Luận văn tốt nghiệp nghiên cứu sản xuất enzyme celllulase từ nấm mốc - Chương 2

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN
3
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1 Cấu tạo và tính chất của ligno-cellulose
Trong tự nhiên phế liệu chứa ligno-cellulose là nguồn chất hữu cơ thay thế
được tạo ra trong quá trình quang hóa ở thực vật. Trong công nghiệp nó được tạo ra
trong quá trình sản xuất gỗ, giấy và bột giấy. Ligno-cellulose chiếm khoảng 60% toàn
bộ phế liệu từ gỗ được sản xuất trên trái đất.
Ligno-cellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó để phân cắt. Tuy nhiên
nó là nguồn giàu carbon và năng lượng hóa học, do đó việc tận dụng nguồn phế liệu
ligno-cellulose là vấn đề rất cần thiết để duy trì vòng tuần hoàn carbon toàn cầu. Về
mặt hóa học, chúng gồm 2 polymer mạch thẳng cellulose và hemicellulose và một
polymer có cấu trúc 3 chiều lignin. Cellulose được bao quanh bởi phân tử
hemicellulose và lignin.
Hình 2.1– Cấu trúc của ligno-cellulose
4
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1.1 Cellulose [2]
Cellulose là polysaccharide chủ yếu của thành tế bào thực vật. Trong bông nó
chiếm trên 90%, còn trong gỗ hơn 50%. Ngoài ra, người ta còn thấy chúng có nhiều ở
tế bào một số loài VSV. tế bào thực vật và ở tế bào một số loài VSV, chúng tồn tại
ở dạng sợi. Khi đun sôi với acid sulfuric đặc, cellulose sẽ chuyển thành glucose còn
khi thủy phân trong điều kiện nhẹ nhàng sẽ tạo thành disacarit cellobiose.
Cellulose không có trong tế bào động vật. Chúng là một homopolimer mạch
thẳng, được cấu tạo bởi các β-D-glucose-pyranose. Các thành phần này liên kết với
nhau bởi liên kết β-1,4 glucoside. Tinh bột cũng được cấu tạo bởi các glucose này và
bằng liên kết α-1,4 glucoside. Điểm khác biệt là tinh bột chứa các gốc glucose phân
nhánh còn cellulose chứa các glucose không phân nhánh. Các gốc glucose trong
cellulose thường lệch một góc 180
0
và có dạng như một chiếc ghế bành. Cellulose

thường chứa 10.000-14.000 gốc đường và được cấu tạo như sau:
Đầu không khử Đầu khử
Hình 2.2- Cấu tạo phân tử cellulose.
Trọng lượng phân tử của cellulose khoảng từ 50000-2500000 Dalton. Các phân
tử cellulose kết hợp với nhau nhờ lực hút Van der war và liên kết hydro.
Các phân tử cellulose tạo nên sợi sơ cấp có đường kính khoảng 3nm. Các sợi sơ
cấp kết hợp với nhau tạo thành vi sợi. Trong điều kiện tự nhiên, các vi sợi thường
không đồng nhất, chúng thường tồn tại 2 vùng:
- Vùng kết tinh: các mạch cellulose kết với nhau theo một trật tự đều đặn nhờ
liên kết hydro nối nhóm hydroxyl thứ nhất của mạch này với nhóm hydroxyl
ở mạch cacbon của mạch khác. û vùng này cellulose rất bền vững dưới tác
5
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
động của điều kiện bên ngoài. Enzym cellulase chỉ có tác dụng ở bề mặt hệ
sợi ở vùng này.
- Vùng vô đònh hình: các mạch liên kết với nhau nhờ lực Vander Waals. Ở
vùng này cellulose có cấu trúc không chặt và dễ bò tác động bởi các yếu tố
bên ngoài. Khi gặp nước, chúng dễ bò trương phồng lên, enzym cellulase rất
dễ tác động, làm thay đổi toàn bộ cấu trúc của chúng.
Chiều dài phân tử cellulose trong vùng vô đònh hình thường lớn gấp hàng chục
lần so với chiều dài của phân tử cellulose kết tinh. Các cây gỗ lâu năm thường chứa
lượng cellulose kết tinh nhiều, các cây thảo mộc ngược lại, chứa nhiều cellulose vô
đònh hình.
Trong phân tử cellulose có nhiều liên kết hydroxyl tồn tại dưới dạng tự do,
hydrogen của chúng dễ bò thay thế bởi một số gốc hoá học như metyl hoặc gốc acetyl
tạo nên các dẫn xuất ete hoặc este của cellulose. Một trong những dẫn xuất được ứng
dụng rất nhiều là CMC, trong đó một số nhóm hydroxyl của cellulose được thay thế
bằng gốc –OCH
2
COOH.

Hình 2.3–Cấu trúc của CMC
Trong thiên nhiên, khi thực vật và VSV có chứa cellulose bò chết, cellulose của
chúng chỉ bò phân hủy bởi cả một tập đoàn VSV. Các loài VSV sẽ thay phiên nhau
phân hủy cellulose để tạo ra mùn và từ đó các thành phần cấu tạo của cellulose lại
được đi vào các con đường chuyển hóa trong chu trình chuyển hóa vô tận của thiên
nhiên.
6
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
Trong thực vật, cellulose thường tồn tại một lượng rất lớn. Số lượng cellulose
thường không đều ở các cơ quan khác nhau trong thực vật. Người ta thấy rằng, lượng
cellulose ít nhất ở lá và nhiều nhất ở thân cây, đặc biệt ở sợi bông, cellulose có thể
chiếm đến 80-90%.
VSV cấu trúc của cellulose không bền và không theo một trật tự như ở thực
vật. đó, cellulose thường thuộc loại vô đònh hình. Chính vì thế việc phân hủy chúng
thường rất dễ thực hiện.
2.1.2 Hemicellulose [1]
Hemicellulose là polysaccharide có phân tử lượng nhỏ hơn phân tử lượng của
cellulose rất nhiều. Chúng thường được cấu tạo từ 150 gốc đường. Các gốc đường này
được nối với nhau bằng các liên kết β-1,4; β-1,3; β-1,6 glucoside. Chúng thường là
những mạch ngắn, phân nhánh. Cấu trúc của hemicellulose không bền, chúng không
hòa tan trong nước nhưng dễ dàng bò phân giải bởi acid loãng hoặc kiềm.
Hemicellulose cũng là thành phần của tế bào thực vật và tồn tại chủ yếu ở các
phần như: vỏ hạt, bẹ ngô, cám, rơm rạ, trấu. Khi thủy phân hemicellulose sẽ thu được
các monosaccharide thuộc nhóm hexose như manose, galactose, nhóm pentose như
arabinose, xilose. Tùy theo trong thành phần của hemicellulose có chứa
monosaccharide nào mà nó sẽ có những tên tương ứng như mannan, galactan, và
pentozan. Các polysaccharide như mannan, galactan, araban và xilan đều là các chất
phổ biến trong thực vật, chủ yếu ở các thành phần của màng tế bào của các cơ quan
khác nhau như: gỗ, rơm rạ,…
Trong thiên nhiên, loại hemicellulose dễ gặp nhất là xylan. Xylan thường thấy

nhiều trong rơm, rạ (chiếm khoảng 30%), cây lá rộng (chiếm khoảng 20-25%).
những cây lá kim thường chứa ít xylan.
2.1.3 Lignin [21]
Lignin là một hợp chất cao phân tử, chúng có nhiều ở thực vật bậc cao. cây
gỗ, lignin chiếm tới 20-30%. Trong thành phần của lignin, carbon chiếm tới 69%,
hydro chiếm 7% và oxy chiếm 24%
7
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
Lignin có cấu tạo vô đònh hình, không tan trong nước và trong acid vô cơ. Dưới
tác dụng của bisulfite natri và H
2
SO
4
lignin bò phân giải tạo ra các hợp chất thơm.
Trong thực vật chúng như chất ximang liên kết các tế bào lại với nhau, làm tăng độ
bền cơ học cho tế bào, tăng khả năng chống thấm nước, ngăn chặn các độc tố, các
VSV từ bên ngoài.
Trong suốt quá trình phát triển của thực vật, lignin được tạo ra, không bò biến
đổi sinh lý. Chúng có cấu tạo rất phức tạp, tạo thành từ sự ngưng tụ của các loại rượu
khác nhau.
8
CHệễNG 2: TONG QUAN
Hỡnh 2.4Caỏu taùo phaõn tửỷ lignin
2.2 Enzym cellulase [1,2,4,23]
2.2.1Phaõn loaùi enzym cellulase [4]
9
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
Tên gọi cellulase dùng để chỉ chung cho các enzym tham gia phân cắt hợp chất
cellulose. Tất cả các enzym cellulase đều có tác dụng phân cắt liên kết β-1,4 giữa 2
đơn vò glucose và được các nhà khoa học phân ra làm 3 nhóm chủ yếu sau đây:

 1,4 β-D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91) (CBH). Enzym cắt đầu
cuối của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose. Enzym này còn có một
loạt các tên khác như: cellobiohydrolase, cellobiosidase và avicellase.
 1,4 β-D-glucan –4- glucanohydrolase (EC.3.2.1.4) (EG). Enzym này tham
gia phân giải liên kết β-1,4 glucoside trong cellulose và β-D-glucanase.
Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose.
Enzym này còn có một loạt tên khác như: endoglucanase, endo 1,4 β-D-
glucanase, C-cellulase.
 β-D-glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21). Enzym này tham gia phân
hủy cellobiose tạo thành glucose. Chúng không có khả năng phân hủy
cellulose nguyên thủy. Trong các tài liệu khoa học, chúng có tên là
cellobiase và β-glucosidase.
Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng các enzym EG có tác dụng phân cắt tốt trên
cellulose vô đònh hình và đặc biệt có tác dụng trên cellulose biến tính như CMC, HEC.
Vì vậy, để xác đònh hoạt tính enzym này người ta thường sử dụng cơ chất là CMC.
Còn các enzym CBH thì có tác dụng trên cellulose kết tinh, ít trên cellulose vô đònh
hình và hầu như không có tác dụng phân cắt cellulose biến tính. Trong hệ thống
enzym CBH thì enzym CBH I tấn công từ đầu khử, trong khi CBH II tấn công vào đầu
không khử của chuỗi cellulose.
Sự thủy phân cellulose là sự kết hợp của 3 loại enzym trên. Đầu tiên enzym EG
tấn công vào giữa mạch cellulose và giải phóng các đầu cuối của chuỗi. Tiếp sau đó
các enzym CBH tiếp tục phân cắt để tạo sản phẩm cuối là cellobiose. Việc phân cắt
cuối cùng tạo thành glucose là nhờ vào enzym thứ ba β-glucosidase. Vì vậy tuy rằng
enzym β-glucosidase không có tác dụng trên chuỗi cellulose nhưng nó vẫn được xếp
vào hệ thống enzym cellulase.
10
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
Bảng 2.1 –Sự phân loại enzym phân cắt 1,4-β-glucans
Tên hệ thống Tên thường gọi EC No. Cơ chất
Liên

kết thủy
phân
Sản phẩm
chính
Endo 1,4-β-D-glucan-4-
glucanohydrolase
Cellulase,
endoglucanase (EG)
3.2.1.4
Cellulose,
1,3-1,4-β-glucans
1,4-β 1,4-β-
dextrins,
1,3-1,4-β-
dextrins
1,3-1,4-β-D-
glucan-4-
glucanohydrolase
Lichenase, β-
glucanase 3.2.1.73
Lichenin,
1,3-1,4-β-glucans
Kế 1,4-
β sau 1,3-
β-
Hỗn hợp
1,3-1,4-β-
dextrins
1,3-β-D-
glucan-3/4-

glucanohydrolase
Laminarinase
3.2.1.6
Laminarin,
1,3-1,4-β-glucan
Kế liên
kết 1,4-β-
hoặc 1,3-
β- và sau
1,3-β-
Hỗn hợp
1,3-1,4-β-
dextrins
1,3-β-D-glucan-3-
glucanohydrolase
Laminarinase
3.2.1.39
Laminarin,
pachyman (1,3-1,4-
β-glucans)
1,3-β 1,3-β-
dextrins (1,4-β-
dextrins)
Exo 1,4-β-D-glucan-
cellobiohydrolase
Cellobiohydrolase
(CBH)
3.2.1.91
Cellulose,
1,3-1,4-β-glucans

1,4-β Cellobiose
,4-β-D-glucan-
glucohydrolase
Exoglucanase
3.2.1.74
1,4-β-
glucans
1,4-β glucose
β-glucosidase Cellobiase
3.2.1.21
β-D-
glucosides
1,4-β
1,3-β
1,6-β
glucose
11
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
Tuy nhiên sự phân loại này chưa thật sự thỏa đáng khi một vài enzym CBH
cũng có hoạt tính như enzym EG. Sự phân loại enzym cellulase trở nên phức tạp hơn
khi chúng có hoạt tính trên polysaccharide như xylan. Do đó khóa phân loại mới cho
những enzym này cũng như các enzym thủy phân liên kết glucoside là dựa trên sự
tương đồng về cấu trúc của chúng. Điều này cần những thông tin về trật tự sắp xếp
các aminoacid của chúng. Hiện nay người ta phân loại các enzym thủy phân liên kết
glycoside thành 111 nhóm, trong đó enzym cellulase có trong 11 nhóm (từ nhóm 5 đến
nhóm 10, 12, 26, 44, 45, và 48). [23]. Trong bài này, tên enzym được sử dụng theo
cách phân loại cũ.
2.2.2Mối quan hệ cấu trúc-chức năng trong enzym cellulase [4]
Enzym có cấu trúc 2 phần gồm phần xúc tác và phần liên kết với cơ chất là đặc
trưng cho enzym phân cắt cellulose được thu nhận từ cả nấm mốc và vi khuẩn. Sự tồn

tại của phần liên kết với cơ chất cũng phổ biến trên những enzym khác tham gia phân
cắt cơ chất rắn. Trong enzym của nấm mốc, phần liên kết với cellulose (CBD) được
liên kết với phần xúc tác bởi những liên kết tách biệt hoàn toàn giữa 2 phần này. CBD
có thể là đầu C hoặc đầu N của enzym. Trong một vài trường hợp như trong enzym E4
của vi khuẩn Thermomonospora fusca, CBD là một phần cấu trúc bên trong của
enzym. Một vài vi khuẩn được nghiên cứu sản xuất enzym có cấu trúc 2 phần như
trên. Nhưng có điểm khác biệt là các phần được liên kết đồng hoá trò và phần xúc tác
tham gia thủy phân cellulose và hemicellulose cũng như vùng liên kết với cơ chất.
Hình 2.7– Cấu trúc 2 phần của enzym CBH từ Trichoderma reesei. Phần xúc tác lớn
được liên kết với phần liên kết với cellulose nhỏ hơn.
12
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
Nhiều VSV hiếu khí sản xuất số lượng lớn phức chất cellulosome – gồm nhiều
bó sợi protein liên kết không đồng hóa trò. Cellulosome có thể bao gồm vài enzym
EG, CBH, và những glycanase khác nhưng những protein cũng tham gia trong liên kết
giữa cellulosome với cơ chất. Mỗi một enzym riêng biệt trong phức hệ enzym thông
thường không có hoạt tính trên cellulose kết tinh, nhưng cellulosome thì có thể. Mỗi
một thành phần enzym được gắn với protein không phải enzym được gọi là scaffoldin.
Polypeptide của scaffoldin gồm những phần CBD lặp lại bên trong cấu trúc phân tử,
phần này tương tác với enzym. Trọng lượng phân tử của cellulosome có thể đến
2000kDa.
Mặc dù hiện nay đã có 13 loại CBD đã được xác đònh dựa vào sự tương đồng
của chúng nhưng chỉ một trong chúng tồn tại trong enzym từ nấm mốc. CBD nấm mốc
được phân biệt do kích thước nhỏ của chúng (<40 aminoacid). Giống như phần lớn
protein liên kết với carbonhydrate, sự liên kết với cellulose chiếm ưu thế do tương tác
từ các amino acid còn lại. CBD là thành phần quan trọng tạo chức năng của cellulase
trên cơ chất rắn. Nếu chúng bò loại bỏ bằng các kỹ thuật protein thì cả hoạt tính và
liên kết giữa cellulase và cơ chất rắn đều bò giảm nghiêm trọng. Trong nhiều nghiên
cứu cho thấy rằng liên kết giữa cellulase và cellulose là không thuận nghòch, và đôi
khi người ta cho rằng nguyên nhân là do CBD. Sự tương tác rất phức tạp, tuy nhiên

được xem như là sự tác động lẫn nhau giữa phần xúc tác và phần liên kết, và tạo ra
kết quả trong việc liên kết với cellulose. Trong enzym của nấm mốc không có bằng
chứng cho rằng sự hiện diện của CBD có vai trò tác động trong việc thủy phân
cellulose kết tinh.
Cấu trúc không gian của protein thể hiện chi tiết tính chất hóa sinh của enzym.
Vì vậy nhiều mô hình cấu trúc của cellulase đã được đề ra. Ví dụ EG I và CBH II của
T.reesei có cấu trúc giống nhau 45%. So sánh cấu trúc của chúng ta thấy rằng trung
tâm hoạt động của CBH I được đặt bên trong ống (tunnel) được tạo thành bởi các
vòng xoắn ở bề mặt. Trong khi đó ở EG I thì các vòng xoắn này ít hơn, chính vì thế
enzym này có trung tâm hoạt động có diện tích tiếp xúc rộng hơn. Hình dáng ống của
trung tâm hoạt động trong CBH I cũng như trong các CBH khác, giải thích về mặt cấu
trúc cho sự hoạt động của enzym. Những tunnel này càng dài giữ enzym liên kết với
chuỗi cellulose càng lâu và vì vậy sự tương tác nhiều hơn khi nó di chuyển dọc theo
13
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
chuỗi để thủy phân đơn vò cellobiose. Trung tâm hoạt động mở của EG cho phép
chúng thủy phân ở giữa mạch cellulose.
Hình 2.8- Cấu trúc của EG và CBH của Trichoderma reesei
Cấu trúc này cho thấy nhóm xúc tác của CBH I được bao quanh rất chặt chẽ
còn trong EG thì lỏng lẻo hơn.
2.2.3Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzym [1]
4.3.1 Nồng độ enzym
Trong điều kiện thừa cơ chất thì tốc độ phản ứng enzym tỉ lệ tuyến tính với
nồng độ enzym. Nhưng khi nồng độ enzym quá lớn tốc độ phản ứng enzym cũng tăng
chậm.
V= k [E]
Với v: vận tốc phản ứng
[E] nồng độ enzym.
14
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

Hình 2.9– nh hưởng nồng độ enzym đến tốc độ phản ứng
4.3.2 Nồng độ cơ chất
Mở đầu phản ứng phải tạo thành phức enzym-cơ chất, sau đó phức ES chuyển
hóa tiếp tạo thành sản phẩm cuối cùng của phản ứng enzym tự do, enzym lại kết hợp
với phân tử cơ chất khác bắt đầu vòng xúc tác mới. Nồng độ cơ chất càng cao tốc độ
phản ứng càng tăng nhưng nồng độ cơ chất tăng đến mức độ nào đó thì dù nồng độ cơ
chất có tăng nhưng tốc độ phản ứng vẫn không đổi.
15