nghiên cứu thành phần hóa học thiết lập chất đối chiếu và xây dựng quy trình kiểm nghiệm thành phần alcaloid và flavonoid cho cây trinh nữ hoàng cung (crinum latifolium l amaryllidaceae)

B

GIÁO D C VÀ ÀO T O
IH CYD

B

C THÀNH PH

H

YT

CHÍ MINH

*****

NGUY N H U L C TH Y

NGHIÊN C U THÀNH PH N HÓA H C,
THI T L P CH T

I CHI U VÀ XÂY D NG

QUY TRÌNH KI M NGHI M THÀNH PH N ALCALOID
VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH N

HOÀNG CUNG

(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)

LU N ÁN TI N S D

CH C

Tp H Chí Minh – N m 2014


B

GIÁO D C VÀ ÀO T O
IH CYD

B

C THÀNH PH

H

YT

CHÍ MIINH

NGUY N H U L C TH Y

NGHIÊN C U THÀNH PH N HÓA H C,
THI T L P CH T

I CHI U VÀ XÂY D NG

QUY TRÌNH KI M NGHI M THÀNH PH N ALCALOID

VÀ FLAVONOID CHO CÂY TRINH N

HOÀNG CUNG

(Crinum latifolium L., Amaryllidaceae)
Chuyên ngành: KI M NGHI M THU C
Mã s : 62.73.15.01

LU N ÁN TI N S D
Ng

ih

CH C

ng d n khoa h c: PGS.TS. VÕ TH B CH HU

Tp H Chí Minh – N m 2014


L I CAM OAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên c u c a riêng tơi. Các s li u, k t qu
đ

c trình bày trong lu n án là trung th c và ch a t ng đ

c ai cơng b trong b t k

cơng trình nào khác.

Ng

i cam đoan,

Nguy n H u L c Th y


i

M CL C
M C L C............................................................................................................... i
B NG CÁC CH

VI T T T .............................................................................iii

DANH M C HÌNH NH...................................................................................... v
DANH M C S

............................................................................................ vi

DANH M C CÁC B NG ................................................................................... vii
TV N
CH

........................................................................................................ 1

NG 1: T NG QUAN TÀI LI U ............................................................... 3

1.1. T ng quan th c v t h c cây Trinh n hoàng cung ......................................... 3
1.2. T ng quan hóa h c c a chi Crinum và cây TNHC ........................................ 5

1.3. T ng quan tác d ng sinh h c chi Crinum và TNHC .................................... 14
1.4. Chi t ho t ch t t d
1.5. Các ph
1.6. Ph
CH

c li u b ng dung môi CO2 siêu t i h n...................... 21

ng pháp nghiên c u hóa h c c a cây Trinh n hoàng cung........... 22

ng pháp thi t l p ch t đ i chi u........................................................... 24

NG 2: PH

NG PHÁP NGHIÊN C U ................................................ 27

2.1. Nguyên v t li u ........................................................................................... 27
2.2. Trang thi t b .............................................................................................. 28
2.3. Ph

ng pháp nghiên c u............................................................................. 29

2.3.1. Chi t xu t – phân l p ho t ch t t cây TNHC ...................................... 29
2.3.3. Thi t l p ch t đ i chi u ........................................................................ 34
2.3.4. Ph
2.3.5.
CH

ng pháp đ nh tính, đ nh l

ng alcaloid và flavonoid ..................... 35

xu t m t s ch tiêu c n thi t đ xây d ng TCKN d

c li u TNHC 40

NG 3: K T QU NGHIÊN C U ........................................................... 41

3.1. Quy trình chi t cao c n, phân đo n alcaloid và flavonoid t cây TNHC...... 41
3.1.1. Quy trình chi t ho t ch t b ng ph

ng pháp ng m ki t ........................ 42

3.1.2. Chi t ho t ch t t lá TNHC b ng ph

ng pháp SFE và ng m ki t ....... 44

3.2. Phân l p h p ch t tinh khi t t cao chi t TNHC ......................................... 47
3.2.1. S c ký c t chân không ......................................................................... 47
3.2.2. S c ký c t c đi n ............................................................................... 48


ii

3.2.3. Xác đ nh c u trúc ................................................................................. 53
3.2.3.1. Xác đ nh c u trúc h p ch t (2)....................................................... 53
3.2.3.2. C u trúc các h p ch t ch a đ
3.2.3.3. C u trúc các h p ch t đã đ

c công b t cây TNHC................ 60

c công b t cây TNHC ................... 63

3.3. Thi t l p ch t đ i chi u ............................................................................... 70
3.3.1. Xây d ng ph

ng pháp đánh giá nguyên li u thi t l p C C ................ 70

3.3.2. Xây d ng tiêu chu n ch t l

ng đánh giá các nguyên li u C C .......... 76

3.3.3. Xây d ng tiêu chu n ch t l

ng đánh giá các C C.............................. 77

3.3.4. óng gói và đánh giá đ ng nh t lơ ....................................................... 77
3.3.5. ánh giá đ ng nh t liên phịng thí nghi m ........................................... 79
3.3.6. Xác đ nh giá tr n đ nh và giá tr công b ............................................ 79
3.4. Xây d ng ph

ng pháp HPLC, CE, d u vân tay ......................................... 83

3.4.1. Quy trình x lý m u ............................................................................. 83
3.4.2. Quy trình đ nh l

ng đ ng th i 6 alcaloid b ng ph

3.4.3. Quy trình đ nh l

ng đ ng th i 2 flavonoid b ng HPLC ...................... 89

3.4.4. Quy trình đ nh l

ng đ ng th i 6 alcaloid b ng ph

3.4.5. Quy trình đ nh l

ng đ ng th i 2 flavonoid b ng ph

3.4.6. Ph
3.5.
CH

ng pháp HPLC ... 84
ng pháp CE ........ 92
ng pháp CE ..... 95

ng pháp d u vân tay ..................................................................... 98

xu t m t s ch tiêu c n thi t đ xây d ng TCKN d

c li u TNHC..... 100

NG 4: BÀN LU N ................................................................................. 103

4.1. Các ph

ng pháp chi t xu t ho t ch t t cây TNHC ................................. 103

4.2. Phân l p h p ch t tinh khi t ...................................................................... 107

4.3. Thi t l p ch t đ i chi u ............................................................................. 112
4.4. Quy trình đ nh l

ng alcaloid và flavonoid ............................................... 113

4.5. Tiêu chu n ki m nghi m d

c li u TNHC ................................................ 118

K T LU N
KI N NGH
DANH M C CƠNG TRÌNH NGHIÊN C U LIÊN QUAN
TÀI LI U THAM KH O
PH N PH L C

N LU N ÁN


iii

B NG CÁC CH
ASEAN

VI T T T

Association of Southeast Asian Nations
(Hi p h i các qu c gia ông Nam Á)

AL-NK

Phân đo n alcaloid chi t t lá TNHC b ng ph

ng pháp ng m ki t

AL-SA

Phân đo n alcaloid chi t t lá TNHC b ng sóng siêu âm

AL-SFE

Phân đo n alcaloid chi t t lá TNHC b ng ph

AR-96

Phân đo n alcaloid chi t t r TNHC v i dung môi c n 96%

As

H s b tđ i

C C

Ch t đ i chi u

CE

Caplillary Electrophoresis ( i n di mao qu n)

Corr Area

Corrected Area (Di n tích pic đ

CZE

Caplillary Zone Electrophoresis ( i n di mao qu n vùng)

d

doublet (đ nh đôi)

D VN IV

D

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DSC

Differential Scanning Calorimetry (Nhi t vi sai)

DMSO

Dimethylsulfoxyd

DVT

D u vân tay

FL-NK

Phân đo n flavonoid chi t t lá TNHC b ng ph

FL-SA

Phân đo n flavonoid chi t t lá TNHC b ng sóng siêu âm

FL-SFE

Phân đo n flavonoid chi t t lá TNHC b ng ph

FR-96

Phân đo n flavonoid chi t t r TNHC v i dung môi c n 96%

GC

Gas Chromatography (S c ký khí)

GC-MS

Gas Chromatography – Mass Spectrometry (S c ký khí ghép kh i ph )

HPLC

High Performance Liquid Chromatography (S c ký l ng hi u n ng cao)

HMBC

Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC

Heteronuclear Single Quantum Correlation

IR

Infrared (H ng ngo i)

J

Coupling constant (H ng s ghép)

ng pháp SFE

c chu n hóa)

c đi n Vi t Nam xu t b n l n th IV

ng pháp ng m ki t
ng pháp SFE


iv

LC-MS

Liquid Chromatography – Mass Spectrometry
(S c ký l ng ghép kh i ph )

L-SFE

Cao toàn ph n chi t t lá TNHC b ng ph

ng pháp SFE

MEKC

Micellar Electrokinetic Chromatography (S c ký mixen đi n đ ng)

MS

Mass Spectrometry (Kh i ph )

NMR

Nuclear Magnetic Resonance (C ng h

P

Phân đo n

PDA

Photo Diode Array (Dãy diod quang)

PCRS

Primary Chemical Reference Standard

ng t h t nhân)

(Ch t đ i chi u hóa h c s c p)
PTN

Phịng thí nghi m

RSD

Relative Standard Deviation (

Rs

đ phân gi i gi a pic có th i gian l u nh và l n h n k bên

S

Di n tích pic (µV x giây)

s

singlet (

SK

S c ký đ

SCRS

Secondary Chemical Reference Standard

l ch chu n t

ng đ i)

nh đ n)

(Ch t đ i chi u hóa h c th c p)
SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

SFE

Supercritical Fluid Extraction (Chi t b ng ch t l ng siêu t i h n)

SKLM

S c ký l p m ng

TCKN

Tiêu chu n ki m nghi m

TR

Th i gian l u (phút)

TM

Th i gian di chuy n (phút)

TNHC

Trinh n hồng cung

TGA

Thermogravimetric Analysis (Phân tích nhi t tr ng l

TT

Thu c th

UV-Vis

Ultraviolet-Visible (T ngo i kh ki n)

VLC

Vacuum Liquid Chromatography (S c ký c t chân không)

ng)


v

DANH M C HÌNH NH
Hình 1.1: Hình v cây TNHC ................................................................................. 5

Hình 1.2: Các c u trúc hóa h c c a alcaloid khung crinin ....................................... 6
Hình 1.3: C u trúc hóa h c alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B) ......... 6
Hình 1.4: C u trúc hóa h c khung belladin (C) và c u trúc khung galanthamin (D) 7
Hình 1.5: C u trúc hóa h c khung lycorenin (E) và c u trúc khung cheryllin (F) .... 7
Hình 1.6: C u trúc hóa h c c a các flavonoid trong chi Crinum ............................. 8
Hình 1.7: C u trúc hóa h c các h p ch t flavonoid trong cây TNHC .................... 10
Hình 3.1: Hình lá và c m hoa c a cây TNHC (Crinum latifolium L.) ................... 41
Hình 3.2: Hình hoa Trinh n hồng cung (Crinum latifolium L.) .......................... 41
Hình 3.3: SK các h p ch t phân l p t các phân đo n alcaloid. .......................... 49
Hình 3.4: SK các h p ch t phân l p t phân đo n alcaloid AR và flavonoid. ..... 49
Hình 3.5: C u trúc hóa h c và d li u ph NMR (500 MHz, CDCl3) c a (2). ....... 59
Hình 3.6: C u trúc hóa h c c a 6-ethoxyundulatin................................................ 59
Hình 3.7: SK xác đ nh đ tinh khi t c a C C crinamidin b ng HPLC. .............. 72
Hình 3.8: SK xác đ nh đ tinh khi t C C 6-hydroxycrinamidin HPLC. ............ 73
Hình 3.9: SK xác đ nh đ tinh khi t c a C C lycorin b ng HPLC..................... 73
Hình 3.10: SK xác đ nh đ tinh khi t c a C C hippadin b ng HPLC. ............... 74
Hình 3.11: SK xác đ nh đ tinh khi t c a C C astragalin b ng HPLC............... 74
Hình 3.12: SK xác đ nh đ tinh khi t c a C C isoquercitrin b ng HPLC. ......... 75
Hình 3.13: Các SK th m đ nh tính đ c hi u trong quy trình đ nh l
alcaloid trong lá TNHC b ng ph
Hình 3.14: Các SK

ng đ ng th i 6

ng pháp HPLC. ................................................ 86

th m đ nh tính đ c hi u trong quy trình đ nh l

astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng ph

ng đ ng th i

ng pháp HPLC. .................... 90

Hình 3.15: Các đi n di đ th m đ nh tính đ c hi u c a quy trình đ nh l
th i 6 alcaloid trong lá TNHC b ng ph

ng đ ng

ng pháp CE............................................ 93


vi

Hình 3.16: Các đi n di đ th m đ nh tính đ c hi u c a quy trình đ nh l
th i astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng ph

ng đ ng

ng pháp CE................... 96

Hình 3.17: S c ký đ DVT – SKLM alcaloid TNHC. ........................................... 98
Hình 3.18: S c ký đ DVT – SKLM flavonoid TNHC.......................................... 99
Hình 4.1: SK alcaloid TNHC b ng HPLC, k thu t r a gi i isocratic. ............. 114
Hình 4.2: SK alcaloid TNHC b ng HPLC, k thu t r a gi i gradient. .............. 114
Hình 4.3: i n di đ so sánh m u th alcaloid phân tích b ng CZE và MEKC. . 115
Hình 4.4: i n di đ m u th alcaloid pha trong methanol. ................................ 116
Hình 4.5: i n di đ m u th alcaloid pha trong đ m dinatri tetraborat 25 mM. . 116
Hình 4.6: i n di đ m u th alcaloid pha trong dung d ch acid H3PO4.............. 116

DANH M C S
S đ 2.1 S đ kh o sát quy trình chi t ho t ch t t cây TNHC........................... 29
S đ 2.2 S đ kh o sát chi t ho t ch t t lá TNHC k t h p hai ph
và ph

ng pháp SFE

ng pháp chi t ng m ki t v i c n 70%........................................................ 32

S đ 3.1 S đ chi t cao c n, P alcaloid và P flavonoid t lá TNHC .............. 43
S đ 3.2 S đ chi t alcaloid và flavonoid t r TNHC. ...................................... 43
S đ 3.3 S đ chi t alcaloid và flavonoid b t lá k t h p hai ph

ng pháp chi t. 46

S đ 3.4 S đ phân l p h p ch t (2) và (3) t P alcaloid AL-SFE. .................. 51
S đ 3.5 S đ chi t alcaloid AL-SA ho c flavonoid FL-SA. .............................. 83


vii

DANH M C CÁC B NG
B ng 1.1: Alcaloid c a TNHC Crinum latifolium L. ............................................. 11
B ng 3.1: Hi u su t chi t (%) ho t ch t b ng ph

ng pháp ng m ki t. ................. 42

B ng 3.2: K t qu kh o sát nh h

ng th i gian lên hi u su t chi t. ..................... 44

B ng 3.3: K t qu kh o sát nh h

ng c a áp su t lên hi u su t chi t. .................. 45

B ng 3.4: K t qu tách phân đo n m u AL-SFE và FL-NK b ng VLC. ................ 47
B ng 3.5: Các h p ch t tinh khi t phân l p đ

c t cao chi t TNHC. ................... 48

B ng 3.6: K t qu phân l p alcaloid t phân đo n ALS1. ..................................... 49
B ng 3.7: K t qu tri n khai s c ký c t v i ch t h p ph pha đ o. ........................ 50
B ng 3.8: K t qu phân l p (2) và (3) t P n–hexan. .......................................... 50
B ng 3.9: K t qu phân l p các (8), (9), (10) t P alcaloid AL-NK. ................... 52
B ng 3.10: D li u ph NMR (Máy 500 MHz, CDCl3) c a h p ch t (2)............... 57
B ng 3.11: Các t

ng tác proton trên ph COSY, HMBC c a h p ch t (2). ......... 58

B ng 3.12: K t qu đ tinh khi t; hàm m b ng phân tích nhi t tr ng l
B ng 3.13: Thành ph n pha đ ng và b

ng. ........ 70

c sóng phát hi n c a quy trình xác đ nh đ

tinh khi t c a các nguyên li u C C b ng ph

ng pháp HPLC. ............................. 71

B ng 3.14: K t qu kh o sát tính phù h p h th ng quy trình phân tích HPLC. .... 71
B ng 3.15: K t qu xác đ nh đ tinh khi t s c ký (%) các C C b ng HPLC. ........ 75
B ng 3.16: D li u ph UV-Vis, MS và đi m ch y c a các C C. ........................ 76
B ng 3.17: D li u ph IR c a các C C. .............................................................. 76
B ng 3.18: K t qu đánh giá đ ng nh t lơ c a các C C sau khi đóng gói. ............ 78
B ng 3.19: K t qu phân tích robust A c a C C crinamidin. ................................ 80
B ng 3.20: K t qu phân tích robust A c a C C 6-hydroxycrinamidin................. 80
B ng 3.21: K t qu phân tích robust A c a C C hippadin. ................................... 81
B ng 3.22: K t qu phân tích robust A c a C C lycorin. ..................................... 81
B ng 3.23: K t qu phân tích robust A c a C C astragalin. ................................. 82


viii

B ng 3.24: K t qu phân tích robust A c a C C isoquercitrin. ............................. 82
B ng 3.25: K t qu xác đ nh giá tr n đ nh và giá tr công b các C C. .............. 82
B ng 3.26: Ch

ng trình dung mơi đ nh l

ng 6 alcaloid b ng HPLC.................. 84

B ng 3.27: K t qu kh o sát tình phù h p h th ng c a quy trình đ nh l
th i 6 alcaloid trong lá TNHC b ng ph

ng pháp HPLC (n = 6). .......................... 84

B ng 3.28: K t qu kh o sát đ chính xác trung gian trong quy trình đ nh l
th i 6 alcaloid trong lá TNHC b ng ph

ng đ ng

ng pháp HPLC (n = 6). .......................... 87

B ng 3.29: K t qu kh o sát t l ph c h i c a quy trình đ nh l
alcaloid trong lá TNHC b ng ph

ng đ ng

ng đ ng th i 6

ng pháp HPLC (n = 9). .................................... 88

B ng 3.30: K t qu kh o sát tình phù h p h th ng c a quy trình đinh l
th i astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng ph

ng đ ng

ng pháp HPLC (n = 6). . 89

B ng 3.31: K t qu kh o sát đ chính xác c a quy trình đ nh l

ng đ ng th i

astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng HPLC (n = 6)............................... 91
B ng 3.32: K t qu kh o sát đ đúng c a quy trình đ nh l
và isoquercitrin trong lá TNHC b ng ph

ng đ ng th i astragalin

ng pháp HPLC (n = 9). ........................ 91

B ng 3.33: K t qu kh o sát tình phù h p h th ng quy trình đ nh l
alcaloid trong lá TNHC b ng ph

ng đ ng th i 6

ng pháp CE (n = 6). ......................................... 92

B ng 3.34: K t qu kh o sát đ chính xác trung gian trong quy trình đ nh l
th i 6 alcaloid trong lá TNHC b ng ph

ng pháp CE (n = 6). ............................... 94

B ng 3.35: K t qu kh o sát t l ph c h i c a quy trình đ nh l
alcaloid trong lá TNHC b ng ph

ng đ ng

ng đ ng th i 6

ng pháp CE (n = 9). ......................................... 94

B ng 3.36: K t qu kh o sát tình phù h p h th ng c a quy trình đ nh l

ng đ ng

th i astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng CE (n = 6). ........................... 95
B ng 3.37: K t qu kh o sát đ chính xác c a quy trình đ nh l

ng đ ng th i

astragalin và isoquercitrin trong lá TNHC b ng CE (n = 6). .................................. 97
B ng 3.38: K t qu kh o sát đ đúng c a quy trình đ nh l
và isoquercitrin trong lá TNHC b ng ph

ng đ ng th i astragalin

ng pháp CE (n = 9). ............................. 97


1

TV N
Cây Trinh n hoàng cung (Crinum latifolium L. – Amaryllidaceae) là d
đ

c s d ng ph bi n nh th c ph m ch c n ng ho c d

c li u đang

i các d ng bào ch thu c

c truy n và thu c hi n đ i.
Công d ng đ

c quan tâm và đã đ

c th nghi m lâm sàng nh đi u tr u x t cung,

u phì đ i lành tính tuy n ti n li t đ

c cho là do tác d ng c a thành ph n alcaloid

trong cây v i các ch ph m nh Crila, Tadimax [16], [26].
K đ n là cơng d ng kháng viêm, ch ng oxi hóa in vitro do nhóm flavonoid c ng đã
đ

c nghiên c u [16], [95].

Tuy nhiên, các nhà khoa h c k v ng vào tác d ng kháng kh i u c a lồi này. Cho
đ n nay đã có nhi u cơng trình nghiên c u v kh n ng kháng ung th t cao toàn
ph n nh : cao ethanol (có thành ph n alcaloid) làm ch m s phát tri n kh i u gây ra
b i t bào Sarcoma TG 180 [11]; cao methanol c ch NF- B [103]; cao chi t n

c

kích thích s sinh s n và ho t hóa t bào lympho T [139]; kh n ng c ch s phát
tri n c a t bào ung th và h i ph c ch c n ng mi n d ch (in vitro) c a cao chi t n

c

là tác d ng đáng chú ý khi gi i thích tính kháng ung th c a loài Crinum latifolium
[31], [95], [139]. Các h p ch t alcaloid tinh khi t đ

c phân l p t Trinh n hoàng

cung (TNHC) nh lycorin, pratorimin, undulatin, crinafolin và crinafolidin đã đ

c

th c nghi m ch ng minh là có kh n ng ng n ch n ch n l c s phát tri n c a các t
bào ung th th c nghi m.
Thành ph n hóa h c và tác d ng sinh h c c a TNHC đ
r t nhi u cơng trình nghiên c u đã đ

c nhi u tác gi quan tâm và

c công b v hai l nh v c này – cho đ n n m

2013, có kho ng 30 cơng trình cơng b d

i d ng bài báo khoa h c. Tuy nhiên các

nghiên c u v l nh v c ki m nghi m thì h n ch h n (kho ng 6 cơng trình): ph
pháp quang ph đ nh l

ng alcaloid toàn ph n [22]; ph

ph n alcaloid [11], [106]; ph

ng pháp HPLC đ nh l

ng

ng pháp GC đ nh danh thành
ng alcaloid d a trên 1 ch t đ i

chi u [12], [24], [27]. Ch a có nghiên c u ng d ng ph

ng pháp CE và c ng ch a


2

có cơng trình cơng b vi c đ nh l

ng đ ng th i m t s alcaloid hay flavonoid trong

lá TNHC.
D

c đi n Vi t Nam IV ch a có chuyên lu n cây TNHC. Do đó, v n đ qu n lý và

đ m b o ch t l
đ

ng c a nguyên li u và các ch ph m có thành ph n TNHC v n ch a

c th c hi n m t cách ch t ch .

Nguyên nhân ch y u là do thành ph n hóa h c c a d

c li u v n ch a đ

c u toàn di n; ch t đánh d u trong nguyên li u ch a đ

c xác đ nh và hồn tồn ch a

có b t k ch t đ i chi u có ngu n g c t d

c li u này đ

c nghiên

c phân ph i trên th tr

ng.

V i mong mu n góp ph n gi i quy t các b t c p hi n t i và góp ph n vào cơng tác
“

m b o ch t l

ng” cho d

c li u Trinh n hồng cung, chúng tơi ti n hành đ tài:

“Nghiên c u thành ph n hóa h c, thi t l p ch t đ i chi u
và xây d ng quy trình ki m nghi m thành ph n alcaloid và flavonoid
cho cây Trinh n hoàng cung - Crinum latifolium L., Amaryllidaceae”
v i 4 m c tiêu chính nh sau:
1. Chi t xu t cao c n, các phân đo n alcaloid, phân đo n flavonoid và phân l p các
h p ch t tinh khi t t cây Trinh n hoàng cung.
2. Thi t l p m t s ch t đ i chi u hóa h c có ngu n g c t cây Trinh n hồng cung.
3. Xây d ng quy trình đ nh tính, đ nh l
hoàng cung b ng các ph
4.

ng alcaloid và flavonoid trong lá Trinh n

ng pháp s c ký l ng hi u n ng cao và đi n di mao qu n.

xu t m t s ch tiêu c n thi t cho vi c xây d ng tiêu chu n ki m nghi m d

li u Trinh n hoàng cung.

c


3

CH

NG 1: T NG QUAN TÀI LI U

1.1. T NG QUAN TH C V T H C CÂY TRINH N

HOÀNG CUNG

1.1.1. H Amaryllidaceae và chi Crinum
H Amaryllidaceae có tên g i theo đa s tài li u c a các nhà th c v t h c Vi t nam
là h Th y tiên [4], [5], [21], Loa kèn đ [1], Náng [7] hay Lan Hu . V trí c a chi
Crinum thu c h Th y tiên theo h th ng phân lo i ngành th c v t h t kín c a A. L.
Takhtajan cơng b n m 1987 và đã s a đ i n m 2009 [4], [36] nh sau:
Ngành Ng c lan (Magnoliophyta)
L p Hành (Liliopsida)
Phân l p Hành (Liliidae)
Liên b hành (Lilianae)
B Th y tiên (Amaryllidales)

H Th y tiên (Amaryllidaceae)
Chi Crinum L.
c đi m hình thái c a h Th y tiên: thân c , s ng nhi u n m nh hành hay thân r .
Lá m c t g c, m ng hay m ng n

c, gân lá song song.

i v i chi Crinum, các b

lá h p thành thân gi cao 10-15 cm. C m hoa d ng chùm, tán, ít hay nhi u hoa và có
m t mo bao l i. Tr c c m hoa dài m c t m t đ t. Hoa đ u, l

ng tính, 5 vòng, m u

3. Bao hoa: 6 phi n cùng màu d ng cánh hoa, dính thành ng dài, ít khi r i. Vài lo i
có tràng ph . B nh : 6 nh đính trên 2 vịng. Ch nh r i hay dính nhau. Bao ph n
th ng hay l c l . B nh y: 3 lá noãn t o thành b u d

i 3 ô, m i ơ ch a nhi u nỗn,

đính nỗn trung tr ; 1 vòi nh y, đ u nh y chia 3 thùy. Qu : thông th

ng là nang n t

l ng. H t có n i nh [5].
Chi Crinum có kho ng 130 loài

các vùng nhi t đ i, c n nhi t đ i và vùng nóng.

Vi t Nam, chi Crinum có 6 lồi đ

c tr ng làm c nh và làm thu c: Crinum amabile

Donn., Crinum asiaticum L., Crinum defixum Ker Gawl., Crinum giganteum Andr.,
Crinum latifolium L., Crinum moorei Hook F. [4]


4

1.1.2. Cây Trinh N Hoàng Cung (TNHC)
Tên khoa h c: Crinum latifolium L.
Tên thơng th

ng: Trinh N Hồng Cung [11], Hoàng Cung Trinh N [17], T i l i

lá r ng [1], [4], Náng lá r ng [4], [7], [9].
c đi m hình thái: đ

c nhi u nhà th c v t h c Vi t nam mô t r t chi ti t [1], [4],

[5], [7], [11], [14], [17], [21]. Tài li u [7] phù h p v i h u h t các tài li u khác: c
nhi u n m; thân hành, hình c u, phía ngồi có áo m ng, phía trên có thân gi ng n
do các b lá ôm sát nhau làm thành. Phi n lá d ng b n, kích th

c 60-90  7-10 cm,

màu xanh nh t, n c, m t trên h i lõm xu ng thành hình máng, mép l
gi a l i lên

m td

n sóng, gân

i, gân bên song song, chóp nh n, g c d ng b . C m hoa tán, có

10-20 hoa; cu ng c m dài 60-90 cm, chi u ngang 1,5-2,0 cm, màu xanh, g c tím nh t.
Lá b c t ng bao 2, d ng mo, m ng, kích th

c 7,5-10,0  2,5-3,0 cm. Hoa đ u, l

ng

tính, màu tím h ng, đ ng th ng; cu ng hoa ng n. Bao hoa dài 15-20 cm, 6 m nh,
d ng tràng, ph n d

i dính nhau thành ng dài 9-10 cm, th ng đ ng ho c cong lên,

ph n trên 6 thùy, hình m i giáo, gi a l ng có 1 d i màu tím h ng, đ m h n, nh t d n
ra phía mép, chóp nh n ng n, có m i màu h ng. Nh 6, r i nhau; ch nh dài 6-7 cm,
d ng s i, màu tr ng, th ng đ ng ho c chỗi ra, đính

h ng ng bao hoa; bao ph n

màu vàng, dài 1,2-1,8 cm, 2 ơ, hình d i, đính l ng, h

ng trong, m b ng khe d c.

B u h , hình thoi, 3 ơ, m i ơ 5-6 nỗn; vịi nh y dài 15-18 cm, d ng s i, dài, m nh,
phía trên màu tím th m nh t d n xu ng phía d
hình c u, đ

i; đ u nh y nh , d ng c u. Qu nang,

ng kính 4-5 cm.

Tài li u [17] mơ t b nh c a TNHC có màu đ , trong khi các tài li u khác [7], [11]
mô t b ph n này có màu tr ng. Các tài li u cịn l i đ u khơng đ c p chi ti t này.
Phân b - Sinh thái: cây TNHC đ

c tr ng r ng rãi

Indonexia, Philippin, Campuchia, Lào.

n

Vi t Nam, cây đ

, Thái lan, Trung Qu c,
c tr ng ch y u

các

t nh t Qu ng Nam- à N ng tr vào. Mùa hoa qu : tháng 8-9. Là lo i cây a m,
sáng ho c m t ph n bóng mát. Sinh tr

ng và phát tri n

khí h u nóng và m c a

vùng nhi t đ i. M i n m cây cho 6-8 lá m i và đ thêm 3-5 hành con. Cây ra hoa

hàng n m vào kho ng tháng 6-8. B ph n dùng ch y u là lá và thân hành [1].


5

Cây TNHC đã đ

c nghiên c u nhân gi ng b ng ph

ng pháp c y mơ [20].

Hình 1.1: Hình v cây TNHC: 1. Cây v i thân hành và lá 2. C m hoa;
3. M t ph n bao hoa và b nh ; 4. B nh y “Ngu n: Nguy n Th

, 2007” [7]

N m 2012, m t th m i c a lồi TNHC do nhóm tác gi Nguy n Th Ng c Trâm,
Tr n Công Khánh xác đ nh trong qu n th Crinum Vi t nam là “Trinh n Crila” có
tên khoa h c Crinum latifolium L. var. Crilae Tram & Khanh, var. n [32].

1.2. T NG QUAN HÓA H C C A CHI CRINUM VÀ CÂY TNHC
Thành ph n hóa h c c a các loài trong chi Crinum đ

c nghiên c u t n m 1950.

Nhóm h p ch t chính là alcaloid, k đ n là nhóm non-alcaloid, trong đó đ c bi t là
các h p ch t phenolic [116].
Chi Crinum đ

c xem là đ i di n cho h Amaryllidaceae do thành ph n hóa h c có

h u h t các h p ch t c a các chi khác trong h . Kho ng 180 alcaloid thu c nhi u
nhóm c u trúc khác nhau đ

c phân l p và đ nh danh. Ph n l n chúng thu c các

khung alcaloid crinin (5,10 b-enthanophenanthridin), lycorin (benzopyrano-(3,4 g)indol) và tazettin (2-benzopyrano-(3,4 c)-indol) [116].
Kho ng 100 các h p ch t non-alcaloid đ

c phân l p và đ nh danh, chúng thu c các

nhóm flavonoid, chromon, coumarin, terpenoid, steroid, ionon, alcohol, aldehyd,
ceton, acid, ester và hydrocarbon m ch dài. Các h p ch t phenol là nhóm chi m u
th trong nhóm h p ch t non-alcaloid [107], [116].
Thân hành là b ph n đ
đ

c nghiên c u nhi u nh t, các h p ch t alcaloid và flavonoid

c tìm th y ch y u t b ph n này.


6

1.2.1. Thành ph n hóa h c c a các loài trong chi Crinum
1.2.1.1. Alcaloid c a chi Crinum
Alcaloid khung crinin: đây là nhóm đ i di n cho alcaloid Crinum do ph n l n các
alcaloid đ u thu c khung này v i h n 80 alcaloid đã đ

c phân l p. C u trúc các

alcaloid khung này thay đ i theo 3 c u trúc sau [107], [116]:

Hình 1.2: Các c u trúc hóa h c c a alcaloid khung crinin
Alcaloid khung lycorin: lycorin là nhóm đ
l

ng alcaloid v i kho ng 40 alcaloid đã đ

c x p th hai sau nhóm crinin v s
c phân l p.

i di n lycorin, đ

c tìm

th y trong 30 lồi Crinum. K đ n là hippadin, pratorimin và pratorinin [107], [116].
Alcaloid khung tazettin: kho ng 13 alcaloid thu c khung này, đ i di n là tazettin và
criwellin đ
thay đ i
m

và đ

c tìm th y trong 6-7 lồi Crinum. C u trúc các alcaloid khung tazettin

v trí R1, R2, R3, R4, m t s ít (3 alcaloid) có c u trúc vịng methylendioxy
c thay b ng 2 nhóm CH3O- (ornamin - C18H21NO3); 2 nhóm -OH

(ornazidin-C16H20NO3); 1 nhóm -OH và 1 nhóm acetyl (ornazamin - C18H22NO4).

(A)

(B)

Hình 1.3: C u trúc hóa h c alcaloid khung lycorin (A) và khung tazettin (B)
Alcaloid ki u khung belladin: 7 alcaloid đã đ
latisodin và latisolin [55] đ

c tìm th y, đ i di n là belladin [57],

c phân l p t C. asiaticum và C. latifolium.


7

Alcaloid khung galanthamin: galanthamin là alcaloid đ i di n cho khung này, đ

c

tìm th y trong thân hành c a 8 lồi Crinum. Các alcaloid cịn l i (kho ng 7 alcaloid)
có c u trúc thay đ i theo khung Galanthamin.

(C)
(D)
Hình 1.4: C u trúc hóa h c khung belladin (C) và c u trúc khung galanthamin (D)
Alcaloid khung lycorenin: các alcaloid có c u trúc thay đ i
Riêng hippeastrin có c u trúc vịng methylendioxy

các v trí R1, R2, R3, R4.

v trí R1 và R2.

(E)
(F)
Hình 1.5: C u trúc hóa h c khung lycorenin (E) và c u trúc khung cheryllin (F)
Các ki u khung còn l i có ít s l

ng alcaloid h n:

Alcaloid khung narciclasin: crinasiadin - C14H9NO3, crinasiatin - C22H17NO4 và
narcicrinin - C14H17NO5.
Alcaloid khung cheryllin: cheryllin - C17H19NO3 và latifin - C17H19NO3.
Alcaloid khung phenanthridin: trisphaeridin - C14H9NO2 và 3-hydroxy-8,9methylendioxyphenanthridin.
Alcaloid khung augustamin: augustamin - C17H19NO4.
Alcaloid khung latindin: latindin - C41H31N3O10.


8

1.2.1.2. Các nhóm h p ch t non-alcaloid trong chi Crinum
Kho ng 100 h p ch t đã đ
ch t đ

c đ nh danh, flavonoid là nhóm đ

c cơng b v i s h p

c phân l p nhi u nh t [107], [116].

Nhóm flavonoid: 24 flavonoid đã đ

c phân l p t thân hành và hoa. Hai flavonoid

3’4’-dihydroxyflavan và 7-hydroxy-8-methoxyflavanon đ

c phân l p t Crinum

latifolium, l n đ u tiên tìm th y trong h Amaryllidaceae [104]. Isoliquiritigenin
(2’,4,4’-trihydroxychalcon) t C. bulbispermum là c u trúc chalcon đ u tiên đ

c tìm

th y trong chi Crinum [112].
Flavonoid trong chi Crinum có c u trúc thu c các nhóm sau:
R4

R2

R1

OH
R3

O

OH
O

R2O

R1

O

(A)

(B)

C u trúc flavonoid nhóm flavan (A)

C u trúc flavonoid nhóm flavanon (B)

R6
R5

R3

R1
R2

R2

OR3

O

(C)

OH

R3
OR4

O

R4O

R1

R1

OR7

OH

O

O

(D)

C u trúc flavonoid nhóm flavon (C) (D)

R2

(E)

C u trúc flavonoid nhóm chalcon (E)

Hình 1.6: C u trúc hóa h c c a các flavonoid trong chi Crinum
Nhóm coumarin: ch m i đ

c tìm th y trong lồi C. latifolium [104], hai h p ch t

coumarin g m 4-[(senecioyloxy)methyl]-3-4-dimethoxycoumarin - C17H20O6 và 4[(senecioyloxy)methyl]-6-7-dimethoxycoumarin - C17H20O6.
Nhóm terpenoid và sterol: các steroid th c v t nh
dihydrositosterol đã đ

stigmasterol, sitosterol,

c tìm th y trong vài lồi c a chi Crinum.

Nhóm acid béo: h n 20 acid béo nh linoleic, palmitic, arachidic, myristic, oleic,
palmitic, stearic… đ

c đ nh danh t d ch chi t n

c.


9

Nhóm carbohydrat: g m resin, pectin, hemicellulose, glucan và polysaccharid. Thân
hành loài C. amabile ch a 5,4% saccharid; 8,7% pectin, 8,2% hemicellulose. Glucan
A và B t loài C. latifolium, glucan A ch a 12 đ n v glucose và 110 g c c a glucose.
Glucose, arabinose, xylose, galacturonic và glucuronic acid đ
chi t n

c phân l p t d ch

c c a thân hành loài C. bulbispermum.

1.2.2. Thành ph n hóa h c c a TNHC - Crinum latifolium L.
- Thành ph n hóa h c lồi C. latifolium kh o sát t n m 1982 do nhóm tác gi n

c

ngoài nh Ghosal S. [53], [55], [56], [57], [58], [59], [60], [61], [62], Kobayashi S.
[83], [84] th c hi n.
- Nh ng nghiên c u

Vi t Nam v thành ph n hóa h c c a lồi này ph i k đ n các

cơng trình c a các tác gi Phan T ng S n [9], Nguy n Công Hào [8], [33], [102],
Nguy n H i Nam [103], [104], Võ Th B ch Hu [11], [12], [13], [14].
- Tác gi Nguy n Th Ng c Trâm v i các công trình nghiên c u ch y u v tác d ng
sinh h c [31], [106], [107], [139].
Alcaloid c a TNHC: đ n nay đã có 36 alcaloid đ

c phân l p và đ nh danh, ph n l n

thu c khung crinin và lycorin (B ng 1.1).
- Thành ph n và hàm l
k tr
-

ng alcaloid thay đ i đáng k theo th i k sinh tr

ng, th i

c và sau khi cây ra hoa [58], [62], [106].

ã có 12 alcaloid đ

c phân l p t TNHC tr ng

Vi t nam, tài li u [9] công b

nhi u nh t v i 12 alcaloid t d ch chi t lá và thân hành. Alcaloid thu c khung crinin
chi m s l

ng nhi u nh t, g m 7 alcaloid: 6-hydroxybuphanidrin [9], ambellin [8],

[9], [11]; crinin [8], [9]; powellin [9]; crinamidin [8], [9], [11]; 6-hydroxycrinamidin
[8], [9], [11], [102]; 6-hydroxyundulatin [9]; khung lycorin có pratorinin [9], lycorin
[8], [9]; hippadin [9], lycorin-1-OAc [9], khung augustamin có augustamin [9], [11].
-Tài li u [11] cơng b 4 alcaloid t d ch chi t lá, trong đó 6-hydroxycrinamidin là
h p ch t alcaloid t nhiên l n đ u tiên đ

c cơng b (n m 1998).

Nhóm carbohydrat: glucan A và B [60]; lectin (methyl- -mannopyranosid) đ u đ
phân l p t d ch chi t thân hành [78].

c


10

Coumarin: t d ch chi t methanol, tài li u [104] công b h p ch t coumarin 4senecioyloxymethyl-6,7-dimethoxycoumarin. Hi n t i thành ph n này ch a đ

c

phát hi n trong các lồi Crinum khác.
Nhóm acid h u c : para-hydroxycinnamic methyl ester và 2,5-dihydroxycinnamic
ethyl ester t d ch chi t lá t

i [33].

Flavonoid c a TNHC: so v i nhóm alcaloid thì flavonoid có s l
đ

ng các h p ch t

c cơng b ít h n, g m 8 flavonoid sau [33], [103], [104]:
OH

OH

OH

OH

O

O

4’,7-dihydroxyflavan

3’4’-dihydroxyflavan

OMe

OCH=CH2
OH

OH

OH
OH

O

4’,7-dihydroxy-3’-methoxyflavan

4’,7-dihydroxy-3’-vinyloxyflavan

OH

OMe
OMe

OMe
OMe

O

OH

O

O

O

OH
OH

O

5,6,3’-trihydroxy-7,8,4’-trimethoxyflavon

7-hydroxy-8-methoxyflavanon
OH

OH

OH

O

OH

O Glc

OH

O

2’,4’,7-trihydroxydihydrochalcon

OH

O

Kaempferol-3-O- -D-glucopyranosyl

Hình 1.7: C u trúc hóa h c các h p ch t flavonoid trong cây TNHC


11

B ng 1.1: Alcaloid c a TNHC Crinum latifolium L.
Stt
Tên alcaloid - TLTK
Khung crinin

CTPT

R1

R2

R3

R4

(I)

1
3
6
8

(I)
11-O-acetylambellin [54]

(II)

Ambellin [9],[11],[57],[92],[100],[126]
Crinafolin [61]

C20H23NO6
C18H21NO5

OMe

H

OMe

OAc

OMe

H

OMe

OH

C18H21NO6
C16H17NO3

OMe

OH

OMe

OH

OMe

H

H

H

13 Powellin [9], [84]

C17H19NO4

OH

H

OMe

H

16 6-hydroxybuphanidrin [9], [100]

C18H21NO5

OMe

OH

OMe

H

Crinin [9], [58], [83]

C20H23NO6
C18H21NO6

OMe

(II)
H
OMe

OMe

H

OMe

OH

11 Undulatin [84],[92], [100], [130], [129]

C18H21NO5

OMe

H

OMe

H

12 6-hydroxyundulatin [9], [92]

C18H21NO6

OMe

OH

OMe

H

14 Crinamidin [9], [11], [92]

C16H18NO5

OH

H

OMe

H

15 6-hydroxycrinamidin [8], [9], [11], [92], [102]

C17H19NO6

H

OH

OMe

H

2
4

11-O-Acetyl-1,2- -epoxyambellin [54]
1,2- -epoxyambellin [57], [56]

(III)

7 Crinamin [83]
9 Hamayn [83]
10 Hamyan-3-O-acety [83]

C17H19NO4
C16H17NO4
C18H19NO5

Me
H
Ac

H
H
H

(IV)

5

Crinafolidin [62], [61]

C19H23NO6

OAc


12

Tên alcaloid - TLTK

Khung lycorin

CTPT

R1

R2

R3

R4

(V)

21 Lycorin-4,5-dehydroanhydro [62]
24 Pratorimin [57]
25 Pratorinin [9], [57]

C16H11NO2
C16H11NO3
C16H11NO3

H
O

H
H

-CH2H
Me

O

H

Me

H

26 Pratosin [57]
27 Pratorin (hippadin) [9], [57]

C17H13NO3
C16H9NO3

O

H

Me

Me

O

H

-CH2-

R2

R1O
H

O
H
O

N

17 1,2-O-Diacetyl-lycorin [83]
18 Lycorin [8], [9], [57], [59], [62], [83]

C20H21NO6
C16H17NO4

Ac

OAc

H

OH

19 Lycorin-1-Oac [9], [83]

C18H19NO5

Ac

OH

20 Lycorin-2-epi [62]
23 Lycorin-1-O- -D-Glucosid [58]

C16H17NO4
C22H27NO9

H
Glc

OH
OH

(VI)

OH
OH

OH

O

(VII)
N

O

22 2-Epipancrassidin [62]
Khung belladin

C16H17NO5
R2
R1O

(VIII)

MeO
R4O

28
29
30
31

Belladin [57]
Ryllistin [56]
Latisodin [55]
Latisolin [55]

N
R3

C19H24NO3
C19H25NO4
C17H21NO3
C24H31NO8

Me
Me
H

Glc

H
OMe
H
H

Me
H
H
H

Me
Me
Me
Me


13

CH3 N
O

OH
O

O
O

32 Hippeastrin [84]

(khung lycorenin)

C17H17NO5

(IX)

CH3
N

O
O

O

33 Augustamin [9], [11], [93]

O

C17H19NO4

(khung augustamin)
Khung cheryllin

(X)

OH

R2

H

H3CO
N CH3

R1

34 Cheryllin [83]
35 Latifin [58], [83], [84]

C17H19NO3
C17H19NO3
O

OH

H

H

OH

(XI)

O

OH

OH
O

O
N

N

36 Latindin [58] (khung clivimin)

O

O

O

O

C41H31N3O10

N

(XII)


14

1.3. T NG QUAN TÁC D NG SINH H C CHI CRINUM VÀ TNHC
1.3.1. Tác d ng sinh h c c a m t s loài trong chi Crinum
Các loài trong chi Crinum đ

c quan tâm do có nhi u tác d ng sinh h c. Nhóm đ

c

chú ý nhi u nh t là alcaloid [52], [58], [107], [116], k đ n là flavonoid [31], [103].
- Tr

c đây, các loài này đ

Thân hành và lá t

c s d ng nh thu c c truy n:

i c a các loài C. amabile, C. asiaticum, C. defixum, C. giganteum

đi u tr các ch ng m n nh t, s ng l , s ng do viêm [4], [21], [58].
Cao c n và cao n

c chi t t thân hành c a loài C. zeylanicum đ

thu c c truy n trong đi u tr các ch ng viêm, v t th
ép t lá t

c s d ng nh v

ng m ng m , tr r n c n. D ch

i dùng đ tr ch ng đau tai [107], [125].

- Các cơng trình khoa h c cho th y các loài trong chi Crinum th hi n ho t tính sinh
h c chung c a h Amaryllidaceae [52], [107], [116] nh sau:
1.3.1.1. Tác d ng kháng acetylcholinesterase:

- Th

nghi m sàng l c kh n ng kháng acetylcholinesterase b ng ph

ng pháp

SKLM, ch t đ i chi u galantamin trên 15 m u cao methanol t thân hành c a 15 loài
trong h

Amaryllidaceae. K t qu cho th y cao chi t C. powellii và Amaryllis

belladonna

n ng đ 10 mg/ml th hi n ho t tính cao nh t [117].

- Cao thân hành c a lồi C. bulbispermum có kh n ng kháng acetylcholinesterase
v i IC50 = 0,14 ± 0,039 µg/ml và C. moorei v i IC50 = 21,5 ± 8,40 µg/ml. Ho t tính
này đ

c gi i thích là do thành ph n alcaloid [34], [51].

- Cao methanol t thân hành c a loài C. jagus (45,1%) và C. glaucum (40,8%) n ng
đ 100 µg/ml. Tính kháng acetylcholinesterase có liên quan đ n s hi n di n c a
nhóm hydroxy trong c u trúc c a alcaloid [66].
1.3.1.2. Tác d ng ch ng oxi hóa:
- Li u 200 mg/kg, cao ethanol c a loài C. asiaticum làm gi m l
máu, gi m cholesterol, triglycerid đ

ng đ

c quan sát sau 15 ngày đi u tr .

ng trong

ng th i, các

ch s men gan đ u gi m ch ng t cao chi t có th b o v t bào gan theo c ch
ch ng oxi hóa trên mơ gan c a chu t b ti u đ

ng [71].