Nghiên cứu thành phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân l ập từ thịt chua phú thọ

..

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Bùi Nguyễn Hải Linh

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ CÁC ĐẶC
TÍNH PROBIOTIC CỦA VI KHUẨN LACTIC
PHÂN LẬP TỪ THỊT CHUA PHÚ THỌ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2017


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Bùi Nguyễn Hải Linh

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN VÀ CÁC ĐẶC
TÍNH PROBIOTIC CỦA VI KHUẨN LACTIC
PHÂN LẬP TỪ THỊT CHUA PHÚ THỌ

Chuyên ngành: Động vật học
Mã số: 60 42 01 03

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS. Trịnh Thành Trung

Hà Nội - 2017


LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình thực hiện đề tài luận văn, tôi xin gửi lời cảm ơn chân
thành tới TS. Trịnh Thành Trung, Th.S Trần Thị Lệ Quyên cùng toàn bộ các
cán bộ Viện VSVvà Công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà Nội đã tận
tình hướng dẫn và giúp đỡ cũng như tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất để tơi có
thể hồn thành đề tại luận văn tốt nghiệp này.
Đồng thời, tôi cũng muốn gửi những lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Thị
Thanh Hương và các quý thầy cô giảng dạy ở Viện Sinh thái và Tài nguyên
sinh vật đã động viện và hỗ trợ tôi rất nhiều trong q trình thực hiện.
Ngồi ra, tơi cũng cảm ơn những người bạn, những người luôn sát cánh
bên tôi những lúc khó khăn và giúp tơi vượt qua để hồn thành luận văn một
cách tốt nhất.
Với tấm lịng biết ơn sâu sắc, tôi luôn biết ơn và ghi nhớ những sự giúp
đỡ hết sức quý báu đó.

Hà Nội, ngày

tháng

năm 2017

Học viên

Bùi Nguyễn Hải Linh

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
I.

TỔNG QUAN ............................................................................................ 2

1.1.

Probiotic ...................................................................................................... 2

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và định nghĩa probiotic ............................................... 2
1.1.3. Vai trò của probiotic ................................................................................... 3
1.1.4. Cơ chế tác động chung của probiotic .......................................................... 7
1.1.5. Các nhóm VSV có đặc tính probiotic thường gặp ...................................... 8
1.2.

Vi khuẩn lactic .......................................................................................... 10

1.2.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic ......................................................... 10
1.2.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic ....................... 11
1.3.

Thực phẩm lên men................................................................................... 13

1.3.1. Định nghĩa và các loại thực phẩm lên men ............................................... 13
1.3.2. Thực phẩm lên men từ thịt heo ................................................................. 14
1.4.

Thịt chua Phú Thọ ..................................................................................... 15

II.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................. 18

2.1.

Nguyên liệu ............................................................................................... 18

2.2.

Thiết bị và hóa chất ................................................................................... 18

2.3.

Phương pháp ............................................................................................. 19

2.3.1. Xử lý mẫu thịt chua ................................................................................... 19
2.3.2. Phân lập và xác định số lượng vi khuẩn lactic.......................................... 19
2.3.3. Hoạt hóa vi khuẩn được lưu giữ ở điều kiện lạnh sâu .............................. 20
2.3.4. Giải trình tự gene ...................................................................................... 20


2.3.5. Phương pháp xác định đặc điểm hình thái ................................................ 22
2.3.6. Phương pháp nghiên cứu đặc tính probiotic ............................................. 23
2.3.6.1. Hoạt tính kháng khuẩn ........................................................................ 23
2.3.6.2. Xác định kiểu lên men ......................................................................... 24
2.3.6.3. Hoạt tính β-galactosidase .................................................................... 24
2.3.6.4. Khả năng chịu acid .............................................................................. 24
2.3.6.5. Khả năng chịu muối mật ..................................................................... 25

III.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................ 26

3.1.

Phân lập vi khuẩn lactic trong thịt chua Phú Thọ ..................................... 26

3.2.

Phân loại và phân tích tần xuất bắt gặp vi khuẩn lactic trong thịt chua

Phú Thọ ............................................................................................................... 28
3.2.1. Phân loại vi khuẩn lactic ........................................................................... 28
3.2.2. Xây dựng cây phát sinh chủng loại ........................................................... 31
3.2.3. Phân tích tần xuất bắt gặp vi khuẩn lactic ................................................ 32
3.3.

Đặc tính probiotic...................................................................................... 34

3.3.1. Hoạt tính kháng khuẩn .............................................................................. 34
3.3.2. Khả năng lên men ..................................................................................... 37
3.3.3. Hoạt tính β-galactosidase .......................................................................... 39
3.3.4. Khả năng chịu acid và muối mật............................................................... 40
3.3.4.1. Khả năng chịu acid .............................................................................. 41
3.3.4.2. Khả năng chịu muối mật ..................................................................... 44
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 48
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 50

PHỤ LỤC ........................................................................................................... 54


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
cs

cộng sự

ĐC

đối chứng

LAB

Lactic Acid Bacteria

VSV

vi sinh vật


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Minh họa cơ chế tác động của probiotic .......................................... 8
Hình 1.2. Nguyên liệu và quy trình sản xuất thịt chua Phú Thọ .................... 16
Hình 2.1. Mẫu thịt chua Phú Thọ……………………………………………18
Hình 3.1. Phân lập vi khuẩn lactic trên mẫu 12 (hình A), 14 (hình B), 19
(hình C) và 20 (hình D)………………………………………………………28
Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gene 16S rRNA của các
lồi thuộc chi Lactobacillus. ........................................................................... 32
Hình 3.3. Tần suất xuất hiện các lồi vi khuẩn lactic trong thịt chua Phú Thọ

......................................................................................................................... 33
Hình 3.4. Khả năng kháng khuẩn của một số chủng LAB với 6 chủng vi
khuẩn kiểm định E. faecalis 52788G (hình A), S. aureus 2421Đ (hình B), K.
pneumoniae 1465G (hình C), A. baumannii 56915Đ (hình D), P. aeruginosa
47793Đ (hình E) và E. coli 2361G (hình F) ................................................... 35
Hình 3.5. Khả năng kháng khuẩn của các chủng LAB với nhóm vi khuẩn
“ESKAPE” ...................................................................................................... 36
Hình 3.6. Số lượng chủng và lồi kháng hoặc ức chế nhóm vi khuẩn
“ESKAPE” ...................................................................................................... 37
Hình 3.7. Khả năng lên men của chủng vi khuẩn lactic ................................. 38
Hình 3.8. Số lượng chủng và lồi có khả năng lên men đồng hình ............... 38
Hình 3.9. Hoạt tính β-galactosidase của chủng TPM 1302 (1), TPM 1303 (2),
TPM 1304 (3), TPM 1308 (4), TPM 1309 (5), TPM 1503 (6) và TPM 1504
(7) sau 24 giờ................................................................................................... 39
Hình 3.10. Khả năng sinh β-galactosidase của chủng LAB qua 24 giờ và 48
giờ .................................................................................................................... 40
Hình 3.11. Số lượng chủng và lồi có khả năng sinh β-galactosidase sau 24
giờ .................................................................................................................... 40
Hình 3.12. Số lượng chủng có khả năng chịu acid......................................... 43


Hình 3.13. Giá trị OD600 của các chủng có khả năng chịu acid ..................... 44
Hình 3.14. Số lượng chủng có khả năng chịu muối mật ................................ 45
Hình 3.15. Giá trị OD600 của các chủng có khả năng chịu muối mật ............. 46


DANH MỤC BẢNG
Bảng 3.1. Giá trị pH và các thông số vi sinh trong 9 sản phẩm thịt chua Phú
Thọ................................................................................................................... 27
Bảng 3.2. Phân loại các loài vi khuẩn lactic trong thịt chua Phú Thọ............ 30

1

MỞ ĐẦU
Trong q trình tiến hóa của con người, rất nhiều loại thực phẩm lên
men và đồ uống lên men có cồn đã được tạo ra theo phương cách lên men tự
nhiên (sử dụng VSV sẵn có trong tự nhiên) hoặc lên men chủ định (sử dụng
các VSV đã tuyển chọn trong giống khởi động). Mỗi đất nước, mỗi dân tộc,
mỗi vùng miền và mỗi nền văn hóa khác nhau ln sở hữu cho riêng mình
từng loại thực phẩm lên men đặc trưng. Với giá thành rẻ, giá trị dinh dưỡng
cao, phù hợp với khẩu vị của từng dân tộc, thực phẩm lên men đã và đang
được sử dụng như một nhu cầu tất yếu của cuộc sống.
Tại Việt Nam, trong số các loại thực phẩm lên men thì thịt chua là món
ăn phổ biến được nhiều người biết đến. Dựa trên kinh nghiệm truyền thống,
mỗi vùng miền có các phương cách chế biến và sản xuất thịt chua khác nhau
để tạo nên hương vị riêng. Mặc dù phương pháp sản xuất cịn thủ cơng và cơ
sở sản xuất cịn nhỏ lẻ nhưng gần đây nhiều loại thịt chua đã được thương mại
hóa và bán trong các cửa hàng và siêu thị.
Tuy nhiên, hiểu biết khoa học về thành phần VSV hay những lồi VSV
chính tham gia vào q trình lên men hình thành chất lượng thịt chua vẫn cịn
nhiều hạn chế. Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu thành
phần và các đặc tính probiotic của vi khuẩn lactic phân lập từ thịt chua Phú
Thọ”.


2

I.
1.1.

TỔNG QUAN

Probiotic

1.1.1. Lịch sử nghiên cứu và định nghĩa probiotic
a, Lịch sử nghiên cứu probiotic
Những nghiên cứu về probiotic mới chỉ bắt đầu vào thế kỷ 20, Henry
Tisser (1900), một bác sỹ người Pháp đã quan sát và thấy rằng phân của
những đứa trẻ mắc bệnh tiêu chảy có ít vi khuẩn lạ hình trứng hoặc hình chữ
Y hơn những đứa trẻ khỏe mạnh [32].
Sau đó năm 1907, Elie Metchnikoff - người Nga, đạt giải Nobel - đã
chứng minh được rằng việc tiêu thụ Lactobacillus sẽ hạn chế các nội độc tố
của hệ VSV đường ruột. Ơng giải thích được điều bí ẩn về sức khỏe của
những người Cơ-dăc ở Bulgary, họ sống rất khỏe mạnh và tuổi thọ có thể lên
tới 115 tuổi hoặc hơn, nguyên nhân có thể là do họ tiêu thụ rất lớn các sản
phẩm sữa lên men, điều này được ông báo cáo trong sách “sự kéo dài cuộc
sống” - The Prolongation of life (1908) [32].
Có thể nói Tisser và Metchnikoff là người đầu tiên đưa ra những đề
xuất mang tính khoa học về probiotic, làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp
theo về probiotic [11].
Năm 1930, nhà khoa học người Nhật Minoru Shirota phân lập các vi
khuẩn lactic từ phân của các em thiếu nhi khỏe mạnh [12]. Cùng năm đó, các
nhà nghiên cứu Hoa Kỳ đã chứng minh là Lactobacillus acidophilus có khả
năng làm giảm bệnh táo bón thường xuyên. Các nhà khoa học đại học Havard
phát hiện ra các vi khuẩn đường ruột đóng một vai trị quyết định trong q
trình tiêu hóa, giúp tiêu hóa thức ăn, cung cấp một số vitamin và các chất dinh
dưỡng khác nhau mà cơ thể vật chủ không tự sản xuất ra được [11]. Sau đó 5
năm, một trong các đồ uống lên men - đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là
hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái niệm chung

3

probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên
men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập
niên 80 [12].
Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc
Lactobacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những
nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như
vật nuôi.
1.1.2. Định nghĩa probitic
Theo ngơn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ
probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ
“những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller,
1989) [11]. Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để
chỉ những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động
vật thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho
vật chủ. Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa
thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy
đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học:
(i) theo Fuller (1989) [11], probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào
thức ăn giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng
có lợi cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là
“các vi sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hóa với một số lượng
đủ sẽ đem lại sức khỏe tốt cho vật chủ”.

1.1.3. Vai trò của probiotic
Probiotic được coi như là một thực phẩm chức năng rất được ưa
chuộng bởi các tính năng của nó mang lại. Những tác động chủ yếu của các

4

chủng vi khuẩn probiotic tới sức khỏe con người gồm những mặt chính như
sau
- Ngăn chặn sự xâm nhập của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách cản
chúng bám vào thành ruột
Probiotic khi được bổ sung vào cơ thể, các VSV này sau khi vượt
qua các rào cản về lý học và hóa học trong hệ dạ dày - ruột non thì
chúng sẽ tiến hành bám dính vào thành ruột để thực hiện chức năng
có lợi cho cơ thể vật chủ. Chúng cạnh tranh nơi ở với vi khuẩn gây
bệnh, ngăn cản không cho các vi khuẩn này bám vào thành ruột, từ
đó làm giảm số lượng vi khuẩn ngăn chặn các mầm bệnh [14].
- Giúp cho việc tiêu hóa thức ăn được hữu hiệu hơn
Đối với những người thường bị chứng bất dung nạp đường
lactose trong các sản phẩm sữa do trong ruột khơng có enzyme tiêu
hóa loại đường này thì probiotic sẽ giúp họ tiêu hóa được dễ dàng
hơn [14].
- Giảm nguy cơ bị tiêu chảy do uống nhiều thuốc kháng sinh
Việc sử dụng probiotic để phòng ngừa tiêu chảy gây ra bởi thuốc
kháng sinh rất được quan tâm
Sự phát triển một cách rộng rãi và đặc hiệu cao của thuốc kháng
sinh đã khiến cho ngành y học quá tin tưởng vào phương pháp trị
liệu kháng sinh. Tuy nhiên, tác động loại bỏ của thuốc kháng sinh
không phân biệt được mầm bệnh thực sự và hệ VSV có lợi trong
ruột. Vì vậy, phương pháp trị liệu kháng sinh cũng dẫn đến thay đổi
hệ cân bằng của ruột và gây ra một vài ảnh hưởng xấu mà có thể tòn
tại lâu dài ngay cả sau khi ngừng sử dụng cách điều trị này.
Bên cạnh đó, sự xuất hiện nhanh của nhiều chủng vi khuẩn

kháng lại kháng sinh chẳng hạn như Enterocci kháng vancomycin
và Staphylococcus aureus kháng methicillin là một vấn đề đáng


5

quan tâm. Hơn nữa một vài bệnh lây nhiễm lại gia tăng và trở nên
trầm trọng hơn trong điều trị thuốc kháng sinh. Ví dụ, bệnh tiêu
chảy có thể do Clostridium difficile, một mầm bệnh cơ hội, hoạt
động và tăng nhanh khi có sự mất cân bằng của hệ VSV trong ruột
thơng thường diễn ra trong suốt q trình điều trị kháng sinh [14].
Mặc dù bệnh này nói chung được điều trị thành công với một loại
thuốc kháng sinh thứ hai, tuy nhiên một vài bệnh lây nhiễm vẫn tái
diễn mặc cho các phương pháp trị liệu kháng sinh khác (Sanders,
1999).
Về sau việc sử dụng probiotic đã cải thiện đáng kể hệ VSV nội
sinh (Markowitz và Bengmark, 2002) bằng cách thay thế các vi
khuẩn có ích bị mất. So với các nhược điểm như đắt, tính hóa học và
xâm hại ruột của thuốc kháng sinh, ưu điểm của probiotic là an tồn,
nguồn gốc tự nhiên và phần lớn khơng có bất cứ ảnh hưởng có hại
nào.
Ngồi tác dụng giảm nguy cơ bị tiêu chảy do uống nhiều thuốc
kháng sinh thì việc sử dụng probiotic cịn có tác dụng ngăn ngừa
nguy cơ tiêu chảy gây ra bởi các loại virus gây bệnh [14].
- Tăng cường hệ miễn dịch
Probiotic như một vị thuốc chứa các phân tử chống viêm cho
đường ruột. Đồng thời góp phần đẩy mạnh sự báo hiệu cho tế bào
vật chủ để giảm các phản ứng viêm bằng cách tạo các phản ứng
miễn dịch cho cơ thể.
- Giảm cholesterol trong máu

Hàm lượng cholesterol trong huyết thanh ảnh hưởng rất lớn đến
các bệnh về tim mạch. Nếu hàm lượng này cao hơn 1mmol so với
mức bình thường thì người bệnh đang ở mức độ nguy hiểm của các
bệnh về tim mạch (35%) và có thể gây chết người nếu cao hơn 45%.


6

Vì vậy chỉ cần giảm 1% hàm lượng cholesterol trong máu là có thể
giảm được mức độ nguy hiểm của bệnh về tim mạch từ 2 đến 3%
(Masnon, 1992) [20]. Và việc sử dụng các sản phẩm probiotic có
khả năng làm giảm hàm lượng cholesterol trong máu [1]. Một trong
những bằng chứng đầu tiên đó là việc sử dụng probiotic
Lactobaccilii trong các sản phẩm có ảnh hưởng tốt đến tim mạch,
bao gồm cả khả năng ngăn ngừa và điều trị các hội chứng thiếu máu
cục bộ của tim (Oxman, 2001) và giảm đáng kể hàm lượng
cholesterol trong máu (De Roos và Katan, 2000) [15].
- Giảm thiểu hiện tượng dị ứng
L. rhammousus GG đã được thử nghiệm trên hai đối tượng có
mức độ dị ứng cao đó là phụ nữ 6 tuần trước khi sinh và trẻ sơ sinh
trong vòng 6 tháng. Kết quả cho thấy sự giảm có ý nghĩa về mức độ
dị ứng (Kalliomaki, 2001). Nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của
probiotic trong việc tạo ra các phản ứng giúp cơ thể chống lại các
chất lạ xâm nhập vào cơ thể và ngăn ngừa hiện tượng dị ứng xảy ra.
Trong nghiên cứu y học khác về bệnh dị ứng của trẻ con với sữa bò,
người ta thấy rằng chứng viêm da dị ứng này có thể giảm bớt khi sử
dụng thực phẩm probiotic của chủng L. rhammousus và B. lactic
BB-11 (Majamaa và Isolauri, 1996; 1997; Isolauri và cs, 2000) [15].
Ngồi các ứng dụng chính trên thì probiotic theo như các nghiên cứu
khác cịn có khả năng thun giảm triệu chứng đường ruột của hội chứng ruột

bị kích thích, nhiễm nấm âm đạo, nhiễm Helicobacter pylori ở dạ dày, bệnh
viêm ruột và nhiễm trùng đường tiết niệu.


7

1.1.4. Cơ chế tác động chung của probiotic
Có rất nhiều cách giải thích khác nhau về cơ chế tác động, nhưng phần
lớn các tài liệu về probiotic đề cập đến ba khía cạnh sau: (i) cạnh tranh loại
trừ; (ii) đối kháng vi khuẩn và (iii) hỗ trợ miễn dịch (Steiner, 2006). Minh họa
cơ chế hoạt động của probiotic thông qua hình 1.1
Cạnh tranh loại trừ là đặc tính đấu tranh sinh tồn điển hình của các
VSV. Hình thức cạnh tranh loại trừ thường thấy ở các VSV ruột là cạnh tranh
vị trí bám dính. Các VSV probiotic cư ngụ và nhân lên trong ruột, khóa chặt
các vị trí thụ cảm và ngăn cản sự bám dính của các VSV khác như:
Escherichia coli, Salmonella. Một số nấm men probiotic (Saccharomyces
cereviese, S. boulardii) khơng chỉ cạnh tranh vị trí bám dính của các vi khuẩn
khác mà còn gắn kết các vi khuẩn có roi (phần lớn là những vi khuẩn có hại)
thơng qua các cơ quan thụ cảm mannose và đẩy chúng ra khỏi vị trí bám dính
ở niêm mạc ruột (Czerucka, 2002). Tuy nhiên, cạnh tranh dinh dưỡng là
phương thức cạnh tranh khốc liệt nhất vì sự sinh sơi với số lượng lớn của một
lồi VSV nào đó là một đe dọa nghiêm trọng đối với các loài khác về nguồn
cơ chất cho phát triển.
Đồng thời cạnh tranh loại trừ, các VSV probiotic cịn sản sinh các chất
kìm hãm vi khuẩn như lactoferrin, lysozym, hydrogen peroxide cũng như một
số axit hữu cơ khác. Các chất này gây tác động bất lợi lên vi khuẩn có hại chủ
yếu là do sự giảm thấp pH trong ruột (Conway, 1996).


8

Hình 1.1. Minh họa cơ chế tác động của probiotic
Ruột là cơ quan miễn dịch lớn nhất ở động vật có vú. Giữa hệ VSV
ruột và hệ thống miễn dịch có mối tương tác đặc thù. Năng lực miễn dịch thể
dịch và miễn dịch tế bào của hệ thống miễn dịch đường ruột bị ảnh hưởng rất
lớn bởi sự cân bằng của hệ VSV ruột (Cebra, 1999). Thông qua tương tác với
hệ thống miễn dịch ruột, các probiotic có thể điều chỉnh cả miễn dịch thụ
động và chủ động hoặc cả hai. Tác động điều chỉnh miễn dịch đặc hiệu của
probiotic phụ thuộc vào chủng giống hoặc các loài vi khuẩn probiotic (Dugas,
1999). Tuy nhiên, cơ chế tác động của probiotic đối với việc nâng cao chức
năng miễn dịch vẫn cịn chưa được hiểu biết đầy đủ.

1.1.5. Các nhóm VSV có đặc tính probiotic thƣờng gặp
Các nhóm VSV cơ bản
-

Nhóm vi khuẩn lactic


9

Đây là vi khuẩn thân thuộc với con người từ ngàn xưa. Trong tự
nhiên, chúng phân bố rất rộng rãi, thường gặp nhiều trong các sản phẩm
muối chua như dưa chua, thịt chua và sữa chua. Nhiều nghiên cứu đã
cho thấy rằng, vi khuẩn lactic có một vai trị quan trọng trong q trình
tiêu hóa và hấp thụ thức ăn của vật chủ. Nhờ khả năng sản sinh ra axit
lactic, axit pyruvic, tổng hợp vitamin nhóm B và sản sinh enzyme nên
có tác dụng ức chế VSV, cải thiện tăng trưởng và sức đề kháng của vật
chủ.
- Nhóm vi khuẩn Bacillus

Các vi khuẩn Bacillus là nhóm trực khuẩn sinh bào tử, sống hiếu khí
tùy tiện nhưng trong điều kiện hiếu khí hoạt động mạnh hơn. Chúng
phân bố phổ biến trong tự nhiên. Một số loại của giống này còn thấy
trong khoang miệng, trong đường ruột của người và động vật. Tất các
lồi Bacillus đều có khả năng phân giải hợp chất hữu cơ như protein,
tinh bột, cellulose nhờ khả năng sinh enzyme ngoại bào mạnh như
amylase, cellulose, protease.
- Nấm men Saccharomyces
Nhóm này được con người biết đến từ rất lâu và được sử dụng trong
nghề làm bánh mì, nấu rượu, làm bia và ủ rượu vang. Trong thành phần
của tế bào nấm men rất giàu protein, vitamin nhóm B và khống chất.
Chúng cịn hấp thu và bài thải độc tố ra ngồi, tham gia chuyển hóa
glucose thành axit pyruvic là cơ chất cho các VSV có lợi hoạt động và
sinh sản.
- Nấm mốc
Điển hình là Aspergillus oryzae, A. niger, chúng có vai trị sản sinh
các enzyme amylase, protease, cellulose nhằm tăng cường khả năng
tiêu hóa thức ăn của con người và động vật.


10

1.2.

Vi khuẩn lactic

1.2.1. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
Theo hệ thống phân loại của Bergey (2009), vi khuẩn lactic (LAB)
được phân loại như sau:
Lactobacteriaceae

Họ
Chi

Lactobacillus

Paralactobacillus

Pediococcus

Vi khuẩn lactic là vi khuẩn Gram dương, chịu acid, có dạng hình cầu
hoặc hình que, khơng tạo bào tử, có oxidase và catalase âm tính và hầu hết
khơng di động. Đa số các lồi vi khuẩn lactic lên men kỵ khí bắt buộc. Một số
lồi hiếu khí có thể sử dụng oxi thơng qua flavoprotein oxidase.
Vi khuẩn lactic có khoảng nhiệt độ sinh trưởng khá rộng. Những lồi
ưa nhiệt có nhiệt độ tối ưu từ 50C - 65C. Trong khi đó, một số lồi có thể
sinh trưởng ở 5C hoặc thấp hơn nữa. Vi khuẩn lactic rất khó ni bởi vì hầu
hết chúng khơng có khả năng sinh tổng hợp một số hợp chất hữu cơ phức tạp
như vitamin, amino acid, purine và pyrimidine, do đó, cần phải bổ sung các
hợp chất này vào mơi trường ni cấy.
Trong q trình lên men, các VSV sẽ chuyển hóa các chất có trong
ngun liệu thơ ban đầu thành sản phẩm lên men có giá trị dinh dưỡng cao
hơn và có mùi vị hấp dẫn hơn. Hơn nữa, các chất được tạo ra có thể bảo quản
được thực phẩm lâu hơn, tăng lượng axít amin cần thiết, axít béo omega-3,
isoflavones, các chất có hoạt tính có lợi cho sức khỏe, vitamin và khống
chất, làm giảm các chất khơng mong muốn và các chất kháng dinh dưỡng, tạo
nên nhiều các chất oxy hóa như α-tocopherol, β-carotene, selenium, phenolic
và chất kháng khuẩn, tăng cường khả năng tiêu hóa và thúc đẩy các chức năng
probiotic (Tamang và cs, 2010). Bên cạnh việc tham gia vào hình thành chất
lượng sản phẩm, nhiều VSV trong thực phẩm lên men sở hữu các tính trạng

có lợi cho sức khỏe con người (đặc tính probiotic). Vi khuẩn lactic có khả
năng sản sinh β-galactosidase, một enzyme phân cắt đường lactose thành


11

đường đơn và là enzyme rất cần thiết cho người khơng có khả năng dung nạp
lactose trong sữa (Vrese và cs, 2001; Solomons, 2002). Hơn nữa, vi khuẩn
lactic có thể tổng hợp bacteriocin, một loại peptide có chứa các axít amin bất
thường “unusual amino acid” được tổng hợp trên hệ thống ribosome của tế
bào. Bacteriocin có khả năng kháng khuẩn, đặc biệt là những vi khuẩn có
quan hệ gần gũi với chủng sản sinh bacteriocin.

1.2.2. Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic có đặc tính probiotic
Về lý thuyết, bất kỳ lồi vi khuẩn lactic khơng gây độc nào cũng đều có
khả năng sử dụng làm probiotic. Tuy nhiên, để có thể tác động có lợi lên hệ
tiêu hóa của vật chủ thì trước hết chúng phải có khả năng sống sót ở điều kiện
khắc nghiệt trong đường tiêu hóa, cụ thể như sau
- Chịu muối mật
Muối mật được coi là chất kháng khuẩn trong đường tiêu hóa, bảo
vệ ruột khỏi sự xâm nhập của các VSV gây bệnh. Do vậy, khi thức ăn
cùng với VSV probiotic từ dạ dày chuyển xuống vùng ruột, tại đây,
chúng sẽ chịu tác động của muối mật. Khả năng sống sót của các chủng
VSV sau tác dụng của muối mật là một trong những đặc tính quan
trọng của VSV được sử dụng làm probiotic.
- Chịu pH thấp
Các nhà khoa học đã chứng minh, các probiotic phải trải qua các
q trình tiêu hóa khắc nghiệt hơn 90 phút trước khi được giải phóng từ
dạ dày và ruột. Tuy nhiên, các q trình tiêu hóa có thời gian xảy ra lâu
hơn nên VSV probiotic phải chịu áp lực của dạ dày với pH thấp đến

khoảng 1,5. Do đó, các chủng được sử dụng làm probiotic phải chịu
được pH thấp ít nhất 90 phút, tiếp đến chúng phải gắn vào biểu mô ruột
và phát triển được trong ruột trước khi phát huy vai trò đối với vật chủ.


12

Vì vậy, đây là yếu tố cần thiết để tạo sự thích nghi ban đầu, là một
trong những tiêu chí quan trọng khi sàng lọc, tuyển chọn các chủng
probiotic.
- Chịu kháng sinh
Kháng sinh được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh đường ruột
cho người cũng như động vật. Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích do
kháng sinh mang lại thì phương pháp trị liệu bằng kháng sinh có một số
hạn chế nhất định như: tác động loại bỏ không chọn lọc, không phân
biệt được mầm bệnh thật sự và hệ VSV có lợi trong đường ruột. Vì thế,
phương pháp này đã dẫn đến sự mất cân bằng VSV đường ruột. Vì thế,
phương pháp này đã dẫn đến sự mất cân bằng hệ VSV đường ruột và
có thể gây ra một số ảnh hưởng xấu cho vật chủ như tiêu chảy, rối loạn
tiêu hóa.
Chính vì vậy, việc sử dụng probiotic thường được bổ sung cho vật
chủ trong thời gian điều trị bằng kháng sinh để hạn chế sự mất cân bằng
hệ VSV đường ruột. Do đó, các chủng dùng làm probiotic cần phải có
khả năng chịu được kháng sinh và phải đảm bảo không chuyển gen
kháng sinh sang những những vi khuẩn khác có mặt trong đường tiêu
hóa, đặc biệt là những vi khuẩn gây bệnh.
- Khả năng bám dính vào tế bào biểu mô ruột
Các chủng vi khuẩn lactic chỉ có thể tác động tốt khi chúng có thể
sinh trưởng và phát triển được trong đường tiêu hóa. Bên cạnh khả
năng sống sót được trong đường tiêu hóa thì chúng phải có khả năng

bám dính vào thành biểu mơ ruột để khơng bị rửa trơi ra ngồi cùng với
phân.


13

Nhờ khả năng bám dính đó mà các chủng probiotic có thể ngăn cản
được sự khu trú của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách giành vị trí bám
trên thành ruột hay trên các bề mặt biểu mơ khác.
Do đó, sự kết bám với tế bào biểu mô ruột của các chủng probiotic
là một yêu cầu quan trọng cho việc định cư lâu dài và tạo ưu thế cạnh
tranh trong hệ VSV đường ruột.
Bên cạnh khả năng sống sót và phát triển được trong điều kiện khắc
nghiệt của đường tiêu hóa, VSV probiotic cịn có khả năng sản sinh những
chất có hoạt tính kháng khuẩn như các axit hữu cơ, bacteriocin và H2O2.
Những chất này được sản sinh cùng với quá trình sinh trưởng và phát triển
của chúng trong đường tiêu hóa, tác động ức chế và tiêu diệt các vi khuẩn gây
bệnh, tạo nên sự cân bằng hệ VSV đường ruột. Ngồi ra, một số chủng VSV
probiotic cịn có khả năng sinh nhiều loại enzyme có lợi cho việc tiêu hóa
thức ăn, kích thích tăng trọng, điều hịa hệ miễn dịch vật chủ và tăng khả năng
đề kháng cho vật chủ.

1.3.

Thực phẩm lên men

1.3.1. Định nghĩa và các loại thực phẩm lên men
a, Định nghĩa
Theo định nghĩa của Tamang và cs năm 2010, thực phẩm lên men là
loại thực phẩm do một nhóm người hay một nhóm dân tộc nào đó chế biến từ

nguồn nguyên liệu sẵn có tại địa phương theo phương cách lên men sử dụng
các VSV sẵn có trong tự nhiên hay các VSV trong giống khởi động nhằm
thay đổi bản chất sinh hóa của nguyên liệu ban đầu thành loại thực phẩm có
thể ăn được và phù hợp với khẩu vị của dân tộc đó. Theo đó, thực phẩm lên
men truyền thống là loại thực phẩm mà dân tộc nào đó đã biết cách chế biến
và sử dụng trong nhiều thế kỷ.


14

b, Các loại thực phẩm lên men
Có 4 loại thực phẩm lên men
- Thực phẩm lên men từ rau củ
- Thực phẩm lên men từ thịt heo
- Thực phẩm lên men từ cá
- Thực phẩm lên men từ sữa

1.3.2. Thực phẩm lên men từ thịt heo
Qua cách chế biến và phương cách lên men khác nhau, cùng một loại
nguyên liệu ban đầu nhưng mỗi dân tộc tạo cho riêng mình các loại thực
phẩm lên men đặc trưng và mỗi loại đó có một tên gọi khác nhau trong từng
Quốc gia hay giữa các Quốc gia khác nhau. Chẳng hạn, cùng một loại nguyên
liệu là thịt lợn lên men: ở Việt Nam có nem chua, thịt chua; ở Thái Lan có
nham; ở Châu Âu có salami; ở Đức có thuringer; ở Tây Ban Nha có androlla;
ở Ý có mortadello và mỗi sản phẩm lên men đó đều có hương vị đặc trưng
riêng (Tamang và Kailasapathy, 2010) [29]. Mặc dù từ xa xưa, con người
khơng có bất cứ kiến thức gì về VSV nhưng bằng kinh nghiệm thực tiễn qua
nhiều thế hệ, người cổ xưa đã tạo nên và truyền lại phương pháp chế biến và
sản xuất các loại thực phẩm lên men phù hợp với khẩu vị cho riêng dân tộc
mình.

Trong thời kỳ sinh học hiện đại ngày nay, con người đã biết VSV đóng
vai trị quan trọng trong q trình sản xuất thực phẩm lên men. VSV tham gia
vào quá trình lên men đó bao gồm vi khuẩn, nấm men và nấm mốc. Các VSV
này có thể có sẵn trong gia vị bổ sung, trong nguyên liệu, trong vật dụng chế
biến hoặc ở ngồi mơi trường. Trong q trình lên men, các VSV sẽ nhân lên
và chiếm ưu thế nhờ thích ứng với nguyên vật liệu ban đầu (Tamang và
Kailasapathy, 2010) [29]. Vì thế, mỗi sản phẩm lên men khác nhau sẽ có
thành phần VSV khác nhau và thành phần VSV này sẽ quyết định chất lượng


15

và hương vị đặc trưng của từng sản phẩm lên men. Các nghiên cứu về VSV
tham gia vào quá trình lên men thường tập trung vào xác định mật độ VSV có
trong sản phẩm, phân loại VSV, các đặc tính kiểu hình và kiểu gene. Phân
loại chính xác các VSV có mặt ở thành phẩm cuối cùng của q trình lên men
có ý nghĩa rất quan trọng vì các VSV này là những VSV đóng góp chính vào
việc hình thành chất lượng sản phẩm lên men (Tamang và cs, 2010).
Vi khuẩn (vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic và vi khuẩn Bacillus) đóng
vai trị rất quan trọng trong lên men thực phẩm. Trong đó, vi khuẩn lactic là
những vi khuẩn chủ yếu tham gia vào quá trình lên men.

1.4.

Thịt chua Phú Thọ
Thịt chua là một sản phẩm lên men truyền thống của vùng trung du Bắc

bộ Việt Nam, đặc biệt nổi tiếng tại huyện Thanh Sơn, tỉnh Phú Thọ. Đây là
sản phẩm lên men từ thịt heo, quá trình lên men trong thịt chua là quá trình
lên men lactic. Axit lactic sinh ra trong q trình lên men làm pH mơi trường

giảm làm protein đông tụ, tạo cấu trúc và mùi bị đặc trưng cho thịt chua. Cho
đến nay thịt chua vẫn chủ yếu được sản xuất thủ công, dựa theo kinh nghiệm
là chính.
Nguyên liệu chính dùng sản xuất thịt chua là thịt nạc (chủ yếu là nạc
thăn, nạc mông, nạc vai), bì lợn và thính. Hỗn hợp này khi đã thấm gia vị
được nèn chặt vào ống nứa lót lá ổi, bọc kín đầu bằng lá chuối hoặc lá dong
sạch. Tuy nhiên hiện nay một số nơi thay ống nứa bằng lọ nhựa sạch PP nắp
kín (Hình 1.2)
Thịt chua thành phẩm phải có vị chua của thịt lên men, vị giịn của bì
và hương thơm bùi bùi của thính hịa quyện.