Nghiên cứu cố định urease trên bề mặt rắn - Võ Khôi Nguyên

Luận văn tốt nghiệp
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE
1.1.1 Giới thiệu chung về enzyme urease [2, 7, 77, 92]
Urease có tên hệ thống là carbamine amidohydrolase, là enzyme xúc tác quá trình
thủy phân urea thành ammonia và khí cacbonic. Nó thuộc nhóm enzyme hydrolase
(enzyme thủy phân).
Trong bảng phân loại enzyme theo quy ước quốc tế, urease mang mã số EC 3.5.1.5
trong đó: số 3 chỉ nhóm chính-hydrolase, số 5 chỉ nhóm phụ enzyme tác dụng lên liên kết C-
N, khác liên kết peptid, số 1 chỉ phân nhóm phụ cắt các amid thẳng (amidohydrolase), số 5
chỉ số thứ tự của urease trong phân nhóm phụ.
Hình 1.1: Enzyme urease
1
Luận văn tốt nghiệp
Như vậy, từ tên kí hiệu quốc tế của urease, ta có thể biết được nó là enzyme thủy
phân thuộc nhóm amidase, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết C-N, không phải liên kết
peptid.
Urease lần đầu tiên được J.B.Sumner tách chiết và kết tinh từ đậu rựa (jack bean -
Canavalia ensiformis) vào năm 1926.
Hiện nay, urease từ đậu rựa là loại urease được sử dụng nhiều nhất.
1.1.2 Cấu tạo
Bình thường urease tồn tại ở dạng tinh thể 8 cạnh, trong suốt không màu, có đường
kính tùy phương pháp chiết tách và có khối lượng cũng như hình dạng khác nhau tùy vào
nguồn thu nhận [7].
Hình 1.2: Tinh thể urease được J.B.Sumner tách chiết và kết tinh.
Urease là một enzyme cấu trúc bậc 4. Mỗi phân tử enzyme có từ 3 – 4 tâm hoạt
động. Các nghiên cứu đã chứng minh rằng có sự hiện diện của các nhóm –SH tại trung tâm
hoạt động. Các nhóm này đóng vai trò rất quan trọng đối với khả năng xúc tác của urease:
góp phần trong việc hình thành phức chất enzyme – cơ chất, kết hợp cơ chất với các
cofactor của enzyme, duy trì cấu trúc không gian của enzyme để đảm bảo hoạt lực xúc tác.
Các nghiên cứu cho thấy rằng hoạt tính của urease giảm khá nhiều nếu như các nhóm –SH

này bò vô hoạt [7,92].
2
Luận văn tốt nghiệp
Ngoài ra, tại trung tâm hoạt động, người ta còn tìm thấy sự có mặt của 2 ion Ni
2+
. Hai
ion này liên kết rất chặt chẽ với phân tử protein. Tuy nhiên, trong môi trường acid với sự có
mặt của EDTA nồng độ 1mM thì các ion này bò giải phóng khỏi liên kết, dẫn đến việc giảm
hoạt tính của urease. Các ion Ni
2+
tạo liên kết với các acid amin và tạo ra bề mặt hoạt hóa
làm tăng hoạt tính của enzyme [2,7,92].
Hình 1.3: Trung tâm hoạt động của enzyme urease
Về khối lượng phân tử, urease từ những nguồn khác nhau có phân tử lượng khác
nhau. Theo các kết quả nghiên cứu của Joseph và Evelyn, khối lượng phân tử urease được
xác đònh bằng phương pháp lọc gel trên cột Agarose A_15m sẽ dao động trong khoảng
420.000 Da đến 540.000 Da [45].
1.1.3 Cơ chế xúc tác [2,7,92]
3
Luận văn tốt nghiệp
Hình 1.4: Cơ chế xúc tác của urease
Cơ chế xúc tác của enzyme urease được chấp nhận nhiều nhất hiện nay là cơ chế
dựa trên vai trò khác nhau của 2 ion Ni
2+
. Trong đó, một ion sẽ liên kết và hoạt hóa urea,
còn ion còn lại sẽ liên kết và hoạt hóa nước. Dựa trên hình vẽ, ta nhận thấy, ban đầu ion
Ni
2+
- 1 tạo liên kết với nguyên tử oxy trong nhóm carbonyl và nhóm OH
-

của nước là cầu
nối giữa ion Ni
2+
- 2 với nguyên tử C trong nhóm carbonyl của urea. Ở giai đoạn sau, trong
phức hợp enzyme – cơ chất sẽ diễn ra sự chuyển dòch điện tử và kết quả là ammoniac được
giải phóng kết hợp với acid carbamic để tạo thành ammonia carbamate, kèm theo là sự tái
cấu trúc lại trung tâm hoạt động của enzyme.
Như vậy, vai trò của 2 ion kim loại Ni
2+
là rất quan trọng trong việc tạo liên kết giữa
enzyme với cơ chất ở giai đoạn tạo phức chất trung gian. Đây chính là một cofactor của
urease.
Trong thực tế, nhiều nghiên cứu đã chứng minh, trong phản ứng thủy phân urea dưới
sự xúc tác của enzyme urease, sản phẩm chính là ammonium carbamate NH
4
COONH
2
. Mặc
dù vậy, vẫn có sự phân hủy ammonium carbamate để tạo thành khí CO
2
và NH
3
và sự phân
hủy này không phụ thuộc vào việc có hay không có enzyme urease mà lại phụ thuộc vào
4
Luận văn tốt nghiệp
bản chất của dung dòch đệm sử dụng. Các loại đệm phosphate và maleate sẽ tạo thuận lợi
cho quá trình phân hủy tạo CO
2
và NH

3
, ngược lại, ammonium carbamate bền trong đệm
citrate và tris.
1.1.4 Cơ chất của enzyme urease [2,7,92]
Enzyme urease có tính đặc hiệu tuyệt đối đối với cơ chất urea. Nghiên cứu của Jabri
và cộng sự năm 1995 đã chứng minh rằng vận tốc phản ứng thủy phân urea dưới xúc tác của
enzyme urease cao hơn phản ứng thủy phân không enzyme đến 10
14
lần. Ngoài ra, người ta
nhận thấy urease cũng xúc tác phản ứng thủy phân một số cơ chất khác có cấu trúc gần
giống với urea như semicarbazide, formamide, acetamide, methylurea, hydroxyurea, phenyl
phosphorodiamidate, phosphoric triamide, diamidophosphate, phosphoramidate và một số
amide, ester khác của acid phosphoric. Tuy nhiên, tốc độ phản ứng thủy phân các cơ chất
khác của enzyme urease thấp hơn nhiều so với cơ chất là urea.
1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme urease
1.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất [4]
Tốc độ của phản ứng enzyme trong một giới hạn nào đó phụ thuộc vào nồng độ cơ
chất có trong môi trường. Khi nào chưa bò bão hòa bởi cơ chất thì tốc độ phản ứng vẫn tỉ lệ
thuận với nồng độ cơ chất.
1.1.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ
Phản ứng dưới sự xúc tác của enzyme cũng giống như các phản ứng hóa học khác
nghóa là khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng cũng tăng theo. Tuy nhiên, vì enzyme có bản
chất protein nên có thể bò biến tính nếu nhiệt độ vượt quá một giới hạn nào đó. Vì vậy, mỗi
enzyme sẽ có một nhiệt độ hoặc một khoảng nhiệt độ mà tại đó, năng lực xúc tác của nó là
cao nhất. Người ta gọi đó là nhiệt độ tối thích T
opt
cho enzyme hoạt động [4].
Đối với urease có nguồn gốc từ đậu rựa, theo các tác giả thì nhiệt độ tối thích vào
khoảng 40 – 50
o

C. Ở nhiệt độ này, hoạt tính của enzyme là lớn nhất. Khi nhiệt độ vượt quá
65
o
C, hoạt tính của urease bò giảm và có thể mất hẳn khi nhiệt độ đạt 85
o
C. Tuy nhiên,
5
Luận văn tốt nghiệp
nhiệt độ tối thích của urease không cố đònh mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nguồn thu
nhận, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, pH, thời gian phản ứng… [2,7]
Urease ở dung dòch loãng không có cơ chất thường kém bền nhiệt nhất, còn ở dạng
bột khô và có cơ chất thì khá bền nhiệt [2,7].
Ở nhiệt độ thấp, hoạt tính của urease giảm nhưng urease không bò biến tính.
1.1.5.3 Ảnh hưởng của pH
pH ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính enzyme do pH làm thay đổi trạng thái ion hóa
của phân tử enzyme và cơ chất. Nghiên cứu của Howell và Sumner về enzyme urease kết
luận urease có pH
opt
= 6 khi nồng độ cơ chất urea 8% và bằng 7,5 khi nồng độ urea là 1%.
Điều này cho thấy giá trò pH tối ưu của urease không cố đònh và nó còn phụ thuộc vào nồng
độ cơ chất, nhiệt độ cũng như vào nguồn thu nhận. Ngoài ra, tính chất của dung dòch đệm
cũng ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme urease [2,4,7].
Theo các tài liệu nghiên cứu thì pH tối thích của urease nằm trong khoảng từ 6,4 –
7,6. Urease từ đậu rựa và hầu hết các loại vi sinh vật có pH
opt
dao động xung quanh giá trò 7,
urease từ tảo Spirulina maxima có pH
opt
khoảng 8,7, trong khi đó, các loại acid urease có giá
trò pH tối thích từ 2 trở xuống [92].

1.1.5.4 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa, chất kìm hãm
Mỗi enzyme đều tồn tại một số hợp chất vô cơ hoặc hữu cơ mà sự có mặt của chúng
có khả năng kích thích hoặc kìm hãm hoạt động của enzyme, gọi là chất kích thích (chất
hoạt hóa) và chất kìm hãm (chất ức chế). Tuy nhiên không có sự phân biệt rõ ràng chất ức
chế và kìm hãm vì một chất có thể là kích thích với enzyme này nhưng là kìm hãm của
enzyme khác hoặc ở nồng độ này là kích thích, nồng độ khác là kìm hãm [6].
 Chất hoạt hóa
Chất hoạt hóa là các chất có khả năng làm tăng hoạt động xúc tác của enzyme hoặc
làm cho enzyme chuyển từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động. Các chất
này có thể là các anion, các ion kim loại, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp, có thể đóng
vai trò nhóm ngoại của các enzyme 2 cấu tử hoặc tham gia vào cấu tạo của coenzyme, hoặc
6
Luận văn tốt nghiệp
là cầu nối giữa enzyme với cơ chất, hoặc là cầu nối giữa phần apoenzyme với coenzyme
[4].
Hoạt tính của urease bò ức chế khi các nhóm –SH bò vô hoạt. Do vậy, những chất có
tác dụng phục hồi chức năng của các nhóm –SH tại trung tâm hoạt động như L-cystein thì
có thể làm hoạt hóa urease [2,7,92].
Những nhóm –SH tại tâm hoạt động chòu sự oxy hóa dưới tác động của nhiều yếu tố,
và sự oxy hóa này xảy ra với tốc độ đáng kể khi có mặt của các ion kim loại xúc tác như
Ag
+
, Cu
2+
, Hg
2+
… Khi dùng EDTA để hấp thụ các ion kim loại trong dung dòch sẽ làm cho
tính ổn đònh của enzyme urease nói riêng và các enzyme chứa nhóm –SH trong tâm hoạt
động tăng lên rất nhiều [2,7,92].
Khi nồng độ EDTA-Na

2
thấp , EDTA sẽ hấp thụ các ion kim loại, nghóa là một cách
gián tiếp cũng là một chất hoạt hóa urease.
Tuy nhiên, nếu nồng độ EDTA-Na
2
đạt đến một ngưỡng nào đó, nó sẽ hấp thụ ion
Ni
2+
tại trung tâm hoạt động của enzyme, làm ức chế urease. Điều này cũng đồng nghóa với
việc EDTA là một chất kìm hãm [92].
 Chất kìm hãm
Chất kìm hãm là các chất có tác dụng chuyển enzyme từ trạng thái hoạt động sang
trạng thái không hoạt động, hoặc từ trạng thái hoạt động mạnh sang trạng thái hoạt động
yếu. Các chất này tồn tại hai loại kìm hãm: cạnh tranh và không cạnh tranh [4].
 Kìm hãm cạnh tranh: xảy ra trong trường hợp chất kìm hãm có cấu trúc tương
đồng với cơ chất, vì vậy cũng có khả năng kết hợp với enzyme, giảm mối
liên kết giữa enzyme và cơ chất. Như vậy, các hợp chất như hydroxyurea,
dihydroxyurea, thiourea hay hydroxamic acid là những chất ức chế đặc hiệu
cạnh tranh của urease. Vì chúng có cấu tạo gần giống cơ chất (urea) nên
chúng cũng có khả năng kết hợp với enzyme. Do đó sự có mặt của chúng
trong dung dòch làm giảm tốc độ phản ứng thủy phân urea. Có thể làm giảm
7
Luận văn tốt nghiệp
tác dụng của những chất ức chế này bằng cách tăng nồng độ cơ chất urea
[2,4,7,92].
 Kìm hãm không cạnh tranh: xảy ra trong trường hợp chất kìm hãm có khả
năng kết hợp với enzyme hoặc cơ chất, có thể là ion kim loại cùng hóa trò với
các ion kim loại là nhóm ngoại của enzyme. Các ion kim loại như như Hg
2+
,

Cu
2+
, Pb
2+
, Mn
2+
… là những chất kìm hãm không cạnh tranh vì nó có hóa trò
cùng với cofactor của urease là Ni
2+
. Các ion kim loại này sẽ tranh giành các
liên kết với Ni
2+
, và do đó sẽ làm “khóa”ù trung tâm hoạt động của urease.
Urease rất nhạy cảm với sự có mặt của các ion kim loại vì ngoài tác dụng
kìm hãm không cạnh tranh như trên, các ion kim loại còn có thể làm biến tính
enzyme do chúng thúc đẩy phản ứng oxy hóa các nhóm –SH tại tâm hoạt
động. Sự kìm hãm urease của các ion kim loại giàm dần theo thứ tự sau:
Ag
+
> Hg
2+
> Cu
2+
> Zn
2+
> Cd
2+
> Au
2+
> Pb

2+
> Co
2+
> Ni
2+
> Ce
2+
> Mn
2+
.
Ví dụ: với hàm lượng AgNO
3
là 0,002 mg/ml đã làm mất hoạt tính của urease, đối
với HgCl
2
là 0,004 mg/ml và đối với Cu
2+
là 0,01 mg/ml [2,4,7,92].
Ngoài ra, các acid hay kiềm đặc cũng như các tác nhân gây kết tủa protein như acid
tricloacetic (TCA) hay tannin cũng là những chất có tác dụng kìm hãm enzyme urease.
1.1.6 Nguồn thu nhận enzyme urease [2,7,92]
Urease được các nhà khoa học tìm thấy khá sớm ở những nguồn nguyên liệu khác
nhau.
Năm 1980, Miquel tìm thấy urease ở nhiều loài vi sinh vật, nhất là các vi sinh vật
trong đất, trong thực vật và một số ít ở động vật. Ông đã tìm ra hơn 200 loài vi khuẩn, nhiều
loại nấm men và ở đa số các loại thực vật bậc cao có khả năng sinh tổng hợp urease. Các vi
khuẩn có chứa urease tham gia vào quá trình đồng hóa urea thành muối amon có nhiều loài,
chúng có tên chung là Ureabacterium, hầu hết chúng thuộc 2 họ: Cocoaceae và Bacilaceae
[2,7,92].
8

Luận văn tốt nghiệp
Trong ngành cộng nghệ sinh học, C.Palacco và A.Havir cũng đưa ra phương pháp thu
nhận enzyme từ nuôi cấy mô đậu.
Nguồn enzyme urease tự nhiên trong các cây họ đậu rất phong phú. Các nhà khoa
học đã tận dụng từ các nguồn này để trích ly ra enzyme urease và ứng dụng rộng rãi trong
các ngành phân tích thực phẩm và y học.
Bảng 1.1: Tính chất của một số loại urease từ các nguồn khác nhau (Liu và cộng
sự, 1996) [30]
Nguồn enzyme Hoạt tính riêng (đơn vò/ml) K
m
(mmol/l)
Đậu nành đen 21.8 3.75
Đậu nành xanh 25.2 3.71
Đậu rựa 137 1.54
Hạt bí ngô 34 1.55
Hạt bí ngô bỏ vỏ 26.5 1.89
Đậu nành bỏ vỏ 31.3 3.46
Hạt dưa hấu bỏ vỏ 23.6 4.16
1.1.7 Ứng dụng của enzyme urease
Enzyme urease hiện nay được ứng dụng nhiều trong các ngành nông nghiệp, thực
phẩm, trong y học và các lónh vực phân tích khác.
Trong nông nghiệp, urease được sử dụng để thúc đẩy quá trình thủy phân urea thành
NH
3
cung cấp thành phần Nitơ cho cây trồng. Quá trình thủy phân này được thực hiện bởi hệ
vi sinh vật trong đất do chúng sản sinh ra một lượng đáng kể enzyme urease.
Trong ngành thực phẩm: urease đã được ứng dụng để phát hiện sự tồn tại của urea
trong các loại sản phẩm thòt cá, nước giải khát, các sản phẩm lên men và các sản phẩm từ
sữa. Urea là một hợp chất không được phép có mặt trong thực phẩm. Vì một nguyên nhân
không mong muốn, hoặc do có chủ ý mà một lượng urea đã có mặt trong các sản phẩm thực

phẩm. Do đó mà các chế phẩm urease được sử dụng để phát hiện và, có thể đònh lượng
được urea trong thực phẩm.
9
Luận văn tốt nghiệp
Trong y học, urease được sử dụng để xác đònh hàm lượng urea trong máu và nước
tiểu của người. Đây là phương pháp khá chính xác, ít tốn kém và dễ tiến hành. Việc xác
đònh hàm lượng urea trong máu và nước tiểu sẽ cho biết năng lực hoạt động của các hệ cơ
quan, mà quan trong nhất là thận và hệ bài tiết. Ngoài ra, urease còn được gắn trong các
tiểu vi cầu dùng để loại urea của máu trong thận nhân tạo.
Trong công nghệ môi trường: urease dùng để phân tích hàm lượng các kim loại nặng
trong các chất thải và trong nguồn nước.
Trong lónh vực phân tích: urease được ứng dụng làm các điện cực urease để xác đònh
hàm lượng urea trên dòng liên tục.
1.2 SƠ LƯC VỀ ENZYME CỐ ĐỊNH [4]
1.2.1 Giới thiệu
1.2.1.1 Đònh nghóa
Enzyme cố đònh có thể được hiểu theo 2 nghóa:
 Nghóa hẹp: enzyme không hòa tan là enzyme được đưa vào những pha riêng
rẽ, pha này được tách riêng với dung dòch tự do. Pha enzyme không hòa tan
trong nước và được gắn với các polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn.
 Nghóa rộng: các chất xúc tác cố đònh là các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở
trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy, theo nghóa rộng, enzyme không
hòa tan bao gồm cả enzyme được cố đònh vào một chất mang, cả enzyme có
trong tế bào sống được cố đònh trong các bình phản ứng sinh học có sự gắn
kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần.
Enzyme không hòa tan hay enzyme cố đònh thường là những enzyme hòa tan được
gắn vào một chất mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này mà enzyme
từ trạng thái hòa tan chuyển sang không hòa tan.
1.2.1.2 Đặc điểm của enzyme cố đònh [4]
Enzyme cố đònh có các đặc điểm sau đây:

10
Luận văn tốt nghiệp
 Hoạt tính riêng của enzyme cố đònh thường nhỏ hơn hoạt tính riêng của
enzyme tự do cùng loại. Sở dó có sự thay đổi về hoạt tính riêng của enzyme
cố đònh là do những nguyên nhân sau đây:
o Do ảnh hưởng điện tích của chất mang: khi điện tích của chất mang có
sự khác biệt với điện tích của enzyme thì khi gắn enzyme vào chất
mang, cấu trúc không gian của enzyme có sự thay đổi ở mức độ nhất
đònh. Chính vì sự thay đổi cấu trúc này mà khả năng kết hợp giữa
enzyme và cơ chất sẽ kém đi, dẫn đến hoạt tính của chúng cũng giảm.
o Do enzyme bò nhốt vào mạng lưới hoặc bò liên kết bởi chất mang
khiến cho sự tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất gặp khó khăn.
 Enzyme cố đònh hoàn toàn tuân theo đònh luật Michaelis – Menten nhưng có
một số sai khác nhất đònh:
o Có thể xảy ra sự cạnh tranh cơ chất với enzyme và chất mang.
o Xảy ra hiện tưởng cản trở sự khuếch tán của cơ chất và sản phẩm làm
giảm tốc độ phản ứng.
 Enzyme cố đònh thường có tính bền nhiệt hơn enzyme tự do nhờ tác dụng che
chở của các chất mang.
 Enzyme cố đònh thường có pH tối ưu không trùng với pH tối ưu của enzyme
tự do cùng loại.
 Enzyme cố đònh có khả năng bảo quản tốt hơn enzyme tự do.
 Enzyme cố đònh có thể tái sử dụng nhiều lần do có thể tách riêng enzyme ra
khỏi cơ chất một cách dễ dàng sau phản ứng và độ bền của enzyme cố đònh
cao hơn so với enzyme tự do.
1.2.1.3 Ưu, nhược điểm của enzyme cố đònh [4]
Enzyme cố đònh có các ưu điểm sau:
 Enzyme cố đònh có thể sử dụng lặp lại nhiều lần trong một thời gian dài.
11
Luận văn tốt nghiệp

 Enzyme cố đònh không lẫn vào trong sản phẩm cuối của phản ứng enzyme,
do đó nó không gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm, hay nói cách
khác chúng ta không phải tốn chi phí cho việc tách enzyme ra khỏi sản phẩm.
 Có thể ngừng phản ứng khi cần thiết bằng cách tách hệ chất mang-enzyme ra
khỏi dung dòch cơ chất.
 Enzyme cố đònh tương đối bền với các tác nhân vật lý và hóa học hơn
enzyme tự do.
 Dễ dàng tiến hành quá trình sản xuất theo phương pháp liên tục.
Bên cạnh đó, enzyme cố đònh vẫn có một số nhược điểm như sau:
 Sự có mặt của chất mang có thể làm giảm hoạt tính của enzyme.
 Trong đa số trường hợp, enzyme có thể bò giảm hoặc mất hoạt tính sau quá
trình cố đònh.
Tuy nhiên, những hạn chế trên là không đáng kể so với lợi ích mà enzyme cố đònh
đem lại. Do vậy, ngày càng có nhiều nghiên cứu về cố đònh enzyme cũng như ứng dụng
enzyme cố đònh vào sản xuất công nghiệp.
1.2.2. Các phương pháp cố đònh enzyme [4]
Các phương pháp cố đònh enzyme được chia thành 2 nhóm chính:
 Phương pháp hóa học:
o Gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trò.
o Gắn các phân tử enzyme lại với nhau bằng liên kết cộng hóa trò.
 Phương pháp vật lý:
o Hấp phụ enzyme lên chất mang bằng liên kết vật lý như: lực mao
quản, liên kết ion, lực Van der Waals…
o Phương pháp nhốt enzyme trong khuôn gel hoặc màng bao vi thể.
12
Luận văn tốt nghiệp
Bảng 1.2: Ưu – Nhược điểm của các phương pháp cố đònh enzyme [4].
Phương pháp Ưu điểm Nhược điểm
Phương pháp hóa học
Phương pháp gắn

enzyme lên chất mang
bằng liên kết cộng hóa
trò
- Liên kết giữa enzyme
và chất mang là liên kết
bền, do đó hạn chế được
tối đa sự mất mát
enzyme trong quá trình
phản ứng.
- Hoạt tính enzyme có
thể bò giảm do những
biến đổi về cấu trúc của
enzyme trong quá trình
cố đònh.
Phương pháp gắn các
phân tử enzyme lại với
nhau bằng liên kết cộng
hóa trò
- Tạo được liên kết rất
bền trước các tác nhân
pH, nhiệt độ.
- Thường được dùng phối
hợp với các phương pháp
cố đònh khác.
- Chi phí cao, thao tác
thực hiện tương đối phức
tạp.
- Hoạt tính enzyme có
thể bò giảm do những
biến đổi về cấu trúc của

enzyme trong quá trình
cố đònh.
Phương pháp vật lý
Phương pháp gắn
enzyme lên chất mang
bằng tương tác vật lý.
- Thao tác thực hiện đơn
giản.
- Điều kiện tiến hành cố
đònh enzyme ôn hòa nên
không làm mất hoạït tính
của enzyme trong quá
trình cố đònh.
- Có khả năng tái sử
dụng chất mang.
- Do lực tương tác giữa
enzyme và chất mang
yếu nên dễ xảy ra hiện
tượng nhả hấp phụ trong
quá trình sử dụng
enzyme cố đònh do
khuấy trộn hay do thay
đổi nhiệt độ, pH của môi
trường.
Phương pháp nhốt
enzyme
- Thao tác đơn giản.
- Không đòi hỏi phải có
các nhóm tạo liên kết
nên phù hợp với nhiều

loại enzyme.
- Hiệu quả cố đònh
enzyme cao.
- Có thể cố đònh đồng
thời nhiều enzyme.
- Chỉ thích hợp cho phản
ứng với cơ chất có khối
lượng phân tử nhỏ.
13
Luận văn tốt nghiệp
1.3 TỔNG QUAN VỀ ENZYME UREASE CỐ ĐỊNH
1.3.1 Giới thiệu [92]
Nghiên cứu về enzyme urease cố đònh đã được tiến hành khá nhiều kể từ thập
niên 1960. Nhiều loại chất mang ở các dạng và kích cỡ khác nhau, đặc biệt là các màng
polymer đã được dùng để cố đònh urease. Các chất mang đó có thể là các polymer sinh
học như alginate, chitosan, các loại protein, cellulose và các dẫn xuất của nó. Bên cạnh
đó, cũng có rất nhiều nghiên cứu tìm hiểu phương pháp cố đònh trên những chất mang
hữu cơ khác như polyacrylamide, các loại nylon, màng PVC, các chất liệu silica như
TEOS (tetraethoxysilane), TMOS (tetramethoxysilane)… Những nghiên cứu trên đã góp
phần mở rộng hiểu biết về enzyme urease cũng như phạm vi ứng dụng của nó trong các
lónh vực khác nhau trong thực tế.
1.3.2. Các phương pháp cố đònh enzyme urease.
Hiện nay, hầu hết các phương pháp cố đònh enzyme nêu trên đều có thể được áp
dụng để cố đònh enzyme urease. Tuy nhiên, tùy vào mỗi phương pháp cũng như tính chất
của các chất mang mà hiệu quả cố đònh urease sẽ khác nhau. Các nghiên cứu về phương
pháp cố đònh enzyme urease được tiến hành với số lượng khá đáng kể và cũng đạt được
một số thành công nhất đònh. Có thể kể đến như sau: [92]
 Phương pháp cố đònh urease bằng liên kết cộng hóa trò trên vật liệu hỗn
hợp gồm titanium (IV) chloride và silica được Martins áp dụng vào năm
1987 cho kết quả rất khả quan: khi được sử dụng ở nhiệt độ 37

o
C, hoạt tính
của enzyme cố đònh hầu như không thay đổi so với enzyme tự do trong
suốt hơn 1200 giờ. Ngoài ra, pHopt của enzyme cố đònh cũng dòch chuyển
từ 7.4 lên 8, còn nhiệt độ tối thích thì thay đổi từ 65
o
C lên 75
o
C. Martins
cũng thấy khả năng bảo quản cũng như độ bền nhiệt của urease cố đònh
tăng lên rõ rệt.
 Phương pháp cố đònh urease trên chất mang là polymethylglutamate
(PMG) của Minamoto và cộng sự (1980) đã giữ lại đến 95% hoạt tính ban
14
Luận văn tốt nghiệp
đầu của urease. Bên cạnh đó, độ bền nhiệt của enzyme cố đònh cũng tăng
lên đáng kể nhưng các thông số khác như KM và pHopt cho thấy không có
sự thay đổi đáng kể. Urease cố đònh trong các hạt PMG được nhồi trong
các cột của bình phản ứng có thể giữ được 80% hoạt tính ban đầu trong
vòng 1 năm.
 Phương pháp cố đònh urease lên chất mang là màng chitosan bằng liên kết
cộng hóa trò qua glutaraldehyde của Krajewska và cộng sự (1990) giữ lại
được hơn 94% hoạt tính so với enzyme tự do. Bên cạnh đó, các tính chất
khác của enzyme cố đònh được cải thiện đáng kể như tính bền nhiệt, độ
bền ở pH thấp, khả năng tái sử dụng và khả năng bảo quản…[17]
 Urease cố đònh trên chất mang là sợi tổng hợp từ acrylamide và poly
(ethylene terephthalate) sau khi được hoạt hóa bằng glutaraldehyde (Elcin
và Sacak, 1996) có độ bền khi sử dụng và khả năng tái sử dụng rất cao với
khoảng hơn 85% hoạt tính ban đầu được giữ lại sau 90 ngày.
15

Luận văn tốt nghiệp
Bảng 1.3: Một số phương pháp cố đònh enzyme urease
Phương pháp cố đònh Chất mang Tác giả
Phương pháp hóa học
Liên kết cộng hóa trò Chitosan, tác nhân liên kết là glutaraldehyde Krajewska và cộng sự, 1990. [17]
Krajewska và cộng sự, 2005. [18]
Krajewska, 2000. [19]
Nylon, tác nhân liên kết là glutaraldehyde Pietta và cộng sự, 1990. [65]
George và cộng sự, 1996. [79]
Anita và cộng sự, 1997. [10]
Nhựa Amberlite MB_1, tác nhân lên kết là glutaraldehyde Anita và cộng sự, 1997. [9]
Organosilane, tác nhân liên kết là glutaraldehyde Airoldi, 2003. [26]
Cellulose George và cộng sự, 1996. [79]
Silica George và cộng sự, 1996. [79]
Aminopropyl triethoxysilane
Mourzina, 2003. [41]
Màng trao đổi cation
Turmanova, 2005. [75]
Copolymer của gelatin và poly HEMA
Rao, 1995. [60]
Polymethylglutamate, tác nhân liên kết là glutaraldehyde
Kubo và cộng sự, 1986. [42]
Phương pháp vật lý
Nhốt trong gel
Albumine huyết thanh bò Joseph và cộng sự, 1984. [46]
Boubriak và cộng sự, 1995. [64]
Zhylyat và cộng sự, 1995. [39]
Lee và cộng sự, 2000. [90]
Milardovic và cộng sự, 1999. [80]
16

Luận văn tốt nghiệp
Mourzina, 2003. [41]
Chitosan và alginate Kara và cộng sự, 2006. [34]
Polymer của polyacrylamide và carrageenan Kara và cộng sự, 2006. [34]
CMC và gelatin
Sungur và cộng sự, 1992. [76]
Gelatin
Teke và cộng sự, 2007. [56]
Vật liệu silica (phương pháp sol-gel)
Craith và cộng sự, 1997. [22]
Lee và cộng sự, 2002. [74]
Sahney và cộng sự, 2005. [72]
Ilangovan và cộng sự, 2006. [68]
Nhốt enzyme trong hệ sợi
Composite của cellulose acetate và TiO
2
Hatayama và cộng sự, 1995. [40]
17
Luận văn tốt nghiệp
1.3.3 Tính chất của enzyme urease cố đònh
1.3.3.1 Hoạt độ xúc tác của enzyme urease cố đònh
Các nghiên cứu về enzyme cố đònh nói chung và về enzyme urease cố đònh nói
riêng đều cho thấy hoạt tính riêng của enzyme sau cố đònh giảm đi so với enzyme tự do.
 Nghiên cứu của Rao và cộng sự cố đònh enzyme urease trên chất mang là
một copolymer của gelatin và poly (HEMA) (1995) cho kết quả hoạt tính
riêng của enzyme cố đònh chỉ còn lại 75% so với hoạt tính của enzyme
urease tự do [60].
 Nghiên cứu của Turmanova và cộng sự về việc cố đònh urease lên màng
trao đổi ion (2005) với màng là polymer của acid acrylic và lớp phim
polyethene mỏng cho thấy hoạt tính của urease sau cố đònh còn lại khoảng

80% so với enzyme tự do [75].
Nguyên nhân xảy ra hiện tượng giảm hoạt tính riêng của enzyme khi cố đònh trên
chất mang có thể là do: [4]
 Khi gắn enzyme vào chất mang, dưới ảnh hưởng của điện tích ở chất
mang, hình thể của phân tử enzyme sau khi cố đònh bò thay đổi làm cho
khả năng xúc tác của enzyme cũng bò thay đổi.
 Khi gắn enzyme lên chất mang bằng liên kết cộng hóa trò, một số hóa chất
sử dụng trong quá trình cố đònh có thể làm vô hoạt bất thuận nghòch
enzyme.
 Tương tác protein-protein giữa các phân tử enzyme đã cố đònh làm biến
đổi một phần cấu trúc không gian của phân tử enzyme, do đó hoạt độ xúc
tác cũng giảm.
 Đối với trường hợp enzyme cố đònh trên chất mang bằng phương pháp nhốt
enzyme trong khuôn gel, sự có mặt của chất mang có thể hạn chế khả
18
Luận văn tốt nghiệp
năng tiếp xúc của cơ chất với enzyme (nhất là các cơ chất có kích thước
lớn), do đó hoạt lực của enzyme cố đònh giảm.
Nhìn chung enzyme urease cố đònh cũng như các loại enzyme cố đònh khác vẫn
giữ được tính đặc hiệu của mình. Thêm vào đó, nhờ liên kết với chất mang mà chúng có
độ bền vững lớn đối với các tác động khác nhau. Như vậy, đứng trên quan điểm thực tế,
sự giảm hoạt độ hoàn toàn có thể được bù lại bằng tính chất này [4].
1.3.3.2 Tính chất động học của enzyme urease cố đònh
Kết quả của hầu hết các nghiên cứu đều cho rằng urease cố đònh cũng tuân theo
đònh luận Michaelis – Menten [4].
Tuy nhiên, các thông số động học của urease cố đònh như K
M
, V
max
có thể bò biến

đổi. Cũng theo kết quả của các nghiên cứu này thì đối với urease cố đònh, hằng số K
M
thường có khuynh hướng tăng còn V
max
lại có khuynh hướng giảm so với urease tự do.
 Krajewska đã có nhiều công trình nghiên cứu cố đònh urease trên chất
mang là chitosan. Năm 1990, nghiên cứu cố đònh urease lên chitosan của
tác giả cùng các cộng sự cho thấy: K
m
của enzyme cố đònh là 26.4 mmol/lit
so với enzyme tự do là 5.04 mmol/lit, trong khi đó, V
max
của enzyme cố
đònh lại giảm khoảng 1.5 lần so với enzyme tự do. Một nghiên cứu khác
của tác giả vào năm 2005 cũng cho kết quả K
m
của enzyme cố đònh tăng
so với enzyme tự do [17].
 Nghiên cứu của Hatayama và cộng sự (1995) cố đònh urease bằng phương
pháp nhốt trong hệ sợi tổng hợp từ cellulose acetate và TiO
2
cũng cho thấy
K
m
của urease cố đònh có giá trò là 8.10
-1
mol/lit, cao hơn nhiều so với K
m
của urease tự do (có giá trò 9,4.10
-4

mol/lit), trong khi đó, V
max
của urease
cố đònh là 7,2 .10
-5
mol/phút/g, thấp hơn urease tự do (2,7.10
-3
mol/phút/g)
[40].
 Nghiên cứu chế tạo biosensor sử dụng urease cố đònh bằng phương pháp
sol – gel và phương pháp nhốt urease trong gel nhờ albumine huyết thanh
19
Luận văn tốt nghiệp
bò và glutaraldehyde của Lee và cộng sự (1999) cho kết quả là hằng số
Michealis – Menten K
m
của urease cố đònh lần lượt là 4.95 và 6.5 mM cao
hơn so với urease tự do là 1.69 mM [90].
 Nghiên cứu cố đònh urease trên các chất mang khác nhau như hỗn hợp
chitosan – alginate và hỗn hợp poly(acrylamide-co-acrylic acid)/κ-
carrageenan của Kara và cộng sự (2006) cho thấy: K
m
của enzyme cố đònh
lớn hơn enzyme tự do (4.3 mmol và 3.30 mmol của enzyme cố đònh so với
3.03 mmol của enzyme tự do), trong khi đó V
max
của enzyme tự do là
0.0182 mM/phút lớn hơn enzyme cố đònh lần lượt là 0.0104 và 0.0099 mM/
phút [31].
Nguyên nhân của sự thay đổi các thông số động học của urease cố đònh có thể là

do: [4]
 Sự khác biệt về hiện tượng phân bố chất hòa tan trong môi trường có
enzyme cố đònh với sự phân bố chất hòa tan trong môi trường có enzyme
tự do. Hiện tượng này xảy ra khi sử dụng các chất mang có tích điện để cố
đònh enzyme. Sự có mặt của các chất mang có điện tích sẽ gây ra hiện
tượng tập trung cơ chất tại bề mặt chất mang nếu cơ chất tích điện ngược
dấu với chất mang và ngược lại. Kết quả của sự tương tác này dẫn đến sự
phân bố nồng độ chất hòa tan ở môi trường gần enzyme khác với nồng độ
chất hòa tan ở môi trường trong dung dòch. Nếu cơ chất và chất mang tích
điện trái dấu, cơ chất sẽ tập trung nhiều trên bề mặt chất mang, kết quả
dẫn đến ái lực biểu kiến của enzyme và cơ chất sẽ tăng và ngược lại.
 Những thay đổi về cấu trúc không gian của enzyme khi có mặt chất mang.
Khi enzyme gắn lên chất mang sẽ gây ra những biến đổi hình thể của
enzyme cũng như sẽ tạo ra sự cản trở không gian giữa enzyme và cơ chất
do có mặt chất mang, làm giảm khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất,
K
m
sẽ tăng lên.
20
Luận văn tốt nghiệp
 Những hạn chế về mặt khuếch tán khi có mặt chất mang, đặc biệt là trong
trường hợp chất mang dạng khuôn gel hoặc màng bao vi thể. Vận tốc
khuếch tán cơ chất và các chất hòa tan khác phụ thuộc vào kích thước lỗ
mao quản và kích thước phân tử của cơ chất. Tuy nhiên, để làm tăng vận
tốc khuếch tán, chúng ta có thể gia tăng sự khuấy đảo môi trường hoặc
giảm kích thước hạt gel [4].
1.3.3.3 nh hưởng của nhiệt độ đến enzyme urease cố đònh
Cũng như enzyme tự do, nhiệt độ là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến hoạt tính
cũng như các tính chất khác của enzyme urease cố đònh. Nhiều nghiên cứu về enzyme
urease cố đònh đã kết luận rằng nhờ liên kết với chất mang mà urease cố đònh có tính bền

nhiệt tốt hơn so với enzyme tự do. Bên cạnh đó, nhiệt độ tối ưu của enzyme cố đònh cũng
có xu hướng chuyển dòch lên những nhiệt độ cao hơn tùy vào loại enzyme urease và
phương pháp cố đònh [4].
 Nghiên cứu của Rao và cộng sự về cố đònh urease đậu rựa lên màng
polymer từ gelatin và poly(HEMA) (1995) cho thấy nhiệt độ tối ưu của
urease cố đònh dòch chuyển từ 60
o
C lên 70
o
C, trong khi đó độ bền nhiệt của
urease cố đònh tại các nhiệt độ khác nhau thì cao hơn so với urease tự do
trong cùng điều kiện [60].
(a)
21
Luận văn tốt nghiệp
(b)
Hình 1.5: (a) Nhiệt độ tối ưu của enzyme urease tự do và cố đònh
(b) Độ bền nhiệt của urease tự do và cố đònh
○ Urease tự do ● Urease cố đònh
 Nghiên cứu của Chen và Chiu về cố đònh urease từ đậu rựa trên bề mặt
của các hạt chitosan xốp (1999) cho kết quả tại nhiệt độ 70
o
C trong đệm
pH 7, enzyme cố đònh bền hơn so với enzyme tự do, cụ thể là enzyme tự
do bò mất đi một nửa hoạt tính ban đầu sau 70 phút, trong khi đó, cần đến
175 phút thì urease cố đònh mới bò mất đi một nửa hoạt tính ban đầu.
Nghiên cứu cũng cho thấy T
opt
của urease cố đònh tăng từ 60
o

C lên 70
o
C
[48].
22
Luận văn tốt nghiệp
Hình 1.6: Độ bền nhiệt của enzyme urease tự do và cố đònh tại nhiệt độ 70
o
C
trong đệm pH 7.
Hình 1.7: Nhiệt độ tối ưu của enzyme ureae tự do và cố đònh trong đệm pH 6.5
1.3.3.4 nh hưởng của pH đến enzyme urease cố đònh
pH tối ưu của urease cố đònh, cũng như nhiều loại enzyme cố đònh khác, có thể
thay đổi so với enzyme tự do. pH tối ưu này có thể dòch chuyển về phía kiềm hay về phía
acid sau khi cố đònh [4].
23
Luận văn tốt nghiệp
 Nghiên cứu của Turmanova và cộng sự về việc cố đònh urease lên màng
trao đổi ion (2005) với màng là polymer của acid acrylic và lớp phim
polyethene mỏng cho thấy pH tối ưu của urease tự do là 5.8, trong khi đó,
pH tối ưu của enzyme cố đònh là 6 [75].
Hình 1.8: nh hưởng của pH đến enzyme cố đònh trên màng trao đổi ion
 Nghiên cứu cố đònh urease đậu rựa trên các chất mang khác nhau như hỗn
hợp chitosan – alginate và hỗn hợp poly(acrylamide-co-acrylic acid)/κ-
carrageenan của Kara và cộng sự (2006) cho thấy pH tối ưu của enzyme
sau cố đònh dòch chuyển từ 7.5 lên 8. Thêm vào đó, hoạt tính của urease cố
đònh trong điều kiện pH thấp cũng cao hơn so với urease tự do [34].
Hình 1.9: nh hưởng của pH đến enzyme urease cố đònh.
24
Luận văn tốt nghiệp

Tuy nhiên, cũng có nhiều trường hợp mà pH tối ưu của enzyme cố đònh không có
sự khác biệt so với enzyme tự do, chỉ có một số khác biệt là độ bền của enzyme cố đònh
trong môi trường acid hoặc base tốt hơn so với enzyme tự do.
 Nghiên cứu của Chen và Chiu về cố đònh urease trên bề mặt của các hạt
chitosan xốp (1999) cho thấy pH tối ưu của enzyme cố đònh là 7.5 và
không có sự dòch chuyển so với enzyme tự do, nhưng hoạt tính của urease
cố đònh tại các pH acid và base lại cao hơn so với urease tự do [48].
Nguyên nhân của sự chuyển dòch pH
opt
của enzyme sau cố đònh có thể là do: [4]
 nh hưởng của trường tónh điện của chất mang.
 Sự tương tác giữa các nhóm chức của chất mang với các nhóm chức của
enzyme.
1.3.3.5 nh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính của urease cố đònh
Enzyme urease nói riêng và các enzyme cố đònh nói chung nhờ sự bảo vệ của
chất mang chống lại các tác động bất lợi bên ngoài nên có khả năng bảo quản tốt hơn so
với các enzyme tự do và có thể được tái sử dụng nhiều lần. Hầu hết các nghiên cứu về
enzyme urease cố đònh đều cho thấy kết quả như trên [4].
 Nghiên cứu cố đònh urease nhờ màng bao phospholipid liên kết với silica
của Kallury và cộng sự (1993) cho thấy sau 42 ngày trong điều kiện bảo
quản khô ở nhiệt độ phòng, hoạt tính của urease cố đònh hầu như không
thay đổi so với ngay sau khi cố đònh.
 Nghiên cứu cố đònh urease lên nylon và màng Amberlite MB-1 của Anita
và cộng sự (1997) cũng cho kết quả khả năng bảo quản của enzyme cố
đònh tốt hơn so với enzyme tự do: đối với màng nylon, sau 60 ngày ở điều
kiện 4
o
C và trong đệm phosphate pH 6, hoạt tính urease cố đònh còn lại
đến 76% hoạt tính ban đầu. Còn đối với màng Amberlite MB-1, con số đó
là 65%. [9,10]

25