò sữa cả nước từ 108 nghìn con tăng lên 294,4 nghìn con, tốc độ
tăng trưởng bình quân đạt 10,5%/năm (Cục chăn nuôi 2019). Một trong những
giải pháp tăng đàn nhanh nhất là thông qua con đường nhân giống và sinh sản.
Tuy nhiên, trong điều kiện khí hậu ở Việt Nam nóng ẩm, cùng với trình độ chăn
ni vẫn cịn hạn chế, chất lượng giống bị, chế độ chăm sóc, ni dưỡng, khai
thác, quản lý, di truyền, thú y … chưa được tốt nên sức sản xuất nói chung và
khả năng sinh sản của bị nói riêng vẫn cịn thấp. Một trong những nguyên nhân
chính gây rối loạn sinh sản và thay đổi sức sản xuất là do sự thay đổi các chỉ tiêu
sinh lý, sinh hóa, sự chuyển hóa của các hormone sinh sản quan trọng như
progesterone, FSH, LH, v.v.
Để nâng cao năng suất sinh sản ở bị thì việc phát hiện và chẩn đốn có
thai sớm là rất quan trọng. Nếu thai không được phát hiện kịp thời sau khi phối
giống, sẽ dẫn đến tăng khoảng cách lứa đẻ và giảm tỷ lệ nhân giống cũng như sản
lượng sữa. Nếu bò sữa mang thai được phát hiện ở giai đoạn sớm sẽ được chăm
sóc ni dưỡng cẩn thận theo chế độ bị mang thai, từ đó có thể tăng tỷ lệ đẻ. Đối
với bị khơng có thai, có thể kịp thời phối giống lại, rút ngắn khoảng cách lứa đẻ
và giảm chi phí thức ăn, qua đó tăng hiệu quả kinh tế. Chính vì vậy, nghiên cứu
về các kỹ thuật chẩn đốn thai sớm ở bị sữa là rất quan trọng đối với sự phát
triển của ngành chăn nuôi bị sữa.
Hiện nay, đã có một số phương pháp được ứng dụng để chấn đốn có thai
đối với gia súc nhai lại như siêu âm, khám qua trực tràng nhưng các phương
pháp này thường chỉ phát hiện khi gia súc đã có thai sau 2 tháng trở đi. Trong khi
đó, việc sử dụng kháng thể đơn dòng để tạo các bộ kit-ELISA nhằm phân tích

1


định lượng các chất sinh học nói chung và các hormone sinh sản nói riêng mang
lại hiệu quả cao do có thể phát hiện thai sớm, chỉ cần lấy nước tiểu của gia súc
cái sau khi phối từ 22-25 ngày là có thể khẳng định được gia súc có thai hay
khơng có thai. Đây là tính ưu việt của phương pháp này so với các phương pháp
đang áp dụng hiện nay.
Hormone Progesterone được tiết ra từ thể vàng là chỉ thị phản ánh thực
trạng hoạt động nội tiết của buồng trứng và thể vàng, thực trạng sinh lý cũng như
bệnh lý sinh sản của bò. Sự thay đổi nồng độ của Progesterone trong huyết thanh
hay trong sữa là một trong những chỉ thị phản ánh trạng thái động của buồng
trứng. Độ dài chu kỳ tính của bị bình thường kéo dài 21 ngày, Progesterone thấp
vào đầu chu kỳ, sau đó tăng dần và đạt cao nhất trong giai đoạn giữa chu kỳ, nếu
bị khơng mang thai thì nồng độ Progesterone bắt đầu giảm xuống ở mức thấp
nhất vào ngày thứ 17 sau khi giao phối. Nếu có chửa thì thì nồng độ tiếp tục duy
trì cao trong máu và sữa.
Dựa trên quy luật này, rất nhiều cơng trình nghiên cứu đã được thực hiện
và ứng dụng thành công như định lượng bằng sắc ký, ELISA, RIA, que thử
nhanh. Một số sản phẩm đã được nhập khẩu vào Việt Nam, tuy nhiên do giá
thành còn cao nên việc sử dụng cho các trang trại lớn và hộ chăn ni bị nhỏ lẻ
còn rất hạn chế. Do vậy, việc chủ động sản xuất được que thử thai nhanh trên bò
tại Việt Nam là rất cần thiết. Nghiên cứu này nhằm tạo ra được kháng thể đơn
dịng kháng Progesterone, từ đó làm cơ sở cho việc sản xuất que thử thai nhanh
trên bò tại Việt Nam
Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu tạo
kháng thể đơn dòng kháng progesterone ở bò”
1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Tạo được các dòng tế bào lai tiết kháng thể đơn dòng kháng progesterone

làm cơ sở cho việc ứng dụng sản xuất que thử thai nhanh trên bò tại Việt Nam
1.3. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
- Xây dựng được các bước tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu kháng
progesterone ở bị phục vụ cho cơng tác chế tạo các kit ELISA chẩn đoán nhanh,
que thử thai nhanh (Quick Stick).

2


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THUỘC LĨNH VỰC CỦA
ĐỀ TÀI TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC
2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Các nước trên thế giới đã và đang nghiên cứu chế tạo ra bộ kit có độ nhạy
dùng trong chẩn đốn có thai sớm cũng như chẩn đoán các rối loạn sinh sản theo
các hướng sau:
- T. Nakao, Sugihashi A. Saga, 1981 đã nghiên cứu tạo kháng thể kháng P4
trên thỏ dùng trong kỹ thuật EIA.
- Xác định hàm lượng progesterone trong thời gian động dục (Maurice.J et
al.1981); (Nakao et al.1983)
- Xác định hàm lượng progesterone để chẩn đoán nguyên nhân gây chậm
sinh và điều khiển chu kỳ sinh dục ở gia súc (Nakao et al.1983)
- Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng progesterone ứng dụng trong việc xác
định hàm lượng progesterone trong máu để chẩn đốn có thai sớm ở lợn bằng
phương pháp EIA , cho kết quả chẩn đốn có thai là 92,2%, kết quả chẩn đốn
chính xác khơng có thai là 83,3% (Wu.L.S et al. 1997)
- Isobe et al. (2002) đã nghiên cứu phương pháp tạo kháng thể kháng P4,
HRP-P4 có đặc hiệu cao và cải tiến một bước khi xét nghiệm EIA-P4 trên bò sữa
ở Nhật Bản.
- Homeida et al. (2002) đã nghiên cứu hàm lượng propgesterone ở bò thụ

thai và không thụ thai sau khi thụ tinh nhân tạo, tác giả nhận thấy khi động dục
hàm lượng progesterone rất thấp và khi bị cái có thai hàm lượng progesterone
tăng > 1ng/ml và ổn định từ ngày thứ 7 sau khi phối.
2.1.2. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở Việt Nam, vấn đề chẩn đốn có thai sớm cho bị sữa đang rất được quan
tâm do chính sách phát triển đàn bị sữa của Chính Phủ. Số lượng bị sữa ngày
một tăng cao. Hiện nay sử dụng một số phương pháp chẩn đốn có thai:
- Khám thai qua trực tràng: Đây là phương pháp áp dụng lâu đời nhất.
Khám thai qua trực tràng bò là một nghệ thuật, bước quan trọng nhất là phát hiện
cổ tử cung. Thời gian tốt nhất để khám thai là 42 - 60 ngày sau khi phối giống.

3


- Ứng dụng kỹ thuật RIA để định lượng progesterone trong huyết thanh
với những trường hợp bị có buồng trứng kém phát triển, bị viêm buồng trứng, có
u nang buồng trứng, buồng trứng có thể vàng tồn lưu, bị bị viêm tử cung đã cho
hiệu quả cao hạn chế thiệt hại cho người chăn ni trâu bị tại khu vực Thành phố
Hồ Chí Minh (Chung Anh Dũng và cs. 2001).
- Phan Văn Kiểm và cs. (2003) đã ứng dụng kỹ thuật EIA, ELISA xác
định hàm lượng progesterone để xác định ngun nhân chậm sinh đối với bị cái
ni tại Ba Vì và khu ngoại thành Hà Nội.
- Kỹ thuật EIA-P4 lần đầu tiên được nghiên cứu ở Viện chăn nuôi (từ
11/2001 đến 12/2005) với đề tài “Nghiên cứu hàm lượng một số hormone sinh
dục và ứng dụng để nâng cao năng suất sinh sản gia súc”
- Phan Văn Kiểm và Nguyễn Bá Mùi (2005) đã sử dụng kỹ thuật ELISA
định lượng progesterone trong máu để xác định động thái progesterone trong chu
kỳ động dục bình thường của bị. Kết quả cho thấy hàm lượng progesterone trong
động dục của bò thấp nhất vào ngày động dục (0,21 ng/ml), sau đó tăng vào ngày
thứ 7 (1,50ng/ml), tăng cao vào ngày thứ 14 (2,21 ng/ml), sau đó giảm thấp vào

ngày thứ 21 (0,38 ng/ml). Chính vì thế, có thể dựa vào nồng độ thời điểm sau 21
ngày tính từ thời điểm xuất hiện động dục để chẩn đốn bị có thai hay khơng.
2.2. QUÁ TRÌNH HÌNH THÀNH VÀ CHỨC NĂNG CỦA HORMONE
PROGESTERONE
2.2.1. Tổng quan về Hormone
Hormone (nội tiết tố) là những chất truyền tin hóa học tuần hồn theo máu
đi từ nơi sinh đến cơ quan tiếp nhận (cơ quan đích) để phát huy tác dụng sinh học
cao và được điều hòa theo phương thức điều hòa ngược (Nguyễn Xuân Tịnh và
cs. 1996). Hormone có thể do tuyến nội tiết hoặc một số tế bào tổ chức tiết ra và
theo máu đi khắp cơ thể để điều hịa các q trình sinh lý quan trọng như sinh
trưởng, phát dục, sinh sản… Hormone có hoạt tính sinh học cao nên có thể gây
tác dụng ở nồng độ rất nhỏ. Mỗi hormone chỉ có tác dụng đối với một cơ quan,
bộ phận nhất định.
Khi hormome được vận chuyển đến cơ quan tác dụng sẽ gắn với
receptor tại tế bào đích, gây ra các tác dụng tiếp theo như làm thay đổi tính
thấm màng tế bào (mở kênh hoặc đóng các kênh ion), hoạt hố hệ thống
enzyme ở trong tế bào (đối với các hormome gắn với receptor màng), hoạt hoá

4


hệ gen (đối với các hormome gắn với receptor ở nhân) để gây nên những đáp
ứng sinh học tương ứng.
Tuỳ thuộc vào bản chất và cấu tạo hoá học của hormone mà vị trí gắn của
hormone với receptor sẽ xảy ra trên màng, trong bào tương hoặc trong nhân tế
bào và do đó chúng sẽ có những con đường hay những cơ chế tác dụng khác
nhau tại tế bào đích.

A. Cơ chế tác dụng thơng qua AMP vịng

B. Cơ chế tác dụng thơng qua hoạt hố gen

Hình 2.1. Cơ chế tác dụng của hormone
2.2.2. Sự điều hoà hoạt động sinh dục tuyến nội tiết
Sinh sản là một quá trình sinh học hết sức phức tạp của cơ thể động vật
được điều hịa thơng qua hệ thần kinh - thể dịch của cơ thể, trong đó điều hịa
trực tiếp bằng hormone. Trong các tổ chức của hệ thần kinh, vùng dưới đồi
(hypothalamus) là cầu nối giữa thần kinh và thể dịch, đóng vai trị rất quan trọng
trong kiểm sốt sự hoạt động của tuyến sinh dục. Ở đó tập trung những đường
liên hệ nhiều phía từ các phần của hệ thần kinh và là nơi biến các xung thần kinh
đó thành tác động nội tiết (Trần Tiến Dũng, 2002). Hypothalamus tiết ra các chất
kích thích (yếu tố giải phóng) GnRH (Gonadotropin Realeasing hormone) kích
thích thùy trước tuyến yên tiết FSH, LH. FSH (kích nỗn tố) có tác dụng kích
thích sự phát triển noãn nang của buồng trứng, lớp tế bào hạt tăng sinh, tăng tiết
oestrogen tác động làm biến đổi các cơ quan sinh dục đồng thời tác động ngược
lên vùng hypothalamus, vỏ đại não gây nên những thay đổi về hành vi, tập tính
hay hiện tượng động dục. Sau đó LH (kích hồng thể tố) tác động lên các trứng
đã phát triển nổi rõ trên bề mặt buồng trứng phát triển thành trứng chín. Để q
trình động dục thể hiện rõ, điển hình và đảm bảo sự rụng trứng thì hàm lượng hai

5


loại hormone này phải đạt một tỷ lệ nhất định và đa số các nghiên cứu đã chứng
minh tỷ lệ phù hợp FSH/LH là 3/1 (Lê Văn Thọ, 1979).
Mối liên hệ theo trục dọc từ Hypothalamus, tuyến yên đến buồng trứng có
tác dụng điều hịa hoạt động sinh dục của gia súc cái không chỉ theo chiều thuận
(hormone được bài tiết từ tuyến đến tác động các tuyến đích) mà còn được điều
hòa theo cơ chế điều hòa ngược (feedback) từ các hormone tuyến đích đến tuyến
chỉ huy. Trong đó, cơ chế điều hịa ngược đóng vai trị chủ yếu, quan trọng,

nhanh và nhạy để duy trì ổn định nồng độ hormone trong máu ln hằng định và
thích ứng với các hoạt động của cơ thể khi sống trong môi trường luôn thay đổi.
Khi GnRH được tiết từ Hypothalamus, sẽ kích thích thùy trước tuyến n
tiết hormone kích nỗn tố (FSH) và hormone kích thể vàng tố (LH). FSH làm
cho nang trứng nguyên thủy (primordial follicles) trong buồng trứng phát triển.
Nang trứng phát triển về mặt kích thước do sự phát triển của lớp tế bào hạt tiết
dịch chứa Oestrogen làm cho noãn nang nổi rõ trên bề mặt buồng trứng. Nồng độ
Ostrogen trong máu cao sẽ kiểm soát ngược âm tính lên thùy trước tuyến yên làm
giảm tiết FSH. Tuy nhiên, ở thời gian đầu thời kỳ rụng trứng, sự tăng nồng độ
của oestrogen có tác dụng kiểm sốt ngược dương tính hơn là âm tính lên thùy
trước tuyến yên làm tăng sự giải phóng LH và FSH. Nồng độ của FSH được giải
phóng thấp hơn so với LH vì nang trứng sản xuất ra chất inhibin (chất ức chế), là
một hormone polypeptid có khả năng ức chế đặc hiệu sự giải phóng FSH và
khơng tác dụng lên LH. Sự tăng nồng độ LH sẽ kích thích chín và rụng trứng.

Hình 2.2. Điều hồ tiết các hormone và vị trí tác động của chúng
trong kỳ động dục của bị

6


Sau khi rụng trứng do sự lutein hóa hình thành thể vàng phân tiết
progesterone. Khi xuất hiện, progesterone tác động lên tuyến yên ức chế phân tiết
FSH, LH, quá trình động dục chấm dứt. Nếu khơng có chửa thể vàng tồn tại đến
ngày thứ 15 - 17 của chu kỳ sau đó teo dần kéo theo hàm lượng progesterone
giảm dần, giảm đến một mức độ nhất định cùng với một số nhân tố khác kích
thích vỏ đại não, hypothalamus tiết GnRH kích thích tuyến yên tăng cường phân
tiết FSH, LH lại làm xuất hiện chu kỳ mới (Lê Đức Trình, 1998).
Khi xuất hiện Progesterone tác động làm cho tử cung dày lên tạo điều kiện
tốt cho việc làm tổ của hợp tử, nếu trứng rụng được thụ tinh thể vàng sẽ tồn tại

đến gần hết thời gian chửa, duy trì nồng độ progesterone cao trong máu.
2.2.2.1. Sự rụng trứng
Rụng trứng xảy ra do hiện tượng cao áp bên trong nang trứng cùng sự
phân giải màng collagen của nang trứng. Tuyến yên tiết một lượng lớn hormone
kích thích sinh dục. Ngay khi dịch tích đầy xoang, trong nang trứng bắt đầu tăng
tiết progesterone và các progestin có liên quan sau đó là estradiol và PGF2α
(Prostaglandin F2α). Progesterone tăng làm tăng nhanh hoạt động của Plasmin.
Dưới tác dụng Plasmin và collagen, sợi collagen của lớp vỏ nang bị phân giải.
Hoạt chất sinh học của Plasmin đạt tối đa tại đỉnh nang (J. Mori, 1992). Hoạt chất
sinh học như histamin tăng lên nhanh chóng trong nang trứng làm tăng tính thấm
thành mạch quản. Lớp tế bào hạt bị lutein hóa, collagen tan chảy trên đỉnh nang,
đồng thời PGF2α và oxytocin làm co cơ trơn trên vách nang, kết quả nang trứng bị
vỡ, noãn nang được giải phóng ra khỏi trứng, gọi là hiện tượng rụng trứng.
2.2.2.2. Sự hình thành thể vàng
Sau khi trứng rụng, tại đó hình thành một xoang, từ ngày thứ nhất đến
ngày thứ tư xoang đó chứa đầy máu gọi là thể huyết, từ ngày thứ năm trở đi gọi
là thể vàng do trong xoang nang có nhiều tế bào hạt chứa sắc tố vàng. Tại đậy
các tế bào vỏ lớp trong và các tế bào vỏ hạt bị thoái hóa nhanh chóng hình thành
hai tế bào lớn và nhỏ gọi là sự lutein hóa (Nguyễn Tấn Anh, 1998). Sự lutein hóa
này trùng khớp với hiện tượng tăng tiết P4, điều này được giải thích là do có mặt
của tế bào lớn và nhỏ của thể vàng trong đó tế bào lớn tiết nhiều P4 hơn rất nhiều
so với tế bào nhỏ. Nếu trứng khơng được thụ tinh thì từ ngày 16 - 17 của chu kỳ,
nhờ tác động PGF2α do nội mạc tử cung tiết ra tác động làm co mạch ngoại vi
nuôi thể vàng, thể vàng rơi vào tình trạng khơng được cung cấp chất dinh dưỡng

7


sẽ bị tiêu biến dần thành tế bào nhỏ hoặc thối hóa làm mất chức năng, do đó thể
vàng khơng còn khả năng tăng tiết progesterone (J. Mori, 1992).

Ở bộ linh trưởng những tế bào lutein hoạt động ngay sau lúc rụng trứng và
tiết progesterone với lượng ngày càng nhiều, cịn ở lồi nhai lại thể vàng chỉ hoạt
động sau một chu kỳ tiềm tàng (vài ngày), điều này gắn liền với những biến đổi
mô bào học của chúng (Leymarie. P and Marrtal. J, 1991). Theo tác giả sự thay
đổi progesterone trong máu và dịch thể khác phản ánh cả giai đoạn tăng trưởng,
duy trì thối hóa thể vàng.
2.2.2.3. Động thái của thể progesterone trong một chu kỳ động dục
Tiết progesterone là chức năng chủ yếu của thể vàng từ khi nó hình thành.
Các tài liệu nghiên cứu về động thái progesterone đều chỉ ra rằng: Hàm lượng
progesterone trong dịch thể đạt thấp nhất vào ngày động dục. Sau đó bắt đầu tăng
vào ngày thứ 3 - 4 của chu kỳ và cao nhất vào ngày thứ 13 - 14, sau đó giảm rất
chậm, đến ngày 17 - 18 thì giảm thấp (Chung Anh Dũng, 2001). Hàm lượng
progesterone giảm rất nhanh từ sau ngày 18 và đạt mức thấp nhất vào ngày 20 21 của chu kỳ (ở bò).
Xác định động thái của progesterone trong chu kỳ động dục có ý nghĩa rất
nhiều trong thực tiễn, nó phản ánh tình trạng hoạt động của buồng trứng một
cách rõ ràng và cụ thể.
2.2.2.4. Thể vàng và sự chế tiết progesterone khi mang thai
Sự chuyển đổi thể vàng ở bị có chửa là do nhiều mặt tác động bao gồm
vai trò của phôi. Các hormone tuyến yên và một phần quan trọng của nhau thai
(Nguyễn Tấn Anh, 1998). Sau khi phôi được hình thành, từ lá phơi tiết ra một
loại protein có khối lượng phân tử 20kD được gọi là Trophoblastine (Moor và
Rowson, 1996). Trophoblastine được tiết ra từ ngày 15 - 25 tác động lên nội mạc
tử cung và kích thích làm xuất hiện một chất ức chế prostaglandinsythetase.
Cùng với Trophoblastine nó làm giảm hoạt tính của enzyme tham gia q trình
sinh tổng hợp prostaglandin, làm ngăn cản PGF2α từ tử cung đi vào thể vàng
(Nguyễn Tấn Anh, 1998). Do đó thể vàng khơng bị tiêu biến.
Mặt khác sự có mặt của thai tiết progesterone làm ức chế sự tăng trưởng
của những nang trứng trội và giảm nồng độ estradiol17β trong máu. Progesterone
làm giảm tính cảm thụ của cơ tử cung đối với oxytocin, làm hạn chế sự tiết chế
PGF2α theo nhịp và ức chế teo thể vàng.

8


Có thai, thể vàng duy trì và tiết progesterone. Hàm lượng progesterone
có trong máu và dịch thể cao hơn và được duy trì trong thời gian dài hơn rất
nhiều so với progesterone trong một chu kỳ. Vì vậy, xác định hàm lượng
progesterone cao ở ngày 21 sau khi động dục và phối giống là cơ sở cho việc
chẩn đốn có thai sớm, khi các chẩn đoán lâm sàng và phi lâm sàng khác chưa
thể phát hiện ra được.
2.2.2.5. Vai trò, chức năng của progesterone
Progesteron là một hormone thuộc nhóm steroit do thể vàng tiết ra. Ngồi
ra cịn có nguồn gốc từ miền vỏ tuyến thượng thận và khi có chửa cịn được tiết ở
nhau thai.
Cấu tạo hóa học progesterone: là một steroid hormone có 21 carbon có
nhân cơ bản là pregnan. Ngồi ra hai nhóm –CH3 đính ở vị trí carbon thứ 10,
carbon thứ 13; chuỗi –CO-CH3 đính ở vị trí carbon thứ 17; trong phân tử có vị trí
liên kết đơi ở carbon thứ 4.

Hình 2.3. Cơng thức cấu tạo progesterone
+ Progesterone có tác dụng tránh thai thơng qua ức chế tiết GnRH của
vùng dưới đồi, dẫn đến giảm tiết FSH, LH và do đó ức chế q trình phát triển,
chín và rụng trứng.
+ Sử dụng phương pháp ELISA, EIA, KIA… định lượng progesterone
trong máu, sữa và nước tiểu có thể chẩn đốn có thai sớm và những rối loạn sinh
sản ở gia súc cái.
Định lượng progesterone trong máu và sữa để chẩn đốn trâu, bị có chửa.
Kết quả nghiên cứu nhiều tác giả đã chỉ ra rằng khoảng 90% bị có chửa có hàm
lượng progesterone huyết thanh vào thời điểm từ ngày thứ 21 đến 22 sau khi thụ

9


thai  3 ng/ml hoặc hàm lượng progesterone sữa  11 ng/ml. Nếu trong sữa
nồng độ progesterone nhỏ < 8 ng/ml thì bị khơng có chửa.
+ Phan Văn Kiểm và Nguyễn Bá Mùi (2005) đã sử dụng kỹ thuật ELISA
định lượng progesterone trong máu để xác định động thái progesterone trong chu
kỳ động dục bình thường của bị. Kết quả cho thấy hàm lượng progesterone trong
một chu kỳ động dục bình thường của bị thấp nhất vào ngày động dục (0,21
ng/ml), sau đó tăng lên vào ngày thứ 7 (1,50 ng/ml), tăng cao vào ngày thứ 14
(2,21 ng/ml), sau đó giảm thấp vào ngày thứ 21 (0,38 ng/ml). Chính vì thế, có thể
dựa vào nồng độ thời điểm sau 21 ngày tính từ thời điểm xuất hiện động dục để
chẩn đốn bị có thai hay khơng.

Hình 2.4. Biến thiên nồng độ progesteron sau khi thụ tinh có kết quả
và thời điểm lấy mẫu chẩn đốn có thai
+ Phan Văn Kiểm và cs. (2002) đã sử dụng kĩ thuật EIA để định lượng
progesterone trong huyết thanh kết hợp khám buồng trứng qua trực tràng, để
chẩn đoán một số bệnh ở buồng trứng gây chậm sinh
- Hàm lượng progesterone cao (1,4 ng/ml huyết thanh) ở các thời điểm
lấy mẫu là 0 ngày, 7 ngày, 14 ngày, 21 ngày thì những bị này được xác định có
thể vàng tồn tại trên buồng trứng
- Hàm lượng progesterone nhỏ hơn 0,6 ng/ml được xác định khi buồng
trứng có u nang
- Hàm lượng progesterone rất thấp (0,08 - 0,19 ng/ml huyết thanh) khi có
hiệu tượng thiểu năng buồng trứng

10

+ Phan Văn Kiểm và cs. (2003) đã ứng dụng kỹ thuật EIA, ELISA xác
định hàm lượng progesterone để xác định ngun nhân gây chậm sinh đối với bị
cái ni tại Ba Vì và khu vực ngoại thành Hà Nội
+ RIA còn được dùng để định lượng progesterone trong huyết thanh chẩn
đốn các trường hợp bị có buồng trứng kém phát triển, bò bị viêm buồng trứng,
u nang buồng trứng, buồng trứng có thể vàng tồn lưu, bị bị viêm tử cung... để có
giải pháp can thiệt giảm thiệt hại cho người ni trâu bị tại khu vực thành phố
HCM (Chung Anh Dũng và cs. 2001).
+ Trần Tiến Dũng và cs. (2002) đã sử dụng kết hợp progesterone và
prostaglandin để phá hủy thể vàng, nang nước giúp khắc phục hiện tượng chậm sinh.
+ Định lượng một số hormone sinh sản và sử dụng hormone tổng hợp
Estrumate khắc phục hiện tượng rối loạn sinh sản ở trâu (Trần Tiến Dũng, 2003).
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu xác định hàm lượng progesterone
trong sữa và huyết thanh của bò ở các thời điểm khác nhau như: định hàm lượng
progesterone trong thời gian động dục (Maurice et al. 1981; Nakao et al. 1983;
VanDe Wiel et al. 1996).
- Sản xuất kháng thể đơn dòng kháng progesterone ứng dụng trong việc
xác định hàm lượng progesterone trong máu để chẩn đốn có thai sớm ở lợn bằng
phương pháp EIA, cho kết quả chẩn đoán chính xác có thai là 92,2%, kết quả
chẩn đốn chính xác khơng có thai là 83,3% (Wu.L.S et al. 1997).
- Xác định hàm lượng progesterone để chẩn đoán nguyên nhân gây chậm
sinh và điều khiển chu kì sinh dục ở gia súc (Hase. M et al. 2000).
- Sử dụng hormone trong điều trị nhằm nâng cao năng suất sinh sản của
bò vùng nhiệt đới (Baruselli P.S. et al. 2004).
Ở Việt Nam đã có rất nhiều nghiên cứu định lượng FSH, LH, progesteron,
testosteron, HCG, prolactin trong sữa và huyết thanh của gia súc cái.
Các phương pháp xác định hormone sinh sản
Do hormone có hoạt tính sinh học cao, hàm lượng trong máu, nước tiểu
hoặc các dịch sinh học khác rất thấp nên việc phân tích định lượng và phát hiện
địi hỏi các phương pháp có độ nhạy cao. Ngày nay, để định lượng hormone có

thể sử dụng các phương pháp hóa lý như: sắc kí lỏng kết nối khối phổ (Liqui
Chromatography - Mass Spectrophotometer, LC-MS), hoặc miễn dịch như

11


phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radioactive Immuno Assay - RIA) hoặc miễn
dịch enzyme ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay).
Để định tính hormone có thể sử dụng que thử nhanh (quick-stick) hoặc sử
dụng các phương pháp khác như đo mức độ chuyển hóa của hormome
(Metabolic Clearance Rate), đo mức chế tiết hormone v.v...
Mỗi phương pháp có những ưu điểm riêng, tùy vào điều kiện cụ thể mà có
thể ứng dụng trong thực tế sản xuất và nghiên cứu.
- Phương pháp miễn dịch phóng xạ (Radioactive Immuno Assay - RIA):
Từ năm 1980 người ta đã sử dụng một kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu
cao để định lượng hormone, tiền hormone hoặc các dẫn xuất của chúng, đó là
phương pháp miễn dịch phóng xạ. Nguyên tắc chung của phương pháp định
lượng bằng miễn dịch phóng xạ là dựa trên sự gắn cạnh tranh đặc hiệu giữa
hormome tự nhiên (hormome trong máu cần định lượng) và hormome đánh dấu
phóng xạ với kháng thể.
Mức độ gắn của hai loại hormone này với kháng thể tỷ lệ thuận với nồng
độ ban đầu của chúng. Đo phức hợp hormone gắn đồng vị phóng xạ - kháng thể
bằng máy đếm phóng xạ rồi dựa vào đường cong chuẩn ta có thể tính được lượng
hormone có trong mẫu cần định lượng. Phương pháp có thể định lượng chính xác
hormone ở mức picrogam tuy nhiên cần phải có các thiết bị hiện đại đi kèm, kỹ
thuật viên có trình độ chun mơn và liên quan đến phóng xạ nên chúng thường
được sử dụng trong nghiên cứu ở các phịng thí nghiệm trọng điểm, khó có thể áp
dụng đại trà ngay tại trang trại.
- Sử dụng bộ KIT dựa trên nguyên lý của phương pháp ELISA (KIT
ELISA): Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay - xét

nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có rất nhiều dạng mà đặc điểm
chung là đều dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong
đó kháng thể được gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp (thường
là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất thành một
chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa kháng
thể với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng
nguyên hay kháng thể cần phát hiện. Phương pháp này được thiết kế cho việc
phát hiện và định lượng chất như peptides, protein, antibodies, hormone… Kĩ
thuật này khá nhạy và đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên hoặc kháng

12


thể ở một nồng độ rất thấp (0,1 ng/ml). So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ thì kĩ
thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác như nhau và chỉ
cần thực hiện ở các phịng thí nghiệm thơng thường.
- Sản xuất que thử nhanh (Quick - stick): Từ những thành tựu đạt được
của các kỹ thuật miễn dịch, các nhà khoa học nhận thấy việc ứng dụng các kỹ
thuật này vào cuộc sống đỏi hỏi nhiều trang thiết bị đắt tiền và thao tác kỹ thuật
phức tạp. Chính vì vậy, các nhà nghiên cứu đã mong muốn đưa công nghệ vào
cuộc sống một cách đơn giản, tiện dụng và có độ chính xác cao.
Trong chăn ni sản phẩm này có thể áp dụng ngay tại các trang trại chăn
ni bị, cho kết quả nhanh với thời gian chỉ mất khoảng 5-10 phút. Que thử
(quick-stick) dựa trên cơ sở phản ứng kháng nguyên - kháng thể trên màng mỏng
còn được gọi là sắc ký miễn dịch. Chúng được phát triển dựa trên nguyên lý của
phản ứng kết dính đặc hiệu của kháng nguyên - kháng thể trên một màng mỏng
làm bằng giấy, nylon hoặc nitrocellulose. Kỹ thuật này lần đầu tiên được công bố
năm 1956 bởi Singer và Plotz. Nguyên lý của phản ứng trên que thử: kháng
nguyên cần phát hiện được giải phóng trong đệm nghiền mẫu sẽ kết hợp với
kháng thể đơn dòng gắn vào để tạo nên một phức hợp. Phức hợp này di chuyển

trên màng đến vùng test line và bị bắt giữ bởi kháng thể khác kháng kháng
nguyên cần phát hiện (theo dạng sandwich) để tạo ra vạch T (test line). Phức hợp
tiếp tục di chuyển tiếp đến vùng C (control line) và bị bắt tại đây bằng một
kháng thể đa dòng kháng IgG chuột để tạo vạch C (control line). Kết quả là nếu
mẫu kháng nguyên trên màng sẽ tạo ra hai vạch màu tại C và T. Nếu trong mẫu
khơng có kháng ngun cần phát hiện, phức hợp dạng sandwich sẽ khơng hình
thành vạch tại vùng T kết quả trên màng chỉ xuất hiện một vạch tại C.
Hiện nay để định lượng các hormone nói riêng và các chất sinh học nói
chung hầu hết đều phải dựa vào các bộ KIT ELISA và que thử nhanh (quick-stick).
Cả hai phương pháp này đều dựa trên nguyên lý của phản ứng kháng nguyên kháng thể. Trong đó kháng thể đơn dịng với ưu điểm có độ nhạy và độ đặc hiệu
cao, là yếu tố cơ sở không thể thiếu để sản xuất các sản phẩm sinh học này.
2.3. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ MIỄN DỊCH HỌC
2.3.1. Miễn dịch và đáp ứng miễn dịch
Miễn dịch là quá trình bảo vệ vô cùng quan trọng và rất phức tạp của cơ
thể, nó bao gồm tập hợp tất cả các phản ứng nhằm chống lại sự xâm nhập của vật

13


lạ nào đó đối với cơ thể. Vật lạ có thể là những vi sinh vật sống như: vi khuẩn,
virus, vi nấm, ký sinh trùng hoặc những chất chứa đựng thông tin di truyền khác
biệt với cơ thể như: độc tố, enzyme, ADN, ARN,...
Khi yếu tố gây bệnh (kháng nguyên) xâm nhập vào cơ thể chúng sẽ bị các
tế bào và các phân tử có tính kháng sinh có sẵn trong cơ thể kịp thời phản ứng
ngăn chặn, xử lý. Tiếp đó cơ thể sẽ tạo ra tế bào và phân tử đặc hiệu tương ứng
với từng loại kháng nguyên khác nhau để loại trừ chúng.
Đáp ứng miễn dịch (ĐƯMD) là phản ứng của cơ thể nhận ra vật lạ và loại
trừ chúng ra khỏi cơ thể. Đáp ứng miễn dịch chia làm hai loại:
+ Đáp ứng miễn dịch tự nhiên (hay miễn dịch khơng đặc hiệu), đáp ứng
tức thì.

+ Đáp ứng miễn dịch thu được (miễn dịch đặc hiệu) đáp ứng sau vài ngày
với đặc điểm là khả năng ghi nhớ.
2.3.1.1. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên
Đáp ứng miễn dịch tự nhiên là đặc tính khơng mắc phải một số bệnh của
một số loài hay một số sinh vật ở lứa tuổi nhất định và có ngay khi cơ thể sinh ra,
mang tính chất di truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác, khơng địi hỏi sự tiếp
xúc mầm bệnh. (Nguyễn Như Thanh, 1997)
Có hai loại đáp ứng miễn dịch tự nhiên: Đáp ứng miễn dịch tự nhiên tuyệt
đối và đáp ứng miễn dịch tự nhiên tương đối.
a. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên tuyệt đối
Trong bất cứ điều kiện nào, hoàn cảnh nào ĐƯMD tự nhiên tuyệt đối cũng
khơng bị mất đi, có thể tiêm vào cơ thể động vật một lượng lớn mầm bệnh cũng
khơng có khả năng gây bệnh.
Ví dụ: Bị khơng bao giờ mắc bệnh tị thư ở ngựa, bệnh dịch tả lợn, ngựa
không bao giờ mắc bệnh dịch tả trâu bò,...
b. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên tương đối
Đáp ứng miễn dịch tự nhiên tương đối là tính miễn dịch có thể thay đổi
khi chịu một sự tác động nào đó trong một điều kiện và thời gian nhất định chịu
sự tác động cao của độc lực vi sinh vật hoặc do sự thay đổi nhiệt độ hay sức đề
kháng của cơ thể giảm,...
Ví dụ: Bình thường gà khơng bao giờ mắc bệnh nhiệt thán nhưng khi

14