Khảo sát thời điểm thích hợp lên men malolactic trong lên men rượu vang dâu tằm bằng chế phẩm oenococcus oeni cố định

Đại Học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
--------------------

TRẦN MỸ XINH

KHẢO SÁT THỜI ĐIỂM THÍCH HỢP LÊN MEN
MALOLACTIC TRONG LÊN MEN RƯỢU VANG
DÂU TẰM BẰNG CHẾ PHẨM OENOCOCCUS OENI
CỐ ĐỊNH

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ NGÀNH: 60 42 80

LUẬN VĂN THẠC SĨ

TP. HỒ CHÍ MINH, tháng 08 năm 2010


CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HỒ CHÍ MINH

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG

Cán bộ chấm nhận xét 1:....................................................................................

Cán bộ chấm nhận xét 2:....................................................................................

Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬNVĂN
THẠC SĨ TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA, ngày . . . tháng . . . năm . . .

.


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
----------------

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHIÃ VIỆT NAM
Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
---oOo--Tp. HCM, ngày 31 tháng 7 năm 2010

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ và tên học viên: TRẦN MỸ XINH

Giới tính: Nữ

Ngày, tháng, năm sinh: 02/02/1982

Nơi sinh: Cà Mau

Chun ngành: Cơng nghệ Sinh học

MSHV: 03108155

Khố (Năm trúng tuyển): 2008
1- TÊN ĐỀ TÀI: Khảo sát thời điểm thích hợp lên men malolactic trong lên men rượu
vang dâu tằm bằng chế phẩm Oenococcus oeni cố định.
2- NHIỆM VỤ LUẬN VĂN:
-

Khảo sát thời điểm thích hợp bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni lên men malolactic.

-

Khảo sát thời gian lên men malolactic

-

Cố định tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni lên phức chất mang Bacterial Cellulose –
Alginate.

-

Ứng dụng chế phẩm cố định lên men malolactic theo phương pháp chu kỳ.

3- NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: tháng 1 năm 2010
4- NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: tháng 07 năm 2010
5- HỌ VÀ TÊN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: TS. NGUYỄN THÚY HƯƠNG
Nội dung và đề cương Luận văn thạc sĩ đã được Hội Đồng Chuyên Ngành thông qua.
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)

CHỦ NHIỆM BỘ MÔN
QUẢN LÝ CHUYÊN NGÀNH
(Họ tên và chữ ký)


LỜI CẢM ƠN!
Đã trải qua sáu tháng trong nghiên cứu và đạt được những thành
quả như hơm nay ngồi sự cố gắng nổ lực của tơi cịn nhờ biết bao sự

giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và người thân. Để tỏ lịng biết ơn sâu sắc
đó:
Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại
học Bách khoa TP. Hồ Chí Minh, đặc biệt quý thầy cơ trong Khoa
Cơng nghệ hóa học và Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, đã tạo điều kiện
thuận lợi giúp em hoàn thành luận văn này.
Em xin chân thành cảm ơn cô – Tiến sĩ Nguyễn Thúy Hương đã
luôn theo sát hướng dẫn, chỉ bảo, đồng thời đã tận tình giúp đỡ em
trong suốt thời gian em thực hiện luận văn cũng như trong suốt quá
trình em học tập tại trường. Cơ ơi! dù sau này em có về q thì em vẫn
luôn mãi nhớ cô. Em chúc cô luôn khỏe mạnh và tràn đầy hạnh phúc.
Em cám ơn cơ vì tất cả.
Xin cảm ơn các bạn CH2008 đã luôn giúp đỡ, quan tâm trong
suốt thời gian tôi học tập tại lớp.
Con (em) xin cảm ơn gia đình và gia đình chồng đã luôn quan
tâm ủng hộ con (em) trong quá trình con (em) đi học.
Xin cảm ơn anh, người chồng của “Bé yêu dễ thương”, anh là
nguồn động viên lớn nhất của em. Cảm ơn “Thổ”, người là tấm gương
để em gái út noi theo.
Cuối cùng, xin gửi đến tất cả những người thương yêu nhất của
tôi – những người đã luôn sát cánh cùng tôi, giúp đỡ động viên tôi rất
nhiều trong suốt thời gian tôi học tập cũng như trong q trình tơi thực
hiện luận văn – Lời cảm ơn chân thành nhất.
Tp. HCM, tháng 8 năm 2010
Trần Mỹ Xinh


TĨM TẮT
Lên men malolactic là q trình chuyển hóa acid malic thành acid lactic làm góp phần
biến đổi và cải thiện tính chất cảm quan của rượu vang dâu tằm. Lên men malolactic có

thể thực hiện nhờ các tế bào vi khuẩn tự do hoặc tế bào được cố định trong các chất
mang.
Thực hiện việc nâng cao chất lượng rượu vang dâu tằm chúng tôi đã tiến hành nghiên
cứu thời điểm thích hợp lên men malolactic trong lên men rượu vang dâu tằm bằng chế
phẩm vi khuẩn cố định, đã thu được những kết quả sau:
-

Xác định được thời điểm bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni là sau khi kết thúc
lên men chính (ngày thứ 7 của q trình lên men rượu).

-

Xác định được thời gian lên men malolactic tối ưu là 3 ngày.

-

Cố định được tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni O1 trên chất mang BC – A
(Bacterial Cellulose – Alginate) với các thông số sau:
+ Mật độ tế bào Oenococcus oeni O1 đưa vào cố định: 109 tế bào/ml.
+ Chế phẩm cố định thu được có mật độ vi khuẩn cố định được: 1.4 x 109 tế
bào/g.
+ Cấu trúc chế phẩm cố định: trơn, mềm, rắn chắc.

-

Hiệu quả ứng dụng chế phẩm cố định tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni O1 trên
phức chất mang BC – A trong quá trình lên men malolactic (số lần tái sử dụng)
là 8 lần mà vẫn đảm bảo hoạt tính sinh học như lúc ban đầu.

ABSTRACT
Malolactic fermentation is metabolizing malic acid into lactic acid to help transform
and improve the organoleptic properties of mulberry wine. Malolactic fermentation can
be done by the free bacterial cells or cells is immobilized in the carrier.
Perform quality mulberry wine we have conducted research at the appropriate time
malolactic fermentation in wine fermented mulberry by immobilization bacterial cell,
has obtained the following results:
-

Determine the time of additional bacteria Oenococcus oeni is the end of
fermentation (day 7 of fermentation liquor).

-

Determine the malolactic fermentation time optimization is 3 days.

-

Immobilizing Oenococcus oeni O1 cell in BC - A (bacterial cellulose - Alginate)
compound with the following parameters:
+ Oenococcus oeni O1 cell densities into immobilizing:109 cfu/ml
+ Immobilized cell density: 1.4 x 109 cfu/g
+ Structures: smooth, soft, solid.

-

The effect of using Oenococcus oeni O1 cell, immobilized in BC - A compound,
for malolactic fermentation (number of re-use) is 8 times but ensuring biological
activity as originally .

MỤC LỤC
TRANG
CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU .........................................................................................1
CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................3
2.1. GIỚI THIỆU VỀ DÂU TẰM .......................................................................3
2.1.1. Nguồn gốc .....................................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm sinh học .......................................................................................3
2.1.3. Thành phần hóa học và ứng dụng ...........................................................5
2.2. LÊN MEN RƯỢU ..........................................................................................6
2.2.1. Giới thiệu chung về rượu vang .................................................................6
2.2.2. Cơ sở hóa sinh .............................................................................................6
2.2.3. Tác nhân vi sinh vật ....................................................................................7
2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng ..................................................................................12
2.3. LÊN MEN MALOLACTIC .........................................................................14
2.3.1. Giới thiệu chung ..........................................................................................14
2.3.2. Vai trị của q trình lên men malolactic ................................................15
2.3.3. Các kiểu lên men malolactic ......................................................................16
2.3.4. Tác nhân vi sinh vật ....................................................................................18
2.3.5. Ảnh hưởng của điều kiện công nghệ và môi trường đến quá trình
lên men malolactic .................................................................................................22
2.4. KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT .......................................25
2.4.1. Chất mang ....................................................................................................25
2.4.2. Alginate .........................................................................................................25
2.4.3. Bacterial Cellulose ......................................................................................27
2.4.4. Các phương pháp cố định tế bào ..............................................................28
2..4.5. Ưu nhược điểm của vi sinh vật cố định so với vi sinh vật tự do .........30
2.5. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC LIÊN QUAN ĐẾN
HƯỚNG CỦA ĐỀ TÀI ..........................................................................................32

CHƯƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ................................................34
3.1. NGUYÊN VẬT LIỆU .....................................................................................34
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................................................36
3.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ...............................................................................36
3.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm .................................................................37
3.2.3. Phương pháp phân tích thí nghiệm ..........................................................39
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ - THẢO LUẬN ...........................................................43
4.1. KIỂM TRA GIỐNG VI SINH VẬT ............................................................43
4.1.1. Saccharomyces cerevisiae ...........................................................................43
4.1.2. Oenococcus oeni ...........................................................................................44
4.2. KHẢO SÁT THỜI ĐIỂM BỔ SUNG OENOCOCCUS OENI
LÊN MEN MALOLACTIC .................................................................................47
4.3. KHẢO SÁT THỜI GIAN LÊN MEN MALOLACTIC ..........................55
4.4. CỐ ĐỊNH TẾ BÀO OENOCOCCUS OENI O1 TRÊN CHẤT MANG
BC – A NHẰM KHẢO SÁT QUÁ TRÌNH LÊN MEN MALOLACTIC
THEO CHU KỲ ....................................................................................................56
CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ .........................................................61
5.1. KẾT LUẬN .....................................................................................................61
5.2. KIẾN NGHỊ ....................................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................63
PHỤ LỤC


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Thành phần hóa học của quả dâu tằm ..................................................5
Bảng 2.2. Thành phần vitamin trong quả dâu tằm ................................................5
Bảng 2.3. Tỉ lệ M/G của acid alginic từ một số loài rong nâu .............................27
Bảng 3.1. Thành phần môi trường MLA ...............................................................34
Bảng 3.2. Thành phần môi trường Hansen ...........................................................35

Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm khảo sát thời gian lên men malolactic .....................38
Bảng 4.1. Biến đổi pH theo thời gian của các mẫu bổ sung vi khuẩn tại các
thời điểm khác nhau ................................................................................................48
Bảng 4.2. Biến đổi hàm lượng chất khô theo thời gian của các mẫu bổ sung
vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau .....................................................................49
Bảng 4.3. Biến đổi hàm lượng đường tổng theo thời gian của các mẫu bổ sung
vi khuẩn tại các thời điểm khác nhau .....................................................................51
Bảng 4.4. Biến đổi nồng độ cồn theo thời gian của các mẫu bổ sung vi khuẩn
tại các thời điểm khác nhau ...................................................................................52
Bảng 4.5. Biến đổi acid malic và acid lactic sau 10 ngày lên men của các mẫu
khảo sát ...................................................................................................................53
Bảng 4.6. Biến đổi acid malic và acid lactic theo thời gian lên men
malolactic .................................................................................................................55
Bảng 4.7. Các thông số của dịch dâu tằm thí nghiệm ..........................................58
Bảng 4.8. Sự biến động hàm lượng acid malic và acid lactic sau mỗi chu kỳ
lên men malolactic .................................................................................................. 59


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1. Quả dâu tằm Morus nigra L lúc chín ....................................................3
Hình 2.2. Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae ........................................8
Hình 2.3. Vi khuẩn Oenococcus oeni ....................................................................19
Hình 2.4. Vi khuẩn Lactobacillus ..........................................................................20
Hình 2.5. Vi khuẩn Pediococcus ...........................................................................21
Hình 2.6. Vi khuẩn Leuconostoc oenos ................................................................21
Hình 2.7. Cơng thức cấu tạo của acid alginic .......................................................26
Hình 2.8. Cấu trúc cellulose vi khuẩn ...................................................................27
Hình 3.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát của đề tài ..................................................36
Hình 4.1. Saccharomyces cerevisiae .....................................................................43
Hình 4.2. Vi khuẩn Oenococcus oeni O1 sử dụng trong nghiên cứu ...................45

Hình 4.3. Chế phẩm cố định tế bào Oenococcus oeni O1 trên phức chất mang
BC – A .....................................................................................................................57


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ VÀ ĐỒ THỊ
Biểu đồ 4.1. Biến đổi pH theo thời gian của các mẫu khảo sát ...........................48
Biểu đồ 4.2. Biến đổi hàm lượng chất khô theo thời gian của các mẫu
khảo sát ....................................................................................................................50
Biểu đồ 4.3. Biến đổi hàm lượng đường tổng theo thời gian của các mẫu
khảo sát ....................................................................................................................51
Biểu đồ 4.4. Biến đổi nồng độ cồn theo thời gian của các mẫu khảo sát ............52
Biểu đồ 4.5. Biến đổi acid malic và acid lactic sau 10 ngày lên men của
các mẫu khảo sát ......................................................................................................54
Biểu đồ 4.6. Biến đổi hàm lượng acid malic và acid lactic trong mỗi chu kỳ
khảo sát và mẫu đối chứng .....................................................................................60
Đồ thị 4.1. Đường cong sinh trưởng của Saccharomyces cerevisiae ..................44
Đồ thị 4.2. Đường chuẩn của Oenococcus oeni O1 ..............................................46
Đồ thị 4.3. Đường cong sinh trưởng Oenococcus oeni O1 ...................................46
Đồ thị 4.4. Biến đổi acid malic và acid lactic theo thời gian lên men
malolactic .................................................................................................................55


Trang 1

CHƯƠNG 1.

MỞ ĐẦU

Nước ta có tiềm năng rất lớn trong ngành sản xuất rượu vang trên cả hai phương
diện: nguồn nguyên liệu và nhu cầu tiêu thụ của thị trường. Việt nam là nước có khí

hậu nhiệt đới, có nhiều chủng loại quả phong phú quanh năm với sản lượng lớn, giá
thành rẻ. Xu hướng gần đây vang đã trở thành một loại đồ uống khá thông dụng. Công
nghệ sản xuất rượu vang thường trải qua hai giai đoạn lên men:
- Giai đoạn lên men rượu: Lên men tạo độ cồn thích hợp nhờ hoạt động của
nấm men.
- Giai đoạn lên men malolactic: Lên men malolactic bởi Oenococcus oeni là
q trình decarboxyl hố L-malat thành L-lactat và CO2, làm giảm độ acid của vang.
Quá trình lên men malolactic là quá trình xảy ra sau giai đoạn lên men rượu, góp phần
biến đổi và cải thiện các tính chất cảm quan của rượu vang. Trong giai đoạn này,
Oenococcus oeni tạo ra các hợp chất thơm như diacetyl, acetoin, acetone, các
este…góp phần tạo hương cho sản phẩm. Tác động của vi khuẩn Oenococcus oeni đến
các hợp chất phenol còn cải thiện màu sắc và vị của rượu vang. Sự có mặt của q trình
lên men malolactic cịn hạn chế vi sinh vật tạp nhiễm bởi các hợp chất kháng khuẩn
của Oenococcus oeni [6].
Có thể nói chất lượng của rượu được cải thiện rất nhiều vào giai đoạn lên men
malolactic.
Ở Việt Nam hầu hết các cơ sở sản xuất vang chưa thực hiện giai đoạn thứ hai, quá
trình lên men phụ chủ yếu là để kết lắng nấm men làm trong rượu vang mà khơng có
giai đoạn lên men malolactic, do vậy chất lượng rượu bị hạn chế đáng kể nhất là với
các loại quả có chứa hàm lượng acid malic cao.
Kỹ thuật cố định tế bào đang được đề cập và quan tâm nhiều, đặc biệt trong các lĩnh
vực lên men. Tế bào cố định có nhiều ưu điểm so với việc sử dụng tế bào tự do như: tế
bào sau khi được cố định có thể sử dụng được nhiều lần, khơng lẫn vào sản phẩm và có
thể chủ động ngừng phản ứng theo ý muốn.

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh

Trang 2

Nhằm mục đích nâng cao chất lượng rượu vang dâu tằm, đồng thời ứng dụng những
thành tựu khoa học - kỹ thuật mới vào sản xuất rượu vang dâu tằm, chúng tôi tiến hành
nghiên cứu đề tài: “Khảo sát thời điểm thích hợp lên men malolactic trong lên men
rượu vang dâu tằm bằng chế phẩm Oenococcus oeni cố định”.
Nội dung chính của đề tài:
1. Khảo sát thời điểm thích hợp bổ sung vi khuẩn Oenococcus oeni lên men
malolactic.
2. Khảo sát thời gian lên men malolactic.
3. Cố định tế bào vi khuẩn Oenococcus oeni lên phức chất mang Bacterial
cellulose – Alginate.
4. Ứng dụng chế phẩm cố định lên men malolactic theo phương pháp chu kỳ.
Giới hạn của đề tài:
Các nghiên cứu được thực hiện ở quy mơ phịng thí nghiệm.

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh


Trang 3

CHƯƠNG 2. TỔNG

QUAN TÀI LIỆU

2.1. GIỚI THIỆU VỀ DÂU TẰM
2.1.1. Nguồn gốc
Cây dâu tằm có tên chung là mulberry, chúng có nhiều giống khác nhau như: White

mulberry (Murus alba L.), Black mulberry (M. nigra L.), American mulberry, Red
mulberry (M. rubra L.). Chúng có họ hàng gần với giống Korean mulberry (Morus
australis), Himalayan mulberry (M. laevigata).
Murus alba L. có nguồn gốc từ miền đông và miền trung của Trung Quốc. Murus
alba L. chịu được điều kiện khô hạn, ô nhiễm và đất bạc màu. Murus alba L. còn được
lai với giống M. rubra L. có sẵn ở bản địa. M. rubra L. có nguồn gốc từ miền đơng
nước Mỹ. M. nigra L. có nguồn gốc từ châu Á và được trồng ở châu Âu để lấy quả từ
trước thời kì La Mã cổ đại. M. nigra L. cần có điều kiện thuận lợi chúng mới phát triển
tốt, chúng phát triển chậm trong điều kiện khí hậu lạnh hay nóng ẩm [8].

Hình 2.1. Quả dâu tằm Morus nigra L lúc chín [46].
2.1.2. Đặc điểm sinh học
• Q trình sinh trưởng và phát triển :

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh


Trang 4

Cây dâu tằm thuộc loại cây rụng lá theo mùa. Murus alba L. có thể cao đến 80ft,
thường phát triển theo dạng hình chóp hay dạng tán. Trong điều kiện đất đai màu mỡ
thì M. rubra L. có thể cao 70ft. M. nigra L. là giống thấp nhất trong ba giống dâu tằm,
chúng chỉ cao khoảng 30ft. Các loại dâu tằm có tuổi thọ rất khác nhau: giống M. rubra
L có thể sống trên 75 năm, cịn hai giống cịn lại sống trên trăm năm.
• Hình thái :
Morus alba L. có tên là White mulberry khơng những do chồi nụ có màu trắng mà cịn
do màu sắc của quả. Mức độ dày mỏng và xanh sáng của lá trên cây phụ thuộc từng vị
trí của chúng trên cây, tầng lá trên ngọn thường có màu sáng và mỏng hơn. Morus

rubra L. có lá lớn và dày hơn so với M alba L., bề mặt của lá nhám và có lơng tơ bên
dưới. Morus nigra L. có lá tương tự như của M rubra L. nhưng nhỏ hơn, cành non thì
cứng cáp hơn, chồi cũng lớn hơn. Các lồi dâu có thời gian rụng lá nhất định trong năm
và thời gian rụng lá cũng khác nhau đối với từng loài M alba L. rụng lá vào đầu mùa
xuân còn M nigra L., M rubra L. rụng lá sau đó hai tháng.
• Hoa :
Dâu tằm vừa là cây đơn tính vừa là cây lưỡng tính. Hoa nhỏ, rũ xuống và rất khó nhận
ra, chúng thường ra hoa từ nách lá của nhánh non đang phát triển và trên phần chồi non
của nhánh già. Chúng thụ phấn nhờ gió và một số phương pháp tự nhiên mà không cần
thiết tới sự giao phấn.
• Quả
Dâu tằm có quả khơng phải hồn tồn giống quả mọng mà chỉ một tập hợp quả bề
ngoài tương tự quả mâm xôi. Khi hoa đã được thụ phấn chúng bắt đầu phình to, cuối
cùng chúng thay đổi hồn toàn kết cấu, màu sắc và trở nên mọng, nhiều nước. Màu sắc
của quả khơng đồng nhất hóa với giống dâu, chẳng hạn như: Morus alba L. có thể cho
quả màu trắng, xanh nhạt hơi phai đỏ hoặc đen. Nhìn chung Morus alba L. thường cho
quả ngọt nhưng lại thiếu vị chua cần thiết. Morus rubra L. cho quả màu đỏ thẫm gần

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh


Trang 5

như màu đen. Morus nigra L. cho quả lớn, nhiều nước với sự kết hợp hài hòa giữa vị
ngọt và chua làm cho chúng có hương vị thơm ngon nhất trong các lồi dâu tằm.
• Thu hoạch :
Morus alba L. và Morus rubra L. thường được thu hoạch cuối mùa xuân. Morus
nigra L. chín vào đầu cho đến cuối mùa hè. Morus alba L. thu hoạch bằng cách trải

một tấm vải lớn dưới gốc cây và rung mạnh cành cây. Morus nigra L. khó thu hoạch
hơn vì giống như những quả mọng nước khác chúng sẽ bị dập nát nếu bị nén ép. Nếu
khơng rửa thì dâu tằm có thể giữ được vài ngày dưới điều kiện lạnh. Quả dâu có thể ăn
tươi hay làm bánh, siro, đặc biệt giống Morus nigra L. cịn có thể làm rượu vang.
2.1.3. Thành phần hóa học và ứng dụng
• Thành phần hóa học
Thành phần hóa học của quả phụ thuộc rất nhiều vào nhiều yếu tố như: giống, điều
kiện trồng trọt, thời tiết… Dưới đây là thành phần trung bình của giống Morus nigra L.
trong điều kiện trồng trọt bình thường.
Bảng 2.1. Thành phần hóa học của quả dâu tằm
Nước

Protein

Chất béo

Carbonhydrat

Xơ

Tro

87.5%

1.5%

0.49%

8.3%

1.4%

0.9%
[8]

Ngồi ra, trong quả dâu chứa một lượng vitamin tương đối lớn, thành phần vitamin của
quả dâu như sau (tính trong 100g)
Bảng 2.2. Thành phần vitamin trong quả dâu tằm
Vitamin A

Thiamine

Riboflavin

Nicotinic

Ascorbic acid

174 UI

9 µg

184 µg

0.8 mg

13 mg
[8]

Ngồi ra, cịn có một số thành phần vi lượng khác. Các thành phần cần thiết cho ấu

trùng tằm như: citral, linalyl acetate, linalol, terpinyl acetate, hexenol, β-sitosterol.
• Ứng dụng:

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh


Trang 6

Theo Hartwell quả dâu tằm có thể dùng làm thuốc để chữa trị bệnh u bướu, gián tiếp
giải độc, chống viêm, chống ho, nghiện rượu, thuốc diệt nấm, thuốc nhuận tràng, thuốc
bổ thần kinh, thuốc xổ, giảm sốt, hồi phục sức khỏe, thuốc giảm đau, thuốc bổ, thuốc
diệt giun. Ngồi ra, quả của Morus alba L. cịn có thể trị bệnh aphtha, bệnh armache,
hen suyễn, viêm phế quản, bệnh bugbite, cachexia, cảm lạnh, táo bón, ho, chống suy
nhược cơ thể, chống được cả bệnh phù, chứng khó tiêu, động kinh, nhức đầu, tăng
huyết áp, mất ngủ (Reed, 1976).
2.2. LÊN MEN RƯỢU
2.2.1. Giới thiệu chung về rượu vang
Rượu vang là loại đồ uống lên men trực tiếp từ dịch quả. Khi q trình lên men kết
thúc, người ta khơng chưng cất mà để lắng trong tự nhiên, gạn lọc và hồn thành sản
phẩm. Rượu vang vốn có nguồn gốc từ quả nho và được gọi là “wine”, ngày nay, người
ta mở rộng ý nghĩa của rượu vang là rượu không qua chưng cất có nguồn gốc từ các
loại quả [18].
2.2.2. Cơ sở hóa sinh
Mục đích của q trình lên men là chuyển hóa đường thành rượu theo phương trình
tổng qt sau:
C6H12O6

2 C2H5OH + 2 CO2 + 27 Kcal

• Giai đoạn 1 (giai đoạn đường phân): Qua một loạt các chuỗi phản ứng phức tạp
với sự tham gia của hệ thống nhiều enzyme, một phân tử glucose ban đầu sẽ chuyển
hóa thành hai phân tử axít pyruvic.

Glucose

Acid pyruvic

• Giai đoạn 2 (Acid pyruvic bị decarboxyl hóa):

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh


Trang 7

– CO2

Pyruvat – decarboxylase
Acid pyruvic

Acetaldehyde

• Giai đoạn 3: Acetaldehyde tiếp tục nhận H2 từ NAD – H2 tạo thành etanol [20].

Alcohol
dehydrogenase

NADH2

NAD

2.2.3. Tác nhân vi sinh vật
2.2.3.1. Hình thái tế bào nấm men
Tế bào nấm men có hình cầu, hình ovan hay hình ellip … Nấm men có thể thay đổi
hình dáng trong giai đoạn phát triển và điều kiện mơi trường xung quanh.
Kích thước tế bào nấm men tương đối lớn, đường kính khoảng 1μm, chiều dài
khoảng 8μm. Với kích thước này, ta có thể ước tính bề mặt của tế bào nấm men trong
một lít dịch lên men vào khoảng 10m2 và do vậy cường độ trao đổi chất của tế bào nấm
men với môi trường xung quanh là vô cùng lớn [1, 18].

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh


Trang 8

Hình 2.2. Tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae [47].
2.2.3.2. Cấu tạo tế bào nấm men
Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi, về cơ bản cũng giống như ở tế bào thực vật
động vật.
- Vỏ tế bào: Bao quanh tế bào là một lớp màng mỏng dày đặc, mềm mại, có thể đàn
hồi để định hình cũng như bảo vệ chống lại các chất độc. Vỏ tế bào có mang điện, giữ
áp suất thẩm thấu nội bào, điều chỉnh các chất dinh dưỡng (các chất có phân tử lượng
thấp và các muối khoáng) đi qua tế bào. Thành tế bào dày khoảng 25 nm, chiếm
khoảng 25% khối lượng tế bào, chủ yếu là phức chất protein – polysaccharide,
phosphate và lipid.

Trong thành phần polysaccharide chứa chủ yếu là glucan và mannan (chiếm 90%),
glucan là một polyme phức tạp từ các tiểu phần glucose. Mặc dù có cấu trúc khơng
gian nhưng phần lớn glucan nằm ở phía trong của vỏ và tiếp xúc với màng tế bào chất,
đây là thành phần chính cấu tạo nên vỏ tế bào, nếu thành phần này bị phá hỏng thì tế
bào bị phá vỡ hoàn toàn. Mannan là polyme của đường mannanose, chủ yếu nằm ở
phần vỏ nhưng lại không phải là thành phần quyết định của vỏ tế bào, nếu phần
mannan này bị phá hủy thì hình dáng tế bào khơng đổi.
- Màng tế bào chất: Màng tế bào chất được bao xung quanh tế bào, chiều dày khơng
q 0.1nm, dính chặt với tế bào chất. Có thể quan sát và nhìn thấy màng này dưới kính

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh


Trang 9

hiển vi trường tối: màng là lớp viền sáng rất mỏng quanh tế bào chất.
Màng tế bào chất có các chức năng cơ bản sau: Tác dụng như rào chắn thẩm thấu, điều
chỉnh chất dinh dưỡng từ môi trường vào trong tế bào và ngược lại cho sản phẩm trao
đổi chất đi ra ngoài; Thực hiện sinh tổng hợp một số hợp phần của tế bào; Nơi cư trú
của một số enzyme và cơ quan tử của tế bào (như là ribosome).
Để vận chuyển chất qua màng thì liên quan đến tính thấm của màng, đặc tính này phụ
thuộc vào các enzyme phospholipase và lipase.
- Tế bào chất: Là hệ keo được cấu tạo từ protein, hydrocacbon, lipid, chất khoáng,
nước và các hợp chất khác. Nước chiếm 90% ở dạng tự do dùng để hòa tan các chất
trước khi tham gia vào các phản ứng trao đổi chất và dạng liên kết. Tế bào chất có độ
nhớt cao tương ứng với syrup hay glycerin, khi tế bào già, độ nhớt giảm xuống. Trong
tế bào chất chứa đầy đủ các cơ quan tử của tế bào: ti thể, nhân, khoảng không bào, các
hạt chất dự trữ dạng tinh bột, dạng chất béo, mạng lưới nội chất, các thể vùi khác …

Cấu trúc tế bào chất thay đổi tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và tuổi sinh trưởng của
tế bào. Sự thay đổi có thể thuận nghịch hoặc khơng thuận nghịch là do mức độ tác
động của các yếu tố bên ngồi. Các tế bào trẻ có ngun sinh chất đồng nhất, khi già,
xuất hiện thêm không bào, các giọt chất béo, hạt pholyphosphat và lipid, tế bào trở nên
không đồng nhất.
Ngồi ra, trong tế bào chất cịn có nhiều enzyme tham gia vào tất cả các phản ứng hóa
sinh.
- Ti thể: Có thể nhìn thấy ở giai đoạn sinh trưởng của tế bào, chiều dài 0.2 – 7.5 μm,
hình dáng có thể thay đổi trong q trình ni cấy, bình thường trong tế bào, số lượng
ti thể từ 1 – 50. Trong ti thể có chứa nhiều enzyme giúp thực hiện các phản ứng quan
trọng của cơ thể như: q trình phosphoryl hóa có oxy tham gia để cung cấp năng
lượng và vật liệu tham gia vào cơ chế tái tạo DNA, phiên mã, dịch mã …, các phản
ứng của chu trình Krebs … Như vậy, các phản ứng quan trọng của cơ thể đều xảy ra
trong ti thể.

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh


Trang 10

Ti thể có cấu tạo gồm 30% chất béo, 60 – 70 % là protein trong đó khoảng 25 – 75% là
protein cấu trúc.
- Mạng lưới nội chất: Trong tế bào chất còn chứa một hệ thống màng hai lớp, được
gọi là mạng lưới nội chất bao gồm hàng dãy màng kép có gai cong dày. Một số màng
có kết hợp với ribosome.
Đôi khi đầu màng chuốt lại thành các bọng trịn và có thể từ đây tạo thành khơng bào.
Mạng lưới này cịn được gọi là thể golgi hay bộ máy golgi.
Mặc dù mạng lưới nội chất của nấm men cũng như ở các vi sinh vật khác có tham gia

vào các hoạt động của tế bào. Song mối quan hệ mạng lưới này với các cơ quan nội
bào khác vẫn chưa được biết rõ.
- Nhân: Nhân tế bào có màng vỏ, chất nhân và hạch nhân, đường kính của nhân
khoảng 2 µm, có dạng hình cầu hoặc ellipse. Đây là nơi chứa bộ máy di truyền của
nấm men, xảy ra quá trình phiên mã và sao chép DNA.
- Không bào: Không bào là cơ quan nội bào có dạng hốc, bên trong chứa đầy dịch
bào và được tách ra từ tế bào chất thành màng không bào, hình dạng khơng bào thay
đổi liên tục, dịch chuyển và tiếp xúc với tế bào chất. Trong khơng bào, ngồi các chất
điện ly hịa tan trong nước cịn có các hợp chất keo như protein, chất béo, hydrocarbon
và enzyme. Ngoài ra, trong dịch bào cịn có chứa: K, Na, Ca, Mg, Cl, SO42-, PO43-…
- Chất dự trữ và thể vùi: Chất dự trữ và thể vùi là những hạt glycogen (gần giống
với hạt tinh bột), các hạt chất béo, hạt lưu huỳnh tích tụ, hạt acid, đường tinh thể tích
tụ, các hạt này thường ở dạng không hoạt động và không tan trong nước [1, 18].
2.2.3.3. Sinh sản của nấm men
Nấm men có hai hình thức sinh sản: hữu tính (bằng bào tử) và vơ tính (bằng nảy chồi
hoặc phân cắt tế bào). Tùy vào điều kiện nuôi cấy tế bào mà nấm men sẽ sinh sản theo
kiểu vơ tính hay hữu tính.
- Sinh sản vơ tính: Sinh sản vơ tính bằng cách nảy chồi hoặc phân chia tế bào. Các
tế bào mẹ không chuyển trực tiếp các vật liệu vỏ sang tế bào con mà ở chổ các mấu

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh


Trang 11

chồi sẽ tổng hợp các vật liệu vỏ tế bào và tích tụ ở đây để chuyển sang cho tế bào con.
Chỗ mấu chồi là các sẹo thường ở đầu cong nhất của tế bào (ở đó có thể là trịn hoặc
xoắn).

- Sinh sản hữu tính: Sinh sản hữu tính liên quan đến sự tạo thành bào tử nang. Bào
tử nang được tạo thành là kết quả của sự giao hợp hai tế bào có tính đực và cái, sau đó
phân chia nhân đã thụ thành hợp tử. Sinh sản hữu tính xảy ra khi nấm men bị chuyển
đột ngột sang môi trường nghèo chất dinh dưỡng nhưng vẫn đủ oxi [18].
2.2.3.4. Sinh trưởng của nấm men
- Pha lag: Là giai đoạn nấm men vừa mới được cấy vào mơi trường cịn chưa sinh
sản, nấm men cịn làm quen với mơi trường mới. Tế bào có kích thước tăng đáng kể,
hàm lượng các chất protein, axít nucleic đều tăng, các enzyme được tổng hợp mạnh
mẽ, nhưng số lượng tế bào khơng tăng hoặc tăng rất ít.
- Pha log: Số lượng tế bào tăng mạnh. Kích thước trung bình của S. cerevisae giai
đoạn này là nhỏ nhất vì chúng cịn phải nảy chồi từ nguồn tế bào chất và vỏ tế bào.
Nếu trong một thể tích mơi trường lúc đầu có X0 tế bào thì sau n lần phân chia số tế
bào là:
X = X0. 2n
Logarit phương trình sẽ có: LgX = Lg X0 + n Lg2
Suy ra số lần phân chia thế hệ: n = (LgX – LgX0) /Lg2
Số lần chia trong 1 giờ hay hằng số tốc độ phân chia là:
V= n/t = (lgX – lgX0) /lg2(t – t0)
Thời gian thế hệ là thời gian cần cho một chu kỳ phân chia của một lứa:
g = 1/n = 1/V
t: thời điểm xác định
t0: thời điểm ban đầu
X: nồng độ nấm men ở thời điểm xác định
X0: nồng độ nấm men ở thời điểm ban đầu

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh

Trang 12

V: số lần phân chia trong 1 giờ.
g: thời gian thế hệ, cần cho 1 lứa (chu kỳ phân chia).
- Pha ổn định: Mật độ quần thể là tối đa. Số lượng tế bào sinh ra bằng số lượng tế
bào chết đi.
- Pha suy vong: Số tế bào chết tăng dần và số tế bào sống giảm dần, các tế bào sống
già đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng. Nguyên nhân là do trong môi trường cạn kiệt
nguồn dinh dưỡng, đồng thời có sự tích tụ các chất ức chế sự phát triển của nấm men
[18].
2.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng
2.2.4.1. Nhiệt độ
Đối với nấm men Saccharomyces cerevisiae thích hợp lên men ở nhiệt độ tối ưu là
28 – 320C. Nếu lên men ở nhiệt độ thấp 20 – 220C, thời gian lên men sẽ kéo dài. Tuy
nhiên, nhiệt độ này sẽ hạn chế sự phát triển của tạp khuẩn. Ở nhiệt độ 33 – 350C, hoạt
tính của nấm men sẽ giảm và điều kiện thuận lợi để vi khuẩn, nấm men hoang dại phát
triển mạnh. Ở nhiệt độ 300C, nấm men hoang dại phát triển mạnh hơn nấm men
S.cerevisiae 2 – 3 lần, còn ở nhiệt độ 35 – 380C chúng phát triển nhanh gấp 6 – 8 lần.
Mặt khác, khi lên men rượu ở nhiệt độ cao sản phẩm sẽ tạo ra nhiều este, aldehyt,
CO2…Ở 400C, phần lớn nấm men sẽ ngừng sinh trưởng [19].
2.2.4.2. pH
Nồng độ ion H+ trong canh trường có ảnh hưởng lớn đến hoạt động của nấm men.
Chúng có khả năng làm thay đổi điện tích các chất tham gia cấu tạo màng tế bào, làm
tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá
trình lên men. Mỗi vi sinh vật chỉ hoạt động trong một trạng thái ion nhất định, trạng
thái này phụ thuộc vào pH của môi trường.
Trong điều kiện lên men rượu, pH tối ưu để tạo thành ethanol là 4.5 – 5.0. Nếu tăng pH
thì rất dễ bị nhiễm khuẩn, glycerin sẽ tạo ra nhiều hơn, do đó sẽ làm giảm hiệu suất lên

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh


Trang 13

men. Khi pH < 4.2 nấm men tuy phát triển chậm hơn so với pH ở 4.5 – 5.0 nhưng tạp
khuẩn hầu như không phát triển.
Khi nấm men đã phát triển nhanh và đủ mạnh, ta tăng pH đến giá trị tối ưu cho nấm
men phát triển về điều kiện tối ưu. Lúc này, điều kiện cũng tốt hơn cho các tạp khuẩn
phát triển nhưng vì nấm men có lợi thế về số lượng nên lấn át được hơn so với các vi
sinh vật tạp khuẩn khác nên không gây hại gì cho quá trình lên men [19].
2.2.4.3. Ảnh hưởng của hàm lượng chất khô ban đầu trong dịch lên men
Thông thường khi hàm lượng chất khô ban đầu quá cao, hiệu suất lên men không
cao. Khi nồng độ đường trong dịch lên men đạt 30 – 35% thì q trình lên men dường
như bị ngừng lại, cịn ở nồng độ 25 – 30% thì nấm men phát triển rất chậm. Nồng độ
tối thích cho nấm men phát triển là 10 – 18% đường. Dung dịch có nồng độ đường cao
sẽ gây ra một áp suất thẩm thấu lớn, làm mất cân bằng trạng thái sinh lí bình thường
của nấm men, thời gian lên men sẽ kéo dài nấm men sẽ không sử dụng hết đường, đồng
thời lượng rượu tạo thành nhiều sẽ ức chế hoạt động của nấm men. Nhưng nếu lượng
đường thấp thì nấm men sẽ phát triển rất chậm vì chúng hoạt động trong mơi trường bị
thiếu dinh dưỡng [18].
2.2.4.4. Ảnh hưởng của nồng độ rượu ethanol
Rượu được tích tụ dần trong q trình lên men và chính nó lại là chất độc, kìm hãm
sự sinh sản cũng như khả năng lên men của nấm men. Ở nồng độ 2 – 5% rượu đã có
khả năng ức chế nấm men, ở 5 – 6% rượu làm nấm men đình chỉ sinh sản, mặc dù quá
trình lên men vẫn tiếp tục diễn ra. Mặt khác, khi lên men rượu, sản phẩm tạo thành cịn
có CO2. Khí CO2 có thể ức chế lên men, nhưng cũng kích thích q trình lên men vì
chúng làm mơi trường lên men được khuấy động liên tục, nấm men luôn ở trạng thái lơ
lửng, giúp rút ngắn quá trình lên men [18].

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh


Trang 14

2.3. LÊN MEN MALOLACTIC
2.3.1. Giới thiệu chung
Lên men malolactic là quá trình chuyển L – malic acid (chứa 2 nhóm carboxyl trong
phân tử) có trong dịch quả thành L – lactic acid hoặc D – lactic acid (chỉ chứa 1 nhóm
carboxyl) và carbon dioxide được thực hiện nhờ vi khuẩn lactic gồm: Lactobacillus,
Oenococcus, Leuconostoc, Pediococcus. Thực chất đây là một q trình dị hóa malic
acid, trong đó L – malic acid được decarboxyl hóa thành L – lactic acid bởi sự xúc tác
của enzyme malate carboxylase [31, 33].
Quá trình này xảy ra bên trong tế bào vi sinh vật theo phản ứng sau:
Malate carboxylase
COOHCH2CH(OH)COOH
Acid malic

CH3CH(OH)COOH + CO2
Acid lactic

Đây là một phản ứng hóa sinh có sự tham gia của một enzyme, xúc tác cho phản ứng
tách nhóm CO2 của cơ chất là acid malic thành acid lactic [34].
Trong quá trình lên men malolactic, vi khuẩn lactic có thể chuyển hóa acid malic theo
các con đường:
- Chuyển hóa trực tiếp L – acid malic thành L – acid lactic và carbon dioxide nhờ
enzyme malate carboxylase. Cơ chế này có mặt ở hầu hết các vi khuẩn malolactic.

- Phân giải acid malic nhờ xúc tác của hệ enzyme “enzymemallic” thành oxaloacetate
và tiếp tục thành acid pyruvic và CO2. L – lactate dehydrogenase, sẽ xúc tác cho phản
ứng khử acid pyruvic thành L – acid lactic. Cơ chế này được tìm thấy ở Lactobacillus
casei và Lactobacillus faecalis.
- Vi khuẩn Lactobacillus fermentum có khả năng chuyển hóa L – acid malic thành
acid lactic ở cả hai dạng đồng phân L – và D –. Ngồi ra, cịn một số sản phẩm trao đổi
chất trung gian như: acetate, succinate và carbon dioxide [37].

Luận Văn Thạc Sĩ

Trần Mỹ Xinh