Xây dựng quy trình sản xuất và tiêu chuẩn hóa bộ kit thử định lượng bilirubin trực tiếp trong huyết thanh bằng phương pháp diazo hóa

Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
[\

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
Mã số ngành: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ
Niên khóa 2008 - 2010
TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 07 năm 2010


Luận văn thạc sĩ

CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM
BỆNH VIỆN QUẬN 4 TP.HCM

Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS-TS TRẦN THANH NHÃN.

Cán bộ chấm nhận xét 1: ..................................................................................

Cán bộ chấm nhận xét 2: ..................................................................................

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại:
HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày 22 tháng 07 năm 2010.

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang

Luận văn thạc sĩ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
------------------oOo--TP. HCM, ngày 22 tháng 07 năm 2010.

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: NGUYỄN THỊ PHƯƠNG TRANG
Ngày, tháng, năm sinh : 19/09/1981
Chun ngành : Cơng nghệ Sinh học.

Giới tính : Nữ.
Nơi sinh : TP.HCM
MSHV : 03108149

I - TÊN ĐỀ TÀI:
XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT VÀ TIÊU CHUẨN HỐ
BỘ KIT THỬ ĐỊNH LƯỢNG BILIRUBIN TRỰC TIẾP
TRONG HUYẾT THANH BẰNG PHƯƠNG PHÁP DIAZO HÓA
II - NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:
− Xây dựng quy trình sản xuất bộ kit thử định lượng Bilirubin trực tiếp trong
huyết thanh bằng phương pháp Diazo hóa
− Khảo sát độ đúng, độ chính xác, độ tuyến tính của bộ kit với các huyết thanh
kiểm tra.
− Kiểm tra độ ổn định của bộ kit bằng phương pháp dài hạn và phương pháp già
hóa cấp tốc để dự đốn hạn sử dụng của bộ kit
− Sử dụng bộ kit thử trên trong xét nghiệm có so sánh thống kê với bộ kit ngoại
nhập đang sử dụng

III - NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : tháng 12 năm 2009
IV - NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : tháng 07 năm 2010
V - HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN : PGS-TS. TRẦN THANH NHÃN
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH

Nội dung và đề cương luận văn thạc sĩ đã được Hội đồng chun ngành thơng qua.
TRƯỞNG PHỊNG ĐÀO TẠO SĐH
TRƯỞNG KHOA QL NGÀNH

(Họ tên và chữ ký)

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

LỜI CẢM ƠN
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
- Thầy hướng dẫn tôi: PGS-TS. Trần Thanh Nhãn
- Cô chủ nhiệm của tôi: TS. Nguyễn Thúy Hương
- Quý Thầy Cô trong bộ môn Công nghệ sinh học – trường Đại
học Bách khoa TP.HCM
- Gia đình tôi,
- Quý đồng nghiệp,
- Bạn bè cùng học lớp cao học 2008.
Xin được cảm ơn tất cả đã giúp tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp
này !

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

TÓM TẮT
Đề tài luận văn “Xây dựng quy trình sản xuất và tiêu chuẩn hóa bộ kit thử
định lượng Bilirubin trực tiếp trong huyết thanh bằng phương Diazo hóa” được thực
hiện với mục tiêu ứng dụng phần mềm vi tính (Design-Expert, FormRules, INForm,
Microsoft Office Excel) kết hợp với thực nghiệm để thiết kế và tối ưu hóa công thức
pha chế bộ kit định lượng Bilirubin trực tiếp. Thành phần công thức tối ưu của bộ
kit: nồng độ acid sulfanilic = 49,3252 mmol/L, Natri nitrit = 73,3275 mmol/L
Từ công thức tối ưu được xây dựng, chúng tôi tiến hành pha chế để kiểm tra
độ ổn định của bộ kit theo thời gian và bằng phương pháp già hóa cấp tốc, từ đó dự
đốn hạn sử dụng của bộ kit.Thời hạn sử dụng bộ kit được dự đoán là 62 tháng kể
từ khi pha chế ở điều kiện bảo quản mát từ 2 – 8 0C.
Bên cạnh đó, chúng tôi sử dụng bộ kit trên để định lượng nồng độ Bilirubin
trực tiếp trong huyết thanh của 217 lượt bệnh nhân và 30 mẫu huyết thanh nội kiểm
tra tại khoa xét nghiệm bệnh viện Quận 4-TP.HCM và có so sánh thống kê kết quả
với bộ kit ngoại nhập (ISE - Ý) đang sử dụng tại đây.
Kết quả của đề tài sẽ góp phần tạo ra các dịng sản phẩm nội địa trong lĩnh
vực xét nghiệm, nhằm hạ giá thành sản phẩm và giảm chi phí cho bệnh nhân.

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

Abstract

The project, make a manufacturing process and standardization bilirubin direct
quantitative of a kit in serum by diazo method, is performed towards applying the
software such as Design-Expert, FormRules, INForm, Microsoft Office Excel to
design and be optimum mixing formular for bilirubin direct quantitative kit by diazo
method. Ingredients of optimum formular of a kit include: concentration of acid
sulfanilic = 49,3252 mmol/L, concentration of Natri nitrit = 73,3275 mmol/L.
Based on the optimum formular, we prepare medicines to test the stable kit by
real time method and by aging method so that we can predict a expiry date of the
kit. The predicted expiry date of the kit is 62 months from the manufacture date at
2 – 80C
On the other hands, we use this kit to determine the bilirubin direct quantitative
in serum of 217 patients and serum of 30 IQC (Internal Quality Control) at
biochemistry department of district 4 hospital at Ho Chi Minh City. And then we
compare to imported kit (ISE - Italy) are using at our hospital.
The result of this project is a foundation for manufacturing research to other
biochemical kits in Vietnam, and this result also contributes to create the series of
domestic products in test field. Therefore we can reduce the product price and
lighten the expense of patient.

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN
LỜI CẢM ƠN
TÓM TẮT
MỤC LỤC
Chương 1. MỞ ĐẦU ............................................................................................ 1
Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................ 4

2.1

Tổng quan về bilirubin ......................................................................... 5

2.1.1

Cấu trúc hóa học của bilirubin ............................................................ 5

2.1.2

Chuyển hóa bilirubin ............................................................................ 7

2.1.2.1 Tạo biliverdin......................................................................................... 7
2.1.2.2 Tạo bilirubin .......................................................................................... 8
2.2

Bệnh lý liên quan ................................................................................. 11

2.2.1

Chỉ số bilirubin ở người bình thường................................................ 11

2.2.2

Thay đổi sinh lý ................................................................................... 11

2.2.2.1 Bilirubin gián tiếp tăng ....................................................................... 11
2.2.2.2 Bilirubin trực tiếp tăng ....................................................................... 11

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang

Luận văn thạc sĩ

2.2.2.3 Một số hội chứng rối loạn chuyển hóa bilirubin di truyền.............. 12
2.2.2.4 Các thể vàng da.................................................................................... 14
2.3

Các phương pháp định lượng bilirubin trong huyết thanh .......... 15

2.3.1

Phương pháp diazo hóa ...................................................................... 15

2.3.1.1 Lịch sử phát triển ................................................................................ 15
2.3.1.2 Nguyên tắc............................................................................................ 15
2.3.2

Các phương pháp định lượng khác ................................................... 17

2.3.2.1 Phương pháp enzym ........................................................................... 17
2.3.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng cao áp ....................................................... 17
2.3.2.3 Phương pháp đo bilirubin xuyên da .................................................. 18
2.3.3

Ưu và nhược điểm của các phương pháp định lượng bilirubin ..... 19

2.3.4

Các quy trình tham khảo.................................................................... 19

2.4

Thiết kế và tối ưu hóa cơng thức........................................................ 21

2.4.1

Thiết kế mơ hình thực nghiệm ........................................................... 21

2.4.1.1 Mơ hình cơng thức (formulation designs) ......................................... 22
2.4.1.2 Mơ hình quy trình (process designs) ................................................. 22
2.4.1.3 Mơ hình kết hợp (combined designs)................................................. 22
2.4.2

Nghiên cứu liên quan nhân quả ......................................................... 23

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

2.4.3

Tối ưu hóa cơng thức........................................................................... 23

2.4.4

Ứng dụng phần mềm vi tính............................................................... 24

2.4.4.1 Các phần mềm thơng minh ................................................................ 24

2.4.4.2 Cấu tạo của các phần mềm thông minh ............................................ 27
2.4.4.3 Ứng dụng phần mềm thông minh ..................................................... 29
2.5

Thẩm định quy trình định lượng ...................................................... 30

2.5.1

Miền giá trị - khoảng tuyến tính ....................................................... 30

2.5.1.1 Khảo sát khoảng tuân theo định luật Lambert – Beer .................... 30
2.5.1.2 Sự lệch khỏi định luật Beer ................................................................ 30
2.5.1.3 Miền giá trị (khoảng tuyến tính)........................................................ 31
2.5.2

Xây dựng phương trình hội quy tuyến tính ...................................... 31

2.5.2.1 Cơng thức tính hệ số hồi quy.............................................................. 32
2.5.2.2 Phương sai tái hiện .............................................................................. 32
2.5.2.3 Kiểm định sự có nghĩa của các hệ số hồi quy theo Student............. 32
2.5.2.4 Kiểm định sự tương thích của mơ hình với thực nghiệm theo tiêu
chuẩn Fisher......................................................................................... 33
2.5.3

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ....................................... 33

2.5.4

Độ đặc hiệu (specific) ......................................................................... 34

2.5.5

Độ chính xác (precision) .................................................................... 34

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

2.5.5.1 Độ lặp lại (repeatibility) ..................................................................... 34
2.5.5.2 Độ chính xác trung gian (intermediate precision) ........................... 34
2.5.5.3 Độ sao chép lại (reproducibility)........................................................ 35
2.5.6

Độ đúng (accuracy) ............................................................................. 35

2.6

Độ ổn định ............................................................................................ 36

2.6.1.

Độ ổn định của thuốc........................................................................... 36

2.6.2.

Hạn dùng của thuốc ........................................................................... 36

2.6.3.

Nghiên cứu độ ổn định của thuốc ..................................................... 36

2.6.3.1 Phương pháp thử độ ổn định thực hay phương pháp theo dõi tự
nhiên (real time method)..................................................................... 36
2.6.3.2 Phương pháp thử độ ổn định cấp tốc hay phương pháp già hóa
cấp tốc (aging method) ...................................................................... 36
Chương 3. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP................................ 39

3.1.

Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị.............................................. 40

3.1.1

Hóa chất và dung mơi ......................................................................... 40

3.1.2

Chất chuẩn và chất thử....................................................................... 40

3.1.3

Thiết bị nghiên cứu.............................................................................. 41

3.1.4

Phần mềm chuyên dụng...................................................................... 42

3.2

Phương pháp nghiên cứu.................................................................... 43

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

3.2.1

Sơ đồ nội dung nghiên cứu ................................................................. 43

3.2.2

Xây dựng cơng thức tối ưu và quy trình điều chế bộ kit theo
phương pháp thực nghiệm.................................................................. 43

3.2.2.1 Quy trình định lượng creatinin trong huyết thanh.......................... 43
3.2.2.2 Thăm dò sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng ................................................ 46
3.2.2.3 Thăm dò mối liên quan nhân quả ...................................................... 46
3.2.2.4 Tối ưu hóa quy trình .......................................................................... 47
3.2.3

Thẩm định quy trình định lượng ....................................................... 50

3.2.3.1 Thẩm định quy trình tối ưu................................................................ 50
3.2.3.2 So sánh quy trình tối ưu và quy trình tham khảo ............................ 52
3.2.4

Thử nghiệm độ ổn định của bộ kit..................................................... 52

3.2.4.1 Theo dõi độ ổn định của bộ kit theo phương pháp dài hạn ............ 53
3.2.4.2 Theo dõi độ ổn định của bộ kit theo phương pháp già hoá cấp tốc 54
3.2.4.3

Xác định tuổi thọ của bộ thuốc thử ................................................. 57

3.2.5

Ứng dụng bộ kit nghiên cứu trên mẫu thử thật và so sánh với bộ
kit ngoại nhập ...................................................................................... 57

3.2.6

Tính tốn hiệu quả kinh tế của bộ kit................................................ 58

Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN........................................................... 59
4.1

Xây dựng quy trình bào chế bộ kit .................................................... 60

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

4.1.1

Thăm dò sơ bộ các yếu tố ảnh hưởng ................................................ 60

4.1.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ acid sulfanilic đến độ hấp thu .................. 60

4.1.1.2 Ảnh hưởng của nồng độ natri nitrit đến độ hấp thu........................ 61
4.1.1.3. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến độ hấp thu ...................................... 62
4.1.1.4.
4.1.2

Ảnh hưởng của acid clohydric đến độ hấp thu ............................... 63
Thăm dị nhân quả .............................................................................. 64

4.1.2.1 Mơ hình thí nghiệm ............................................................................. 64
4.1.2.2 Kết quả thực nghiệm........................................................................... 67
4.1.2.3 Liên quan nhân quả ............................................................................ 68
4.1.3

Tối ưu hóa cơng thức........................................................................... 70

4.1.3.1 Dữ liệu đầu vào cho phần mềm INForm........................................... 71
4.1.3.2 Luyện mạng thần kinh ........................................................................ 72
4.1.3.3 Điều kiện tối ưu hóa ............................................................................ 72
4.1.3.4 Kết quả tối ưu hố ............................................................................... 73
4.2

Thẩm định quy trình định lượng ....................................................... 74

4.2.1

Thẩm định quy trình tối ưu................................................................. 74

4.2.1.1 Khoảng tuyến tính................................................................................ 74
4.2.1.2 Xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính ...................................... 81

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

4.2.1.3 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ....................................... 82
4.2.1.4 Độ đặc hiệu........................................................................................... 83
4.2.1.5 Độ chính xác......................................................................................... 84
4.1.2.6 Độ đúng ................................................................................................ 86
4.2.2

So sánh quy trình tối ưu và quy trình tham khảo ............................ 87

4.2.2.1 Đánh giá quy trình tham khảo ........................................................... 87
4.2.2.2 So sánh thành phần thuốc thử và điều kiện tiến hành..................... 89
4.2.2.3 So sánh các chỉ số thống kê ................................................................ 89
4.3

Thử nghiệm độ ổn định của bộ kit...................................................... 90

4.3.1

Theo dõi độ ổn định của bộ kit theo thời gian .................................. 90

4.3.2

Theo dõi độ ổn định của bộ kit theo phương pháp già hoá cấp tốc 93

4.3.2.1 Điều kiện theo dõi ở nhiệt độ 25 oC ± 3 oC ......................................... 93
4.3.2.2 Điều kiện theo dõi ở nhiệt độ 40 oC ± 3 oC ......................................... 97

4.3.2.3 Áp dụng phương trình Arrhenius tính tuổi thọ bộ kit .................... 99
4.3.3

Xác định tuổi thọ của bộ thuốc thử .................................................. 102

4.4

Ứng dụng bộ kit nghiên cứu trên mẫu thử thật và so sánh kết quả
với bộ kit ngoại nhập........................................................................... 102

4.5

Tính tốn hiệu quả kinh tế của bộ kit .............................................. 103

Chương 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................... 104

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

5.1

Kết luận .............................................................................................. 105

5.1.1

Xây dựng công thức và quy trình bào chế ...................................... 105

5.1.2

Xây dựng và thẩm định quy trình ................................................... 105

5.1.3

Thử nghiệm độ ổn định của bộ kit................................................... 105

5.1.4

Ứng dụng bộ kit trên mẫu thật và so sánh kết quả với bộ ngoại
nhập ................................................................................................... 105

5.1.5

Tính tốn hiệu quả kinh tế của bộ kit.............................................. 105

5.2

Đề nghị................................................................................................ 105

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

Bảng 2.1 - Ưu, nhược điểm của các phương pháp định lượng bilirubin .............. 19
Bảng 2.2 - Các quy trình tham khảo...................................................................... 20

Bảng 2.3 -Thời gian cần thiết để kiểm tra lại kết quả phụ thuộc vào tbảo quản [5].. 37
Bảng 3.1 - Hóa chất và dung môi: ......................................................................... 40
Bảng 3.2 - Chất chuẩn và chất thử:........................................................................ 40
Bảng 3.3 - Trang thiết bị được sử dụng:................................................................ 41
Bảng 3.4 - Phần mềm được sử dụng ..................................................................... 42
Bảng 3.5 - Thành phần của quy trình định lượng bilirubin trực tiếp .................... 45
Bảng 3.6 - Mẫu cho tiến hành thử nghiệm độ đặc hiệu......................................... 51
Bảng 3.7 - Thể tích thuốc thử cần dùng thử nghiệm độ ổn định (dự kiến) ........... 53
Bảng 3.8 - Thời khóa biểu tiến hành thử độ ổn định theo phương pháp dài hạn
(dự kiến).............................................................................................. 54
Bảng 3.9 - Thời khóa biểu tiến hành thử độ ổn định theo phương pháp già hoá ở
250C ± 30C, độ ẩm tương đối 75% ± 5% (dự kiến) ............................ 55
Bảng 3.10 - Thời khóa biểu tiến hành thử độ ổn định theo phương pháp già hoá
ở 400C ± 30C, độ ẩm tương đối 75% ± 5% (dự kiến) ......................... 56
Bảng 4.1 - Sự phụ thuộc độ hấp thu (Y) theo nồng độ acid sulfanilic.................. 60

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

Bảng 4.2 - Sự phụ thuộc độ hấp thu (Y) theo nồng độ natri nitrit. ...................... 61
Bảng 4.3 - Sự phụ thuộc độ hấp thu (Y) theo thời gian ủ. .................................... 62
Bảng 4.4 - Sự phụ thuộc độ hấp thu (Y) theo nồng độ acid chlohydric ................ 63
Bảng 4.5 - Các yếu tố và mức được khảo sát trong mơ hình D-Optimal.............. 64
Bảng 4.6 - Mơ hình D-Optimal ............................................................................. 65
Bảng 4.7 - Dữ liệu của mơ hình D-Optimal .......................................................... 66
Bảng 4.8 - Kết quả thực nghiệm theo mơ hình D-Optimal (thăm dị nhân quả)... 67
Bảng 4.9 - Dữ liệu đầu vào cho phần mềm FormRules ........................................ 68
Bảng 4.10 - Các yếu tố ảnh hưởng đến độ hấp thu .............................................. 69

Bảng 4.11 - Đầu vào cho phần mềm INForm........................................................ 71
Bảng 4.12 - Thành phần công thức tối ưu của bộ kit ............................................ 73
Bảng 4.13 - Độ hấp thu đo được ở các nồng độ khảo sát khoảng tuyến tính (từ 0
đến 22 mg/dL với khoảng biến thiên 1mg/dL)................................... 75
Bảng 4.14 - Độ hấp thu đo được ở các nồng độ khảo sát khoảng tuyến tính (giữa
nồng độ từ 20 – 21 mg/dL với khoảng biến thiên 0,05mg/dL) .......... 77
Bảng 4.15 - Độ hấp thu đo được ở các nồng độ khảo sát khoảng tuyến tính (giữa
nồng độ từ 0 – 1 mg/dL với khoảng biến thiên ............................... 79
Bảng 4.16 - Sự phụ thuộc độ hấp thu (Y) theo nồng độ bilirubin trực tiếp (công
thức tối ưu). ........................................................................................ 81

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

Bảng 4.17 - Kết quả độ hấp thu trong thử nghiệm độ đặc hiệu ........................... 83
Bảng 4.18 - Kết quả thực nghiệm về độ chính xác (lặp lại) ................................. 84
Bảng 4.19 - Kết quả thẩm định độ chính xác trung gian ...................................... 85
Bảng 4.20 - Kết quả thực nghiệm độ đúng ........................................................... 86
Bảng 4.21 - Sự phụ thuộc độ hấp thu theo nồng độ của quy trình I.S.E ............... 87
Bảng 4.22 - Kết quả thực nghiệm với độ chính xác (quy trình I.S.E)................... 88
Bảng 4.23 - Kết quả thực nghiệm của quy trình I.S.E........................................... 88
Bảng 4.24 - So sánh thành phần thuốc thử và điều kiện tiến hành các quy trình.. 89
Bảng 4.25 - So sánh các chỉ số thống kê giữa quy trình tối ưu và quy trình tham
khảo..................................................................................................... 89
Bảng 4.26 - Kết quả nồng độ thay đổi theo theo thời gian (phương pháp dài hạn)90
Bảng 4.27 -Tuổi thọ của bộ kit ở 3 lô thử nghiệm theo phương pháp dài hạn...... 92
Bảng 4.28 - Nồng độ bilirubin trực tiếp trong các chu kỳ theo dõi bằng phương
pháp già hóa cấp tốc ở 25oC, độ ẩm tương đối 75 ± 5% .................... 93

Bảng 4.29 - Kết quả xác định độ ổn định theo quy tắc Van’t Hoff (trong điều
kiện 25± 30C,độ ẩm tương đối là 75 ± 5%) của lô BD120901........... 94
Bảng 4.30 - Kết quả xác định độ ổn định theo quy tắc Van’t Hoff (trong điều
kiện 25± 30C,độ ẩm tương đối là 75 ± 5%) của lô BD120902........... 95
Bảng 4.31 - Kết quả xác định độ ổn định theo quy tắc Van’t Hoff (trong điều
kiện 25± 30C,độ ẩm tương đối là 75 ± 5%) của lô BD120902........... 96

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

Bảng 4.32 -Tuổi thọ 3 lô bộ kit trong điều kiện 25±30C, độ ẩm tương đối
75±5%)................................................................................................ 96
Bảng 4.33 - Nồng độ creatinin trong các chu kỳ theo dõi bằng phương pháp già
hóa cấp tốc ở 40oC, độ ẩm tương đối 75 ± 5% ................................... 97
Bảng 4.34 - Kết quả xác định độ ổn định theo quy tắc Van’t Hoff (400C) ........... 98
Bảng 4.35 - Bảng tương ứng giữa lnK và 1000/T ................................................. 99
Bảng 4.36 -Tuổi thọ của bộ kit tính theo phương pháp Arrhenius1.................... 101
Bảng 4.37 - Tuổi thọ được xác định của bộ kit ................................................... 102
Bảng 4.38 - So sánh kết quả định lượng bilirubin trực tiếp của 2 bộ kit............. 102
Bảng 4.39 - Giá tham khảo một số bộ kit bilirubin trực tiếp trên thị trường ...... 103
Bảng 4.40 - Giá tham khảo các loại hoá chất chế tạo bộ kit BD1209................. 103

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

Hình 2.1. Cấu trúc thẳng của bilirubin. ................................................................ 5

Hình 2.2. Mối liên quan cấu trúc giữa porphyrin và sắc tố mật........................... 6
Hình 2.3. Sơ đồ phản ứng liên hợp của bilirubin. ................................................ 8
Hình 2.4. Sơ đồ chuyển hóa bilirubin................................................................. 10
Hình 2.5. Sơ đồ phản ứng của phương pháp diazo hóa ..................................... 16
Hình 2.6.

Sơ đồ tóm tắt quy trình thiết kế và tối ưu hóa cơng thức ................... 21

Hình 2.7.

Mối liên quan nhân quả ...................................................................... 23

Hình 2.8. Minh họa các mối liên quan của xi với y............................................ 24
Hình 2.9. Nguyên lý vận hành của phần mềm thông minh INForm .................. 26
Hình 2.10. Cấu trúc mạng đa lớp ......................................................................... 27
Hình 2.11. Giới hạn của định luật Beer về sự hấp thụ quang............................... 30
Hình 3.1. Sơ đồ nội dung nghiên cứu................................................................. 43
Hình 3.2. Sơ đồ quy trình điều chế bộ kit .......................................................... 44
Hình 3.3. Minh họa các hàm mục tiêu áp dụng trong tối ưu hóa ....................... 49
Hình 4.1. Ảnh hưởng của nồng độ acid sulfanilic đến độ hấp thu. ..................... 60
Hình 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ natri nitrit đến độ hấp thu ............................ 61

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

Hình 4.3. Ảnh hưởng của thời gian ủ đến độ hấp thu ......................................... 62
Hình 4.4. Ảnh hưởng của acid clohydric đến độ hấp thu.................................... 63
Hình 4.5. Mối liên quan giữa độ hấp thu (Y) với nồng độ acid sulfanilic (X1)

và nồng độ natri nitrit (X2).................................................................. 70
Hình 4.6. Sơ đồ quy trình định lượng bilirubin trực tiếp của bộ kit ................... 74
Hình 4.7. Đường biểu diễn độ hấp thu theo nồng độ bilirubin trực tiếp (với
khoảng khảo sát từ 0 - 22 mg/dL)....................................................... 76
Hình 4.8. Đường biểu diễn độ hấp thu theo nồng độ bilirubin trực tiếp (với
khoảng khảo sát từ 20 - 21 mg/dL)..................................................... 78
Hình 4.9. Đường biểu diễn độ hấp thu theo nồng độ bilirubin trực tiếp (với
khoảng khảo sát từ 1 - 0 mg/dL)....................................................... 80
Hình 4.10. Đường chuẩn giữa độ hấp thu và nồng độ......................................... 82
Hình 4.11. Đường chuẩn giữa độ hấp thu và nồng độ của quy trình I.S.E ......... 87
Hình 4.12. Đường tuyến tính giữa thời gian và ln[C] của lơ BD120901............ 90
Hình 4.13. Đường tuyến tính giữa thời gian và ln[C] của lơ BD120902............ 91
Hình 4.14. Đường tuyến tính giữa thời gian và ln[C] lơ Cr-T110803 ................ 91
Hình 4.15. Đường tuyến tính liên quan giữa ln K và 1000/T ở lô BD120901.... 99
Hình 4.16. Đường tuyến tính liên quan giữa ln K và 1000/T ở BD120902...... 100
Hình 4.17. Đường tuyến tính liên quan giữa ln K và 1000/T ở lô BD120903.. 100

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang

1


Luận văn thạc sĩ

2

Vàng da là bệnh lý rất thường gặp hiện nay. Đây là những một trong những
bệnh liên quan đến sự tăng nồng độ bilirubin trong các dịch cơ thể. Xác định được
nồng độ bilirubin trong huyết thanh (HT) có thể giúp chẩn đốn sớm bệnh lý liên
quan cũng như dự đốn ngun nhân của bệnh. Do đó việc định lượng bilirubin
trong huyết thanh là một trong những xét nghiệm sinh hóa quan trọng cần được thực
hiện để giúp cho việc chẩn đoán sớm và điều trị bệnh có hiệu quả.
Có nhiều phương pháp được sử dụng để định lượng bilirubin trực tiếp trong
huyết thanh như: phương pháp diazo hóa, phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC),
phương pháp sử dụng enzym, phương pháp đo bilirubin xuyên qua da,… trong đó
phương pháp diazo hóa được sử dụng rộng rãi trong các phịng xét nghiệm sinh hóa
dưới dạng kit thử vì có ưu điểm là đơn giản, tiện dụng, nhanh chóng và có độ chính
xác cao.
Trong lĩnh vực xét nghiệm sinh hóa lâm sàng hiện nay hầu hết các phòng
xét nghiệm đều sử dụng các kit thử nhập từ nước ngồi. Đó là một trong những
ngun nhân làm tăng giá thành các xét nghiệm và đồng thời làm tăng thêm gánh
nặng điều trị cho bệnh nhân. Việc sản xuất trong nước những kit thử cho các xét
nghiệm hóa sinh với chất lượng ổn định, giá thành rẻ là một đòi hỏi cấp thiết. Thực
hiện được điều này, chúng ta sẽ từng bước chủ động trong việc cung cấp các thuốc
thử cho các phịng xét nghiệm hóa sinh, giảm bớt lệ thuộc vào các sản phẩm nhập
ngoại, tiết kiệm được ngoại tệ, cũng như góp phần giảm chi phí điều trị cho bệnh
nhân.
Chúng tôi chọn đề tài “Xây dựng quy trình sản xuất và tiêu chuẩn hóa bộ kit
định lượng Bilirubin trực tiếp trong huyết thanh bằng phương pháp Diazo hóa”
nhằm mục đích nghiên cứu và hướng đến sản xuất bộ kit thử này để thay thế các sản
phẩm ngoại nhập.
Mục tiêu nghiên cứu:
–

Áp dụng các phần mềm vi tính trong nghiên cứu kỹ thuật bào chế như: khảo

sát mối liên hệ nhân quả, thiết kế mơ hình thực nghiệm và tối ưu hóa cơng
thức. Từ đó xác định cơng thức và quy trình bào chế tối ưu cho bộ kit.

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

–

3

Thẩm định quy trình định lượng nồng độ Bilirubin trực tiếp trong huyết
thanh từ bộ kit.

–

Ứng dụng sản xuất thử 3 lô bộ kit ở quy mô phịng thí nghiệm.

–

Xác định độ ổn định bộ kit theo thời gian và phương pháp lão hóa cấp tốc.

–

Sử dụng bộ kit thử trên mẫu huyết thanh bệnh nhân có so sánh thống kê với
bộ kit ngoại nhập.

–

Đánh giá sơ lược hiệu quả kinh tế của việc sản xuất bộ kit trên.

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang


Luận văn thạc sĩ

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang

4


Luận văn thạc sĩ

5

2.1

TỔNG QUAN VỀ BILIRUBIN

2.1.1

CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA BILIRUBIN [2], [16],[22], [25] ,[30]
Bilirubin được tìm ra đầu tiên bởi Virchow năm 1849, ông gọi sắc tố vàng

xanh này là “hematoidin”. Thuật ngữ “bilirubin” được Stadeler đặt ra năm 1864, và
đến 1874 thì Tarchanoff chứng minh được mối liên quan trực tiếp giữa sắc tố mật
và hemoglobin. Fisher và Plieninger đã tổng hợp và đưa ra cấu trúc của bilirubin
IXα (hình 2.1). Cấu trúc bốn vịng pyrol liên kết thẳng hàng này của phân tử
bilirubin đã được thừa nhận suốt hơn 30 năm. Cấu trúc này gồm 4 vòng pyrol nối

với nhau bằng cầu nối carbon. Carbon β (carbon nằm xa nguyên tử nitro) mang
những chuỗi bên. Carbon α của vịng pyrol ở phía ngồi sẽ gắn với nhóm carbonyl
(C=O).
HO

CH2

C H2
Me CH

O

OH

O O

Me C H2

C H2
C H 2M e

C H2
Me CH

A
N

B
N

C
N

D
N

H

H

H

H

O

Hình 2.1. Cấu trúc thẳng của bilirubin.
Tuy nhiên, cấu trúc bốn vịng pyrol thẳng hàng lại khơng giải thích được
đặc tính quan trọng của bilirubin là tính ít tan trong nước và tan nhiều trong các
dung môi không phân cực vì trong cấu trúc có hai phân tử acid propionic được cho
rằng làm tăng tính phân cực và như thế sẽ làm phân tử bilirubin trở nên thân nước
hơn. Do đó cấu hình dạng chữ “U” đã được đưa ra và nó đã giải thích được đầy đủ
trạng thái vật lý của phân tử bilirubin trong các dung môi hữu cơ không phân cực.
So sánh công thức của bilirubin và protoporphyrin cho thấy mối liên hệ cấu trúc gần
gũi giữa các sắc tố mật với porphyrin (hình 2.2).

Học viên: Nguyễn Thị Phương Trang