Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen ssiv mã hóa enzyme starch synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột

Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
..

VIỆN KHOA HỌC VÀ
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----------------------

NGUYỄN MẬU HƢNG

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN
GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG
CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2016

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

1

BỘThạc
GIÁO
Luận văn
sỹ DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN KHOA HỌC
VÀ Mậu Hưng
Nguyễn
CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
----------------------

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN
GEN SSIV MÃ HÓA ENZYME STARCH SYNTHASE TĂNG
CƢỜNG SINH TỔNG HỢP TINH BỘT

Chuyên ngành:
Mã số:

Sinh học thực nghiệm
60420114

Học viện:
Hƣớng dẫn khoa học:

Nguyễn Mậu Hƣng

TS. Phạm Bích Ngọc

Hà Nội - 2016
LỜI CAM ĐOAN

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

2




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan Luận văn này hoàn toàn được hoàn thiện bằng quá
trình nghiên c ứu khoa học của bản thân dưới sự hướng dẫn trực tiếp của TS .
Phạm Bích Ngọc cùng v ới cán bộ Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công
nghệ Sinh học. Các số liệu hình ảnh, kết quả được trình bày, trong luận văn này
là trung thực, không sao chép bất cứ tài liệu, công trình nghiên cứu của người
khác mà không chỉ rõ nguồn tham khảo. Tôi xin chịu trách nhiệm về lời cam
đoan của mình trước hội đồng khoa học.

Hà Nội, tháng 1 năm 2016
Học viên

Nguyễn Mậu Hƣng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

3




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến những người đã hướng dẫn,
giúp đỡ tận tình để tơi hồn thành luận văn này:
TS. Phạm Bích Ngọc, Phó trưởng phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật Viện Công nghệ Sinh học, đã hướng dẫn và hỗ trợ tận tình, truyền đạt kiến thức,
những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
PGS.TS. Chu Hoàng Hà - Viện trưởng Viện công nghệ sinh học, Viện
trưởng Viện Công nghệ sinh học đã chỉ bảo tận tình về chuyên môn, luôn theo
sát thí nghiệm của tơi để có những lời khun bổ ích và kịp thời.
ThS. Lê Thu Ngọc, CN. Nguyễn Khắc Hưng, CN. Phạm Thanh Tùng đã
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm luận văn.
Tơi cũng xin bày tỏ lịng biết ơn đến các thầy cô giáo tại Cơ sở đào tạo
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý
báu trong thời gian học tập vừa qua.
Bằng tình cảm chân thành, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè
đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn
này.
Hà Nội, tháng 1 năm 2016
Học viên

Nguyễn Mậu Hưng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

4




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................................................... 11
1.

Đặt vấn đề ....................................................................................................................................... 11

2.

Mục đích nghiên cứu ....................................................................................................................... 12

3.

Nội dung nghiên cứu ....................................................................................................................... 12

4.

Ý nghĩa khoa học ............................................................................................................................. 13

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU...................................................................................................... 14
1.1.

Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột ............................................................................. 14

1.1.1. Giới thiệu về tinh bột ....................................................................................................................... 14
1.1.2. Cấu trúc của tinh bột........................................................................................................................ 15
1.1.3. SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT ........................................................................................................ 16
1.1.4. HÌNH DẠNG TINH BỘT ............................................................................................................... 17
1.1.5. Các loại hạt tinh bột hay gặp ........................................................................................................... 17
1.1.6. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan ........................................................................ 18
1.1.7. Nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ sinh học nhằm cải biến q trình trao đổi tinh bột. ..................... 21
1.2.

Cây sắn và tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới và Việt Nam .................................................... 22

1.3.

Rễ tơ và ứng dụng nuôi cấy rễ tơ trong sản xuất protein tái tổ hợp ............................................ 26

1.4

Giới thiệu về Agrobacterium rhizogenes – phƣơng pháp tạo rễ tơ ở tế bào thực vật ................. 28

1.5

Cơ chế chuyển các gen vùng T-DNA vào tế bào thực vật ............................................................... 29

1.6

Nuôi cấy sinh khối rễ tơ................................................................................................................... 30

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 32
2.1.

Vật liệu , hóa chất và thiết bị ........................................................................................................... 32

2.1.1 Thực vật .......................................................................................................................................... 32
2.1.2 Chủng khuẩn, vector và cặp mồi sử dụng ..................................................................................... 32
2.1.3 Hóa chất .......................................................................................................................................... 33
2.1.4. Thiết bị ............................................................................................................................................ 33
2.2.

Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................................................. 34

2.2.

Phƣơng pháp thu thập mẫu, phân lập, xác định trình tự gen SSIV ............................................. 34

2.2.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140 ........................................................................ 34
2.2.2. Phản ứng RT-PCR ........................................................................................................................... 34

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

5

Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

2.2.3. Tách dòng sản phẩm bằng vector pENTR™/D-TOPO ................................................................... 36
2.2.4. Kiểm tra các khuẩn lạc bằng phƣơng pháp PCR từ khuẩn lạc ......................................................... 37
2.2.5. Tách chiết plasmid ........................................................................................................................... 38
2.2.6. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank. ....... 39
2.2.7. Thiết kế vector pK7GWIWG2(II) mang đoạn gen SSIV bằng kỹ thuật Gateway. .................... 39
2.2.8. Phƣơng pháp chuyển gen tạo rễ tơ ở khoai lang nhờ vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ...... 42
2.2.9. Phƣơng pháp đánh giá mô chuyển gen trên môi trƣờng chọn lọc ............................................... 43
2.2.10. Phƣơng pháp xử lí số liệu .............................................................................................................. 43
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................................. 44
3.1.

Phân lập, giải trình tự gen SSIV mã hóa cho enzyme Starch Synthase ở sắn .................................. 44

3.1.1. Tách chiết RNA tổng số từ củ sắn giống KM140. ....................................................................... 44
3.1.2. Thiết kế mồi đặc hiệu nhân gen SSIV của sắn và tổng hợp cDNA............................................. 44
3.1.3. Phân lập, tách dịng, giải trình tự gen SSIV của sắn .................................................................... 45
3.2.

Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV và tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium

rhizogenes tƣơng ứng ................................................................................................................................. 46
3.2.1. Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D/SSIV bằng kỹ thuật Gateway ............................. 46
3.2.2. Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium mang cấu trúc vector chuyển gen đã thiết kế ......................... 47
3.3.

Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ khoai lang mang gen SSIV ............................................................... 48

3.5.

Phân tích các dịng rễ tơ khoai lang chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật PCR ..................................... 50

3.6.

Phân tích cây chuyển gen SSIV bằng kỹ thuật RT-PCR ............................................................. 51

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................................................................... 55
KẾT LUẬN: ................................................................................................................................................ 55
ĐỀ NGHỊ:.................................................................................................................................................... 55
Tài Liệu Tham Khảo .................................................................................................................................. 56
Phụ Lục: ........................................................................................................................................................ 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

6




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng
DANH MỤC HÌNH

Hình 1. Cấu trúc phân tử của amylopectin và amylose .................................. 15
Hình 2. Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan ................ 19
Hình 3. Cây Sắn .............................................................................................. 23

Hình 4. Sản lƣợng sắn theo châu lục, năm 2006-2011Error! Bookmark not
defined.
Hình 5. Tỷ lệ sản lƣợng sắn các nƣớc trên thế giới, 2012Error!

Bookmark

not defined.
Hình 6. Vector pK7GWG2D ........................................................................... 40
Hình 7. RNA tổng số tách chiết từ củ giống sắn KM140 ............................... 44
Hình 8. Điện di kiểm tra sản phẩm PCR khuếch đại gen SSIV từ cDNA sắn 45
Hình 9. Colony-PCR chọn lọc các dịng khuẩn mang vector pENTR/SSIV.. 46
Hình 10. Kết quả colony-PCR sử dụng mồi đặc hiệu SSIV-Frag_F/R và kiểm tra
sản phẩm cắt plasmid pK7WG2D/SSIV bằng EcoRI. ......................................... 47
Hình 11. Kết quả điện di colony-PCR các dòng khuẩn lạc ......................... 48
Hình 12. Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro trên môi
trƣờng đồng nuôi cấy sau 2 ngày lây nhiễm A.rhizogenes ............................ 49
Hình 13. Hình ảnh các mảnh lá và thân mẫu khoai lang in vitro bắt đầu ra rễ
trên môi trƣờng chọn lọc sau khi chuyển gen 30 ngày ................................... 49
Hình 14. Kết quả tách chiết DNA tổng số một số rễ tơ .................................. 50
Hình 15. Sản phẩm PCR nhân gen SSIV từ DNA tổng số tách chiết từ một số
dòng rễ tơ chuyển gen và khơng chuyển gen .................................................. 51
Hình 16. Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen
actin trong các dòng rễ tơ chuyển gen M: thang chuẩn DNA 1kb; 1 - 15: sản
phẩm RT-PCR các cây chuyển gen ................................................................. 52
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

7

Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

Hình 17. Điện di đồ kiểm tra sản phẩm RT-PCR xác định hoạt động của gen
......................................................................................................................... 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1. Diện tích, năng suất và sản lƣợng sắn của thế giới từ năm 2000-2012
......................................................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 2. Trình tự các cặp mồi sử dụng ............................................................ 32
Bảng 3. Kích thƣớc các phân đoạn thu đƣợc khi cắt plasmid tái tổ hợp
pK7GWG2D/SSIV bằng EcoRI ...................................................................... 41
Bảng 4: Kết quả chuyển gen tạo rễ tơ mang cấu trúc gen tăng cƣờng tổng hợp
tinh bột SSIV ở cây khoai lang ....................................................................... 53

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

8




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

STT

KÝ HIỆU

CHỮ VIẾT TẮT

1

A.tumefaciens

Agrobacterium tumefaciens

2

DNA

Acid Deoxiribonucleic

3

BA

6-benzyl adenine

4

bp

Base pair

5

cDNA

Complementary DNA

6

E.coli

Escherichia coli

7

EDTA

Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

8

Etal

Đồng tác giả

9

EtBr

Ethidium Bromid

10

GFP

Green Fluorescent Protein

11

HSPs

Heat shock proteins

12

Hyg

Hygromycine resistant

13

LB

Luria Bertani

14

M

Thang Marker chuẩn

15

mRNA

RNA thông tin

16

MT

Môi trường

17

MS

Murashige and Skoog, 1962

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

9




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

18

MT-sHSP

Mitochondrial small Heat shock protein

19

MUG

4-methyl-umBelliferyl-β -D-glucoronide

20

µl

Micro litte

21

µM

Micromolar

22

NAA

1-Naphthaleneacetic acid

23

PCR

Polymerase Chain Reaction

24

RT-PCR

Reverse transcription polymerase chain
reaction

25

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

26

SOD

Superoxide dismutase

27

SSIV

Starch synthase IV

28

T-DNA

Transfer-DNA

29

TAE

Tris-acetate –EDTA

30

Ti-plasmid

Tumor-Inducing Plasmid

31

TP

Transit peptide

32

Vir

Virulence

33

WT

Dịng khơng chuyển gen

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

10




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng
MỞ ĐẦU

1. Đặt vấn đề
Tinh bột là nguồn carbohydrate dự trữ chính của cây trồng, là hợp chất
cao phân tử có hàm lƣợng lớn trong tự nhiên và có ý nghĩa quan trọng đối với
đời sống nhân loại. Tinh bột là chất rắn khơng hồ tan, có cấu trúc dạng
polymer đƣợc tạo ra các monomer là glucose. Tùy thuộc vào dạng liên kết
của các phân tử glucose mà tạo thành dạng mạch thẳng amylose, hoặc dạng
mạch nhánh amylopectin. Tinh bột đƣợc tích lũy chủ yếu ở cơ quan củ của
thực vật: củ sắn, củ khoai tây, củ khoai lang, củ rong giềng …
Tinh bột có vai trò quan trọng trong đời sống, đây là nguồn cung cấp
cacbonhydrat hay năng lƣợng chính cho con ngƣời. Ngồi ra, tinh bột cịn
đƣợc ứng dụng rộng rãi trong cơng nghiệp nhƣ thực phẩm, dƣợc. Trung bình
trên thế giới sử dụng tới 60 triệu tấn tinh bột hàng năm bao gồm bột mỳ, bột

ngô, bột khoai tây, bột gạo, bột sắn, bột khoai lang. Hầu hết tinh bột đƣợc sử
dụng cho các ngành công nghiệp chế biến nhƣ: sử dụng làm chất nền cho quá
trình lên men của vi sinh vật (chủ yếu cho sản xuất mỳ chính), cơng nghiệp
dệt vải sợi, công nghiệp giấy và nhiều ngành công nghiệp khác.
Hàm lƣợng tinh bột, kích thƣớc hạt tinh bột và hàm lƣợng amylose là
những tính chất quan trọng của tinh bột có ảnh hƣởng nhiều đến các sản
phẩm trong các ngành cơng nghiệp thực phẩm (mì sợi, bánh bì và bánh
cookies) và phi thực phẩm (dệt, giấy, và dƣợc phẩm). Các tính chất này
quyết định độ nở của bột mì và tinh bột lúa mì, đó là các chỉ số quan trọng
liên quan đến các sản phẩm thực phẩm giàu tinh bột nhƣ mì sợi và mì ăn liền
(McCormick et al., 1991; Konik et al., 1993; Sasaki & Matsuki 1998; Dennett
et al., 2009; Salman et al., 2009). Đặc tính tinh bột chịu ảnh hƣởng của gen
cũng nhƣ môi trƣờng tăng trƣởng (Rharrabti et al., 2001; Kindred et al., 2008;
Weightman et al., 2008). Sự hiểu biến đổi của tính chất tinh bột đƣợc quyết
định bởi hai yếu tố là giống và điều kiện mơi trƣờng xung quanh. Cùng một
điều kiện, tính chất tinh bột có thể thay đổi ở các giống khác nhau. Tƣơng tự,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

11




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

cùng một giống trồng ở mơi trƣờng khác nhau tính chất tinh bột cũng thay
đổi, từ đó sẽ gây khó khăn cho các nhà dinh dƣỡng và nhà chế biến thực
phẩm trong việc dự đoán thành phần hóa học và q trình chế biến. Các

nghiên cứu về chọn lọc các giống cho hàm lƣợng tốt đã và đang đƣợc đẩy
mạnh nghiên cứu. Tuy nhiên, hầu hết chỉ dừng lại ở mức độ chọn lọc giống
cho chất lƣợng tinh bột tốt và ổn định. Các nghiên cứu sâu hơn về hoạt động
của gen liên quan đến các giống tại Việt Nam đang cịn ít và chƣa cụ thể.
Xuất phát từ thực tiễn đó, cùng với sự phát triển công nghệ và các nghiên cứu
lâu năm của Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, nhóm nghiên cứu tiến hành tập
trung đánh giá cụ thể hoạt động của gen Starch Synthase IV. Đây là một trong
5 gen quyết định lớn đến sinh tổng hợp và cấu trúc của tinh bột. Để có đƣợc
Starch Synthase IV cũng nhƣ đánh giá gen này chúng tôi tiến hành: “Nghiên
cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen SSIV mã hóa enzyme starch
synthase tăng cường sinh tổng hợp tinh bột”.
2. Mục đích nghiên cứu
Mục tiêu tổng quát: Nghiên cứu phân lập và thiết kế vector chuyển gen
SSIV mã hóa enzyme starch synthase, đồng thời bƣớc đầu đánh giá hoạt động
của gen này đến khả năng tăng cƣờng sinh tổng hợp tinh bột ở các dòng rễ tơ
khoai lang.
Mục tiêu cụ thể:
-

Phân lập và thiết kế vector mang gen SSIV phục vụ cho mục đich chuyển

gen vào cây khoai lang.
-

Tối ƣu hóa đƣợc quy trình chuyển gen thơng qua Agrobacterium

rhizogenes và tạo đƣợc các dòng rễ tơ.
-

Bƣớc đầu đánh giá khả năng hoạt động của gen trong các dòng rễ tơ khoai

lang ở mức độ phiên mã
3. Nội dung nghiên cứu
-

Nghiên cứu phân lập gen SSIV từ giống sắn KM140.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

12




Luận văn Thạc sỹ
-

Nguyễn Mậu Hưng

Thiết kế vector chuyển gen thực vật pK7WG2D mang gen SSIV bằng kỹ

thuật Gateway.
-

Tạo

chủng

Agrobacterium

rhizogenes

mang

cấu

trúc

vector

pK7WG2D/SSIV.
-

Tạo rễ tơ khoai lang chuyển gen và đánh giá hoạt động của gen SSIV

trong các dòng rễ tơ khoai lang ở mức độ phiên mã.
4. Ý nghĩa khoa học
Làm cơ sở cho việc đánh giá hoạt động của các gen chức năng liên quan đến
sinh tổng hợp tinh bột ở các cây lƣơng thực tại Việt Nam.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

13




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.

Tổng quan về tinh bột và sinh tổng hợp tinh bột

1.1.1. Giới thiệu về tinh bột
Tinh bột là một glucan không tan, đƣợc cấu thành từ hai chuỗi polymer
(amylopectin và amylase) đƣợc cấu thành từ các tiểu phần là glucose. Ở thực vật
bậc cao, tinh bột đƣợc tổng hợp trong plastid (thể lạp) của cả tế bào quang hợp
và không quang hợp. Là carbohydrate dự trữ chủ yếu, tinh bột đóng vai trị quan
trọng trong suốt chu kỳ sống của thực vật. Trong lá, một phần nhỏ carbon đồng
hóa thơng qua quang hợp đƣợc giữ lại trong các lục lạp ở dạng tinh bột chứ
không đƣợc chuyển đổi thành sucrose để vận chuyển đến các bộ phận khác.
Dạng tinh bột tạm thời này sẽ đƣợc phân hủy vào ban đêm để cung cấp cơ chất
cho q trình hơ hấp ở lá và tiếp tục tổng hợp sucrose cho việc phát triển khác
của cây(McMaugh et al. 2014) . Tinh bột, công thức hóa học: (C6H10O5)n) là
một polysacarit carbohydrate chứa hỗn hợp amyloza và amylopectin, tỷ lệ phần
trăm amilose và amilopectin thay đổi tùy thuộc vào từng loại tinh bột, tỷ lệ này
thƣờng từ 20:80 đến 30:70. Tinh bột có nguồn gốc từ các loại cây khác nhau có
tính chất vật lí và thành phần hóa học khác nhau. Chúng đều là các
polymer carbohydrat phức tạp của glucose (công thức phân tử là C6H12O6). Tinh
bột đƣợc thực vật tạo ra trong tự nhiên trong các quả, củ nhƣ: ngũ cốc. Tinh bột,
cùng với protein và chất béo là một thành phần quan trọng bậc nhất trong chế độ
dinh dƣỡng của loài ngƣời cũng nhƣ nhiều loài động vật khác. Ngoài sử dụng
làm thực phẩm ra, tinh bột cịn đƣợc dùng trong cơng nghiệp sản xuất
giấy, rƣợu, băng bó xƣơng. Tinh bột đƣợc tách ra từ hạt nhƣ ngơ và lúa mì, từ rễ
và củ nhƣ sắn, khoai tây, dong là những loại tinh bột chính dùng trong cơng
nghiệp (Evans et al. 2000).
Tinh bột lƣu trữ đƣợc tái sử dụng để hỗ trợ giai đoạn phát triển khác của
cây. Các bộ phận thu hoạch của cây trồng chủ lực của loài ngƣời phần lớn là cơ

quan lƣu trữ tinh bột ở thực vật. Có thể kể đến nhóm hạt ngũ cốc (gạo, ngơ, lúa
mì, lúa mạch, lúa miến…) là nhóm quan trọng nhất, tiếp theo là các loại củ than
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

14




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

(khoai tây, khoai lang, khoai mỡ) và rễ củ (sắn, khoai môn), và hạt cây họ đậu.
Hầu hết tinh bột của cây trồng đều dùng trực tiếp làm thực phẩm hoặc thức ăn
cho chăn nuôi. Tuy nhiên nhu cầu dùng tinh bột cho công nghiệp đang ngày một
tăng lên. Đặc biệt tinh bột đang là nguồn vật liệu chủ yếu cho thế hệ nguyên liệu
sinh học đầu tiên do đặc tính dễ lên men.

Cấu trúc phân tử amylopectin

Cấu trúc phân tử amylose

Hình 1. Cấu trúc phân tử của amylopectin và amylose
1.1.2. Cấu trúc của tinh bột
Tinh bột đƣợc cấu tạo bởi 2 loại polysaccharid đƣợc gọi là amylose và
amylopectin.
Amylose: phân tử amylose là một chuỗi hiện nay đƣợc biết đến hàng
nghìn đơn vị β-D-glucose nối với nhau theo dây nối (1→ 4). Quan niệm trƣớc
đây cho rằng chỉ có từ 200-400 đơn vị vì do q trình chiết xuất và phân tích,

mạch bị đứt. Phân tử amylose đa số là các chuỗi thẳng rất ít phân nhánh.
Amylopectin: amylopectin có phân tử lƣợng lớn hơn khoảng 106-107 gồm
5000-50.000 đơn vị glucose và phân nhánh nhiều. Các đơn vị α-D-glucose trong
mạch cũng nối với nhau theo dây nối (1→ 4) cịn chỗ phân nhánh thì theo dây
nối (1→ 6). Để xét mức độ phân nhánh, ngƣời ta methyl hóa tồn bộ các nhóm
OH của amylopectin rồi sau đó thủy phân và suy ra từ lƣợng 2, 3
dimethylglucose. Lƣợng 2, 3, 4, 6 tetramethylglucose ứng với những đơn vị tận
cùng của mạch còn lƣợng 2, 3, 6 trimethylglucose ứng với những đơn vị glucose
trong mạch (Evans et al. 2000).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

15




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

Ngồi ra cịn có thể xác định lƣợng glucose cuối mạch dựa vào tính khử
của amylopectin khơng methyl hóa. Chú ý rằng ở đây là glucose ở cuối mạch có
OH bán acetal tự do. Mạch bên trong (mạch giữa 2 điểm phân nhánh) của
amylopectin có khoảng 5-9 đơn vị glucose, những mạch bên ngồi có từ 10-18
đơn vị. Trong các loại tinh bột, trung bình tỉ lệ amylose là 25% còn amylopectin
là 75%. Tuy nhiên ngƣời ta cũng tạo ra đƣợc những chủng có nhiều amylose, ví
dụ ngơ, có tinh bột chứa 75% amylose.
Amylose cho với thuốc thử iod màu xanh đậm có cực đại phổ hấp thu
khoảng 660nm, cịn amylopectin thì có màu tím đỏ và cực đại hấp thụ khoảng

540nm. Màu tạo thành giữa tinh bột và iod đƣợc giải thích do sự hấp phụ. Ngƣời
ta cho rằng iod bị hấp phụ vào phía trong hình xoắn ốc. Ứng với một vịng xoắn
ốc thì có 1 phân tử iod. Những phân tử chƣa đủ 6 đơn vị glucose thì khơng phản
ứng với iod(Mason-Gamer, Weil, and Kellogg 1998).
1.1.3. SỰ THỦY PHÂN TINH BỘT
Khi thủy phân tinh bột bằng acid thì sản phẩm cuối cùng là glucose
C6H12O6 (C6H10O5)n + nH2O -> (1+n) (C6H12O6)
Sự thủy phân qua các chặng: dextrin, erythrodextrin, achrodextrin,
maltose, glucose. Amylose dễ bị thủy phân hơn amylopectin vì dây nối (1-> 4)
dễ bị cắt hơn là dây nối (1-> 6).
Thủy phân bằng enzym
Enzym amylase. Có 2 loại chính: a-amylase và β-amylase. Enzym a phổ
biến trong cây, nhiều nhất là các hạt ngũ cốc nẩy mầm, ngồi ra cịn có trong
nấm mốc, nƣớc bọt, dịch tụy. a-amylase chịu đƣợc nhiệt độ đến 70o, ở nhiệt độ
này thì các enzym khác mất hoạt tính. Enzymβ-amylase có trong khoai lang, đậu
nành và một số hạt ngũ cốc, chịu đƣợc nhiệt độ đến 50onhƣng chịu đƣợc môi
trƣờng acid cao hơn so với enzym a (pH = 3,3). Trong thực tế ngƣời ta dựa vào
ảnh hƣởng khác nhau đó về độ pH và nhiệt độ để tách 2 loại enzym trên.
a) Enzym β cắt xen kẽ những dây nối α-(1->4)-glucosid của amylose để
tạo thành các đƣờng maltose, kết quả thu đƣợc là 100% đƣờng maltose. Đối với
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

16




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

amylopectin thì b-amylase chỉ cắt đƣợc các dây nối (1->4), khi gặp mạch nhánh
thì dừng lại, kết quả tạo thành maltose và dextrin, lƣợng maltose chỉ đạt từ 5060%.
b) Enzym α cắt một cách ngẫu nhiên vào dây nối (1->4). Đối với amylose
thì sản phẩm cuối cùng khoảng 90% là maltose ngồi ra có một ít là glucose.
Đối với amylopectin thì α-amylase cũng chỉ tác động đến dây nối (1->4) mà
không cắt đƣợc dây nối(1->6) vì thực tế ngƣời ta tìm thấy các phân tử
isomaltose (= 6-O-α-D-gluco-pyranosyl-D-glucopyranose) trong dịch thủy phân.
Enzym α-amylase tiếp tục cắt đƣợc những dextrin mà enzym b để lại để tạo
thành các dextrin phân tử bé hơn. Nhƣ vậy α-amylase tác dụng lên tinh bột thì
sản phẩm thu đƣợc chủ yếu là maltose rồi đến glucose và dextrin phân tử bé.
Tinh bột nguồn gốc khác nhau, enzym nguồn gốc khác nhau thì khả năng thủy
phân cũng khác nhau.
1.1.4. HÌNH DẠNG TINH BỘT
Tinh bột tồn tại trong cây dƣới dạng hạt có hình dạng và kích thƣớc khác
nhau, đây là một đặc điểm giúp ích cho việc kiểm nghiệm một dƣợc liệu chứa
tinh bột. Tùy theo loài cây và tùy theo độ trƣởng thành của cây mà hình dáng và
kích thƣớc thay đổi. Về hình dáng thì có thể hình cầu, hình trứng, hình nhiều
góc ... kích thƣớc có thể từ 1-100mm đƣờng kính. Soi kính hiển vi thƣờng thấy
hạt tinh bột cấu tạo bởi nhiều lớp đồng tâm sắp xếp chung quanh một điểm gọi
là rốn hạt. Các lớp này tạo nên là do hạt tinh bột lớn dần bằng cách tăng thêm
các lớp ở phía ngồi. Các lớp này khác nhau ở chỉ số chiết quang và hàm lƣợng
nƣớc. Có tác giả cho rằng các lớp khác nhau đó là do những lớp đƣợc tăng thêm
về ban đêm và những lớp tăng thêm về ban ngày nên khơng hồn tồn giống
nhau.
1.1.5. Các loại hạt tinh bột hay gặp
Hạt hình trứng và hình thận: Tinh bột khoai tây chế từ củ cây khoai tây
- Solanum tuberosumL. , thuộc họ Cà - Solanaceae. Hạt tinh bột hình trứng, rốn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

17




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

hạt ở đầu hẹp, các vân đồng tâm dễ nhận. Thỉnh thoảng có hạt kép 2 hoặc 3.
Kích thƣớc trung bình 50mm nhƣng có hạt lớn đến 80-100mm.
Tinh bột hoàng tinh chế từ củ cây dong - Maranta arundinacea L. ,
thuộc họ dong - Marantaceae, (đừng nhầm với cây hồng tinh - Polygonatum
sp.). Hạt hình trứng kích thƣớc 30-60mm.
Tinh bột sen, chế từ hạt cây sen - Nelumbo nucifera Gaertn., họ Sen Nelumbonaceae. Hạt tinh bột hình trứng hay hình thận, rốn hạt hình vạch kích
thƣớc hạt từ 3-25mm.
Tinh bột sắn (= khoai mì) chế từ cây sắn (= khoai mì) - Manihot
esculenta Crantz; họ Thầu Dầu- Euphorbiaceae. Hạt hình cầu phần lớn một đầu
bị lẹm và hơi lõm trông nhƣ cái chuông. Rốn hạt hình sao, kích thƣớc 3-35mm.
Tinh bột đậu, chế từ hạt của nhiều loại đậu - Phaseolus spp.; họ Đậu Fabaceae. Hạt hình trứng hay hình thận. Rốn hạt dài và phân nhánh, kích thƣớc
trung bình 35mm.
Tinh bột hồi sơn, chế từ củ của cây củ mài - Dioscorea persimilis Prain
và Burkill, họ Củ nâu - Dioscoreaceae. Hạt hình trứng hay hình thận. Rốn hạt
dài, kích thƣớc trung bình 40mm.
Hạt hình đĩa hay hình thấu kính dẹt: Tinh bột mì chế từ hạt của cây lúa
mì - Triticum vulgareL., họ Lúa - Poaceae, kích thƣớc hạt lớn đến 30mm, hạt bé
6-7mm. Tùy theo vị trí nhìn mà thấy hình trịn hoặc hình thấu kính lồi 2 mặt.
Rốn hạt là 1 điểm ở giữa hạt, khơng rõ.
Hạt hình nhiều góc: Tinh bột gạo chế từ hạt cây lúa - Oriza sativa L.,
họ Lúa - Poaceae. Hạt nhiều góc, nhỏ, kích thƣớc từ 4-6mm, thƣờng đƣợc kết

thành đám. Rốn hạt không rõ.
Tinh bột ngô (= bắp), chế từ hạt cây ngô - Zea mays L. ; họ Lúa Poaceae. Hạt nhiều góc, rốn hạt ở giữa rất rõ, kích thƣớc 15-30mm.
1.1.6. Cơ chế sinh tổng hợp tinh bột và các gen liên quan
Quá trình tổng hợp tinh bột α-1,4 glucan bao gồm ba bƣớc quan trọng xảy
ra trong lục lạp và thể vô sắc: i) cung cấp glucose-6-phosphate (Glc-6-P) vào
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

18




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

trong các thể lạp, ii) tổng hợp ADP-glucose (ADPG) từ Glc-1-P, và iii) tổng hợp
tinh bột từ ADPG (Zeeman, Kossmann, and Smith 2010). Nói một cách ngắn
gọn, bƣớc đầu tiên không thể thiếu đƣợc là sự tổng hợp ADPG từ Glc-1-P và
ATP đƣợc xúc tác bởi ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase). Một khi
đƣợc hoạt hóa, starch synthase (SS) chuyển ADPG tới đầu không khử của α-1,4
glucan để tạo thành các sợi α-1,4 glucan. Tiếp theo, các sợi α-1,4 glucan đƣợc
dùng nhƣ là các cơ chất cho các enzyme phân nhánh của tinh bột (BE hoặc Qenzyme) tạo ra các liên kết sợi α-1,6 là amylopectin. Cuối cùng amylopectin
đƣợc tinh thể hóa tạo thành tinh bột dƣới tác động của các enzyme phân rã
(DPE), phosphorylase (P-enzyme) và glucanotransferase (D-enzyme). Ngoài ra,
UDP-glucose: protein glucosyltransferase hoặc amylogenin (38 hoặc 45 kDa)
cũng đƣợc dự đoán tham gia vào bƣớc đầu tiên trong quá trình tổng hợp tinh bột
(Zeeman, Kossmann, and Smith 2010), (Egli et al. 2010).

Hình 2. Quá trình sinh tổng hợp tinh bột và các enzyme liên quan

Các starch synthase (SS) của thực vật bậc cao mã hóa bởi 5 nhóm gen ký
hiệu là GBSS (granule-bound starch synthase), SSI, SSII, SSIII, và SSIV. GBSS
gắn chặt với hạt tinh bột và chịu trách nhiệm tổng họp amylose. Các biến thể
khác nhau của SS (thƣờng gọi là SS hòa tan) tạo ra các chuỗi amylopectin (1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

19




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

dạng tinh bột đã polyme hóa) có thể tan hoặc trong các plastic hoặc một phần
hòa tan một phần gắn với hạt tinh bột. Số liệu di truyền và sinh hóa chỉ ra rằng
mỗi biến thể enzyme SS có các cấu thành khác nhau và vai trị nhất định trong
tổng hợp amylopectin. Phân tích việc phân phối chiều dài chuỗi amylopectin
trong các cây đột biến và cây chuyển gen mất các biến thể enzyme SS đặc trƣng
đã dẫn tới kết luận rằng nhóm SSI, SSII, và SSIII đóng vai trị trong việc kéo dài
các chuỗi ngắn, trung bình và dài tƣơng ứng.
Việc phân nhánh của amylopectin xảy ra đồng thời với quá trình kéo dài
chuỗi. Quá trình phân nhánh đƣợc xúc tác bởi enzyme phân nhánh (BE).
Enzyme này cắt chuỗi α-l,4-glucan sẵn có và chuyển đoạn cắt mang 6 đơn vị
glucose hoặc nhiều hơn tới vi trí C6 của gốc glucosyl ở chuỗi glucan khác. BE
của thực vật bậc cao bao gồm hai nhóm I và II. Nhóm I vận chuyển các chuỗi
dài hơn. Phân tích di truyền chỉ ra rằng hai nhóm BE có vai trò đặc biệt trong
tổng hợp amylopectin.
Bên cạnh SS và BE cịn có các enzyme khác nhau tham gia vào quá trình

sinh tổng hợp tinh bột. Các enzyme khừ phân nhánh - (debranching enzymes,
DBE) làm mất các điểm phân nhánh và quan trọng trong việc quyết định cấu
trúc của amylopectin. Thực vật có hai loại DBE— isoamylase (ISA) và
limitdextrinase (LDA, hay còn gọi là pullulanase). Hai loại này khác nhau bởi
trình tự amino acid và cơ chất. ISA có 3 nhóm - ISA1, ISA2, và ISA3. ISA1 và
ISA2 liên quan chặt với tổng hợp amylopectin. Vai trò cơ bản của LDA và ISA3
là phân hủy tinh bột. ISA1 hoạt động mạnh nhất khi cơ chất là các chuỗi glucan
tƣơng đối dài nhƣ là các amylopectin bị hòa tan, trong khi đấy LDA và ISA3 có
hoạt tính cao với các chuỗi glucan ngắn nhƣ β-limit dextrins. ISA2 dƣờng nhƣ
khơng có hoạt tính xúc tác mà tác dụng điều tiết hoặc ổn định ISA1 chứ khơng
tham gia trực tiếp vào q trình hủy phân nhánh. Trong các cây đột biến hoặc
chuyển gen thiếu hụt ISA1, tinh bột dạng hạt bị giảm, thậm chí khơng có và thay
thế một phần bởi các glucan tan trong nƣớc. Hiện tƣợng này quan sát đƣợc ở
một số thực vật, ví dụ nhƣ ở nội nhũ non của ngũ cốc, lá Arabidopsis và củ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

20




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

khoai tây. Trong Arabidopsis và khoai tây việc mất hoạt tính ISA2 có ảnh hƣởng
giống nhƣ mất hoạt tính của ISA1 (McMaugh et al. 2014). Đột biến thiếu hoạt
tính DBE (tức là đột biến đồng thời 4 gen: isal, isa2, isa3, Ida) không phát hiện
đƣợc các hạt tinh bột. Kết quả này hoàn toàn đồng nhất với ý kiến cho rằng hoạt
tính DBE là cần thiết cho việc sinh tổng hợp tinh bột. Tuy nhiên các phân tích

sâu hơn về sinh hóa và di truyền chỉ ra rằng việc mất hoàn toàn tinh bột trong
đột biến này là kết quả của việc thay đổi và mất các glucan đƣợc phân nhánh
nhờ các enzyme phân hủy tinh bột chứ khơng phải việc mất hoạt tính DBE
(Wattebled et al. 2008). Mặc dù có những phát hiện mới trong việc xác định các
enzyme tổng hợp amylopectin synthesis, những vẫn chƣa thể có những hiểu biết
một cách chính xác cấu trúc SS và BE nào đƣợc tạo ra, làm thể nào DBE có thể
khử phân nhánh một cách chọn lọc, hoạt động nào của 3 enzyme này đƣợc phối
hợp nhƣ thế nào để tạo thành một phân tử amylopectin có khả năng tử hình
thành hạt tinh bột. Để giải quyết vấn đề này đòi hỏi phát triển về kỹ thuật trong
phƣơng pháp phân tích và phân tử.
Thành phần amylose của tinh bột đƣợc tổng hợp bởi GBSS. Các cây đột
biến và chuyển gen thiếu enzyme này là cẩn thiết đế tạo ra cây khơng có
amylose. Các hạt tinh bột khơng có amylose vẫn có hình thái bình thƣờng, điều
đó chứng tỏ rằng amylopectin là cần thiết cho việc hình thành hạt. GBSS khác
các biến thể khác nhau của enzyme SS ở chỗ vị trí đặc biệt đối với các hạt và
kiểu phản ứng. Không giống các biến the synthase của tinh bột, GBSS chuyển
các gốc glucosyl từ thực vật bậc cao.
1.1.7. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học nhằm cải biến quá trình
trao đổi tinh bột.
Cho đến nay những cố gắng nhàm tăng khả năng tích lũy tinh bột tập
trung vào việc tăng hoạt tính ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) trong
cây. Đây là enyme cung cấp cơ chất cho SS. Một loạt đột biến của gene AGPase
Escherichia coli (glgC16) mã hóa cho các dạng điều khiển khác nhau của
enzyme này đã đƣợc dùng để biểu hiện mạnh trong cây. Khi glgC16 đƣợc biểu
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

21

Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

hiện ở plastid của cây khoai tây chuyển gen, một vài dịng đã có khả năng tích
luỹ tinh bột cao hơn dịng khơng chuyển gen là 60%. Tuy nhiên với các cây
khác nhƣ sắn, ngô và các lồi khác việc tăng tinh bột khơng đạt đƣợc mức nhƣ
vậy. Vì thế việc biến đổi một mình AGPase có thể khơng có đạt đƣợc kết quả
mong muốn tăng tinh bột trong các cơ quan dự trữ. Ngoài ra, có một số bằng
chứng về việc tăng nguồn cung cấp ATP cho các plastid có thể kích thích việc
tạo ra ADP-glucose và dẫn đến việc tăng tốc độ sinh tổng hợp tinh bột. Biểu
hiện mạnh yếu tố dẫn truyền adenylate ở vỏ plastid của Arabidopsis trong khoai
tây làm tăng ADP-glucose lên 2 lần và hàm lƣợng tinh bột tăng lên từ 16-36%
so với đối chứng. Khi kìm hãm adenylate kinase của plastic (enzyme chuyển hóa
hai chiều 2 phân từ ADP thành ATP và AMP) làm ADP-glucose tăng lên 10 lần
và tinh bột tăng lên gấp đôi trong củ khoai tây cả ở trong nhà kính và ngồi đồng
ruộng (Ballicora, Iglesias, and Preiss 2003)
Tăng khả năng phân hủy tinh bột lại có tác dụng đối với cây trồng cung
cấp nguyên liệu sản xuất ethanol. Biểu hiện α-amylase chịu nhiệt trong cây ngô
đã đƣợc ứng dụng để tạo ra cây tự chế biến, giảm giá thành biến đổi từ tinh bột
sang ethanol. Amylase đƣợc biểu hiện trong gian bào nên không tham gia vào
sinh tổng hợp tinh bột hay dự trữ vì thế việc có mặt của nó khơng ảnh hƣởng
đến việc tích tụ tinh bột trong q trình phát triển của cây. Khi hạt xay ra đƣợc
làm nóng trong nƣớc để dính hóa tinh bột thì amylase chịu nhiệt sẽ bắt đầu
chuyển đổi tinh bột thành dạng có thể lên men (Zeeman, Kossmann, and Smith
2010).
1.2.

Cây sắn và tình hình sản xuất cây sắn trên thế giới và Việt Nam

Sắn (Manihot esculenta Crantz) là cây lƣơng thực hàng năm. Củ sắn có tỷ lệ

chất khơ 38 - 40%, tinh bột 16 - 32%, giàu vitamin C, calcium, vitamin B và các
chất khoáng, nghèo chất béo, muối khoáng, vitamin và nghèo đạm.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

22




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

Hình 3. Cây Sắn
Cây sắn hiện đƣợc trồng trên 100 nƣớc có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới
thuộc ba châu lục: châu Á, châu Phi và châu Mỹ La tinh (Hình 3). Sắn đƣợc
trồng chủ yếu ở các hộ nông dân nhỏ. Sắn đƣợc sử dụng với nhiều mục đích đa
dạng tùy vùng khác nhau trên thế giới. Ở Châu Á và Châu Mỹ Latinh, củ sắn
cung cấp nguyên liệu thô cho chế biến thức ăn cho gia súc và làm tinh bột ở quy
mô nhỏ và lớn. Hiện nay, mặc dù đƣợc trồng bởi các hộ nông dân nhỏ, tại các
vùng đất khó trồng trọt nhất, các sản phẩm từ sắn đang đƣợc chuyển đổi nhanh
chóng từ sản phẩm mang tính truyền thống thành mặt hàng có tính thƣơng mại.
Ở Đơng Nam Á, hầu hết sắn thu hoạch đƣợc bán cho các mục đích cơng nghiệp
trong nƣớc và xuất khẩu (Hồng Kim và Phạm Văn Biên (1996).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

23




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

Tình hình nghiên cứu chọn tạo và phát triển giống sắn tại Việt Nam
Hầu hết những nghiên cứu đối với cây sắn hiện nay tập trung chủ yếu vào
việc chọn tạo các giống sắn có năng suất cao, thời gian sinh trƣởng ngắn thông
qua các phƣơng pháp lai tạo truyền thống. Một trong những yếu tố chính góp
phần hiệu quả trong việc nâng cao năng suất và sản lƣợng sắn là sự tăng cƣờng
nghiên cứu, nhập nội, lai tạo, ứng dụng công nghệ mới trong việc chọn tạo và
nhân giống sắn lai (Hoàng Kim et al., 2001). Trƣớc năm 1990, Gòn, H34 và
Xanh Vĩnh Phú là những giống sắn phổ biến ở Việt Nam. Từ năm 1986 đến năm
1993, Trung tâm Hƣng Lộc đã thu thập và tuyển chọn đƣợc 3 giống sắn mới là
HL20, HL23 và HL24 đƣợc canh tác mỗi năm ở các tỉnh phía Nam khoảng 70
000 – 80 000 ha (Hồng Kim et al., 1990). Giai đoạn 1991-2005, Viện Khoa học
Kỹ thuật Nơng nghiệp miền Nam phối hợp với Chƣơng trình sắn Việt Nam,
Trung tâm Quốc tế Nông nghiệp Nhiệt đới (CIAT) đã nhập nội, tuyển chọn và
giới thiệu cho sản xuất 5 giống sắn tốt: KM60, KM94, KM95, SM937-26,
KM98-1 (Hoàng Kim et al., 2008; 2010). Tổng diện tích các giống sắn mới ở
Việt Nam năm 2005 ƣớc tính đạt 270.000 ha, chiếm 69,2% tổng diện tích sắn
của cả nƣớc. Năm 2007, giống sắn lai KM140 đƣợc phát triển bởi các nhà khoa
học tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam. Ƣu điểm của giống
KM140 là thời gian sinh trƣởng ngắn 7-10 tháng, năng suất bột tƣơng đƣơng
KM94 (tỷ lệ tinh bột trong củ là ~ 28%), dạng củ đẹp, thịt củ màu trắng, ít đắng,
dạng cây thẳng (Trần Cơng Khanh et al. 2007, 2008). Ngồi ra, ƣu điểm của các

giống sắn ở Việt Nam là hầu nhƣ không nhiễm các bệnh virus thông thƣờng ở
cây sắn nhƣ virus bệnh khảm sắn, tuy nhiên hiện nay một số vùng trồng sắn đã
có hiện tƣợng sắn nhiễm bệnh chổi rồng có khả năng do nấm gây ra.
Mặc dù những phƣơng pháp lai tạo truyền thống và việc áp dụng chỉ thị
phân tử đã thành công trong việc tạo ra những giống sắn mới có phẩm chất cao
hơn, tuy nhiên trong thực tiễn sản xuất các phƣơng pháp lai tạo truyền thống vẫn
cịn tồn tại những vấn đề khó giải quyết đối với việc phát triển và cải tạo cây sắn
theo hƣớng mong muốn . Không giống những cây trồng chủ yếu khác trên thế
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

24




Luận văn Thạc sỹ

Nguyễn Mậu Hưng

giới, sắn đặc biệt không thể cải tạo về mặt di truyền qua lai hữu tính. Nhiều
giống sắn hiếm khi ra hoa và năng suất hạt thƣờng rất là thấp. Sắn thƣờng đƣợc
nhân lên bằng sinh sản sinh dƣỡng dựa vào các đoạn thân. Đặc điểm tự nhiên
này gây hạn chế về mặt lai tạo nhƣng đem lại thuận lợi đối với việc sử dụng sinh
học phân tử để cải tạo giống, vì mỗi cây đều đƣợc nhân lên từ một dòng, phân ly
hoặc di chuyển của gen qua lại giữa các loài là rất hạn chế. Chính vì vậy mà áp
dụng những tiến bộ của công nghệ gen đối với cây sắn trở nên cần thiết và là
một trong những yêu cầu mà thực tiễn sản xuất địi hỏi. Cơng nghệ gen có thể
tạo ra những giống sắn mới mang những tính trạng mong đợi. Thêm vào đó
cơng nghệ này có thể chuyển những tính trạng tốt từ các giống sắn dại vào giống
sắn đang canh tác mà điều này thƣờng gặp trở ngại rất lớn do các yếu tố về di

truyền khi sử dụng phƣơng pháp lai truyền thống. Hơn nữa với công nghệ này
các nhà khoa học có thể đƣa vào cây sắn những nguyên liệu di truyền (gen) từ
bên ngoài giúp cải thiện tính kháng của cây chủ với các yếu tố gây bệnh nhƣ
virus, vi khuẩn… .
-

Trong kế hoạch 5 năm 2011-2015, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn

đƣa ra chủ trƣơng giảm diện tích trồng sắn và nâng cao năng suất trồng sắn. Kế
hoạch đề ra là diện tích trồng sắn duy trì ổn định khoảng 500.000 ha, năng suất
đạt khoảng 178 tạ/ha. Nếu đạt đƣợc theo kế hoạch thì với mức sản lƣợng 8,9
triệu tấn vẫn sẽ xảy ra tình trạng tranh mua nguyên liệu giữa các nhà máy sản
xuất ethanol với các nhà máy thức ăn chăn nuôi, nhà máy sản xuất tinh bột sắn
và lƣợng sắn dùng cho xuất khẩu. Nhƣ vậy, ứng dụng công nghệ sinh học nhằm
cải tạo cây sắn theo hƣớng các tính trạng có lợi nhƣ năng suất cao, chất lƣợng
phù hợp mục đích sử dụng nhằm phục vụ cơng nghiệp và xuất khẩu là một vấn
đề cấp thiết ở nƣớc ta.
-

Phần lớn các nghiên cứu về sắn ở Việt Nam trong thời gian gần đây chủ yếu

sử dụng các phƣơng pháp truyền thống để chọn tạo, lai tạo giống sắn mới từ các
giống nhập nội và giống địa phƣơng nhằm cải tiến năng suất. Ứng dụng công
nghệ sinh học hiện đại trong nghiên cứu về sắn đang ở giai đoạn khởi đầu và sử
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – ĐHTN

25