Phương pháp xác định Melamine trong sữa bằng HPLC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHIỆP TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CƠNG NGHỆ KỸ THUẬT HÓA HỌC

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

ĐỀ TÀI: PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH MELAMINE TRONG SỮA
BẰNG SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP HPLC


NỘI DUNG BÁO CÁO

1.PHƯƠNG PHÁP HPLC
2. TỔNG QUAN VỀ CHẤT MELAMINE
3. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT
4.KẾT QUẢ, THẢO LUẬN
5.TÀI LIỆU THAM KHẢO


Có nhiều phương pháp để xác định melamine trong sữa như:
máy sắc ký khí khối phổ GC/MS
Dùng
pháp Dumas
 Phương
Phương pháp Kjedal
Phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC



Tại sao lại chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC ?

HPLC được sử dụng rộng rãi hơn cả trong phân tích lương thực thực phẩm như xác định các hóa chất bị cấm,
các chất tồn dư và kiểm sốt chất lượng, nó mang lại độ chính xác cao cũng như thời gian tiến hành ngắn và
thỏa mãn các tiêu chí:








High speed – tốc độ nhanh
Low detection limit - giới hạn phát hiện thấp
Simple method – phương pháp đơn giản
Efficient – hiệu quả
Cheap – giá rẻ
Not labor intensive – không tốn lao động


1. PHƯƠNG PHÁP HPLC

Cơ sở lý thuyết của phương pháp:
HPLC:
là kĩ thuật tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha
tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với
pha tĩnh và pha động. Thành phần pha động đưa chất phân tích di chuyển qua cột được
điều chỉnh để rửa giải chất phân tích với thời gian hợp lý.

Nguyên lý hoạt động:


Sắc ký lỏng được phân thành:

ký lỏng pha thường ( Normal phase chromatography )
• Sắc
ký lỏng pha đảo ( Reversed phase chromatography )
• Sắc
ký trao đổi ion ( Ion exchange chromatography )
• Sắc
• Sắc ký lỏng lọc gel ( Size exclusion chromatography )



•
•

Sắc ký lỏng pha đảo: sử dụng nhiều (>90%)
Pha tĩnh : Cột nhồi không phân cực ( C18, C8, C3, phenyl… )
Pha động: là hỗn hợp nước – dung môi ( methanol, acetonitrile )

Sử dụng trong phân tích:

•
•
•
•

•
•

Thuốc kháng sinh, an thần, giảm đau, steroid
Axit amin, protein, hydrat cacbon, lipid…
Đường nhân tạo, chất chống oxi hóa, chất phụ gia, aflatoxin…
Chất thơm, chất điện hoạt, hóa chất cơng nghiệp…
Thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ, phenol, dẫn xuất phenol…
Thuốc, chất độc, cồn trong máu…


2. TỔNG QUAN VỀ CHẤT MELAMINE
 

Melamine được tổng hợp lần đầu tiên năm 1834, Melamine (tên đầy đủ 1,3,5
-triazine-2,4,6-triamine) là một bazơ hữu cơ có cơng thức hóa học tạo thành từ 3
phân tử cyanamide (C)

Melamine tan ít trong nước

Thành phần chính của cơng nghệ sản xuất các
vật dụng gia đình, bao bì, nhựa

Được tổng hợp từ chất urê

Là dẫn chất của thuốc trừ

Có khả năng giải phóng N khi gặp nhiệt độ cao

Melamine có độc tính qua thử

sâu cyromazine

và được sử dụng làm chất chống cháy

nghiệm: gây ngộ độc cấp trên chuột


VỤ BÊ BỐI SỮA TRUNG QUỐC NĂM 2008

Ngày 22 tháng 9 năm 2008, người ta đã thống kê được gần 53.000 trẻ em đã bị bệnh,
hơn 12.800 trẻ phải nằm viện và 4 trẻ bị chết, với nguyên nhân là sỏi thận và suy
thận. Chất hóa học đã được trộn vào sữa để làm cho sữa có vẻ có độ đạm cao hơn.
Cũng chất hóa học này đã có liên quan đến chuỗi các vụ thu hồi thức ăn cho thú cảnh
vào năm 2007. Trong một vụ khác, sữa chất lượng kém đã gây ra cái chết do suy dinh
dưỡng của 13 trẻ sơ sinh tại Trung Quốc năm 2004.

 Tổ

chức Y tế Thế giới coi vụ bê bối này là một trong những sự kiện an toàn thực phẩm lớn nhất mà tổ chức này phải

đối phó trong những năm gần đây. Tổ chức này nói rằng khủng hoảng lòng tin của người tiêu dùng Trung Quốc sẽ khó
vượt qua.


Tại sao melamine lại được cho vào sữa tươi và sữa bột trẻ em?

Đối với nhà sản xuất, melamine và cả với acid cyanuric, là hai
chất giúp làm tăng “nồng độ đạm” trong sản phẩm dù nồng độ
đạm thật trong đó chả có bao nhiêu!

Vì lợi nhuận, nhà sản xuất thực phẩm đã đánh lừa nhà kiểm định bằng cách cho melamine vào thực phẩm. Do lịng
tham khơng đáy, một số nhà sản xuất còn cho vào cả hai chất melamine và acid cyanuric. Thế là gây ra thảm họa
ngộ độc hàng loạt. Acid cyanuric rẻ hơn melamine nhiều, đó cũng là lý do có thể có sự hiện diện cả đôi trong thực
phẩm dẫn tới gây độc mà người ta không ngờ đến.


Bản thân melamine khơng có tính độc ở liều thấp nhưng khi kết hợp với axit
cyanuric (cũng có trong sữa bột) sẽ tạo thành muối tinh thể đóng trong các ống
thận nhỏ gây bít tắc, sỏi thận, ảnh hưởng đến sự tạo nước tiểu và gây suy thận,
tử vong. Một số nghiên cứu trên động vật cho thấy melamine có khả năng gây
ung thư.

Melamine (màu xanh) dễ dàng kết hợp với axít cyanuric (màu đỏ)
qua liên kết hydro tạo kiểu liên kết phân tử hình mái ngói, lắng
đọng và gây sỏi thận.


Nồng độ Melamine an toàn cho sữa và thực phẩm

Theo tiêu chuẩn do Ủy ban luật quốc tế về chất lượng và an tồn thực phẩm của LHQ
(CAC) cơng bố ngày 5/7/2012, hàm lượng an tồn melamine tối đa là:

• 0,15 mg/kg với sữa nước dành cho trẻ em
• 1 mg/kg với sữa bột dành cho trẻ em
• 2,5 mg/kg với thức ăn cho động vật và các thực phẩm khác


3. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HĨA CHẤT

Cân phân tích

Bình tia

Bình định mức, pipet các loại


3. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT

Bể rung siêu âm

Máy ly tâm


3. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HĨA CHẤT

Bộ lọc 0.45µm (màng
Nylon)

Hệ thống Q-pod Millipore

Máy HPLC đầu dò UV


3. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, HĨA CHẤT

Hóa chất và thuốc thử:
• Chất chuẩn: Melamine (99,0%)
• Dung mơi: Methanol
• Dung mơi rửa giải: Trifluoroacetic và Methanol

• Mẫu thử : sữa dạng bột hoặc lỏng
• Nước sử dụng cho việc chuẩn bị pha động và pha loãng được lọc bằng hệ thống Qpod Millipore

Hệ thống sắc ký – detector:
Đầu dò UV, cột C18 (150mm x 32mm ID, kích thước hạt 5µm)


 Pha dung dịch

Dung môi:
Dung môi 50% methanol (về thể tích) được chuẩn bị bằng cách pha thể tích
bằng nhau của methanol và nước


Dung dịch chuẩn Melamine
 C = 1000 µgm

100ml

Hịa tan trong
metanol 50%

Cân 100mg

30 phút

melamine

Định mức

Hút 5ml

 C = 10 µgm
 C = 100 µgm

Hút 5ml
Chuẩn làm việc

50ml

50ml

Định mức bằng metanol

Định mức bằng metanol

50%

50%


Chuẩn bị mẫu
100ml
50ml
Methanol 50%
100ml
10 ml DD melamine

10ml mẫu lỏng hoặc 1,0g mẫu khơ

1000 µg/mL

30 phút
Làm lạnh về nhiệt độ phịng

3ml đầu của dung dịch lọc bị loại bỏ,
lấy phần lọc còn lại được cho vào một
lọ HPLC để phân tích

Lọc qua bộ lọc
Dịch ly tâm

0.45µm

C = 100µg/mL
100ml

50ml

Định mức bằng
Metanol 50%

Ly tâm ≥ 3200 rpm

Định mức bằng
Metanol 50%




Các thông số cài đặt:

Các tham số khi dùng HPLC (Theo tiêu chuẩn của FDA):

•
•
•

Cột hấp phụ: VenusilASBC8 kích thước: 4.6 x 250 mm
Pha động: buffer: acetonitrile (ACN) = 85:15; 10mM citric acid; 10mM sodium octane,
pH=3.0

 

•
•
•
•

Tốc độ chảy: 1.0 mL/min
Bước sóng tia UV: 240nm
Nhiệt độ: C
Detector: DAD



4. Kết quả, thảo luận
 

Một đường hiệu chỉnh tuyến tính thu được trên dải hiệu chuẩn từ 1,0 đến 80 µgmL

-1
 với hệ số tương

quan () 0,999. Giá trị R.S.D của các lần tiêm mẫu lặp lại < 0,02% đối với mỗi nồng độ và hệ số lệch
chuẩn y < 2%