Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn (Catharanthus roseus L.) của Việt Nam - Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Tp. Hồ Chí Minh

Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (495.64 KB, 20 trang )

<b>NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN </b>

<b>“NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO </b>

<b>DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( </b><i><b>CATHARANTHUS ROSEUS</b></i><b> L.) </b>

LUẬN VĂN THẠC SĨ: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

</div>
<span class='text_page_counter'>(2)</span><div class='page_container' data-page=2>

<b>NGUYỄN THỊ THANH HUYỀN </b>

<b>“NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP HỆ THỐNG NUÔI CẤY TẾ BÀO </b>

<b>DẠNG HUYỀN PHÙ CÂY DỪA CẠN ( </b><i><b>CATHARANTHUS ROSEUS</b></i><b> L.) </b>

<b>Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm </b>

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
Hƣớng dẫn 1 : TS. Trần Mỹ Linh
Hƣớng dẫn 2: TS. Nguyễn Tƣờng Vân

</div>
<span class='text_page_counter'>(3)</span><div class='page_container' data-page=3>

Tôi xin cam đoan:

Đây là cơng trình nghiên cứu của tơi và một số kết quả cùng cộng tác với
các cộng sự khác.

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án này là trung thực và chƣa
đƣợc ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác.

</div>
<span class='text_page_counter'>(4)</span><div class='page_container' data-page=4>

Với lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin trân trọng cảm ơn TS.
Trần Mỹ Linh – Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam (VAST), TS. Nguyễn Tƣờng Vân – Viện Công nghệ sinh học,
VAST và ThS. Nguyễn Chi Mai - Viện Hóa sinh biển, VAST đã tận tình
hƣớng dẫn, động viên tơi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Xin cảm ơn
Nhiệm vụ HTQT cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, mã số
QTBY01.05/18-19 do TS. Trần Mỹ Linh làm chủ nhiệm đã hỗ trợ trong quá
trình thực hiện nghiên cứu.

Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô trong Học viện Khoa

học và Cơng nghệ, VAST đã hết lịng truyền đạt kiến thức cho tôi xong suốt
hai năm học vừa qua.

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ thuộc Phòng Nghiên cứu Tài
nguyên sinh vật – Viện Hóa sinh biển, VAST đã tạo điều kiện và giúp đỡ tơi
trong q trình thực hiện luận văn.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè động viên giúp
đỡ tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện luận văn.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

<i><b>Hà Nội, ngày tháng năm 2020 </b></i>
<b> Học viên </b>

</div>
<span class='text_page_counter'>(5)</span><div class='page_container' data-page=5>

LỜI CAM ĐOAN ... 1

LỜI CẢM ƠN ... 2

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ... 5

DANH MỤC CÁC BẢNG ... 6

DANH MỤC CÁC HÌNH ... 7

MỞ ĐẦU ... 8

CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ... 10

1.1. Giới thiệu chung về dừa cạn ... 10

1.1.1. Đặc điểm sinh học và phân bố ... 10

1.1.2. Giá trị y học ... 11

1.2. Nuôi cấy mô tế bào cây thuốc in vitro ... 12

1.2.1. Các xu hƣớng trong sản xuất chất thứ cấp in vitro ... 13

1.2.2. Các yếu tố chính ảnh hƣởng ni cấy mơ và tế bào cây thuốc in vitro ... 16

1.2.3. Nuôi nhân chồi in vitro ... 19

1.2.4. Nuôi cấy mô sẹo và tế bào huyền phù ... 20

1.3. Nuôi cấy mô cây dừa cạn để tăng cƣờng sx chất thứ cấp có hoạt tính sinh học 23
1.4. Những thách thức trong sản xuất chất thứ cấp in vitro ... 26

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 27

2.1. Vật liệu ... 27

2.1.1. Các giống thực vật nghiên cứu ... 27

2.1.2. Các môi trƣờng dùng cho nghiên cứu ... 27

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu ... 28

2.2.1. Khử trùng và nảy mầm hạt ... 28

2.2.2. Tạo nguồn vật liệu bằng phƣơng pháp nhân nhanh chồi in vitro ... 28

2.2.3. Thí nghiệm cảm ứng tạo mô sẹo từ đoạn thân dừa cạn ... 28

2.2.3.1. Tối ƣu hóa loại và nồng độ chất điều hòa sinh trƣởng lên khả năng tạo mơ
sẹo ... 28

</div>
<span class='text_page_counter'>(6)</span><div class='page_container' data-page=6>

2.2.3.3. Tối ƣu hóa kích thƣớc đoạn thân ... 29

2.2.3.4. So sánh khả năng tạo mô sẹo giữa các giống dừa cạn thu thập tại Việt Nam30
2.2.4. Tối ƣu hóa mơi trƣờng nhân nhanh mô sẹo dừa cạn ... 30

2.2.5. Phát triển điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa cạn ... 30

2.2.6. Đánh giá ảnh hƣởng của ánh sáng và nhiệt độ lên sự phát triển của tế bào
huyền phù dừa cạn... 31

2.2.7. Tách chiết và định lƣợng alkaloid tổng số ... 31

CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ... 33

3.1. Nghiên cứu tạo mô sẹo phù hợp cho việc nuôi cấy tế bào huyền phù từ các vật
liệu ban đầu khác nhau của hai giống dừa cạn ... 33

3.1.1 Đánh giá khả năng nảy mầm hạt dừa cạn trong điều kiện in vitro ... 33

3.1.2. Đánh giá khả năng nhân chồi in vitro của dừa cạn ... 33

3.1.3. Nghiên cứu cảm ứng tạo mô sẹo từ các vật liệu nuôi cấy in vitro ... 35

3.1.4. Nghiên cứu ảnh hƣởng của đoạn lóng thân đến khả năng hình thành mơ sẹo 39
3.1.5. Tối ƣu hóa kích thƣớc đoạn thân dùng trong thí nghiệm cảm ứng tạo mơ sẹo39
3.1.5. Đánh giá khả năng hình thành mơ sẹo ở hai giống dừa cạn QN02 và H01 từ
đoạn thân thứ 3, kích thƣớc 0,3cm ... 41

3.2. Nghiên cứu phát triển tế bào huyền phù dừa cạn ... 43

3.2.1. Phát triển mơi trƣờng nhân nhanh mơ sẹo, bảo tồn khả năng sinh tổng hợp
alkaloid ... 43

3.2.2. Ảnh hƣởng của nồng độ tế bào ban đầu đến sự phát triển của tế bào dừa cạn
nuôi lỏng ... 47

3.2.3. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và ánh sáng lên tốc độ phát triển của tế bào ... 49

3.2.4. So sánh khả năng nhân nhanh của tế bào huyền phù của hai giống dừa cạn
QN02 và H01 ... 51

CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ... 54

4.1. Kết luận ... 54

4.2. Kiến nghị ... 54

</div>
<span class='text_page_counter'>(7)</span><div class='page_container' data-page=7>

<b>DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT </b>
2,4,5-T 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic axit

2,4-D Axit 2,4-Dichlorophenoxyacetic

B5 Môi trƣờng nuôi cấy của Gamborg (1968)
BAP 6-benzyladenine

CT Công thức

DDW Nƣớc cất hai lần (double distilled water)
DW Trọng lƣợng khô – dry weight

IAA Indole Acetic acid
IBA Indole-3-butyric acid

Kin Kinetin

LS Môi trƣờng nuôi cấy của Linsmaier và Skoog (1965)
MS Môi trƣờng nuôi cấy của Murashige và Skoog (1962)
N6 Môi trƣờng nuôi cấy của Chu và cs (1975)

NAA α-Naphthaleneacetic acid

</div>
<span class='text_page_counter'>(8)</span><div class='page_container' data-page=8>

</div>
<span class='text_page_counter'>(9)</span><div class='page_container' data-page=9>

</div>
<span class='text_page_counter'>(10)</span><div class='page_container' data-page=10>

Từ lâu thực vật luôn là nguồn cung cấp một số lƣợng khổng lồ các hợp
chất hóa học có hoạt tính và đƣợc dùng làm thuốc. Các hợp chất hoạt tính
sinh học đƣợc chiết xuất từ thực vật có thể đƣợc sử dụng nhƣ thuốc điều trị

bệnh, thực phẩm chức năng, thuốc bảo vệ thực vật, phụ gia thực phẩm, thuốc
nhuộm, chất tạo hƣơng vị và mỹ phẩm. Hiện có khoảng 25–28% thuốc chữa
bệnh có nguồn gốc từ thực vật, hơn 60% thuốc điều trị ung thƣ trực tiếp hoặc
gián tiếp từ thực vật và có nhiều loại khơng có sản phẩm tổng hợp hoặc bán
tổng hợp thay thế. Vì thế nguồn sinh khối thực vật đang ngày một tăng cao và
những nghiên cứu nhằm tăng cƣờng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp có
hoạt tính dƣợc học là địi hỏi cấp bách..

Trong vài thập kỷ qua, kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã có
những bƣớc phát triển vƣợt bậc, là một phƣơng pháp thay thế thích hợp trong
việc tạo các nguồn sinh khối ở quy mô khác nhau khơng phụ thuộc vào mùa
vụ. Ngồi ra, việc ni cấy mơ tế bào cịn có thể tiến hành ở bất cứ nơi nào
trong điều kiện vô trùng và không phải sử dụng các chất bảo vệ thực vật độc
hại. Một trong những tiến bộ đáng kể trong kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật
chính là tạo tế bào dạng huyền phù (tế bào khơng bị biệt hóa) của thực vật để
nghiên cứu các hoạt tính sinh học và sản xuất các chất trao đổi thứ cấp có giá
trị. Ni cấy tế bào huyền phù cịn là một trong những giải pháp để cải thiện
khó khăn khi nồng độ các chất trao đổi thứ cấp trong cây thấp và đã đƣợc phát
triển thành công nhƣ chất artemisinin (phân lập từ cây thanh hao hoa vàng, có
tác dụng chữa sốt rét) và chất paclitaxel (hay taxol, phân lập từ cây thơng đỏ,
có tác dụng chữa ung thƣ).

</div>
<span class='text_page_counter'>(11)</span><div class='page_container' data-page=11>

(lymphosarcoma), ung thƣ biểu mô rau (choriokarsinoma), u nguyên bào thần
kinh, ung thƣ vú, ung thƣ phổi, bệnh Hodgkin, các khối u dạng Wilkin và ung
thƣ tế bào lƣới. Trên thực tế nhu cầu về các alkaloid ngày một tăng, nhƣng
quá trình sản xuất những hợp chất này vẫn gặp nhiều khó khăn do hai hợp
chất này chỉ có mặt trong cây dừa cạn với hàm lƣợng rất thấp, khoảng
0,0002-0,0005% tổng hàm lƣợng alkaloid trong cây và phụ thuộc vào giống và các
cơ quan khác nhau của cây. Vì thế, sử dụng kỹ thuật ni cấy tế bào in vitro
để phát triển sinh khối và sau đó là điều khiển sinh tổng hợp các chất thứ cấp

có giá trị đã đƣợc nghiên cứu rộng rãi, đặc biệt ở cây dừa cạn, tuy nhiên kết
quả vẫn còn hạn chế và phụ thuộc nhiều vào hệ thống nuôi cấy bao gồm vật
liệu, điều kiện nuôi cấy… Trong khuôn khổ luận văn này, nghiên cứu sẽ tập
trung “ <b>Nghiên cứu thiết lập hệ thống nuôi cấy tế bào huyền phù cây dừa </b>
<b>cạn (</b><i><b>Catharanthus roseus</b></i><b> L.) của Việt Nam</b>” nhằm chọn tạo đƣợc các
dịng tế bào có khả năng phát triển sinh khối với tốc độ nhanh và giữ đƣơc
khả năng tổng hợp các chất thứ cấp. Kết quả của luận văn sẽ là cơ sở cho
những nghiên cứu tiếp theo nhằm cải thiện khả năng tổng hợp các chất thứ
cấp của tế bào dừa cạn ở điều kiện in vitro.

Để đạt đƣợc mục tiêu, các công việc cụ thể sẽ đƣợc tiến hành nhƣ sau:

1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của vật liệu, mơi trƣờng, chất kích thích sinh
trƣởng khác nhau đến khả năng hình thành mô sẹo của 02 giống dừa
cạn của Việt Nam.

</div>
<span class='text_page_counter'>(12)</span><div class='page_container' data-page=12>

<b>CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU </b>
<b>1.1.</b> <b>Giới thiệu chung về dừa cạn </b>

Dừa cạn có tên khoa học là <i>Catharanthus roseus </i>(L) G. Don, tên
thƣờng gọi là dừa cạn hoặc bông dừa hay trƣờng xuân hoa là một loài thực vật
thân thảo thuộc chi <i>Catharanthus, họ Trúc đào (Apocynaceae). Chi </i>
Catharanthus gồm 8 lồi, trong đó 7 lồi có nguồn gốc từ bán đảo Madagascar
(C. coriaceus, C. lanceus, C. longifolius, C. ovalis, C. roseus, C. scitulus, C.
<i>trichophyllus) và 1 loài C. pusillus từ Ấn Độ. Loài Catharanthus roseus </i>(L)
G. Don (dừa cạn) đƣợc du nhập vào Việt Nam, phân bố ở nhiều vùng, trải dài
từ Bắc vào Nam [1]. Loài cây này chủ yếu đƣợc trồng ở các nƣớc nhiệt đới, ở
những vùng lạnh cây đƣợc trồng vào mùa hè vì khơng chịu đƣợc lạnh.

</div>
<span class='text_page_counter'>(13)</span><div class='page_container' data-page=13>

của ống vành, tâm bì rời ở nỗn sào với năm cánh giống thùy hoa. Quả là
một cặp nang dài khoảng 2-4 cm và rộng 3 mm. Dừa cạn <i>C. roseus là một </i>
loài khác biệt với hầu hết các loài khác trong họ ở khả năng tự tƣơng thích.
Tuy nhiên, quá trình tự thụ phấn trong hoa thƣờng khơng xảy ra ở cây dừa cạn
vì sự tách biệt vật lý giữa nhụy và bao phấn, một hiện tƣợng đƣợc gọi là
herkogamy ngƣợc, khi nhụy bị thấp xuống dƣới mức bao phấn [3].

Ở Việt Nam, dừa cạn là cây hoang dại, có vùng phân bố tự nhiên tƣơng
đối đặc trƣng từ tỉnh Quảng Ninh đến Kiên Giang dọc theo vùng ven biển, tập
trung ở các tỉnh miền Trung nhƣ Thanh Hóa, Nghệ An, Thừa Thiên - Huế,
Quảng Nam, Đà Nẵng, Bình Định và Phú Yên. Ngoài ra dừa cạn còn xuất
hiện ở các đảo nhƣ Cô Tô, Côn Đảo và Phú Quốc [1]. Ở những vùng phân bố
tự nhiên ven biển, dừa cạn có khi mọc gần nhƣ thuần loại trên các bãi cát dƣới
rừng phi lao, trảng cỏ cây bụi thấp, có khả năng chịu đựng điều kiện đất đai
khô cằn của vùng cát ven biển.

</div>
<span class='text_page_counter'>(14)</span><div class='page_container' data-page=14>

phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 9 hợp chất có hoạt tính ức chế
enzyme glucosidase từ cây và rễ dừa cạn thu hái tại Hồi Nhơn, Bình Định,
trong đó có 2 chất lần đầu tiên đƣợc phân lập từ loài này. Đánh giá hoạt tính
gây độc tế bào trên 9 dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời, gồm ung thƣ gan
(Hep-G2), ung thƣ biểu mô (KB), ung thƣ phổi (LU-1), ung thƣ vú (MCF-7),
melanoma cancer ung thƣ sắc tố (SK-Mel2), ung thƣ bạch cầu cấp tính
(HL60), ung thƣ buồng trứng (SW626), ung thƣ tuyến tiền liệt (LNCaP) và
ung thƣ ruột kết (HT-29) đã có những kết quả nhất định. Mặc dù có vai trò
quan trong nhƣng cấu trúc phức tạp của vinblastine và vincristine làm cho
việc tổng hợp hóa học các chất này rất khó khăn.

Dừa cạn cũng đƣợc dùng phổ biến trong các bài thuốc Đông y để trị
cao huyết áp, trị bệnh tiểu đƣờng, tiêu hóa kém, lỵ thông tiểu tiện, bệnh đi
tiểu đỏ và ít... Một số trƣờng hợp cịn dùng để trị ung thƣ máu, ung thƣ phổi
[7]. Trƣớc đây, nguồn dừa cạn mọc tự nhiên ở Việt Nam tƣơng đối dồi dào.
Trƣớc năm 1975, miền Bắc đã từng xuất khẩu sang Đông Âu 1-3 tấn/năm.
Những năm gần đây, lƣợng xuất khẩu sang Pháp (khoảng trên 10 tấn/năm)
thƣờng xuyên hơn, nhƣng chủ yếu là từ cây trồng tại Phú Yên.

<b>1.2.</b> <b>Nuôi cấy mô tế bào cây thuốc </b><i><b>in vitro</b></i>

</div>
<span class='text_page_counter'>(15)</span><div class='page_container' data-page=15>

cấp dùng trong chăm sóc sức khỏe cho con ngƣời (ví dụ, thuốc chống ung
thƣ) [8].

Những ƣu điểm chính của hệ thống ni cấy mơ tế bào so với trồng trọt
ngồi tự nhiên bao gồm: các hợp chất thực vật đƣợc lựa chọn có thể đƣợc tạo
liên tục khơng phụ thuộc các yếu tố bên ngoài nhƣ mùa vụ, điều kiện đất đai
và khí hậu; các tế bào nuôi cấy không bị đe dọa bởi sự tấn công của vi sinh
vật hoặc côn trùng; các tế bào của bất kỳ lồi thực vật nào thậm chí là những
lồi q hiếm hoặc có nguy cơ tuyệt chủng có thể dễ dàng duy trì để tạo ra
các chất chuyển hóa thứ cấp; và q trình sản xuất chất chuyển hóa thứ cấp có
thể điều khiển nhằm giảm chi phí và cải thiện năng suất.

<i><b>1.2.1.</b></i> <i><b>Các xu hướng trong sản xuất chất thứ cấp in vitro </b></i>

Nuôi cấy in vitro liên quan đến việc sản xuất các tế bào, mô và cơ quan
mới đơn thuần từ phân bào, do đó tạo ra các tế bào, mơ và cơ quan, có cùng
gen di truyền của cây mẹ. Việc sử dụng các kỹ thuật in vitro để tạo ra các chất
thứ cấp, đặc biệt là các chất có hoạt tính dƣợc học có những ƣu điểm chính
nhƣ khơng bị ảnh hƣởng bởi các điều kiện mơi trƣờng bên ngồi và các điều
kiện ni cấy đƣợc kiểm sốt trong phịng ni cấy; việc sinh tổng hợp chất

thứ cấp có khả năng cải thiện bằng cách tạo ra các quy trình đặc thù cho
từng bƣớc để tăng tốc tích lũy sinh khối tƣơi và tăng nồng độ chất trong các
mơ; có thể sản xuất quanh năm khơng phụ thuộc vào mùa vụ; các chất thứ cấp
đƣợc tạo ra trong điều kiện vơ trùng và có rất ít rủi ro bị nhiễm bởi các hợp
chất độc hại không mong muốn.

</div>
<span class='text_page_counter'>(16)</span><div class='page_container' data-page=16>

chế trong trong điều kiện thiếu ánh sáng và CO2 nồng độ thấp; các chất điều

hòa sinh trƣởng thực vật, đƣợc sử dụng để kiểm sốt sự phát triển của mơ và
để kích thích sự gia tăng sinh khối thực vật và hàm lƣợng chất thứ cấp; các
chất bổ sung khác nhƣ axit amin, vitamin, than hoạt tính, chất chống oxy hóa
và các chất khác tùy thuộc vào lồi cụ thể.

Các vật liệu ban đầu cho việc nuôi cấy thƣờng là các chồi mang mô
phân sinh, các mảnh lá non và các mô phù hợp khác, đƣợc khử trùng bề mặt
(vô trùng) để loại bỏ vi sinh vật sử dụng cồn 70% hoặc natri hypochlorite.
Tiếp theo, các vật liệu ban đầu đƣợc cấy vào môi trƣờng nuôi cấy phù hợp để
bắt đầu thiết lập hệ thống ni cấy <i>in vitro. Khởi đầu của hệ thống có thể là </i>
tạo mô sẹo từ các các mô phân sinh, tạo cây hoàn chỉnh, tạo chồi hoặc chỉ là
tạo rễ in vitro. Một vài vật liệu ban đầu nhƣ mảnh lá, có thêm một một số giai
đoạn đƣợc gọi là organogenesis để biến các dạng tế bào chuyên biệt thành các
tế bào có khả năng phân bào và phát triển mô sẹo (indirect organogenesis)
hoặc chồi và chồi trực tiếp từ mô ban đầu (direct organogenesis). Sau khi
thiết lập thành công giai đoạn khởi đầu nuôi cấy in vitro, không bị nhiễm với
vi khuẩn và nấm, các giai đoạn tiếp theo bao gồm quá trình nhân các tế bào,
mô, chồi và rễ. Các giai đoạn này rất quan trọng, có tính quyết định về hiệu
quả kinh tế của quá trình, chủ yếu là do càng nhiều tế bào và mô đƣợc sản
xuất, năng suất của các chất thứ cấp mục tiêu càng cao.

</div>
<span class='text_page_counter'>(17)</span><div class='page_container' data-page=17>

xuất chất thứ cấp mục tiêu; iii) biến đổi gen của cây thuốc để sản xuất chất

thứ cấp trong các mô cụ thể, nhằm cải thiện hiệu quả sản xuất sinh khối, tế
bào và do đó, chất thứ cấp từ các lồi hiếm hoặc khó phát triển trong tự nhiên,
hoặc các chất ở nồng độ thấp trong các loài ban đầu đƣợc cải thiện hiệu quả
hơn.

Q trình vi nhân giống có thể góp phần vào việc sản xuất thuốc thảo
dƣợc và các sản phẩm thông thƣờng sử dụng hợp chất thứ cấp đƣợc chiết xuất
từ cây thuốc. Các kỹ thuật vi nhân giống in vitro đẩy nhanh quá trình sản xuất
cây vơ tính từ giống có khả năng sinh tổng hợp các chất thứ cấp tốt hơn và có
thể phát triển tốt hơn trong điều kiện tự nhiên. Mặc dù hai phƣơng thức cịn
lại cũng có thể dẫn đến việc sản xuất các loại thuốc thảo dƣợc, nhƣng đƣợc
ứng dụng chủ yếu để sản xuất các chất thứ cấp có giá trị cao vì chi phí của
các kỹ thuật liên quan tƣơng đối đắt đỏ [9]. Dùng các chất elicitor là một
phƣơng tiện có thể thúc đẩy những khó khăn khác nhau liên quan đến việc
sản xuất quy mô lớn của hầu hết các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh
học quan trọng từ thực vật, ni cấy mơ biệt hóa và khơng biệt hóa bằng cách
áp dụng nồng độ thấp của các yếu tố sinh học và phi sinh học đã đƣợc tiến
hành rộng rãi. Một vài hợp chất hóa học thƣờng đƣợc sử dụng là salicylic
axit, metyl salicylat, axit bezoic, chitosan, v.v. có ảnh hƣởng đến sản xuất các
hợp chất phenolic và kích hoạt các enzym liên quan đến chống chịu trong
thực vật [10]. Đối với tạo cây thuốc biến đổi gen, hiện đang có nhiều yêu cầu
về an toàn sinh học liên quan đến việc trồng cây dƣợc liệu chuyển gen ngoài
tự nhiên và nhận thức của ngƣời tiêu dùng [9]. Do vậy, các mô chuyển gen in
<i>vitro sẽ chỉ có nghĩa là để tạo ra sinh khối cho việc chiết xuất các hợp chất </i>
hóa học tinh khiết (nhƣ ở cây không chuyển gen).

</div>
<span class='text_page_counter'>(18)</span><div class='page_container' data-page=18>

muốn. Các tế bào phát triển rất nhanh này sẽ cho phép tăng khả năng sinh
tổng hợp chất thứ cấp theo cấp số nhân. Tế bào cây thuốc lá đƣợc lựa chọn vì
đây là các tế bào dễ dàng tiến hành biến đổi gen và cho phép điều khiển quá
trình phát triển sinh khối. Ngoài ra, cây thuốc lá biến đổi gen đã đƣợc dùng để

sản xuất các loại chất có hoạt tính khác nhau nhƣ vắc-xin, hormone và kháng
thể [11].

<i><b>1.2.2.</b></i> <i><b>Các yếu tố chính ảnh hưởng ni cấy mơ và tế bào cây thuốc in vitro </b></i>
Kiểu gen là yếu tố có ảnh hƣởng trực tiếp đối với việc sản xuất sinh
khối thực vật và chất thứ cấp. Các giống có hàm lƣợng chất thứ cấp cao là lựa
chọn đầu tiên cho việc sử dụng nuôi cấy mơ. Ví dụ nhƣ cây gai Ấn độ
(Pilocarpus microphyllus) có hàm lƣợng pilocarpin, một alkaloid có vai trò
tăng cƣờng hoạt động của hệ thần kinh giao cảm, nằm trong khoảng từ 16,3
đến 235,9 µg/g lá khơ tùy thuộc vào giống [12], có sự chênh lệch đến 14,5
lần về hàm lƣợng pilocarpin. Tuy nhiên, các kiểu gen quý của cây dƣợc liệu
có hàm lƣợng chất có hoạt tính cao cịn hạn chế và cần phải có những nghiên
cứu chi tiết đối với các giống ở từng vùng địa lý khác nhau.

</div>
<span class='text_page_counter'>(19)</span><div class='page_container' data-page=19>

mô, đồng hồ sinh học; và các yếu tố ngoại sinh, chẳng hạn nhƣ chu kỳ quang,
cƣờng độ chiếu sáng và bƣớc sóng, nhiệt độ, nguồn nƣớc, loại đất và thành
phần khơng khí, có thể riêng rẽ hoặc phối hợp ảnh hƣởng đến cả thành phần
và nồng độ của một chất thứ cấp đơn lẻ hoặc nhiều chất khác nhau [14,15].

Những yếu tố tƣơng tự cũng có thể ảnh hƣởng đến hình thành các chất
thứ cấp có hoạt tính trong ni cấy in vitro. Ví dụ, Kapoor và cs [16] cho biết
chỉ cần một thay đổi một yếu tố là chất lƣợng ánh sáng đã có ảnh hƣởng đến
tích lũy sinh khối, tốc độ sinh trƣởng và nồng độ của hợp chất phenolic
Salidroside trong cây rễ vàng Rhodiola imbricata. Dƣới tác động của ánh sáng
đỏ, mơ sẹo có chỉ số tăng trƣởng cao nhất (2,97) và nồng độ phenolic tổng số
và Salidroside lại cao nhất dƣới ánh sáng xanh sau 21 ngày nuôi cấy. Trong
trƣờng hợp này, nuôi cấy mô sẹo để phát triển sinh khối cần ánh sáng trắng và
sau đó để tăng cƣờng sinh tổng hợp chất mong muốn sẽ chuyển đổi sang ánh
sáng xanh. Các yếu tố khác có thể đƣợc vì thế cũng cần đƣợc tối ƣu hóa để cải
thiện q trình ni cấy, chẳng hạn nhƣ kết hợp ánh sáng xanh /trắng với tỷ lệ

thích hợp có thể cải thiện đồng thời việc tăng sinh khối và sinh tổng hợp chất
thứ cấp.

</div>
<span class='text_page_counter'>(20)</span><div class='page_container' data-page=20>

Diện tích cần dùng cho ni cấy in vitro thay đổi tùy theo loại và kích
cỡ bình, hiệu quả tạo sinh khối và hệ thống sử dụng. Các hệ thống thông
thƣờng bao gồm môi trƣờng bán rắn, chứa agar hoặc mơi trƣờng lỏng, có
khuấy trộn không liên tục hoặc trong hệ thống bioreactor ngập tạm thời (TIB).
Việc sử dụng TIB đƣợc cho gia tăng tích lũy sinh khối tốt hơn so với ni cấy
trên môi trƣờng bán rắn [17, 18].

Các yếu tố phi sinh học, chẳng hạn nhƣ nhiệt độ, ánh sáng cƣờng độ,
thời gian chiếu sáng và bƣớc sóng, độ ẩm tƣơng đối và thành phần khơng khí
quyển trong bình ni cũng ảnh hƣởng mạnh đến sự tích lũy sinh khối tƣơi và
khơ, nồng độ chất trong sinh khối và thời gian nuôi. Những đặc điểm trên
cũng phụ thuộc vào từng lồi cây thuốc cần ni cấy. Mơi trƣờng nuôi cấy và
các thành phần dinh dƣỡng, chẳng hạn nhƣ lƣợng nƣớc và áp suất của môi
trƣờng nuôi cấy, dinh dƣỡng đa lƣợng, vi lƣợng, carbohydrate, vitamin và axit
amin, và các chất kích thích sinh trƣởng thuộc các nhóm khác nhau nhƣ
auxin, cytokinin [19], gibberellin, jasmonate và salicylate [20] cũng ảnh
hƣởng sâu sắc đến các đặc điểm này.

</div>


Luận văn thạc sĩ Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu ảnh hưởng bổ sung tế bào và hormone lên sự phát triển của phôi lợn thụ tinh ống nghiệm