Nghiên cứu điều kiện lên men và tách chiết hoạt chất kìm hãm α glucosidase từ dịch đậu đen lên men bởi vi khuẩn bacillus subtilis m1

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
=======* & *======

DƯƠNG THỊ NGỌC QUỲNH

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ TÁCH CHIẾT HOẠT
CHẤT KÌM HÃM α – GLUCOSIDASE TỪ DỊCH ĐẬU ĐEN LÊN
MEN BỞI VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS M1

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT
CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Hà Nội - 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI
=======* & *======

DƯƠNG THỊ NGỌC QUỲNH

NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN VÀ TÁCH CHIẾT HOẠT
CHẤT KÌM HÃM α – GLUCOSIDASE TỪ DỊCH ĐẬU ĐEN LÊN
MEN BỞI VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS M1

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. LÊ THANH HÀ

Hà Nội – 2013


LỜI CAM ĐOAN

Tôi là Dương Thị Ngọc Quỳnh xin cam đoan nội dung trong luận văn này với
đề tài “Nghiên cứu điều kiện lên men và tách chiết hoạt chất kìm hãm α –
glucosidase từ dịch đậu đen lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis M1” là cơng
trình nghiên cứu và sáng tạo do chính tơi thực hiện dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Lê
Thanh Hà. Các số liệu, kết quả trình bày trong luận văn là hồn tồn trung thực và chưa
cơng bố trong bất cứ cơng trình khoa học nào khác.


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành được luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi
đã nhận được sự ủng hộ, giúp đỡ tận tình của thầy cơ giáo, gia đình và bạn bè.
Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Lê Thanh Hà - Viện Công
nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã tận
tình chỉ bảo tơi trong suốt q trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc Viện Công nghệ sinh
học & Công nghệ thực phẩm – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội đã giảng dạy và
giúp đỡ tơi trong suốt q trình học tập và thực hiện luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè và đã tạo điều kiện, quan tâm,
động viên và góp ý cho tơi trong suốt q trình học tập, nghiên cứu và hồn thành
luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn!

Học viên

Dương Thị Ngọc Quỳnh


MỤC LỤC
Trang bìa phụ
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục hình
Danh mục bảng

MỞ ĐẦU ...................................................................................................................1
PHẦN 1. TỔNG QUAN..........................................................................................3
1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường (tiểu đường) ở người .........................3
1.1.1. Giới thiệu về bệnh đái tháo đường (ĐTĐ) ............................................................... 3
1.1.2. Phân loại bệnh đái tháo đường .................................................................................. 3
1.1.3. Biến chứng của bệnh đái tháo đường........................................................................ 4
1.1.4. Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường............................................................... 5
1.1.5. Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và ở Việt Nam .................................. 7

1.2. Enzyme chuyển hóa - Alpha glucosidase (EC 3.2.1.20) ..............................8
1.2.1 Giới thiệu về α - glucosidase ...................................................................................... 8
1.2.2 Cấu trúc hóa học α – glucosidase ............................................................................... 9
1.2.3. Tính chất của α-glucosidases...................................................................................10

1.3. Chất kìm hãm alpha – glucosidase (alpha - glucosidase inhibitors –
AGIs) ....................................................................................................................... 10
1.3.1. Giới thiệu về chất kìm hãm alpha – glucosidase....................................................10
1.3.2. Phân loại các hoạt chất kìm hãm alpha – glucosidase ...........................................11

1.3.2.1. Nhóm Disaccharides ................................................................................................... 11
1.3.2.2. Nhóm Iminosugars ...................................................................................................... 12


1.3.2.3. Carbasugars và pseudoaminosugars ............................................................................ 14
1.3.2.4. Thiosugars ................................................................................................................... 15

1.3.3. Cơ chế kìm hãm α – glucosidase của AGIs và tác dụng trong điều trị đái tháo
đường type 2. ......................................................................................................................15
1.3.4. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng AGIs ...............................................................18
1.3.4.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng AGIs trên thế giới ............................................... 18
1.3.4.2 Tại Việt Nam ................................................................................................................ 19

1.4. Nguồn thu nhận và công nghệ sản xuất AGIs .......................................... 20
1.4.1. Sản xuất AGIs theo phương pháp tổng hợp hóa học .............................................20
1.4.2. Sản xuất AGIs theo con đường tự nhiên.................................................................20
1.4.2.1. Sản xuất AGIs từ động vật .......................................................................................... 20
1.4.2.1. Sản xuất AGIs từ thực vật ........................................................................................... 21
1.4.2.3. Sản xuất AGIs từ vi sinh vật ....................................................................................... 24

1.5. Sản xuất AGIs từ đậu đen lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis ...........................25
1.5.1. Nguồn cơ chất đậu đen ............................................................................................25
1.5.2. Nguồn chủng vi khuẩn Bacillus subtillis ................................................................26

PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................ 29
2.1. Nguyên liệu ..................................................................................................... 29
2.2. Mơi trường ...................................................................................................... 29
2.3. Hóa chất .......................................................................................................... 30
2.4. Thiết bị............................................................................................................. 30
2.5. Phương pháp .................................................................................................. 31

2.5.1. Xác định một số tính chất của nguyên liệu đậu đen ..............................................31
2.5.2. Lên men và khảo sát điều kiện lên men thích hợp thu hoạt chất kìm hãm α glucosidase ..........................................................................................................................33
2.5.3. Xác định hoạt tính kìm hãm α-amylase của dịch chiết sau lên men .....................33
2.5.4. Phương pháp xác định hoạt tính kìm hãm α-glucosidase ......................................35


2.5.5. Phương pháp xây dựng phương trình động học của quá trình lên men thu hoạt
chất kìm hãm α – glucosidase ............................................................................................36
2.5.6. Thu hồi hoạt chất kìm hãm α – glucosidase từ dịch đậu đen lên men bằng chủng
Bacillus subtilis M1 ............................................................................................................37
2.5.7. Khảo sát khả năng loại màu dịch lên men bằng than hoạt tính .............................................. 38

2.5.8. Xác định giá trị IC50 .................................................................................................38
2.5.9. Tính tốn thống kê ...................................................................................................38
2.5.10. Hiệu suất thu hồi ....................................................................................................38

PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................ 40
3.1. Khảo sát đặc tính cơng nghệ ngun liệu đậu đen ................................... 40
3.2. Nghiên cứu điều kiện lên men thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất
kìm hãm α – glucosidase bởi Bacillus subtilis M1 ............................................ 40
3.2.1. Nghiên cứu môi trường dinh dưỡng thích hợp.......................................................40
3.2.2. Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α –
glucosidase ..........................................................................................................................42
3.2.3. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α –
glucosidase ..........................................................................................................................43
3.2.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng tổng hợp hoạt chất
kìm hãm α –glucosidase .....................................................................................................44
3.2.5. Nghiên cứu thời gian lên men thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α –
glucosidase ..........................................................................................................................45

3.3. Động học quá trình sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase và
mối tương quan với mật độ vi khuẩn Bacillus subtilis M1 trong quá trình
lên men .................................................................................................................... 46
3.4. Nghiên cứu điều kiện thu hồi và tạo chế phẩm chứa hoạt chất kìm
hãm α – glucosidase từ dịch lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis M1
.................................................................................................................................. 50
3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của quá trình kết tủa cồn đến hoạt tính kìm hãm α –
glucosidase của dịch lên men.............................................................................................50


3.4.2. Khảo sát q trình cơ đặc dịch lên men chứa hoạt chất kìm hãm α - glucosidase
.............................................................................................................................................52
3.4.3. Khảo sát phương pháp sấy tạo sản phẩm dạng bột chứa hoạt chất kìm hãm α –
glucosidase ..........................................................................................................................55

3.5. Nghiên cứu khả năng kìm hãm α – amylase của chế phẩm chứa AGI . 57
3.6. Khảo sát khả năng tẩy màu của than hoạt tính với sản phẩm lên men ....................58
3.7. Đề xuất qui trình lên men và tạo chế phẩm chứa hoạt chất kìm hãm α – glucosidase
từ đậu đen lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis M1 .....................................................61

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 64
KẾT LUẬN ............................................................................................................ 64
KIẾN NGHỊ........................................................................................................... 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 66


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
KÝ HIỆU

TÊN ĐẦY ĐỦ

4-NPG

4-nitrophenyl α-D-glucopyranoside

AGIs (Alpha Glucosidase Inhibitors)

Chất kìm hãm alpha - Glucosidase

CFU (Colony forming unit)

Đơn vị khuẩn lạc

DNJ

1-deoxynojirimycin

DNS

Dinitrosalicylic acid

ĐTĐTN

Đái tháo đường thai nghén

GLP

Glucagon peptide

HTKH

Hoạt tính kìm hãm

IC50 (half maximal inhibitory concentration)

Nồng độ chất kìm hãm kìm hãm
50% hoạt tính α-glucosidase

IGT

Rối loạn dung nạp glucose

WHO (World Health Organization)

Tổ chức y tế thế giới

XOS

Xylooligosaccharides


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Tỷ lệ phần trăm bệnh nhân đái tháo đường trong độ tuổi 20 – 79 phân chia
theo khu vực trên thế giới ........................................................................................... 7
Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của một số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có bản
chất là disaccharide……………………………………………………………...…12
Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo của một số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase thuộc
lớp Piperidines ...........................................................................................................13
Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo của một số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có bản
chất là Iminosugars ...................................................................................................14

Hình 1.5. Cơng thức cấu tạo của một số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có bản
chất là Carbasugars ...................................................................................................15
Hình 1.6. Cơng thức cấu tạo của một số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có bản
chất là Thiosugars .....................................................................................................15
Hình 1.7. Ảnh hưởng của chất kìm hãm α-glucosidase đến quá trình trao đổi đường
trong cơ thể................................................................................................................16
Hình 1.8. Cơ chế kìm hãm α-glucosidase của acarbose ........................................... 17
Hình 1.9. Cấu trúc hóa học của salacinol và kotalanol tách chiết từ cây Salacia ................. 21
Hình 1.10. Khuẩn lạc B. subtilis trên mơi trường TSA (A) và hình thái tế bào, bào
tử dưới kính hiển vi điện tử độ phóng đại 1000 lần (B)............................................27
Hình 2.1. Phương trình tạo màu giữa đường khử và DNS acid ................................ 34
Hình 3.1. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng và thời gian lên men đến khả
năng sinh tổng hợp hoạt tính kìm hãm α – glucosidase .........................................41
Hình 3.2. Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường đến khả năng sinh tổng hợp
hoạt chất kìm hãm α – glucosidase ...........................................................................43


Hình 3.3. Ảnh hưởng của tốc độ lắc đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm
α – glucosidase ..........................................................................................................44
Hình 3.4. Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh tổng hợp hoạt tính
kìm hãm α – glucosidase của dịch lên men...............................................................46
Hình 3.5. Động học quá trình sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α – glucosidase .... 48
Hình 3.6. Chế phẩm chứa AGI sau sấy đơng khơ ..................................................... 56
Hình 3.7. Khả năng kìm hãm α – amylase tụy tạng lợn của chế phẩm chứa AGI....57
Hình 3.8. Hoạt tính kìm hãm α – glucosidase trước và sau khi lọc than hoạt tính .......... 59
Hình 3.9. Sản phẩm lên men trước và sau khi lọc than hoạt tính ............................. 60
Hình 3.10. Quy trình sản xuất chế phẩm hoạt chất kìm hãm α-glucosidase từ đậu
đen lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis M1 .........................................................61

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Một số α – glucosidase quan trọng ............................................................. 9
Bảng 1.2. Hoạt tính kìm hãm α – glucosidase từ một số loại thực phẩm ................ 22
Bảng 1.3. Hoạt tính kìm hãm α – glucosidase của một số loại trà dân gian Việt
Nam ...........................................................................................................................23
Bảng 2.1. Thành phân dinh dưỡng các môi trường sử dụng ..................................... 29
Bảng 2.2. Nghiên cứu các điều kiện lên men............................................................ 33
Bảng 3.1. Khảo sát đặc điểm nguyên liệu đậu đen ................................................... 40
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến khả năng sinh tổng hợp hoạt chất
kìm hãm α – glucosidase…………………………………………………………...45
Bảng 3.3. Sự tương quan giữa mật độ vi khuẩn và hoạt tính kìm hãm α - glucosidase
của dịch lên men…………………………………………………………………...49
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của q trình kết tủa cồn đến hoạt tính kìm hãm α –
glucosidase của dịch lên men ....................................................................................51
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của kết tủa cồn đến IC50 và hiệu suất thu hồi DNJ…………52
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kìm hãm của dịch lên men khi cô
đặc ở áp suất thường…………………………………………………….....……....53
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kìm hãm của dịch lên men khi cô
đặc ở áp suất chân không…………………………………………………….........54
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của phương pháp sấy đến hoạt tính kìm hãm α – glucosidase
...................................................................................................................................55
Bảng 3.9. Hoạt tính kìm hãm α – amylase của các mẫu chế phẩm………………..58


MỞ ĐẦU
Cùng với sự phát triển của nền kinh tế, mức đơ thị hóa nhanh đặc biệt ở các
nước đang phát triển trên thế giới là những thay đổi về lối sống, chế độ dinh dưỡng,
ô nhiễm môi trường dẫn đến sự gia tăng nhanh chóng của các căn bệnh mang tính
xã hội. Bên cạnh các căn bệnh đang là mối đe dọa sức khỏe của nhân loại như bệnh
tim mạch, ung thư thì đái tháo đường là một trong những bệnh hiểm nghèo với tỷ lệ

tử vong chiếm vị trí thứ ba chỉ sau hai căn bệnh kể trên. Chính vì vậy Tổ chức Y tế
Thế giới đã khuyến cáo đái tháo đường là bệnh đặc biệt nghiêm trọng đe dọa đến
sức khỏe và sự phát triển kinh tế ở tất cả các quốc gia trên thế giới.
Theo thống kê của Hiệp hội đái tháo đường quốc tế, năm 2010 có khoảng
285 triệu người mắc bệnh trong đó đái tháo đường type 2 chiếm khoảng 85 - 95%
tổng số bệnh nhân đái tháo đường trên thế giới. Ước tính đến năm 2030 con số đó
tăng lên 438 triệu người. Việt Nam là một quốc gia đang phát triển và cũng là một
trong những quốc gia có tỉ lệ gia tăng bệnh đái tháo đường nhanh nhất thế giới. Tỷ
lệ dân số mắc đái tháo đường hiện tại tăng lên hơn 6% so với chỉ có 2,7% trong năm
2001. Theo Tổng hội Y học Việt Nam dự báo sẽ có từ 7 - 8 triệu bệnh nhân đái tháo
đường vào năm 2025, hơn 90% trong số đó thuộc type 2.
Bệnh đái tháo đường là bệnh mãn tính với nhiều biến chứng nguy hiểm như
bệnh tim mạch vành, suy thận, tai biến mạch máu não, mù mắt, liệt dương, hoại
thư… Vì vậy phòng và điều trị bệnh đái tháo đường là một vấn đề bức thiết. Ngày
nay, y học đã tìm ra nhiều hướng điều trị căn bệnh mãn tính này như tiêm insulin,
dùng các loại thuốc nhóm sulphonylureas, glinides, metformin, thiazolidinedione và
hoạt chất kìm hãm α – glucosidase (AGIs). Trên thị trường có một số dược phẩm có
bản chất là các hoạt chất kìm hãm α-glucosidase như acarbose, miglitol và
voglibose được sử dụng rộng rãi. 1-deoxynojirimycin (DNJ) là hoạt chất kìm hãm α
– glucosidase có cơng thức cấu tạo tương tự miglitol.
Trên thế giới đã có nhiều cơng trình nghiên cứu sản xuất AGIs nói chung và
DNJ nói riêng từ nguồn đậu tương lên men. Tuy nhiên, những nghiên cứu về tổng

1


hợp AGIs từ đậu đen vẫn còn hạn chế và là hướng đi mới ở Việt Nam. Trong khi
đó, các chế phẩm có chất kìm hãm α – glucosidase dùng cho bệnh nhân đái tháo
đường ở nước ta đều là nhập khẩu với giá thành cao.
Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu điều kiện lên men và tách chiết hoạt chất kìm hãm α –
glucosidase từ dịch đậu đen lên men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis M1”.
Đề tài thực hiện với mục đích và nội dung sau:
1. Mục đích của đề tài:
- Tìm điều kiện thích hợp cho q trình tạo AGIs bằng quá trình lên men đậu đen
bởi Bacillus subtilis.
- Tìm điều kiện tách chiết và thu hồi hoạt chất kìm hãm α-glucosidase từ đậu đen
lên men.
2. Nội dung của đề tài, các vấn đề cần giải quyết:
- Nghiên cứu điều kiện (ảnh hưởng của nhiệt độ, thời gian, các chất bổ sung) nâng
cao sinh tổng hợp hoạt chất kìm hãm α-glucosidase khi lên men đậu đen bằng vi
khuẩn Bacillus subtilis M1.
- Nghiên cứu lựa chọn điều kiện tách chiết, thu hồi và tạo chế phẩm chứa hoạt chất
kìm hãm α-glucosidase từ đậu đen len men bởi vi khuẩn Bacillus subtilis M1.

2


PHẦN 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về bệnh đái tháo đường (tiểu đường) ở người
1.1.1. Giới thiệu về bệnh đái tháo đường (ĐTĐ)
Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), “Đái tháo đường là một hội chứng có
đặc tính biểu hiện bằng sự tăng đường máu do hậu quả của việc mất hồn tồn
insulin hoặc là do có liên quan đến sự suy yếu trong bài tiết hoặc hoạt động của
insulin" [2].
Ở bệnh nhân ĐTĐ quá trình vận chuyển glucose khơng hoạt động bình
thường, tụy tạng khơng hoặc sản xuất thiếu hụt insulin hay cơ thể không điều khiển
việc sử dụng insulin để đưa glucose vào tế bào. Do đó glucose tồn tại trong máu làm
chỉ số đường huyết tăng cao hơn mức bình thường, khi đó dẫn đến bệnh ĐTĐ. Khi
đường huyết tăng cao vượt qua khả năng lọc cân bằng của thận, kết quả là đường sẽ

theo nước tiểu ra ngoài.
1.1.2. Phân loại bệnh đái tháo đường
Đái tháo đường type 1
Đái tháo đường type 1 chiếm tỷ lệ khoảng 5 - 10% tổng số bệnh nhân ĐTĐ
thế giới. Nguyên nhân do tế bào beta bị phá hủy, gây nên sự thiếu hụt insulin tuyệt
đối cho cơ thể (nồng độ insulin giảm thấp hoặc mất hoàn toàn). Theo một số nghiên
cứu, các kháng nguyên bạch cầu người (HLA) chắc chắn có mối liên quan chặt chẽ
với sự phát triển của ĐTĐ type 1 [10]. ĐTĐ type 1 phụ thuộc nhiều vào yếu tố gen
và thường được phát hiện trước 40 tuổi. Nhiều bệnh nhân, đặc biệt là trẻ em và trẻ
vị thành niên biểu hiện nhiễm toan ceton là triệu chứng đầu tiên của bệnh [23].
Đái tháo đường type 2
Đái tháo đường type 2 chiếm tỷ lệ khoảng 90 - 95% ĐTĐ trên thế giới,
thường gặp ở người trưởng thành trên 40 tuổi. Đặc trưng của ĐTĐ type 2 là kháng
insulin đi kèm với thiếu hụt tiết insulin tương đối. Đặc điểm lớn nhất trong sinh lý
của bệnh ĐTĐ type 2 là có sự tương tác giữa yếu tố gen và yếu tố môi trường trong
3


cơ chế bệnh sinh. Người mắc bệnh ĐTĐ type 2 có thể điều trị bằng cách thay đổi
thói quen, kết hợp dùng thuốc để kiểm soát glucose máu, tuy nhiên nếu q trình
này thực hiện khơng tốt thì bệnh nhân cũng sẽ phải điều trị bằng cách dùng insulin.
Đái tháo đường thai nghén (ĐTĐTN)
Đái tháo đường thai nghén xảy ra ở phụ nữ có thai, có glucose máu tăng, gặp
khi có thai lần đầu. Sự tiến triển của ĐTĐTN sau sinh theo 3 khả năng: bị đái tháo
đường, giảm dung nạp glucose và bình thường [4].
Ngồi ra cịn một số thể hiếm gặp khác liên quan đến một số bệnh, sử dụng
thuốc hoặc tiếp xúc với hoá chất.
1.1.3. Biến chứng của bệnh đái tháo đường
Biến chứng cấp tính
Biến chứng cấp tính thường là hậu quả của chẩn đốn muộn, nhiễm khuẩn

cấp tính hoặc điều trị khơng thích hợp. Trong đó hôn mê nhiễm toan ceton và hôn
mê tăng áp lực thẩm thấu là hai biến chứng nguy hiểm. Nhiễm toan ceton là biểu
hiện nặng của rối loạn chuyển hóa gluxit do thiếu insulin gây tăng glucose máu,
tăng phân hủy lipid, tăng sinh thể ceton gây toan hóa tổ chức với tỷ lệ tử vong cao
từ 5 - 10%. Hôn mê tăng áp lực thẩm thấu là tình trạng rối loạn chuyển hóa glucose
nặng, đường huyết tăng cao. Hơn mê tăng áp lực thẩm thấu chiếm 5 - 10%. Ở bệnh
nhân ĐTĐ type 2 nhiều tuổi, tỷ lệ tử vong từ 30 - 50% [10].
Biến chứng mạn tính
Biến chứng tim - mạch: các nghiên cứu cho thấy nồng độ glucose máu cao
làm tăng nguy cơ mắc các bệnh mạch vành, xơ vữa động mạch, tăng huyết áp và
các biến chứng tim mạch khác. Người ĐTĐ có bệnh tim mạch là 45%, nguy cơ mắc
bệnh tim mạch gấp 2 - 4 lần so với người bình thường.
Biến chứng thận: bệnh thận do ĐTĐ khởi phát bằng tăng protein niệu, sau đó
khi chức năng thận giảm xuống, ure và creatinin sẽ tích tụ trong máu. Bệnh thận do
ĐTĐ là nguyên nhân thường gặp nhất gây suy thận giai đoạn cuối.
4


Bệnh lý mắt: đục thủy tinh thể và bệnh lý võng mạc là những bệnh lý về mắt
do biến chứng của bệnh ĐTĐ hay gặp nhất. Trong đó đục thuỷ tinh thể là tổn
thương thường gặp và tương quan với thời gian mắc bệnh cũng như mức độ tăng
đường huyết kéo dài. Bệnh lý võng mạc ĐTĐ biểu hiện nhẹ bằng tăng tính thấm
mao mạch, ở giai đoạn muộn hơn bệnh tiến triển đến tắc mạch máu, tăng sinh mạch
máu với thành mạch yếu dễ xuất huyết gây mù loà.
Bệnh lý thần kinh: biến chứng thần kinh do ĐTĐ được chia thành các hội
chứng lớn như viêm đa dây thần kinh, bệnh đơn dây thần kinh, bệnh thần kinh thực
vật, bệnh thần kinh vận động gốc chi.
Bệnh lý bàn chân: là sự phối hợp của tổn thương mạch máu, thần kinh ngoại
vi và cơ địa dễ nhiễm khuẩn do glucose máu tăng cao. Tỷ lệ cắt cụt chân của người
bị biến chứng bàn chân ĐTĐ của Việt Nam cũng khá cao, khoảng 40% tổng số

người có bệnh lý bàn chân ĐTĐ [9].
1.1.4. Phương pháp điều trị bệnh đái tháo đường
Đái tháo đường là căn bệnh mạn tính, vì vậy q trình điều trị của người
bệnh nhằm mục đích ổn định đường huyết ở mức bình thường và hạn chế đến mức
thấp nhất các biến chứng. Phương pháp điều trị phụ thuộc vào dạng thức bệnh mắc
phải.
Đái tháo đường type 1: ĐTĐ type 1 còn gọi là ĐTĐ phụ thuộc insulin, vì vậy
với bệnh nhân mắc bệnh ĐTĐ type 1 thì việc tiêm insulin là giải pháp bắt buộc để
duy trì chỉ số đường huyết ở mức cho phép và hạn chế các biến chứng đặc biệt là
nhiễm cetone máu. Việc áp dụng liều lượng insulin cần thiết phụ thuộc vào tình
trạng bệnh cũng như chế độ dinh dưỡng và vân động của mỗi bệnh nhân.
Đái tháo đường type 2: quá trình điều trị của bệnh nhân ĐTĐ type 2 chủ yếu
dựa vào các loại thuốc hạ đường huyết và kết hợp tiêm bổ sung insulin trong một số
trường hợp cần thiết như biến chứng, hôn mê hay thời kỳ bệnh nặng. Hiện nay có 6
nhóm thuốc giúp cải thiện quá trình chuyển hóa glucose cho bệnh nhân ĐTĐ type 2
gồm: sulphonylureas, glinides, metformin, thiazolidinedione, chất kìm hãm
5


dipeptidyl peptidase IV và hoạt chất kìm hãm α – glucosidase. Việc lựa chọn sử
dụng thuốc có chứa loại hoạt chất nào tùy thuộc vào bản chất của quá trình rối loạn
hấp thu glucose theo hướng kháng insulin hay suy giảm bài tiết insulin.
- Sulphonylureas: là hoạt chất trực tiếp kích thích tiết insulin của các tế bào
beta. Sulphonylureas giúp giảm chỉ số đường huyết HbA1c từ 1-2% và giảm sự
tiến triển của các biến chứng vi mạch đến 25%. Tuy nhiên, việc sử dụng
sulphonylureas thường dẫn đến các tác dụng phụ như tăng cân và có thể gây hạ
đường huyết đặc biệt là ở người cao tuổi, bệnh nhân suy thận hoặc bệnh gan. Do
vậy sulphonylureas thường được sử dụng ở các thế hệ thuốc thứ 2 hoặc thứ 3 [41].
- Glinides: là một thế hệ mới của sulphonylurea có tác dụng kích thích tiết
insulin sớm giúp giảm tăng đường huyết sau bữa ăn do vậy được sử dụng đều đặn

sau mỗi bữa ăn. Glinides không gây ra các tác dụng phụ như sulphonylureas do vậy
nó được khuyến cáo sử dụng cho các bệnh nhân suy thận và bệnh gan.
- Thiazolidinediones: thiazolidinediones giúp cải thiện độ nhạy cảm của
insulin bằng cách cải thiện hoạt động đáp ứng tế bào của chúng, tuy nhiên không
tăng cường sản xuất insulin. Một tác dụng phụ phổ biến của thiazolidinediones là
gây tích lũy chất béo dưới da.
- Metformin: giống như thiazolidinediones, metformin giúp tăng hoạt tính
cho insulin, có thể làm giảm HbA1c hiệu quả như sulphonylureas và insulin mà
không gây hạ đường huyết hoặc tăng cân tuy nhiên thường xuyên gây ra tình trạng
phụ thuộc liều dùng sau nhiều năm điều trị [40].
- Hoạt chất kìm hãm α-glucosidase: hiện nay trên thị trường có một số dược
phẩm có bản chất là các hoạt chất kìm hãm α-glucosidase như acarbose (U.S. Pat.
No. 5643874), miglitol (U.S. Pat. No. 4639436) và voglibose (U.S. Pat. No.
6200958). Các hoạt chất này làm chậm lại quá trình hấp thụ carbohydrate từ ruột do
đó giúp chỉ số đường huyết ổn định cả lúc trước và sau ăn. Một số tài liệu đã được
chứng minh rằng hoạt chất kìm hãm α-glucosidase như acarbose có khả năng ngăn
chặn hoặc trì hỗn sự tiến triển của tình trạng suy giảm dung nạp glucose (IGT) đến
6


bệnh ĐTĐ. Đây là một hướng mới đang được chú ý nghiên cứu và ứng dụng khả
quan trong điều trị bệnh ĐTĐ.
1.1.5. Tình hình bệnh đái tháo đường trên thế giới và ở Việt Nam
Trong những năm gần đây, tỷ lệ ĐTĐ gia tăng mạnh mẽ trên toàn cầu, WHO
đã lên tiếng báo động vấn đề nghiêm trọng này trên toàn thế giới.
Theo thống kê của Hiệp hội đái tháo đường quốc tế, năm 2010 có khoảng
285 triệu người mắc bệnh và 344 người suy giảm hấp thu glucose, trong đó bệnh
ĐTĐ type 2 chiếm khoảng 85 - 95 % tổng số bệnh nhân ĐTĐ trên thế giới. Ước
tính đến năm 2030 con số đó tăng lên 438 và 472 triệu người [55].
Theo đánh giá của hiệp hội đái tháo đường quốc tế, các nước đang phát triển

có tỷ lệ người mắc bệnh ĐTĐ cao hơn các nước phát triển và chưa phát triển. Trong
đó, nơi có số lượng bệnh nhân ĐTĐ cao nhất là khu vực Đơng Thái Bình Dương
(26,9 %) và Đông Nam Á (20,6%), thấp nhất là khu vực châu Phi (4,2%) [55].

tỷ lệ %
30
25

20.6

20
15
10
5

9.3
4.2

5.4

26.9
25.7

23

19.3
13.1
12.1

11.7

6.3 6.7

15.1
2010
2030

0

Hình 1.1. Tỷ lệ phần trăm bệnh nhân ĐTĐ trong độ tuổi 20 – 79 phân
chia theo khu vực trên thế giới
7


Việt Nam là một quốc gia đang phát triển có tốc độ gia tăng bệnh ĐTĐ
nhanh nhất thế giới. Tỷ lệ dân số mắc ĐTĐ hiện tại tăng lên hơn 6% so với chỉ có
2,7% trong năm 2001. Theo Tổng hội Y học Việt Nam dự báo sẽ có từ 7 - 8 triệu
người bị bệnh ĐTĐ vào năm 2025, hơn 90% trong số đó thuộc type 2.
1.2. Enzyme chuyển hóa - Alpha glucosidase (EC 3.2.1.20)
1.2.1 Giới thiệu về α - glucosidase
Alpha glucosidase (EC 3.2.1.20) là một enzyme thủy phân thuộc nhóm
glucosidase (α-, β-, và α-1,3-glucosidase), có tác dụng chuyển hóa các cơ chất là
oligo hay polysaccharite thành glucose [19]. Alpha – glucosidase thường được chia
thành ba nhóm I, II và III dựa trên nguồn cơ chất đặc hiệu. Nhóm I bao gồm maltase
và isomaltase thủy phân các cơ chất đồng thể như maltooligosaccharides thành
glucose chậm hơn so với các cơ chất dị thể như các hoạt chất glucosides vòng thơm
điển hình là phenyl α – glucopyranoside hay p – nitrophenyl α – glucopyranoside.
Ngược lại, nhóm II thủy phân mạnh các hơp chất maltooligosaccharides như
maltose và isomaltose. α – glucosidase thuộc nhóm III, ngồi maltooligosaccharides
cịn có thể thủy phân α – glucan thành đường đơn [21].
Alpha glucosidase có thể thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, trong đó,

enzym thuộc nhóm I thu được từ vi khuẩn, nấm men và một số lồi cơn trùng,
nhóm II từ nấm mốc và nhóm III từ thực vật hoặc động vật [21].
Các chế phẩm α- glucosidase trên thị trường có nhiều nguồn gốc khác nhau
như: từ vi khuẩn (Bacillus stearothermophilus …), từ nấm men (Saccharomyces
cerevisiae) hoang dại hoặc tái tổ hợp, từ thực vật (gạo, lúa mạch, kê …), từ ruột non
động vật (chuột, thỏ, lợn …).

8


Bảng 1.1. Một số α – glucosidase quan trọng
STT

Nhóm

Kí hiệu quốc tế

1

Maltase – glucoamylase

EC 3.2.1.20 hoặc 3.2.1.3

2

Surcase – maltase

EC 3.2.1.48 hoặc 3.2.1.20

3

Isomaltase – maltase

EC 3.2.1.10 hoặc 3.2.1.20

4

α – Limit dextrinnase
EC 3.2.1.28

5

Trehalase

6

Lactase and hetero – β - Glucosidase

EC 3.2.1.23 và EC 3.2.1.62

Trong hệ tiêu hóa của người tồn tại maltase-glucoamylase chủ yếu ở niêm
mạc với chức năng thủy phân maltose, dextrin beta và một số loại cyclodextrins.
1.2.2 Cấu trúc hóa học α – glucosidase
Alpha – Glucosidase có khối lượng phân tử khoảng 125kDa gồm nhiều đơn
phân alpha – Glucose liên kết với nhau [27].
Dựa vào sự tương đồng của trình tự gene, α – glucosidases chủ yếu được
phân thành hai họ đặc trưng lớn là GH13 và GH31 và hai họ nhỏ là GH4 và GH97.
Họ GH13 có nguồn gốc từ vi khuẩn, nấm men và cơn trùng trong trình tự gen cùng
có bốn trình tự tương đồng được coi là vùng bảo thủ gồm vùng 1, 2 ,3 và 4 mã hóa
cho các acid amin quan trọng tham gia vào q trình xúc tác phản ứng. Họ GH31

thuộc về nhóm II và III với nguồn thu nhận từ nấm mốc, thực vật và động vật.
Trong nhóm họ này khơng tìm thấy sự tương đồng trong cấu trúc gen của vùng xúc
tác phản ứng. Tuy nhiên theo nghiên cứu của Nakai và cộng sự cho thấy có sự khác
biệt trong sắp xếp các acid amin ở vùng C – terminal của các enzyme thuộc nhóm
II và III, điều đó quyết định đến cơ chất đặc hiệu của các enzyme [19].
Hiện nay mới chỉ có ba cấu trúc hồn chỉnh của α – Glucosidase được gửi
9


trên ngân hàng dữ liệu protein (PDB). Các cấu trúc đó là GH31 Mal từ Sulfolobus
solfataricus với mã số 2g3m và 2g3n, GH4 Ag1A của Thermotoga maritime với mã
số 1lwj và 1lwh, GH97 Susb của Bacteroides thetaiomicron với mã vpi – 5482 và
vpi – 2d73 [56].
1.2.3. Tính chất của α-glucosidases
Alpha glucosidase hoạt động ở pH tối ưu từ 4 - 4,5, là enzyme có khả năng
phân cắt các liên kết ở vị trí α-1,4, α-1,3 và α-1,2 D-glycoside ở đầu khơng khử của
các di-, oligo-, polysaccharide và giải phóng ra D-glucose có thể hấp thu trực tiếp
vào máu [27].
Alpha glucosidase có tác dụng thủy phân đường maltose, đường sucrose
nhưng khơng thủy phân được tinh bột.
Maltose + H2O

α-glucosidase

2 D-Glucose

1.3. Chất kìm hãm alpha – glucosidase (alpha - glucosidase inhibitors – AGIs)
1.3.1. Giới thiệu về chất kìm hãm alpha – glucosidase
Chất kĩm hãm enzyme là chất làm giảm hoạt độ enzyme nhưng khơng bị
chuyển hóa bởi enzyme. Các chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ và hữu

cơ [12].
Chất kìm hãm enzyme được chia thành hai loại là kìm hãm cạnh tranh và
kìm hãm khơng cạnh tranh. Các hoạt chất AGIs là các hoạt chất kìm hãm cạnh
tranh. Với bản chất là các disaccharides, pseudooligosaccharide, thiosugars,
polyhydroxylated alkanoid, carbasugar, pseudoaminosugar,…[14].
AGIs là hoạt chất có thể thu nhận từ nhiều con đường khác nhau như nguồn
thực vật, động vật hay nuôi cấy vi sinh vật và bằng phương pháp tổng hợp hóa học.
Năm 1970, người ta nhận ra rằng việc sử dụng các chất kìm hãm α –
glucosidase có thể kiểm soát sự hấp thụ carbohydrat và hỗ trợ điều trị cho những
người mắc bệnh ĐTĐ một cách hiệu quả.

10


1.3.2. Phân loại các hoạt chất kìm hãm alpha – glucosidase
Hiện nay có nhiều tiêu chí khác nhau để phân loại các hoạt chất kìm hãm α –
glucosidase, tuy nhiên phân loại dựa vào công thức cấu tạo được sử dụng nhiều hơn
cả. Theo tiêu chí này các hoạt chất kìm hãm α – glucosidase được chia ra làm bốn
nhóm chính gồm có: disaccharides, iminosugars, carbasugars và pseudoaminosugars,
cuối cùng là thiosugars.
1.3.2.1. Nhóm Disaccharides
Kojibiose, nigerose và trehalose là nhưng hoạt chất có bản chất là
disaccharides. Việc nghiên cứu và tách chiết được các hoạt chất này đã mở ra những
hướng đi mới trong sản xuất thuốc điều trị bệnh ĐTĐ type 2.
Kojibiose: là hoạt chất có chứa liên kết α - 1, 2 glycoside được tách chiết lần
đầu tiên vào năm 1953 từ dịch chiết có tên là koji, một sản phẩm của quá trình lên
men gạo bởi Aspergillus oryzae và là hoạt chất kìm hãm α - glucosidase nhóm I .
Nigerose: là các sản phẩm thủy phân bằng acid của amylopectin, trong cơng
thức cấu tạo có liên kết α - 1, 2 glycoside, có khả năng kìm hãm α - glucosidase
nhóm II.

Trehalose: là một disaccharide có chứa một liên kết α - 1, 1 của hai phân tử
glucose, trehalose được chiết xuất từ hạt của cây mướp đắng (Mormodica
charantia) và nấm múa (Grifola frondosa). Trehalose cịn được ứng dụng trong
cơng nghệ thực phẩm và sản xuất mỹ phẩm và gần đây đã được sử dụng trong điều
trị loãng xương [14].

11


Kojibiose

Nigerose

Trehalose

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo của một số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase có
bản chất là disaccharide
1.3.2.2. Nhóm Iminosugars
Iminosugars là các polyhydroxylated alkaloid, trong đó các đơn phân là
monosaccharide mà vịng pyranoza có một oxy được thay thế bởi nito do đó vẫn
thường gọi là các hoạt chất “giả đường”, Cấu trúc alkaloid polyhydroxylated chứa ít
nhất hai nhóm hydroxyl và một ngun tử nitơ dị vịng [36].
Iminosugars thu nhận từ thực vật hoặc vi sinh vật là những hoạt chất có tiềm
năng to lớn trong y dược học bởi khả năng kìm hãm glucosidase. Iminosugars có
trọng lượng phân tử thấp và có khả năng kìm hãm α – glucosidase bởi có cấu trúc
và điện tích tương tự như oxacarbenium ion – một sản phẩm trung gian của quá
trình cắt liên kết glycoside các nguồn cơ chất cacbonhydrat bởi glucosidase [14].
Dựa vào cấu trúc iminosugars được chia làm năm lớp sau: piperidines,
pyrrolidines, indolizidines, pyrrolizidines và nortropanes.
- Piperidines: Nojirimycin, 1-deoxynojirimycin, glycosylated deoxynojirimycin

và isofagomine là những hoạt chất được chú ý nghiên cứu và ứng dụng sản xuất thuốc
điều trị bệnh ĐTĐ type 2 thuộc lớp piperidines.
Nojirimycin: là các endocyclic đầu tiên có cấu trúc tương tự glucose được
phát hiện vào năm 1966, là sản phẩm tạo thành trong quá trình sinh trưởng của các
chủng Bacillus, Streptomyces, dịch chiết lá dâu tằm, được biết đến như một chất
kháng sinh và chất kìm hãm α-và β-glucosidases [14].

12


1-deoxynojirimycin (DNJ): là hoạt chất có bản chất iminosugar đang được
chú ý mạnh mẽ trong ngành y học, công nghệ sinh học và thực phẩm bởi các hoạt
tính sinh học mà nó mang lại. Dựa vào khả năng kìm hãm α, β – glucosidase, mà
hoạt chất này có tác dụng điều trị sự mất cân đối của quá trình trao đổi chất có liên
quan đến carbonhydrat như ĐTĐ, DNJ cịn được biết đến với vai trò là một hoạt
chất tiềm năng trong việc điều trị các bệnh hiểm nghèo như ung thư, bệnh liên quan
đến virus (HIV, HBV..) [1].
Glycosylated deoxynojirimycin: là sản phẩm glycosyl hóa của 1deoxynojirimycin đã được thử nghiệm lâm sàng trong điều trị tăng đường huyết sau
ăn ở bệnh nhân đái ĐTĐ [32].
Isofagomine: có hoạt tính kìm hãm (HTKH) β-glucosidases rất mạnh, gấp
khoảng 440 lần so với 1- deoxynojirimycin, nhưng hoạt tính khơng cao với αglucosidases [32].

Nojirimycin

DNJ

Isofagomine

Glycosylated
deoxynojirimycin

Hình 1.3. Công thức cấu tạo của một số hoạt chất kìm hãm α – glucosidase
thuộc lớp Piperidines
- Pyrrolidines: một AGI điển hình thuộc lớp Pyrrolidines là 1,4-dideoxy-1,4imino-D-arabinitol, được chiết xuất lần đầu tiên từ quả một cây họ đậu có tên khoa
học là Angylocalyx boutiqueanus [32].
- Indolizidines: Castanospermine là một indolizidine, chiết xuất từ hạt của
cây cẩm thạch có tên khoa học là Castanospermum australe, có khả năng kìm hãm
α-glucosidases

13