Bài giảng Thực hành công nghệ sinh học động vật

<span class='text_page_counter'>(1)</span><div class='page_container' data-page=1>

<i>Bài 1 </i>

<b>NHẬN DIỆN KHÁNG NGUYÊN </b>

<b> BẰNG PHƯƠNG PHÁP OUTERLONY </b>

<b>I.</b> <b>CƠ SỞ LÝ THUYẾT </b>

<b> 1.</b> <b>Các khái niệm cần nhớ </b>

Miễn dịch là khả năng của cơ thể nhận ra và loại bỏ các vật lạ
(kháng nguyên - Ag: Antigen). Từ cổ xưa, người ta đã biết ứng dụng
miễn dịch trong việc phòng trừ một số bệnh nhiễm khuẩn, vì thế khái
niệm về miễn dịch học đã xuất hiện từ rất sớm. Tuy nhiên, cho tới cuối
thế kỷ thứ XIX, miễn dịch học mới trở thành một môn khoa học riêng
biệt. Trong lịch sử phát triển của môn miễn dịch học, quan niệm về đáp
ứng miễn dịch thay đổi theo tiến bộ của khoa học kỹ thuật và đồng thời
nó cũng có mối liên hệ mật thiết với một số ngành khoa học khác như
Sinh học phân tử, Y sinh học, Dược học, Thú y, Vi sinh học…

Trong cơ thể động vật bậc cao (trong đó có người), đáp ứng miễn
dịch có thể tạm chia ra thành hai loại: <i><b>đáp ứng miễn dịch tự</b></i> <i><b>nhiên</b></i> và
<i><b>đáp ứng miễn dịch thu được</b></i>. Tuy nhiên hai khái niệm này có mối quan
hệ mật thiết với nhau. Nói chung, khi có một yếu tố lạ có hại- có thể
gây các hiệu ứng sinh hóa (kháng nguyên) xâm nhập vào cơ thể, hệ
thống miễn dịch có nhiệm vụ nhận biết và sau đó có những hoạt động
có hiệu quả tiếp theo để loại bỏ. Đáp ứng <i><b>miễn dịch dịch thể</b></i> và đáp
ứng <i><b>miễn dịch tế bào</b></i> là hai phương thức mà hệ thống miễn dịch sử dụng
để chống lại kháng nguyên. Đối với miễn dịch dịch thể thì kháng thể
hịa tan, chính xác hơn là globulin miễn dịch đảm đương chức năng này.
Các globulin miễn dịch này được sản xuất từ các tế bào plasma (tương
bào), biệt hóa từ lympho bào B.

</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>

<i> </i>

<i>Hình 45 :Sơ đồ cấu trúc phân tử Ig.</i>

Về phân loại, người ta chia Ig thành các lớp phân tử sau:

+ <b>Globulin miễn dịch G (IgG):</b> chiếm khoảng 70-75% tổng số Ig
của huyết thanh người. Đây là lớp kháng thể chủ yếu trong đáp
ứng miễn dịch và cũng là phân tử độc quyền kháng độc tố. Lớp
IgG có vai trị quan trọng nhất trong cơ chế đáp ứng miễn dịch.
+ <b>Globulin miễn dịch A (IgA):</b> chiếm khoảng 15-20% tổng số Ig
trong huyết thanh. Chúng có hai loại là IgA nội dịch huyết thanh
và IgA tiết ra ngoài niêm mạc. IgA là phương tiện bảo vệ tại chỗ
rất hữu hiệu của cơ thể, ngăn cản sự xâm nhập của kháng nguyên
(virus, vi khuẩn, tế bào lạ, các phân tử sinh hóa…)

+ <b>Globulin miễn dịch M (IgM):</b> chiếm khoảng 10% tổng lượng
IgG huyết thanh, chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong những
trường hợp nhiễm khuẩn sớm.

+ <b>Globulin miễn dịch D (IgD):</b> chiếm 1% tổng lượng Ig huyết
thanh. Cho tới hiện nay thì chức năng chính của IgD vẫn chưa
được xác định rõ ràng, nhưng người ta thường thấy nồng độ của
chúng tăng chậm trong những trường hợp nhiễm khuẩn mãn tính
nhưng khơng đặc hiệu cho loại nhiễm khuẩn nào.

</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>

<b>2.</b> <b>Phản ứng kháng nguyên- kháng thể </b>

IgG trong hệ thống miễn dịch có nhiệm vụ kết hợp đặc hiệu với

kháng nguyên. Đây là một trong những chức năng quan trọng nhất bên
cạnh các chức năng khác như hoạt hóa bạch cầu, bổ thể, hoạt hóa cơ
chế vận chuyển qua màng tế bào…

Khả năng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên có được là do cấu trúc
đặc biệt của phân tử globulin miễn dịch .

<i>Hình 46:Hình cấu trúc không gian </i>
<i> của protein kháng thể và cách bắt Ag. </i>

Phản ứng in-vitro diễn ra giữa kháng nguyên kháng thể hay còn
được gọi là các phương pháp huyết học (serological assays) đã và đang
được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán bệnh.

</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>

- Lame 9 x 8,5cm.

- Bộ dụng cụ đục lỗ thạch.
- Bình tam giác.

- Ống tiêm 1ml.
- Buồng aåm.

- Agarose tinh khiết.
- Nước muối sinh lý.
- Dung dịch đệm PBS.

- Dung dịch nhuộm màu Commassive brilliant blue.
- Dung dịch tẩy màu.

- Vaccine DPT.

- Huyết thanh kháng độc tố bạch hầu.

- Huyết thanh chuẩn (đã biết trước nồng độ).
- Giải độc tố bạch hầu.

<b>III.</b> <b>TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM </b>

<i><b>(Phương pháp khuyếch tán hai chiều do Outerlony đề xuất) </b></i>

- Giải hấp phụ vaccine DPT: dùng vaccine DPT để giải hấp phụ
độc tố bạch hầu ra khỏi gel aluminum bằng dung dịch Na Citrat nồng độ
2% trong 24 giờ.

- Tiến hành phản ứng nhận diện: dùng phản ứng khuyếch tán kép
(double diffusion) do Outerlony đề xuất (được gọi tắt là phản ứng
Outerlony).

- Các bước tiến hành như sau:

+ Chưng thạch: Agarose tinh khiết 1% pha trong dung dịch
đệm PBS có pH= 7,2.

+ Đổ thạch lên lame: dùng lame nhỏ hoặc film 2,5x8cm,
khoảng 3ml thạch/ lame.

</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>

<i> Hình 47 : Cách bố trí các lỗ thạch trên lame. </i>
Tiến hành phản ứng Outerlony trong buồng ẩm, thực hiện nhuộm
và ép tiêu bản.

<b> GỒM CÁC BƯỚC SAU: </b>

 Ngâm tiêu bản vào dung dịch sinh lý trong 12- 18 để loại bỏ các
yếu tố kết hợp không đặc hiệu.

 Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm commassive brilliant blue
trong 10 phuùt.

 Rửa sạch thuốc nhuộm bằng cách ngâm tiêu bản vào dung dịch
tẩy màu (chú ý trong quá trình ngâm phiến phải thay dung dịch
tẩy màu thường xuyên). Cẩn thận tránh làm biến dạng phiến
thạch hoặc bong agarose.

 Ép khô tiêu bản.

<b>IV.</b> <b>NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý </b>

Khơng để hóa chất dây vào tay, quần áo

Làm thí nghiệm, sinh viên phải mang găng tay

<b>V.</b> <b>YÊU CẦU </b>

- Nộp lại cho cán bộ hướng dẫn mẫu kết quả
<i><b>Huyết thanh kháng độc tố </b></i>
<i><b>bạch hầu 50 Iu/ml </b></i>

<i><b>Vaccine DPT đã giải hấp phụ được pha loãng </b></i>
<i><b>ở các nồng độ khác nhau </b></i>

</div>
<span class='text_page_counter'>(6)</span><div class='page_container' data-page=6>

<i>Baøi 2 </i>

<b>PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN HUYẾT </b>

<b>THANH TỪ MÁU NGƯỜI VAØ ĐỘNG VẬT </b>

<b>I.</b> <b>CƠ SỞ LÝ THUYẾT </b>
<b>a. Định nghĩa </b>

Huyết thanh là huyết tương không có fibrinogen và một số yếu tố
đông máu khác.

<b>b. Vai trị của huyết thanh trong Cơng nghệ Sinh học động vật </b>

Là thành phần quan trọng, không thể thiếu đối với môi trường
nuôi cấy mô và tế bào động vật. Huyết thanh có các đặc điểm:

(1) Cung cấp các chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như
các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên
tố vi lượng…

(2) Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào
phân chia.

(3) Chứa các protein có khả năng làm bất hoạt trypsin (một
enzyme được sử dụng để tách tế bào động vật) tránh hiện
tượng enzyme gây tổn thương tế bào.

(4) Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng.

(5) Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình ni nhờ các

yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ.

(6) Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy mạnh và ức
chế độc tính của oxy.

Huyết thanh còn là nguyên liệu hàng đầu trong điều chế vaccin và
cơng nghiệp dược phẩm nói chung.

<b>c. Nguyên tắc thu nhận huyết thanh </b>

</div>
<span class='text_page_counter'>(7)</span><div class='page_container' data-page=7>

Các bước thiết yếu trong việc thu nhận huyết thanh bao gồm:
- Thu nhận máu từ cơ thể.

- Tạo cục máu đơng trong bình chứa.

- Tách huyết thanh khỏi cục máu đông bằng lọc và ly tâm.
- Tinh sạch, bảo quản.

<b>II.NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ </b>
<b>1. Hóa chất </b>

- Hóa chất bảo quản: merthiolate cần được sử dụng với nồng độ
sao cho việc bổ sung chúng vào huyết thanh sẽ khơng làm lỗng
huyết thanh.

- Mẫu máu (thu nhận từ thỏ).

<b>2. Dụng cụ - thiết bị </b>

<b>a. Dùng cho việc thu máu</b>

 Thỏ 2,5kg hoặc nặng hơn (khơng cho ăn trong 12 giờ trước đó để
huyết thanh thu được ít lipid nhất).

 Bàn cột thỏ, 4 đoạn dây cột.
 Dao cạo mới.

 Kéo, pince y tế.
 Bông gòn + cồn 70o.
 Bộ dụng cụ lấy máu:

+ Kim tiêm vơ trùng, 18G, 2in.
+ Ống dẫn nhựa hoặc cao su.

+ Ống nghiệm vô trùng có sẵn nắp đậy.

 Đèn bóng tròn 15W (đặt bên dưới tai thỏ, làm nóng để máu
khơng đơng nhanh trong q trình lấy máu).

 Băng keo y tế.

 Chai đựng máu có nắp đậy (đã hấp khử trùng).
 10.Giá để ống nghiệm.

 11.Găng tay, khẩu trang và quần áo bảo hộ.
 12.Đồ cấp cứu cá nhân.

<b> b. Duøng cho việc thu nhận huyết thanh </b>

 Tủ lạnh.

</div>
<span class='text_page_counter'>(8)</span><div class='page_container' data-page=8>

 Máy li tâm ống nghiệm.

 Chai thủy tinh có nắp vặn để chứa huyết thanh (vơ trùng).
 Phễu lọc + giấy lọc (vô trùng).

 Milipore filter (màng lọc) 0,22-0,45m.
 Thiết bị làm lạnh sâu (-800C  -200C).
 Giấy hoặc khăn lau sạch.

<b>III.</b> <b>TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM </b>
<b>1. Phương pháp thu máu </b>

a. Cố định thỏ nằm úp trên bàn thao tác

b. Cạo lơng trên tai thỏ để có thể nhìn thấy rõ tĩnh mạch tai.

c. Để lấy máu dễ dàng, cần làm giãn nở mạch bằng cách dùng đèn
bóng trịn 15W làm ấm mặt trong của tai thỏ.

d. Sát trùng nơi định lấy máu trên tai thỏ.

e. Ghim kim tiêm vào tĩnh vạch theo chiều hướng vào gốc tai thỏ
(ngược với chiều chảy của máu).

f. Giữ thỏ nằm yên và thu máu vào ống nghiệm vô trùng gắn với
kim tiêm qua ống dẫn.

g. Phương pháp này có thể thu được đến 20ml máu thỏ (một con,
một lần). Nếu máu ngưng chảy, búng nhẹ vào tĩnh mạch tai để có

thể tiếp tục thu máu.

h. Sau khi thu đủ thể tích máu cần dùng, đặt gịn hoặc gạc lên vết
cắt, dùng ngón cái và ngón trỏ để ép chặt vết thương lại.

i. Dùng băng keo để giữ miếng gạc đúng vị trí.
j. Thu huyết thanh theo quy trình bên trên.
k. Xử lý và bảo quản.

<b>2. Thu nhận huyết thanh </b>

a. Để yên mẫu máu trong 1-2 giờ ở nhiệt độ phòng nhằm tạo
cục máu đông. Cẩn thận tách cục máu đông khỏi thành ống nghiệm
bằng thìa thép hoặc que gỗ. Giữ ống nghiệm đựng máu trong tủ lạnh
trong vòng 12-24 giờ để cục máu đông co lại.

</div>
<span class='text_page_counter'>(9)</span><div class='page_container' data-page=9>

rotor có bán kính 14cm). Cẩn thận lấy huyết thanh ra bằng cách gạn
lấy phần dịch trong bên trên hoặc dùng pipette hút ra

c. Thường thì huyết thanh thu được ở lần li tâm đầu tiên chứa
một ít bạch cầu, để loại những tế bào này, cần li tâm lặp lại các sản
phẩm đã thu ở lần ly tâm thứ nhất như mô tả trên.

e. Khử trùng huyết thanh thu được bằng phương pháp lọc

f. Thêm chất bảo quản, sau đó bảo quản lạnh để giữ được huyết
thanh trong nhiều ngày.

g. Để thuận lợi cho việc lưu giữ huyết thanh và do mỗi khi sử
dụng chỉ cần một lượng nhỏ, huyết thanh cần được chia vào nhiều chai

đựng có kích thước nhỏ. Đây là điều bắt buộc khi thực hiện lưu trữ
huyết thanh ở trạng thái đông lạnh.

<b>IV.</b> <b>NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý </b>

 Trong quá trình làm cần thật nhẹ nhàng, tránh gây lắc mạnh ống
đựng máu khiến vỡ tế bào hồng cầu.

 Sau khi lấy máu (không quá 10ml) thì phải khử trùng vết thương
trên tai thỏ ngay và băng lại.

 Khử trùng toàn bộ dụng cụ.

 Trước khi li tâm phải cân đối trọng cho đều các ống nghiệm

<b>V.</b> <b>YÊU CẦU </b>

- Huyết thanh có màu vàng nhạt đều, trong suốt, ít có hồng cầu vỡ.
- Khơng có lớp mỡ váng bên trên.

- Khơng có lớp cặn dưới đáy chai đựng.

- Khơng có bọt khí hoặc vật lạ hoặc các sợi huyết lơ lửng.
- Huyết thanh thu được đảm bảo vô trùng.

+ Dịch ni cấy đục so với ban đầu: có sự hiện diện của vi sinh vật
trong mẫu huyết thanh.

+ Dịch nuôi cấy không đổi so với ban đầu: khơng có sự hiện diện
của vi sinh vật trong mẫu huyết thanh.

</div>
<span class='text_page_counter'>(10)</span><div class='page_container' data-page=10>

<i>Để lạnh 4o_{C, 12-24h}</i>

<i><b>Lặp lại 2-3 lần </b></i>

<i>Ly tâm 4o_{C, 50.000g, 20 phút}</i>

<i>Gạn lấy phần huyết thanh cho vào chai đựng </i>

<i>Ly tâm 1000g, 30 phút, to₌₄₀o_C</i>
<i><b>Hút dịch trong ra </b></i>

<b>BẢO QUẢN Ở –20O_C</b>

<i>Chia thành các mẫu nhỏ </i>
<i><b>Lọc vô trùng </b></i>

<i><b>Lọc qua giấy lọc nhám </b></i>

<i><b>QUY TRÌNH THU NHẬN HUYẾT THANH. </b></i>
<i>Để yên 1-2h, to_phòng</i>

</div>

<!--links-->