Cố định hệ vi khuẩn nitrosomonas SP VA nitrobacter SP trên bacterial cellulose (BC) và ứng dụng chuyển hóa ammonia nước ương ấu trùng tôm sú penaeus monodon
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (10.35 MB, 0 trang )
I H C QU C GIA THÀNH PH H CHÍ MINH
TR
NG
I H C BÁCH KHOA
LÊ TI N D NG
C
NH H VI KHU N
Nitrosomonas sp. VÀ Nitrobacter sp.
TRÊN BACTERIAL CELLULOSE (BC)
VÀ
NG D NG CHUY N HĨA AMMONIA
N
C
NG U TRÙNG TƠM SÚ
Penaeus monodon
Chuyên ngành: CÔNG NGH SINH H C
Mã s ngành: 604280
LU N V N TH C S
Thành ph H Chí Minh, tháng 7 n m 2010
CƠNG TRÌNH
TR
NG
C HỒN THÀNH T I
I H C BÁCH KHOA
I H C QU C GIA TP. H
Cán b h
CHÍ MINH
ng d n khoa h c: Phó giáo s , Ti n s Nguy n
cL
ng
Ký tên: …………………………….………………………………………….
Cán b ch m nh n xét 1: …………………………………………………………………………….
Ký tên: ……………………………………….…………………………………….
Cán b ch m nh n xét 2: …………………………………………………………………………….
Ký tên: ……………………………………….…………………………………….
Lu n v n th c s
H I
TR
NG
cb ov t i
NG CH M B O V LU N V N TH C S
I H C BÁCH KHOA, ngày
i
tháng 8 n m 2010
TR
NG
I H C BÁCH KHOA
C NG HÒA XÃ H I CH! NGH A VI T NAM
KHOA K" THU T HÓA H C
#c L$p - T% Do - H&nh Phúc
Tp. HCM, ngày . . . . . tháng . . . . n m 2010
NHI M V LU N V N TH C S
H và tên h c viên: LÊ TI N D NG
Phái: Nam
Ngày, tháng, n m sinh: 04/5/1964
N i sinh: Ti n Giang
Chuyên ngành: Công ngh sinh h c
MSHV: 03107108
1- TÊN ' TÀI:
C
nh h vi khu n Nitrosomonas sp. và Nitrobacter sp. trên bacterial
cellulose (BC) và ng d ng chuy n hóa amonia n
c
ng u trùng tơm sú
Penaeus monodon
2- NHI M V LU N V N:
- C
nh h vi khu n Nitrosomonas và Nitrobacter trên bacterial
cellulose (BC) b ng ph
ng pháp b y-h p ph
- !ng d ng ch" ph m BC c
trong n
c
nh vi khu n
chuy n hóa ammonia
ng u trùng tôm sú Penaeus monodon
3- NGÀY GIAO NHI M V : Tháng 01/2010
4- NGÀY HOÀN THÀNH NHI M V : Tháng 6/2010
5- H
VÀ TÊN CÁN B
H
NG D(N:
PHÓ GIÁO S , TI N S# NGUY$N !C L
N i dung và
c
ng Lu n v n th c s
ã
NG
c H i %ng chun
ngành thơng qua.
CÁN B
H
NG D(N
CH! NHI M B MƠN
QL CHUYÊN NGÀNH
ii
KHOA QL CHUYÊN NGÀNH
L IC M
Trong th&i gian theo h c t i Tr &ng
Minh, tôi ã
N
i h c Bách khoa Thành ph H% Chí
c t o nh'ng i u ki n t t nh t trong h c t p, nghiên c u t(
Ban Giám hi u, phòng
ào t o sau
i h c, khoa K) thu t hóa h c và nh t là
t( b môn Công ngh sinh h c.
Tôi ã nh n
c s* t n tình ch+ d n c,a Quý Th-y Cô trong B môn, s*
chu áo c,a cán b , nhân viên . các
n v c,a Tr &ng.
ây c/ng là th&i k0 g1n bó và giúp 2 -y thi n chí c,a t p th b n bè tôi
. l p Cao h c Công ngh sinh h c 2007, Tr &ng
có
c b n lu n v n th c s này, tôi vô cùng bi"t n Th-y Ch, nhi m
b mơn - Phó giáo s , Ti"n s Nguy3n
b
i h c Bách khoa TPHCM.
cL
ng luôn t n tâm, h"t lòng nâng
c cho nhi u th" h h c trị, ng &i ã g1n bó khơng m t m4i v i s* nghi p
tr%ng ng &i, ã cho tơi nhi u ý ki"n q báu trong q trình th*c hi n
Tơi khơng qn lịng nhi t tình, sâu sát, lo l1ng, chia s5 cho m i ho t
tài.
ng
c,a l p, cho t(ng tâm t h c trò c,a Cô giáo ch, nhi m - Ti"n s Nguy3n
Thúy H
ng. Cô ã
ng viên, giúp 2 tôi r t nhi u
v
t qua nh'ng khó
kh n trong th&i gian theo h c.
Tơi c/ng mu n k
"n Ban Giám hi u, %ng nghi p và các thành viên .
Tr &ng Trung h c Th,y s n ã quan tâm t o i u ki n, giúp 2, c/ng nh s*
ti"p s c chân tình và hi u qu t( gia ình nh4 c,a tơi.
Xin
c bày t4 s* tri ân t n áy lịng tôi "n t t c m i ng &i./.
iii
TĨM T)T
N
c ni th,y s n ch a ammonia do quá trình phân h,y th c n d
th(a, phân… gây h i cho th,y s n trong q trình ni và làm phú d 2ng, t o
c phát tri n khi
c th i ra môi tr &ng. C
nh vi khu n nitrate hóa
Nitrosomonas và Nitrobacter vào ch t mang bacterial cellulose (BC) và ng
d ng chuy n hóa ammonia trong b
nghiên c u c
n
ng u trùng tôm sú là b
c -u cho
nh các vi khu n chuy n hóa và tách nit ra kh4i môi tr &ng
c.
Nghiên c u này nh m kh o sát môi tr &ng dinh d 2ng, pH, nhi t
, ch"
l1c trong nuôi sinh kh i Nitrosomonas, Nitrobacter, th&i gian h p ph h vi
khu n vào BC.
K"t qu nghiên c u cho th y Nitrosomonas
S5 . pH 8,2, nhi t
0
28 C, l1c 160rpm
ngày th 8; Nitrobacter
0
28 C, l1c 160rpm
tm t
tm t
c nuôi trong môi tr &ng
cao nh t 8x108CFU/ml .
c nuôi trong môi tr &ng N5 . pH 8,0, nhi t
cao nh t 5x108CFU/ml . ngày th 7.
M u BC ch a vi khu n h p ph . 24, 48, 72 và 96 gi&
ho t l*c chuy n hóa ammonia trong các erlen ch a n
l
ng BC so v i n
c ki m tra
c bi n ti t trùng v i
c bi n là 1/10. K"t qu , m u BC ch a vi khu n h p ph .
72 gi& có kh n ng gi m ammonia trung bình là 48,2% và nitrite là 94,5% so
v i
i ch ng. Ki m tra ho t l*c chuy n hóa ammonia c,a BC h p ph 72 gi&
trong b
v ib
ng u trùng tôm sú, ammonia gi m 51,1%, nitrite gi m 32,7% so
i ch ng.
Qua k"t qu nghiên c u, Nitrosomonas và Nitrobacter
ch t mang BC có th t o thành ch" ph m x6 lý n
cc
nh trên
c trong q trình
ng u
trùng tơm sú. C-n có nh'ng nghiên c u sâu h n kh o sát t+ l BC c
nh so
v i th tích n
c trong b
ng
t "n gi i h n an toàn cho tơm; c
thêm các vi khu n khác có kh n ng chuy n hóa nitrat trong n
l
ng nit trong mơi tr &ng nuôi và c
các ch t mang khác
iv
gi m
nh Nitrosomonas, Nitrobacter trên
có c s. ánh giá hi u qu c
vi khu n này.
c
nh
nh c,a BC
i v i hai
ABSTRACT
Aquaculture water contains ammonia due to decomposite of food
abundance, distribution... harm to fish in the breeding and rich nutrition, toxic
algal development being discharged into the environment. Immobilize
Nitrosomonas and Nitrobacter brought into bacterial cellulose (BC) and apply
ammonia metabolism in the prawn larvae tank is intitialy for the study of
bacterial nitrogen metabolism, separate from the wastewater environment.
In the thesis, we studied growth media, pH, temperature, shaking in mass
culure of Nitrosomonas, Nitrobacter, adsorpted time bacteria in BC.
The results illustrated that Nitrosomonas S5 media at pH 8.2, temperature
0
28 C, 160rpm shaking, 8x108CFU/ml are the highest on the eighth; whereas,
Nitrobacter N5 media at pH 8.0, temperature 280C, 160rpm shaking,
5x108CFU/ml are the highest on the seventh.
Bacterial cellulose samples are adsorpted at 24, 48, 72 and 96 hours to test
metabolized ammonia in seawater erlens which are pasteurized, the proportion
BC and volume is 1/10. We saw that there are some differents between the
study and evident samples, BC samples which are adsopted at 72 hours are
reduced ammonia and nitrit are 48,2% and 94,5% respectively. We saw that
there are some differents between the study and evident samples, BC samples
which are adsopted at 72 hours are reduced ammonia and nitrit in the prawn
larvae tank are 51,1% and 32,7% respectively.
In sum up, Nitrosomonas and Nitrobacter are carried on BC can be made
BC products to treat wastewater in prawn larvae tank. However, we need have
more clear reseaches such as check the rate BC and wastewater volume to safe
for shrimp. Besides, we can immobilize many different bacteria who can
reduce amount of nitrogen in the life environment of shrimp as well as we can
use many different carriers to immobilize to assess the adventages of BC
carriers with these bacteria.
v
M CL C
1. M7 8U
2. T9NG QUAN TÀI LI:U
............................................................ 1
............................................................ 3
c............................................................. 3
2.1. S* chuy n hóa nit trong n
2.1.1. C ch" chuy n hóa nit .......................................................................3
2.1.2. Q trình nitrate hóa ............................................................................4
2.1.3. ;nh h .ng c,a NH3, NO2– "n nuôi tr%ng th,y s n........................9
2.2.
2.2.2. Nitrobacter ..........................................................................................18
2.3. Ph ng pháp c
nh vi sinh v t ........................................................ 22
2.3.1.
u i m c,a vi sinh v t c
nh .......................................................22
2.3.2. Ch t mang trong c
nh t" bào vi sinh v t.....................................22
2.3.3. Các ph ng pháp c
nh t" bào vi sinh v t ...................................28
2.4. K) thu t ng nuôi u trùng tôm sú Penaeus monodon .................... 30
2.4.1. Các giai o n phát tri n c,a u trùng tơm sú ..................................30
2.4.2. Quy trình k) thu t ng nuôi u trùng tôm sú ...............................32
2.5. Các nghiên c u trong và ngoài n c.................................................. 36
2.5.1. Các nghiên c u trong n c ...............................................................36
2.5.2. Các nghiên c u . n c ngoài ...........................................................37
3. V=T LI:U VÀ PH >NG PHÁP ........................................................ 39
3.1.
a i m và th&i gian nghiên c u ...................................................... 39
3.2. Hóa ch t, thi"t b ................................................................................. 39
3.3. Gi ng vi sinh v t và môi tr &ng nuôi c y .......................................... 41
3.3.1. Gi ng vi sinh v t ................................................................................41
3.3.2. Mơi tr &ng ho t hóa Nitrosomonas .................................................41
3.3.3. Mơi tr &ng i v i Acetobacter xylinum ........................................46
3.4. S % và n i dung thí nghi m............................................................. 47
3.4.1. Thí nghi m 1. Kh o sát môi tr &ng ho t hóa Nitrosomonas ........48
3.4.2. Thí nghi m 2. Kh o sát mơi tr &ng ho t hóa Nitrobacter ............48
3.4.3. Thí nghi m 3. Kh o sát nh h .ng c,a các i u ki n nuôi c y "n
sinh tr .ng c,a Nitrosomonas ........................................................................49
3.4.4. Thí nghi m 4. Kh o sát nh h .ng c,a các i u ki n nuôi c y "n
sinh tr .ng c,a Nitrobacter ............................................................................50
3.4.5. Thí nghi m 5. Kh o sát nh h .ng c,a th&i gian "n kh n ng
h p ph c,a h vi khu n vào ch t mang BC .................................................52
3.4.6. Thí nghi m 6. Kh o sát k"t qu chuy n hóa ammonia c,a ch"
ph m trong b
ng u trùng ..........................................................................53
vi
3.5. Ph ng pháp phân tích ....................................................................... 54
3.5.1. Các ph ng pháp vi sinh ...................................................................54
3.5.2. Các ph ng pháp hóa sinh ................................................................54
3.5.3. Ph ng pháp x6 lý s li u .................................................................58
4. K T QU; VÀ TH;O LU=N
.......................................................... 60
4.1. Kh o sát mơi tr &ng ho t hóa Nitrosomonas..................................... 60
4.2. Kh o sát mơi tr &ng ho t hóa Nitrobacter......................................... 62
4.3. Kh o sát nh h .ng c,a các i u ki n nuôi c y "n sinh tr .ng c,a
Nitrosomonas................................................................................................ 64
4.3.1. ;nh h .ng c,a pH "n sinh tr .ng c,a Nitrosomonas ................64
4.3.2. ;nh h .ng c,a nhi t
"n sinh tr .ng c,a Nitrosomonas........65
4.3.3. ;nh h .ng c,a ch" l1c "n sinh tr .ng c,a Nitrosomonas ....66
4.3.4.
&ng cong t ng tr .ng c,a Nitrosomonas ...................................67
4.4. Kh o sát nh h .ng c,a các i u ki n nuôi c y "n sinh tr .ng c,a
Nitrobacter ................................................................................................... 68
4.4.1. ;nh h .ng c,a pH "n sinh tr .ng c,a Nitrobacter ....................68
4.4.2. ;nh h .ng c,a nhi t
"n sinh tr .ng c,a Nitrobacter ............69
4.4.3. ;nh h .ng c,a ch" l1c "n sinh tr .ng c,a Nitrobacter ........70
4.4.4.
&ng cong t ng tr .ng c,a Nitrobacter .......................................71
4.5. Kh n ng h p ph h vi khu n vào ch t mang BC theo th&i gian ..... 73
4.5.1. Chu n b ch t mang BC .....................................................................73
4.5.2. C
nh vi khu n lên màng BC, t o ch" ph m ...............................75
4.5.3. M t t" bào trong ch" ph m ..........................................................75
4.5.4. ;nh h .ng th&i gian h p ph "n kh n ng chuy n hoá NH3 và
NO2- c,a vi khu n c
nh ...............................................................................76
4.6. K"t qu chuy n hóa ammonia c,a ch" ph m trong b
5. K T LU=N VÀ ? NGH@
ng u trùng82
.......................................................... 86
5.1. K"t lu n............................................................................................... 86
5.2.
ngh ............................................................................................... 87
6. TÀI LI:U THAM KH;O
.......................................................... 88
7. PHA LAC
.......................................................... 95
LÝ L@CH TRÍCH NGANG
…………………………………..105
vii
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1. H vi sinh v t chuy n hóa nit trong n
c ....................................... 3
Hình 2.2. Hai giai o n c,a q trình nitrate hóa ............................................. 4
Hình 2.3. T" bào Nitrosomonas d
i kính hi n vi quang h c ........................ 12
Hình 2.4. C u trúc t" bào thu c gi ng Nitrosospira ....................................... 12
Hình 2.5. C u trúc t" bào thu c gi ng Nitrosovibrio...................................... 13
Hình 2.6. C u trúc t" bào thu c gi ng Nitrosolobus....................................... 13
Hình 2.7. C u trúc t" bào thu c gi ng Nitrosococcus .................................... 14
Hình 2.8. T" bào Nitrosomonas europaea d
i kính hi n vi quang h c........ 14
Hình 2.9. T" bào Nitrosomonas europaea d
i kính hi n vi i n t6. ............ 15
Hình 2.10. T" bào Nitrosomonas eutropha d
i kính hi n vi i n t6. ........... 15
Hình 2.11. T" bào Nitrosomonas marina d
i kính hi n vi i n t6............... 16
Hình 2.12. T" bào Nitrosomonas marina d
i kính hi n vi i n t6............... 16
Hình 2.13. T" bào Nitrosomonas mobilis d
i kính hi n vi i n t6............... 17
Hình 2.14. T" bào Nitrosomonas mobilis d
i kính hi n vi i n t6............... 17
Hình 2.15. Vi khu n Nitrobacter winogradsky............................................... 18
Hình 2.16. Khu n l c Nitrobacter alkalicus ................................................... 19
Hình 2.17. Tiên mao (F) . Nitrobacter alkalicus d
Hình 2.18. T" bào Nitrobacter alkalicus d
i kính hi n vi............... 19
i kính hi n vi i n t6................ 20
Hình 2.19. Vi khu n Nitrobacter hamburgensis............................................. 20
Hình 2.20. T" bào Nitrobacter vulgaris.......................................................... 21
Hình 2.21. Phân lo i ch t mang trong c
nh t" bào ..................................... 23
Hình 2.22. H vi s i . BC (a) và . th*c v t (b)............................................. 25
Hình 2.23. Mơ hình vi s i cellulose th*c v t (trái) và vi s i BC (ph i) ......... 25
Hình 2.24. BC
c t o t( môi tr &ng t nh (a) và môi tr &ng l1c (b) ........... 26
Hình 2.25. Bu trùng Nauplius c,a tơm sú Penaeus monodon ....................... 30
Hình 2.26. Bu trùng Zoea c,a tơm sú Penaeus monodon ............................. 31
Hình 2.27. Bu trùng Mysis c,a tơm sú Penaeus monodon............................ 31
Hình 2.28. H u u trùng Post larvae c,a tôm sú Penaeus monodon .............. 32
viii
Hình 4.1. Hình d ng khu n l c và t" bào c,a ch,ng Nitrosomonas ............... 61
Hình 4.2. Hình d ng khu n l c và t" bào c,a ch,ng Nitrobacter............... 6363
Hình 4.3. S* phát tri n c,a Nitrosomonas ph thu c pH ............................... 64
Hình 4.4. S* phát tri n c,a Nitrosomonas ph thu c nhi t
Hình 4.5. S* phát tri n c,a Nitrosomonas ph thu c ch"
....................... 65
l1c.................... 66
Hình 4.6. S* phát tri n c,a Nitrosomonas theo th&i gian............................... 67
nh h s t ng tr .ng c,a Nitrosomonas ............................... 68
Hình 4.7. Xác
Hình 4.8. S* phát tri n c,a Nitrobacter ph thu c pH ................................... 69
Hình 4.9. S* phát tri n c,a Nitrobacter ph thu c nhi t
........................... 70
Hình 4.10. S* phát tri n c,a Nitrobacter ph thu c ch"
l1c...................... 71
Hình 4.11. S* phát tri n c,a Nitrobacter theo th&i gian................................. 72
nh h s t ng tr .ng c,a Nitrobacter................................. 72
Hình 4.12. Xác
Hình 4.13. S n ph m BC lên men c p 1 ......................................................... 73
Hình 4.14. S n ph m BC lên men c p 2 ......................................................... 73
Hình 4.15. S n ph m BC sau q trình ni c y ............................................ 74
Hình 4.16. Ch t mang BC sau x6 lý ............................................................... 74
Hình 4.17. Ch" ph m BC thu
c sau 24, 48, 72.gi& c
nh ..................... 75
Hình 4.18. N%ng
ammonia trong th&i gian x6 lý....................................... 77
Hình 4.19. N%ng
nitrite trong th&i gian x6 lý ............................................ 79
Hình 4.20. N%ng
nitrate trong th&i gian x6 lý............................................. 81
Hình 4.21. Ch" ph m khi cho vào b
ng..................................................... 82
Hình 4.22. Ch" ph m t p trung thành kh i sau 1 tu-n trong b
ng. ........... 83
Hình 4.23. L
ng ammonia trong b
ng u trùng tơm .............................. 84
Hình 4.24. L
ng nitrite trong b
ng u trùng tơm .................................... 84
Hình 4.25. L
ng nitrate trong b
ng u trùng tôm.................................... 85
ix
DANH SÁCH B NG
B ng 2.1. T+ l % NH3 trong hàm l
ng ammonia tCng c ng . pH và nhi t
khác nhau ...................................................................................................... 9
B ng 2.2. Giá tr pH, t+ l NH3 và n%ng
tCng amôn c-n thi"t
cho ra
0,4mg/l NH3 ................................................................................................. 10
B ng 2.3. Các
môi tr &ng ............. 30
B ng 3.1. Thang chu n ammonia.................................................................. 55
B ng 3.2. Thang chu n nitrite....................................................................... 56
B ng 3.3. Thang chu n nitrate ..................................................................... 58
B ng 4.1. M t
Nitrosomonas trên các mơi tr &ng ho t hóa ................... 60
B ng 4.2. S* phát tri n c,a Nitrosomonas trên các mơi tr &ng ho t hóa ... 61
B ng 4.3. M t
Nitrobacter trên các môi tr &ng ho t hóa ....................... 62
B ng 4.4. S* phát tri n c,a Nitrobacter trên các mơi tr &ng ho t hóa........ 62
B ng 4.5. M t
t" bào trong ch" ph m ..................................................... 75
B ng 4.6. L
ng ammonia
B ng 4.7. L
ng nitrite
c chuy n hóa (so v i m u
c chuy n hóa (so v i m u
B ng 4.8. TD l nitrate gi m (so v i m u
i ch ng)........ 77
i ch ng) ............. 79
i ch ng) ................................ 80
B ng 4.9. Kh n ng chuy n hóa ammonia thành nitrate c,a ch" ph m ...... 83
x
Ch *ng 1.
1.
M+ ,U
Th ng kê t( H i quan, 10 tháng -u n m 2009, xu t kh u tôm c,a Vi t
Nam
t 170.283 t n, tr giá trên 1,35 t+ USD, t ng 7,4% v kh i l
ng và giá
tr so v i cùng k0 n m 2008.
Theo B Nông nghi p và Phát tri n nông thôn, trong 6 tháng -u n m
2010, xu t kh u th,y s n c,a n
c ta
t g-n 2 tD USD, t ng 13,1% so v i
cùng k0 n m 2009. Tơm là m
t ng tr .ng v giá tr xu t kh u
m nh nh t, kim ng ch ã t ng t i 27,1% so v i cùng k0 n m 2009.
Tôm sú
m t
c nuôi theo ph
ng th c bán thâm canh ho
th nuôi ban -u 20-40 con/m2, là ngu%n nguyên li u ch, y"u cho xu t
kh u.
áp ng nhu c-u r t l n v con gi ng (20 tD con, 2008) cho ph
th c nuôi trên, các tr i s n xu t gi ng tôm ã
ng
ng nuôi u trùng v i m t
100-200 cá th /l n
c trong nh'ng b cơ l p (th tích phC bi"n 4-5m3). Trong
quá trình
i tác d ng c,a vi sinh v t trong n
ng, d
c, th c n th(a, phân,
xác tôm ch"t…b phân h,y. Các h p ch t h'u c ch a nit nh protein
c
khống hóa thành ammoniac NH3 gây h i, làm u trùng tôm b1t m%i kém, sinh
tr .ng ch m và d3 nhi3m b nh [38]. Trong i u ki n hi"u khí, NH3
c bi"n
Ci thành nitrite và nitrate b.i các vi khu n nitrate hóa.
7 Vi t Nam, các tr i gi ng th &ng thay 25-30% l
gi m n%ng
ammonia NH3
d 2ng cho các ngu%n n
ng n
c trong b
c h i. Vi c làm này ã gây tình tr ng phú
c lân c n, d n "n t ng nguy c xu t hi n t o
c và
vi sinh v t gây b nh. [23, 24, 38]
ki m soát n%ng
cho n
ammonia (TAN – total ammonia nitrogen), có th
c ch y qua m t l p v t li u
l p này sE oxy hóa ammonia trong n
m, vi khu n nitrate hóa
c.
1
c gi' trên
Các nghiên c u liên quan do Abeysinghe và c ng s* (1996), Twarowska
c ti"n hành . qui mô pilot
và c ng s* (1997), Kim và c ng s* (2000)… ã
và
t
c nh'ng thành công nh t
nh. C th , h th ng x6 lý n
ph
ng pháp này ã làm gi m "n 25% l
ng ammonia
Chin và Ong (1997) . trang tr i nuôi tôm th
Tuy v y, các ph
c th i theo
c ti"n hành b.i
ng ph m.
ng pháp trên có chi phí -u t ban -u l n, v n hành
ph c t p, b o trì t n kém nên khó ng d ng
i v i nh'ng c s. có quy mơ
v(a và nh4 v n là thành ph-n ch, l*c trong s n xu t tôm gi ng . Vi t Nam.
Gi i pháp s6 d ng ch" ph m vi sinh v i h vi sinh v t t* do
ammonia c/ng
x6 lý
c áp d ng. H vi khu n nitrate hóa s6 d ng trong ch" ph m
vi sinh thu c nhóm hóa t* d 2ng, Nitrosomonas và Nitrobacter, là nh'ng
sinh tr .ng ch m, th &ng có sFn trong n
ch,ng có t c
m t
c ni tơm. Duy trì
t" bào vi khu n nitrate hóa . m c cao thì kh n ng phân gi i ammonia
c th &ng xuyên ã làm r6a trôi h vi
m i có hi u qu . Tuy nhiên, thay n
khu n có l i này, q trình nitrate hóa trong mơi tr &ng nuôi b h n ch".
C
nh h vi sinh v t trên ch t mang thích h p nh m chuy n hóa các d ng
h p ch t nit trong n
c và lo i kh4i b
ng u trùng c,a tr i s n xu t gi ng
tôm sú là gi i pháp tích c*c. Vi sinh v t
cc
nh trên ch t mang khơng
th t thốt theo dịng ch y, chuy n hóa ammonia trong n
ch" thay n
c, tránh gây thay Ci môi tr &ng n
c
c
ng nuôi sE h n
ng ni và
a ammonia
ra bên ngồi, h n ch" tình tr ng phú d 2ng gây ô nhi3m môi tr &ng. Tr
x6 lý hóa ch t di t khu n, kháng sinh vào b
kh4i b và
c
ng, ch t mang
c
c khi
a ra
a vào tr. l i khi hóa ch t, kháng sinh m t tác d ng, h vi
khu n nitrate hóa khơng b tiêu di t ho
d ng.
tài “C
nh h vi khu n Nitrosomonas và Nitrobacter trên bacterial
cellulose (BC) và ng d ng chuy n hóa ammonia n
Penaeus monodon” góp ph-n áp ng ịi h4i trên.
2
c
ng u trùng tơm sú
CH
NG 2.
T-NG QUAN TÀI LI U
2.
2.1. S% chuy.n hóa nit* trong n /c
2.1.1. C* ch chuy.n hóa nit*
T" bào ch"t
Nitrogen h'u c (protein, urea
%ng
hóa
Vi khu n phân h,y
và th,y phân
N amonia
N th*c v t
vi sinh
N h'u c
ng v t
T* phân và
s* oxy hóa
O2
Nitrosomonas
Nitrate
hóa
Ph n nitrat hóa
P. denitricans
B. lichenifornus
O2
Nitrobacter
Nitrate (NO3)
Thiobacillus
denitrificans
Cacbon h'u c
Hình 2.1. H vi sinh v t chuy n hóa nit trong n
3
c
N2 t* do
2.1.2. Q trình nitrate hóa
Các lo i vi khu n hóa n ng vơ c (chemolithotrophic) th &ng là lo i t*
d 2ng,
u s6 d ng chu trình Calvin
c
nh t. 7 vi khu n nitrate hóa,
c x"p vào lo i hóa t* d 2ng
(chemoautotrophic), sE s6 d ng n ng l
ammonia hay nitrite
nh CO2 nh ngu%n carbon duy
ng thu
c t( q trình oxi hóa
ph c v cho vi c kh6 CO2 thành carbohydrate. Khi
m t phân t6 CO2 i vào chu trình Calvin, nó c-n "n 3 phân t6 ATP và 2 phân
t6 NADPH. i u khó kh n là n ng l
ng thu t( q trình oxi hóa các phân t6
vơ c (nói chung) c,a vi khu n nitrate hóa l i nh4 h n r t nhi u so v i vi c
oxi hóa hồn tồn glucose . lo i vi khu n thông th &ng. T+ l P/O trong q
trình oxi hóa phosphoryl hóa . vi khu n nitrate hóa th &ng b ng 1 nên vi
khu n nitrate hóa nói riêng và các lo i vi khu n hóa n ng vơ c khác nói
chung, c-n oxi hóa m t l
ng l n các h p ch t vơ c
s n, i u này nói lên tác
ng c,a h vi khu n này
sinh tr .ng và sinh
i v i mơi tr &ng r t sâu
s1c.
Q trình nitrate hóa là q trình chuy n hóa ammonia (NH3) thành nitrate
(NO3–) b.i tác
ng c,a vi sinh v t trong i u ki n hi"u khí. Q trình này
c th*c hi n b.i hai nhóm vi khu n tu-n t* n i ti"p nhau, g%m 2 b
c là
giai o n nitrite hóa (nitrition) chuy n NH3 thành nitrite (NO2–) và giai o n
nitrate hóa (nitration) t( nitrite thành nitrate (NO3–).
Hình 2.2. Hai giai o n c,a q trình nitrate hóa
4
2.1.2.1.
Q trình nitrite hóa 0 Nitrosomonas
Nhóm vi khu n chuy n ammonium thành nitrite là Nitrosomonas (N.
europaea, N. aligocarbogenes)
Hai enzyme tham gia vào q trình là ammonia monooxygenase AMO (oxi
hóa NH3 thành NH2OH và H2O) và hydroxylamine oxidoreductase (oxi hóa
NH2OH thành NO2–). Trong t" bào vi khu n nitrite hóa, enzyme ammonia
monooxygenase xúc tác chuy n NH3 ngồi mơi tr &ng thành hydroxylamine
NH2OH
Hydroxylamine GHIch t gây
MNIONIth I
c s6IK ng
c cho t"IJHo khi .In%ng
Ith p, nên m
IGHm ch t kh6Icho OPc QR n ng sinh RSPIbên trong
t"I JHo, nh ng t"I JHo G i oxy RSPI ch t MHy TRHnh NO2–I UHI VW i QRNng n ng
l
ng.
Ph n ng chung c,a q trình nitrite hóa nh sau:
NH3 + 1,5O2
NO2– + H+ + H2O + 84 kcal/mol
i u c-n l u ý là trong q trình nitrite hóa, c
ch t c,a ammonia
monooxygenase là NH3 ch khơng ph i NH4+, vì v y q trình nitrite hóa di3n
ra m nh nh t . pH trung tính ho
Nhóm vi khu n chuy n nitrite thành nitrate là Nitrobacter (N. agilis, N.
winogradsky) theo ph n ng sau:
NO2– + 0,5O2
NO3– + 73 kJ
Enzyme tham gia vào quá trình là nitritoxydase (nitrite oxydase, nitrite
oxidoreductase, NO2– OR) có ch a nhân Fe–S và trung tâm ho t
ng ch a
Mo. Trong t" bào vi khu n nitrate hóa, c ch" chung nh sau:
NO2– + H2O
NO3– + 2H+ + e– + 17,8 kcal/m
2H+ + 2e– + 0,5O2
H2O
Khác v i q trình nitrite hóa, ngun t6 oxy dùng
l y t( H2O thay vì phân t6 O2.
5
oxi hóa NO2–
c
2.1.2.3. Các y u t 1nh h 0ng 2 n q trình nitrate hóa
Các vi khu n hóa n ng vơ c có nh'ng c ch" hóa sinh
n
c chúng trong cát và n
t và d
i
c m a. Là vi sinh
v t t* d 2ng, chúng có kh n ng t* tCng h p sinh kh i nh& có ch a các h
enzyme phân gi i các ch t vô c , ví d nh m t s lồi có th
%ng th&i oxi
hóa urea và methane cùng lúc v i d hóa r t nhi u lo i hydrocarbon khác nhau.
H n n'a, các t" bào này có kh n ng duy trì s* s ng trong i u ki n thi"u
ng hơ h p n i bào và %ng hóa xu ng
ngu%n c ch t b ng nh& gi m ho t
m c th p nh t. Vi khu n nitrate hóa b
c m v i s* bi"n
N ng
ng pH và nhi t
c ch" b.i ánh sáng và
m (25-300C).
ammonia
Theo Anthonisen và c ng s* (1976), khi hàm l
ng ammonia v
t quá t(
10 "n 150 mg/l sE c ch" q trình nitrite hóa. Vi khu n nitrate hóa b
khi ammonia v
t h n m c 0,1 "n 1mg/l. N%ng
c ch"
ion NO2– t( 0,22 "n 2,8
mg/l sE c ch" q trình nitrate hóa. Hi n ch a có nghiên c u nào ghi nh n
n%ng
NO3– . m c nào sE c ch" q trình nitrate hóa.
N ng
oxy hồ tan (DO)
Tuy vi khu n nitrate hóa là lồi hi"u khí b1t bu c nh ng chúng có th s ng
trong th&i gian dài . i u ki n thi"u oxy d
các b x6 lý n
i các t-ng n
c phía áy h%, trong
c th i và bùn ho t tính. Ng &i ta ã ghi nh n
cm t
khu n nitrite hóa là 102 t" bào/ml trong m t b x6 lý k khí có n%ng
52 mg/l. 7 các b x6 lý n
n%ng
c th i liên t c, vi khu n nitrite hóa
TAN
tt i u.
oxi hồ tan kho ng 0,2 mg/l. Q trình nitrite hóa v n x y ra . m c
oxi hoà tan th p 0,05 mg/l mà v n phân gi i
ammonia.Vi khu n nitrate hóa có s c s ng t
m t
vi
c m t l
ng áng k
ng t*, trong m t s tr &ng h p,
t" bào còn nhi u h n vi khu n nitrite hóa vài l-n. Vi c phát tri n các b
x6 lý hi"u khí kín có m t vài khu v*c k khí c c b
ã cho phép ti"n hành
%ng th&i q trình nitrate hóa và ph n nitrate hóa, chuy n t( ammonia ra "n
6
N2 (Davidson và c ng s*, 1986). N%ng
oxi hoà tan t i u cho h vi khu n
nitrate hóa phát tri n t t là 3–4mg/l O2 (Prosser, 1989).
Nhi t
Vi khu n nitrate hóa là lo i vi khu n a m, nhi t
t i thích cho chúng
phát tri n trong kho ng 25-300C. Q trình nitrite hóa có th th*c hi n . nhi t
t( 7-350C trong khi quá trình nitrate hóa
c th*c hi n . nhi t
r ng
h n, t( 5-420C.
pH
H-u h"t các vi khu n nitrate hóa ho t
ng t t nh t . pH trong kho ng 7,5-
8,0. Q trình nitrate hóa di3n ra r t ch m và b
c ch" . pH nh4 h n 6 ho
l n h n 10. Q trình oxi hóa ammonia b.i vi khu n nitrite hóa làm gi m tính
ki m c,a mơi tr &ng, vì th" h
Nitrosomonas ho t
m c,a môi tr &ng là r t quan tr ng.
ng pH 6,7 – 9,2 trong khi Nitrobacter ho t
kho ng pH 8 – 9,2. S* thích nghi c,a vi khu n
th p
ng trong
i v i pH quá cao ho
u ịi h4i ph i có m t kho ng th&i gian. Trong nhi u nghiên c u cho
th y các ch,ng vi khu n t* d 2ng có th thích nghi
th p nh 3–4 ho
c . c giá tr pH r t
c bi n có pH Cn
nh trong
kho ng t( 7,5–8,5 (Boyd, 1995) vì th" q trình nitrate hóa v n di3n ra thu n
l i.
S có m t c a
c ch t
Nitrosomonas và Nitrobacter
th &ng g
u nh y c m v i m t vài h p ch t
c th i. Tuy nhiên, m c
c
nh y c m c,a Nitrosmonas
th &ng cao h n v i Nitrobacter. Các h p ch t này gây ng(ng quá trình nitrate
hóa vì c ch" các h enzyme trên màng c,a t" bào. H-u h"t các h p ch t di t
khu n
u tác
ng nghiêm tr ng "n ho t
ng s ng c,a vi khu n nitrate hóa
( i u này gi i thích vì sao các trang tr i ni tr%ng thuD s n có ngu%n n
c
th i b ô nhi3m h'u c quá cao vì trong quá trình nuôi, ng &i ta ã s6 d ng
ch t di t khu n
tiêu di t vi khu n gây b nh cho
7
ng v t nuôi tr%ng, %ng
th&i di t ln h vi khu n có l i, làm cho kh n ng t* làm s ch t* nhiên c,a ao
nuôi b m t tác d ng). Trong nuôi tr%ng th,y s n, clorin, formol, thu c tím…
dùng trong x6 lý n
c, kháng sinh tr b nh có th gây c ch" vi khu n nitrate
hóa.
Kh n ng bám
H vi khu n nitrate hóa
c bi"t có khuynh h
ng ti"t ra nh'ng polymer
ngo i bào và dính vào ch t mang. Khi ch t mang có l p lipopolysaccharide
ph, bên ngồi thì s* bám dính
c t t h n. N"u b m
h p và n"u có n
c r6a trơi, nh'ng c m t" bào sE hình thành, g i là zoogloeas.
Trong ngu%n n
c t* nhiên, vi khu n nitrite hóa th &ng k"t v i nhau thành
t(ng chùm và nCi trên b m
Tác
ng tích c*c c,a ch t mang lên ho t
ng sinh lý c,a h vi khu n
nitrate hóa hi n v n cịn khá bí n. Powell và Prosser (1986) ghi nh n là q
trình nitrate hóa . trong
nitrate hóa x y ra trong n
t, á sE ít nh y c m h n 10 l-n so v i quá trình
c n"u dùng cùng nitrapyrin làm ch t
Abeliovich (1987) nh n th y s l
c ch".
ng t" bào c,a Nitrosomonas gi m nhanh
trong i u ki n k khí . d ch t" bào t* do so v i t" bào n m trong l p bùn,
c ghi nh n kh n ng s ng sót trong hàng tháng. Diab và Shilo (1988) c/ng
ch ng minh kh n ng t%n t i m nh mE c,a vi khu n nitrate hóa trong i u ki n
c
nh . các ch"
k khí và thi"u ngu%n dinh d 2ng. Audic và c ng s*
(1984) khám phá ra ho t
ng hô h p nitrate hóa c,a vi khu n c
c t sE t ng "n 130% so v i bình th &ng, và t c
trong gi& -u tiên. B.i vì ho t
nh trong
nitrate hóa t ng r t m nh
ng nitrate hóa và kh n ng s ng sót sE r t
th p n"u vi khu n . d ng t* do, vì th" yêu c-u c-n ph i c
nh là c-n thi"t,
vi c t o ra nh'ng ch t mang nhân t o sE nhân hi u qu c,a q trình nitrate
hóa t* nhiên lên r t cao.
8
2.1.3.
nh h 0ng c3a NH3, NO2– 2 n nuôi tr ng th3y s1n
Ammonia có trong n
c ao, b ni tr%ng th,y s n là s n ph m ph c,a
quá trình trao Ci ch t c,a sinh v t và quá trình phân h,y ch t h'u c c,a vi
khu n trong ao, b . Nó t%n t i d
i hai d ng là ammonia t* do (NH3) và ion
(NH4+) trong tr ng thái cân b ng ph thu c vào pH và nhi t
:
NH3 + H2O = NH4+ + OH–
Khi pH t ng, NH3 t* do t ng so v i NH4+. Nhi t
t ng t+ l NH3 nh ng nh h .ng c,a nhi t
n
c t ng c/ng làm
ít h n c,a pH. Theo Boyd
(1990):
ng ammonia tCng c ng . pH và nhi t
B ng 2.1. T+ l % NH3 trong hàm l
khác nhau [23]
pH
Nhi4t 2# (0C)
12
20
24
28
7,0
0,2
0,4
0,5
0,7
8,0
2,1
3,8
5,0
6,6
8,2
3,3
5,9
7,7
10,0
8,4
5,2
9,1
11,6
15,0
8,6
9,7
13,7
17,3
21,8
8,8
12,0
20,1
24,9
30,7
9,0
17,8
28,5
34,4
41,2
9,2
25,8
38,7
45,4
52,6
9,4
35,5
50,0
56,9
63,8
9,6
46,5
61,3
67,6
73,6
9
T t c th*c v t có th dùng nitrate và ammonia. Trong th*c v t, nit b kh6
thành ammonia và k"t h p v i carbon h'u c
t o thành aminoacid. Các
aminoacid liên k"t nhau t o thành protein.
Tính
c c,a ammonia
i v i cá và các th,y sinh v t khác ch, y"u là
d ng t* do [22]. Khi pH n
c t ng, ammonia d ng t* do trong n
bài ti"t ammonia . sinh v t sE b gi m i và l
t ng. K"t qu làm t ng pH máu và tác
c t ng, s*
ng ammonia trong máu và mô
ng x u "n ph n ng xúc tác enzyme
và tính b n c,a màng t" bào. Ammonia làm t ng nhu c-u oxy trong các mô,
làm tCn th
ng mang và gi m kh n ng v n chuy n oxy c,a máu. S* m n c m
v i b nh c/ng gia t ng . sinh v t khi ti"p xúc v i hàm l
ng ammonia g-n
ng 2ng gây ch"t.
Kh n ng ch u *ng hàm l
ng ammonia c,a th,y sinh v t thay Ci tùy
theo loài, i u ki n sinh lý và các y"u t môi tr &ng. N%ng
i v i cá và giáp xác vùng nhi t
NH3 gây ch"t
i . th&i gian ti"p xúc ng1n (24 – 96 gi&) là
trong kho ng 0,4–2,0 mg/L.
B ng 2.2. Giá tr pH, t+ l NH3 và n%ng
tCng amôn c-n thi"t
cho ra
0,4mg/l NH3 (. 280C)
[22]
pH
NH3 %
N ng 2# t5ng amôn (mg/l)
7
0,70
57,14
7,5
2,22
18,02
8
6,55
6,11
8,5
18,40
2,17
9
41,23
0,97
9,5
68, 21
0,59
10
87,52
0,46
10
Nitrite có th tích t t i n%ng
th,y s n d
i nh'ng i u ki n nh t
h p v i hemoglobin
1–10mg/l ho
t o thành methemoglobin khơng có kh n ng k"t h p
v i oxy d n "n làm gi m ho t
ng c,a hemoglobin, gây thi"u máu ch c
n ng. Máu ch a methemoglobin có màu nâu nên ng
c nitrite g i là ”b nh
máu nâu”. Theo các tiêu chu n ngành v ch t l
c NTTS, hàm l
ng n
ng
thích h p cho th,y s n là NH3 là < 0,1mg/l, NO2– < 0,3mg/l, NO3– t( 0,1–
10mg/l.
6c tính sinh h7c c3a Nitrosomonas và Nitrobacter
2.2.
2.2.1. Nitrosomonas
B ng 2.3. Các
Nitrosococcus Nitrosolobus Nitrosomonas Nitrosospira Nitrosovibrio
D ng que
Hình
D ng trịn
D ng thùy
D ng que
Cu n xo1n
d ng
"n ellipse
a hình
thXng
c
1,5–1,8x
1,0–1,5x
0,7–1,5x
0,3–0,8x
0,3–0,4x
1,7–2,5
1,0–2,5
1,0–2,4
1,0–8,0
1,1–3,0
M c r i rác
M c . c*c
M c r i rác
M c . c*c
Chia thành
Có lZ xu t
G p cu n
G p cu n
nhi u ng n
hi n r i rác
vào bên
vào bên
trong
trong
Kích
th
c
(Ym)
Ki u
tiên
mao
M c thành
chùm
C u
Có lZ xu t
trúc
hi n thành
màng
c m
11
m nh, h i
cong
D*a vào hình dáng c,a t" bào, s* s1p x"p c,a màng bao t" bào ch t
(intracytoplasmic membrane), vi khu n nitrite hóa
c phân thành 5 gi ng
chính là Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus và
Nitrosovibrio v i 16 loài vi khu n
DNA, ho t
n%ng
c phân bi t d*a trên t+ l G+C trong
ng c,a carboxysome, ho t tính urease, t c
chuy n hóa NH3,
t i h n ammonia trong mơi tr &ng, yêu c-u v
m
mu i t i h n.
Gi ng Nitrosomonas (Winogradsky, 1982): t" bào v c b n là hình que,
màng bao t" bào ch t có các lZ n m r i rác, ôi khi l p màng này g p cu n
vào bên trong t" bào ch t.
Hình 2.3. T" bào Nitrosomonas d
i kính hi n vi quang h c
Gi ng Nitrosospira (Winogradsky, 1933): t" bào là d ng que xo1n, ơi khi
có d ng d u ph y. Không quan sát th y màng bao t" bào ch t.
Hình 2.4. C u trúc t" bào thu c gi ng Nitrosospira
12
Gi ng Nitrosovibrio (Harms và c ng s*, 1976): t" bào d ng d u ph y.
Không quan sát th y màng bao t" bào ch t. Màng trong t" bào g p cu n vào
bên trong t" bào ch t ã
c ghi nh n.
Hình 2.5. C u trúc t" bào thu c gi ng Nitrosovibrio
Gi ng Nitrosolobus (Watson và c ng s*, 1971): t" bào có d ng thu0 a
hình, chia thành ng n b.i màng t" bào ch t.
Hình 2.6. C u trúc t" bào thu c gi ng Nitrosolobus
13
Gi ng Nitrosococcus (Winogradsky, 1892): Có hai lồi tiêu bi u là N.
oceani và N. halophilus v i d ng c-u cho "n ellipse,
c ghi nh n có màng
bao t" bào ch t v i các lZ t p trung thành t(ng c m.
Hình 2.7. C u trúc t" bào thu c gi ng Nitrosococcus
2.2.1.1. Nitrosomonas europaea
Vi khu n europaea có d ng hình que, hai c*c t" bào có d ng hình trịn,
kích th
c t( 0,8–1,1 x 1,0–1,7 Ym, th &ng t%n t i t(ng t" bào riêng lE, Gram
âm. Kh n ng di
ng thì ch a
c ghi nh n. Carboxysome c/ng khơng có
trong t" bào ch t. Khơng có ho t tính urease. 7 pH kho ng 7,8, t" bào ch u
c n%ng
n%ng
mu i ammonium lên "n 400 mM. T" bào có th ch u
c
mu i NaCl lên "n 500 mM. Vi khu n phân b . các h th ng x6 lý
rác, ngu%n n
c b phú d 2ng hóa và th+nh tho ng t%n t i trong
t [25].
5 Ym
Hình 2.8. T" bào Nitrosomonas europaea d
14
i kính hi n vi quang h c.
