Nghiên cứu sản xuất chế phẩm men phục vụ cho sản xuất sữa chua

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO KẾT QUẢ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG

MÃ SỐ: T2016 – 28

TÊN ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHẾ PHẨM MEN PHỤC
VỤ CHO SẢN XUẤT SỮA CHUA

CHỦ TRÌ ĐỀ TÀI: TRẦN VĂN CHÍ

Thái Ngun, 2017


TÓM TẮT KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ
Tên đề tài: Nghiên cứu sản xuất chế phẩm men phục vụ cho sản xuất sữa chua
Mã số: T2016 – 28
Chủ nhiệm đề tài: Trần Văn Chí

Tel: 0965.051.219

E-mail:
Cơ quan chủ trì đề tài: Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
Cơ quan và cá nhân phối hợp thực hiện: Khoa Công nghệ Sinh học và Công
nghệ Thực phẩm
Thời gian thực hiện: tháng 01/2016 đến 01/2017

1. Mục tiêu: Tìm kiếm các vi khuẩn lactic có hoạt tính cao để sản xuất men phục vụ
cho sản xuất sữa chua

2. Nội dung chính:
- Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính cao từ các nguồn tự
nhiên;
- Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tăng sinh khối mạnh
nhất từ các nguồn tự nhiên;
- Định danh các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn;
- Nghiên cứu điều kiện để tổ hợp chủng vi khuẩn lactic và nấm men đã tuyển
chọn;
- Nghiên cứu sử dụng chất mang và các điều kiện bảo quản
3. Kết quả đạt đƣợc:
- Phân lập đƣợc 50 chủng vi khuẩn LAB, từ đó tuyển chọn đƣợc 01 chủng có
hoạt tính sinh lactic cao nhất, đƣợc định danh là: Lactobacillus plantarum
- Phân lập đƣợc 50 chủng nấm men, tuyển chọn đƣợc 1 chủng có khả năng tăng
sinh khối mạnh, định danh sơ bộ: Saccharomyces cerevesiae (ký hiệu VPk1)
- Đã thử nghiệm đƣợc khả năng kết hợp giữa chủng Lactobacillus plantarum
và VPk1 trong quá trình lên men
- Đã nghiên cứu đƣợc chất mang phù hợp là đƣờng lactose
- Đã nghiên cứu đƣợc điều kiện phù hợp để bảo quản chế phẩm: độ ẩm 14%,
nhiệt độ 28O C.

1


SUMMARY
Research project title:
Code number: T2016 – 28
Coordinator: Tran Van Chi

Implementing: Thai Nguyen University of Agriculture and Forestry
Cooperating Institution(s): Faculty of Biotechnology and Food Technology
Duration: From january 2016 to january 2017
1. Objectives: Isolation of high yield lactic acid bacteria to produce yeast for
yogurt production
2. Main contents:
- Isolation and selection of high yield lactic acid bacteria from natural sources;
- Isolation and selection of yeast producing high yield biomass from natural
sources;
- Identification of selected microorganisms;
- Optimization of conditions to combine selected yeast and bacteria;
- Investigation of carrier and storage conditions;
3. Results obtained:
- 50 strains of lactic acid bacteria have been isolated and 01 strain possesses the
highest lactic acid producing ability, identified as Lactobacillus plantarum
(named P2).
-50 strains of yeast have been isolated and 01 strain possesses the high biomass
producing ability, identified as Saccharomyces cerevesiae (named VPk1)
- Fermentation is tested with the combination of VPK1 and P2
- The suitable carrier is lactose
- The storage condition is in humidity 14% and temperature 28OC.

2


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 4.1. Biểu đồ khả năng tăng sinh của các chủng qua kết qua đo OD .... ….41
Hình 4.2 Kết quả PCR gene 16S rRNA ............................................................. 42
Hình 4.3. Kết quả giải trình tự gen 16S vi khuẩn lactic..................................... 43
Hình 4.4. Kết quả BLAST trên NCBI gen 16S.................................................. 43

Hình 4.5 Hình ảnh tế bào chủng VPk1 soi dƣới kính hiển vi ............................ 44
Hình 4.6: Thử nghiệm catalase .......................................................................... 45
Hình 4.7. Thử nghiệm khả năng kết hợp 2 chủng VPk1 và P2 ......................... 46

3


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic [3] ............................................. 10
Bảng 3.1. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị sử dụng trong thí nghiệm ............................. 22
Bảng 4.1. Kết quả phân lập chủng vi khuẩn LAB ...................................................... 32
Bảng 4.2. Kết quả thử nghiệm khả năng phân giải CaCO3 nhờ axit sinh ra do vi
khuẩn lactic.................................................................................................................. 35
Bảng 4.3. Kết quả đo OD các chủng lactic kiểm nghiệm trong môi trƣờng MRS theo
thời gian nuôi ............................................................................................................... 36
Bảng 4.4. Kết quả thử nghiệm đặc tính sinh lý hóa sinh của các chủng lactic ........... 36
Bảng 4.5 Kết quả phân lập các chủng nấm men từ tự nhiên ....................................... 37
Bảng 4.6. Kết quả thử khả năng lên men đƣờng saccharose và mantose ................... 39
Bảng 4.7. Kết quả thử khả năng tăng sinh khối bằng cách đo OD ............................. 40
Bảng 4.8. Kết quả thử khả năng kết hợp của nấm men VPk1 với chủng LAB P2 ..... 45
Bảng 4.9 Đánh giá hiệu quả sử dụng chất mang ..................................................... 47
Bảng 4.10. Đánh giá tác động của điều kiện bảo quản đến chất lƣợng của chế
phẩm ............................................................................................................................ 47

4


MỤC LỤC
CHƢƠNG 1 MỞ ĐẦU..................................................................................................8
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................8

1.2 Mục đích ..............................................................................................................8
1.3. Yêu cầu ...............................................................................................................8
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................9
2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic (LAB) ......................................................................9
2.1.1. Khái niệm ............................................................................................................9
2.1.2. Lịch sử nghiên cứu của vi khuẩn lactic (LAB) ...................................................9
2.1.3. Đặc tính chung.....................................................................................................9
2.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic ................................................10
2.1.4.1. Đặc điểm sinh lý .........................................................................................10
2.1.4.2. Đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn lactic .......................................................10
Nhu cầu dinh dƣỡng cacbon .................................................................................11
Nhu cầu dinh dƣỡng nitơ ......................................................................................11
Nhu cầu về vitamin ...............................................................................................11
Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác .......................................................................11
Nhu cầu các muối vô cơ khác ...............................................................................11
Nhu cầu dinh dƣỡng oxi .......................................................................................12
2.1.4.3. Quá trình lên men của vi khuẩn lactic ........................................................12
Lên men lactic đồng hình .....................................................................................12
Lên men lactic dị hình ..........................................................................................13
2.2. Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic [4] ..........................................................14
2.2.1. Ứng dụng trong công nghệ thực phẩm .......................................................14
2.2.2. Ứng dụng trong chăn nuôi ................................................................................14
2.2.3. Ứng dụng trong một số lĩnh vực khác ........................................................14
2.3.1. Vai trò của nấm men ......................................................................................15
2.3.2. Ứng dụng của nấm men .................................................................................16
2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc .......................................................17
2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nƣớc. ...............................................................17
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................................19
5

CHƢƠNG 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........22
3.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu .....................................22
3.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn LAB và các chủng nấm men từ
tự nhiên .................................................................................................................22
3.1.2. Dụng cụ, hóa chất, thiết bị nghiên cứu .......................................................22
3.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ..............................................................23
3.2. Nội dung nghiên cứu .........................................................................................23
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ................................................................................23
3.3.1.Phƣơng pháp nuôi cấy, phân lập..............................................................23
3.3.1.1. Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn LAB ..................................................23
3.3.1.2. Phƣơng pháp phân lập nấm men ..........................................................23
3.3.2. Phƣơng pháp cấy chuyển và giữ giống ........................................................25
3.3.3. Thử nghiệm catalase .................................................................................26
3.3.4. Phƣơng pháp thử khả năng phân giải CaCO3 .......................................26
3.3.5. Phƣơng pháp thử khả năng di động .......................................................26
3.3.6. Phƣơng pháp thử khả năng sinh khí ......................................................27
3.3.7. Phƣơng pháp nhuộm Gram [15] .............................................................27
3.3.8. Phƣơng pháp đếm tế bào vi khuẩn lactic ....................................................28
3.3.9. Phƣơng pháp đo pH .................................................................................29
3.3.10. Phƣơng pháp định lƣợng acid lactic ............................................................29
3.3.11. Phƣơng pháp đo sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn lactic bằng cách
đo chỉ số OD trên máy quang phổ UV – Vis ...........................................................30
3.3.12. Phƣơng pháp thử khả năng kết hợp của chủng vi khuẩn lactic với chủng
nấm men ...................................................................................................................30
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..............................................................32
4.1. Kết quả nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn LAB có hoạt tính
cao từ các nguồn tự nhiên ........................................................................................32
4.1.1. Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn LAB ................................................32
4.1.2. Kết quả tuyển chọn chủng LAB có hoạt tính mạnh ...................................35

4.2. Kết quả nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tăng
sinh khối mạnh nhất từ các nguồn tự nhiên .............................................................37
4.2.1. Kết quả phân lập các chủng nấm men từ nguồn tự nhiên ..........................37
4.2.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tăng sinh mạnh nhất .................39
6


Thử khả năng lên men đƣờng saccharose và mantose .........................................39
Kết quả thí nghiệm khả năng tăng sinh . ..............................................................40
Định danh sơ bộ chủng VPk1 ..................................................................................43
Quan sát hình thái tế bào ......................................................................................44
Thử nghiệm catalase .............................................................................................44
4.5. Kết quả nghiên cứu sử dụng chất mang và các điều kiện bảo quản .............46
4.5.1. Kết quả nghiên cứu sử dụng chất mang .................................................46
4.5.2. Kết quả nghiên cứu điều kiện bảo quản .................................................47
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..............................................................49
5.1. KẾT LUẬN .......................................................................................................49
5.2. KIẾN NGHỊ ......................................................................................................49
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................50

7


CHƢƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Vi khuẩn lactic (LAB) có ý nghĩa rất quan trọng trong các q trình lên
men, tạo hƣơng vị và bảo quản thực phẩm. Đặc biệt LAB đƣợc sử dụng rộng rãi
trong sản xuất thực phẩm lên men bao gồm các sản phẩm sữa nhƣ sữa chua, pho mát,
các sản phẩm thịt, các sản phẩm bánh mì và rƣợu vang [26].
Trong quá trình lên men, LAB sinh ra các axit hữu cơ, chúng tạo ra mơi trƣờng

khơng thích hợp cho sự phát triển của những vi sinh vật gây bệnh hay gây hƣ hỏng
sản phẩm, tác động lên màng tế bào chất của vi khuẩn, ảnh hƣởng đến chức năng bảo
vệ và chức năng dinh dƣỡng của màng tế bào, ức chế quá trình vận chuyển chủ động
của màng tế bào. Axit lactic dễ dàng thấm qua màng tế bào, làm giảm pH nội bào
hoặc tự oxi hố, làm dừng q trình trao đổi chất, gây chết những tế bào nhạy cảm
với nó [1].
Trên thị trƣờng hiện nay, sữa chua rất đa dạng và các loại sữa chua này thƣờng
đƣợc sản xuất mang tính chất độc quyền bởi một số hãng hoặc một sô công ty sản
xuất thực phẩm nhất định, do vậy giá thành của sữa chua rất cao so với nhu cầu và
thu nhập của ngƣời lao động. Việc tạo ra sữa chua ở quy mơ nhỏ lẻ, hộ gia đình rất
đơn giản, tuy nhiên chất lƣợng thƣờng không đƣợc nhƣ mong muốn. Lý do là ngƣời
ta thƣờng sử dụng men chính là các loại sữa chua trên thị trƣờng, do vậy giống khơng
ổn định trong q trình lên men.
Với định hƣớng là tìm ra các chủng LAB có khả năng sinh acid lactic cao nhất
ứng dụng trong sản xuất chế phẩm men phục vụ cho sản xuất sữa chua, chúng tôi tiến
hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm men phục vụ cho sản xuất sữa
chua”

1.2 Mục đích
Tìm kiếm các vi khuẩn lactic có hoạt tính cao để sản xuất men phục vụ cho sản xuất
sữa chua.

1.3. Yêu cầu
- Tuyển chọn đƣợc chủng LAB có hoạt lực lên men cao từ nguồn tự nhiên
- Tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có khả năng tăng sinh mạnh từ tự nhiên
- Nghiên cứu đƣợc điều kiện lên men để kết hợp hai chủng thành tổ hợp
- Nghiên cứu đƣợc môi trƣờng lên men thay thế
- Nghiên cứu đƣợc chất mang phù hợp
8

- Nghiên cứu đƣợc điều kiện bảo quản men giống.
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về vi khuẩn lactic (LAB)
2.1.1. Khái niệm
Vi khuẩn lactic (LAB) là một nhóm các vi khuẩn Gram dƣơng có sự thống
nhất về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa và sự trao đổi chất. Chúng là trực khuẩn
ngắn hay que và cầu khuẩn không hô hấp, không sinh bào tử. Chúng thƣờng đƣợc tìm
thấy trong các chất bị phân hủy và sản phẩm chứa lactic, axit lactic đƣợc tạo ra nhƣ là
sản phẩm chủ yếu của sự trao đổi chất và là kết thúc của quá trình lên men
carbohydrate. Vì vậy LAB đƣợc dùng trong thực phẩm lên men, axit hóa ức chế sự
tăng trƣởng của tác nhân gây hƣ hỏng [2].
2.1.2. Lịch sử nghiên cứu của vi khuẩn lactic (LAB)
Từ xa xƣa, con ngƣời đã sử dụng vi khuẩn lactic để bảo quản và chế biến các
loại thức ăn. Cho đến năm 1780, nhà bác học Thuỵ điển Carl Wilhelm Schaele lần
đầu tiên tách đƣợc axit lactic từ sữa bò lên men chua. Năm 1874, Bloudean xác nhận
axit lactic (CH3CHOHCOOH) là sản phẩm cuối cùng của sự lên men. Mƣời năm sau,
năm 1857, L.Pasteur đã chứng minh rằng sữa chua là kết quả hoạt động của một
nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. Đến năm 1878, Joseph Lister đã phân
lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactic, ngày nay gọi là
Streptococcus lactic. Công nghệ sản xuất axit lactic ra đời năm 1881, từ đó đến này
đã có rất nhiều cơng trình nghiên cứu về vi khuẩn lactic cũng nhƣ quá trình lên men
lactic đƣợc thực hiện. Các nhà khoa học cũng liên tục phân lập đƣợc các loài vi
khuẩn lactic khác nhau [3].
2.1.3. Đặc tính chung
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn Gram dƣơng, khơng sinh bào tử, catalase
âm tính và là vi khuẩn vi hiếu khí (aerotolerant organisms), trao đổi chất chủ yếu
bằng con đƣờng lên men và không hô hấp do khơng có cytochromes (trừ giống
Bifidobacterium là kỵ khí bắt buộc). Vi khuẩn lactic có thể lên men đƣợc các đƣờng
monosaccharid, đƣờng disaccharid, protein tan, pepton và axit. Phần lớn chúng

không lên men đƣợc tinh bột và các polisaccharid khác.
Đƣờng kính của các dạng cầu khuẩn lactic từ 0,5 - 1,5μm. Các tế bào hình cầu
xếp thành cặp hoặc hình chuỗi có chiều dài khác nhau. Kích thƣớc tế bào trực khuẩn
lactic từ 1 - 8μm. Trực khuẩn đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi. Các lồi vi khuẩn
lactic có khả năng rất khác nhau khi tạo thành axit lactic trong môi trƣờng, và sức
9


chịu axit (hay độ bền axit) cũng rất khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình
tạo thành axit lactic cao hơn (khoảng 2÷3%) liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực
khuẩn này có thể phát triển ở pH 3,8÷4 (cầu khuẩn không thể phát triển đƣợc ở môi
trƣờng này), hoạt lực lên men tốt nhất của trực khuẩn ở vùng pH=5,5÷6. Nhiệt độ
sinh trƣởng tối thích của vi khuẩn lactic ƣa ấm là 25÷350C, ƣa nhiệt là 40÷450C và ƣa
lạnh là thấp hơn 5oC. Khi gia nhiệt khoảng 60÷800C thì hầu hết chúng bị chết sau
10÷30 phút [27].
2.1.4. Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic
2.1.4.1. Đặc điểm sinh lý
Vi khuẩn lactic đƣợc xếp chung vào họ Lactobacillaceae, thuộc bộ
Eubacteriales. Chúng khơng đồng nhất về mặt hình thái nhƣng về mặt sinh lý tƣơng
đối đồng nhất. Đều là vi khuẩn Gram dƣơng (+), không tạo bào tử, hầu hết không di
động, thu nhận năng lƣợng nhờ phân giải hydratcacbon và sinh axit lactic dƣới dạng
D (-), L (+) hoặc DL [5]
Khác với các vi khuẩn đƣờng ruột cũng sinh ra axit lactic, tất cả các vi khuẩn
lactic đều lên men bắt buộc; không chứa cytochrome, enzyme catalase; hơ hấp tuỳ
tiện. Vi khuẩn lactic địi hỏi nhu cầu cao về mơi truờng dinh dƣỡng ngồi đƣờng,
muối khống, nitơ, đa số chúng cần hàng loạt các loại vitamin (thiamin, biototin, axit
folic, lactoflavin, axit pentotenic, axit nicotinic…) và các axit amin [5].
Hình dạng và kích thƣớc tế bào của vi khuẩn lactic thay đổi tuỳ từng lồi, hình
thái cịn phụ thuộc vào điều kiện môi truờng, thời gian lên men, sự có mặt của oxi và
các tác nhân khác.

Bảng 2.1: Các giống khác nhau của vi khuẩn lactic [3]
Giống
Streptococus
Leuconostoc
Pedicoccus
Lactobacsillus
Bifidobacterium

Hình
Cầu
Cầu
Cầu
Que
Khác
nhau
tuỳ
loại

Tế bào
Sắp xếp
Chuỗi
Chuỗi
Tứ cầu
Chuỗi

Đồng hình
Dị hình
Đồng hình
Đồng hình và dị hình

DNA
(%GC)
34 - 46
36 – 43
34 – 42
32 – 53

Lên men lactic và acetic

55 - 67

Kiểu lên men

Nhiều dạng

2.1.4.2. Đặc điểm sinh hoá của vi khuẩn lactic

10


Các loại vi khuẩn lactic khác nhau thì có nhu cầu dinh dƣỡng khác nhau.
Chúng khơng chỉ có nhu cầu về các nguồn cơ chất chứa các nguyên tố cơ bản nhƣ
cacbon, nitơ, photphat và lƣu huỳnh mà cịn có nhu cầu về một số chất cần thiết khác
nhƣ vitamin, muối vơ cơ…
Nhu cầu dinh dưỡng cacbon
Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhiều loại hydrat cacbon từ các monosaccarit
(glucoza, fructoza, manoza), các disaccarit (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các
polysaccarit (tinh bột, dextrin). Chúng sử dụng nguồn cacbon này để cung cấp năng
lƣợng, xây dựng cấu trúc tế bào và làm cơ chất cho quá trình lên men tổng hợp các
axit hữu cơ.

Nhu cầu dinh dưỡng nitơ
Phần lớn vi khuẩn lactic không tự tổng hợp đƣợc các hợp chất chứa nitơ. Vì
vậy để đảm bảo cho sự sinh trƣởng và phát triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ
có sẵn trong mơi trƣờng. Các nguồn nitơ vi khuẩn lactic có thể sử dụng nhƣ: Cao thịt,
cao nấm men, tryptone, dịch thủy phân casein từ sữa, peptone.
Nhu cầu về vitamin
Vitamin đóng vai trị là các coenzyme trong q trình trao đổi chất của tế bào,
nên rất cần thiết cho hoạt động sống. Tuy nhiên, đa số các loài vi khuẩn lactic khơng
có khả năng sinh tổng hợp vitamin. Vì vậy cần bổ sung vào môi trƣờng các loại
vitamin.
Các chất chứa vitamin thƣờng sử dụng nhƣ nƣớc chiết từ khoai tây, ngô, cà
rốt hay dịch tự phân nấm men…
Nhu cầu các hợp chất hữu cơ khác
Ngoài các axit amin và vitamin, vi khuẩn lactic còn cần các hợp chất hữu cơ khác
cho sự phát triển nhƣ các bazơ nitơ hay các axit hữu cơ. Một số axit hữu cơ có ảnh hƣởng
thuận lợi đến tốc độ sinh trƣởng của vi khuẩn lactic nhƣ axit xitric, axit oleic.
Nên hiện nay ngƣời ta sử dụng các muối citrat, dẫn xuất của axit oleic, axit
axetic làm thành phần môi trƣờng nuôi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn
lactic.
Nhu cầu các muối vô cơ khác
Để đảm bảo cho sinh trƣởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic rất cần các
muối vô cơ.
11


Nhằm cung cấp các nguyên tố khoáng nhƣ đồng, sắt, natri, kali, photpho, lƣu
huỳnh, magiê đặc biệt là mangan, vì mangan giúp ngăn ngừa quá trình tự phân và ổn
định cấu trúc tế bào.
Nhu cầu dinh dưỡng oxi
Vi khuẩn lactic vừa có khả năng sống đƣợc trong mơi trƣờng có oxy và vừa

sống đƣợc trong mơi trƣờng khơng có oxy.
+ Trong điều kiện hiếu khí sinh khối vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với
điều kiện kỵ khí, trong điều kiện này từ một phân tử glucose sẽ bị oxy hóa hồn tồn
thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ một phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38
ATP.
+ Trong điều kiện kỵ khí từ một phân tử glucose chỉ tạo ra 2 ATP do đó lƣợng
cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn.
2.1.4.3. Quá trình lên men của vi khuẩn lactic
Lên men lactic là q trình chuyển hố đuờng thành axit lactic nhờ vi sinh vật,
điển hình là vi khuẩn lactic. Chúng có khả năng lên men nhiều loại đƣờng đơn và
đƣờng đơi nhƣng khơng có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột. Sự
phát triển của nó cần có sự có mặt của pepton, axit amin hay muối amon. Chúng có
yêu cầu đặc biệt về chất dinh duỡng giàu vitamin, axit amin và khoáng chất. Q
trình lên men xảy ra tốt nhất trong mơi trƣờng axit yếu pH từ 5,5 – 6, khi pH nhỏ hơn
5,5 quá trình lên men bị dừng lại. Nhiệt độ thích hợp từ 15 – 50oC. Tuy nhiên mỗi
lồi có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớn hơn 80oC vi khuẩn
lactic bị tiêu diệt hoàn tồn [3].
Q trình lên men lactic diễn ra trong tế bào của vi khuẩn lactic. Đầu tiên
đƣờng đƣợc hấp thụ vào bên trong tế bào nhờ cơ chế vận chuyển đặc trƣng của màng
tế bào. Nếu phân tử đƣờng là đƣờng đơn nhƣ glucose thì sẽ đi thẳng vào chu trình
chuyển hố, nếu phân tử là đƣờng đơi hay các dạng đƣờng khác thì sẽ bị phân huỷ
thành các monosaccharide rồi mới đi vào chu trình chuyển hố tạo ra các sản phẩm là
axit lactic, axit acetic, CO2… Dựa vào sản phẩm lên men sinh ra, chia lên men lactic
thành hai nhóm: Lên men lactic đồng hình và lên men lactic dị hình [3].
Lên men lactic đồng hình
Phƣơng trình tổng quát lên men lactic đồng hình:
C6H12O6  2CH3 – CHOH – COOH + 94 Kcal
12

Lên men lactic đồng hình là quá trình lên men mà sản phẩm tạo ra chủ yếu là
axit lactic. Trong quá trình lên men, sự hình thành axit trải qua hàng loạt giai đoạn
trung gian với sự tham gia của các enzyme tƣơng ứng. Giai đoạn đầu xảy ra quá trình
hoạt hố hexose với sự có mặt của axit phosphoric để hình thành hexose diphosphat,
sau đó diễn ra sự cắt mạch hexose để hình thành triosophosphat (dihydroxyaxeton-P
và glycerađehye-3P) những hợp chất này chuyển hoá thành pyruvat, và pyruvat là
chất nhận H+ từ NADH để chuyển hoá thành axit lactic (chu trình EMP) [28].
Một số lồi vi khuẩn lactic lên men lactic đồng hình:
Streptococcus lactics: Là cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn khi cịn non, kết
đơi hoặc thành chuỗi ngắn. Chúng là giống vi khuẩn ƣa ấm, phát triển tốt ở 30-35oC,
làm đông tụ sữa ở điều kiện này sau 10 – 12 giờ. Trong mơi truờng tích tụ đƣợc 0,8 1% axit lactic. Nhiệt độ tối thiểu cho phát triển là 10oC, tối đa là 40 – 45oC. Một số
chủng tạo thành bacteriocin ở dạng nizin [6].
Lactobacillus plantarum: Là những trực khuẩn nhỏ, thƣờng kết đôi hoặc
chuỗi. Nhiệt độ tối ƣu cho sinh trƣởng là 30oC, tích tụ 1,3% axit. Giống này chủ yếu
trong muối chua rau dƣa và ủ chua thức ăn dùng trong chăn nuôi [7].
Lên men lactic dị hình
Lên men lactic dị hình là quá trình lên men kị khí phức tạp ngồi sản phẩm
axit lactic cịn có nhiều sản phẩm khác nhƣ axit acetic, etanol, CO2...
Phƣơng trình tổng quát:
C6H12O6  CH3-CHOH-COOH + HOOC-CH2-CH2-COOH + CH3-COOH + CH3CH2-OH + CO2 + H2
Trong quá trình lên men lactic dị hình, những vi khuẩn nhóm này thiếu các
enzyme chủ yếu của con đƣờng EMP nhƣ aldolaza và Triosophosphatsomerza, vì
thế giai đoạn đầu của sự phân giải glucoza nhƣ Glucose-6-P, 6-phosphogluconat và
sau đó loại ra 1 CO2 để hình thành Ribulose-5P, hợp chất này bị cắt thành 2 phân
tử: Glyxeraldehyt-3P và axetyl-P. Hợp chất triosophosphat sẽ qua một số phản ứng
nhƣ lên men đồng hình để chuyển thành axit acetic vì vậy trong lên men lactic dị
hình ngồi axit lactic cịn có CO 2 , ethanol, axit acetic, axit sucinic… và 1
ATP/Glucoza [3].
Một số loài lên men lactic dị hình:
13

Lactobacillus brevis (L. brassica fermentati): Là những vi khuẩn đƣợc tìm
thấy chủ yếu trong bắp cải, rau củ muối chua. Trong lên men, ngồi axit lactic
(khoảng 1,2%) nó cịn tạo axit acetic, rƣợu ethylic (khoảng 2,4%) và CO2, nó cịn tạo
hƣơng làm cho sản phẩm có hƣơng vị dễ chịu [6].
Lactobacillus buchneri: Đang đƣợc nghiên cứu sử dụng làm thức ăn ủ chua
cho gia súc bởi khả năng hạn chế sự phát triển của nấm men, nấm mốc trong quá
trình ủ chua hiếu khí. Nó có khả năng lên men xylose và hỗn hợp xylose và glucose,
đƣợc ứng dụng trong sản xuất thức ăn ủ chua [29].
2.2. Một số ứng dụng của vi khuẩn lactic [4]
Vi khuẩn lactic là vi sinh vật thực phẩm an toàn đƣợc ứng dụng rộng rãi trong
nhiều lĩnh vực khác nhau của xã hội nhƣ công nghiệp, nông nghiệp, môi trƣờng, y
dƣợc, đặc biệt trong lĩnh vực chế biến và bảo quản thực phẩm…
2.2.1. Ứng dụng trong cơng nghệ thực phẩm
Q trình lên men lactic các thực phẩm thực hiện bởi vi khuẩn lactic đã đƣợc
biết đến nhƣ ứng dụng đầu tiên và hiện nay đã trở lên rất phổ biến.
Tận dụng hệ vi khuẩn lactic có sẵn trong các nguyên liệu, bằng cách tạo điều
kiện cho chúng phát triển chiếm ƣu thế, ngƣời ta đã tạo ra rất nhiều loại thức ăn chua
có hƣơng vị thơm ngon, dễ tiêu hoá hơn và giữ đƣợc lâu hơn. Có những loại đóng vai
trị quan trọng trong các bữa ăn hàng ngày của một vài dân tộc hay một bộ phận dân
cƣ. Một số khác hiện diện với vị trí của các món ăn truyền thống hoặc đặc sản.
2.2.2. Ứng dụng trong chăn nuôi
Trong lĩnh vực chăn nuôi từ lâu đời ngƣời dân đã biết ủ chua thức ăn, rau xanh
mà thực chất là quá trình lên men lactic tự nhiên. Ủ xanh thức ăn là phƣơng pháp
sinh vật học đặc biệt vừa có tác dụng chế biến và bảo quản thức ăn, ủ xanh thức ăn có
ý nghĩa kinh tế lớn, nhờ đó có thể thu hoạch thức ăn xanh vào bất kì thời tiết nào,
ngồi ra thức ăn ủ xanh còn giữ đƣợc chất dinh dƣỡng nhiều hơn so với các thức ăn
xanh phơi khô, giá trị dinh dƣỡng giảm không quá 5 – 10% (so với thức ăn phơi khô
giảm đi 50%). Từ năm 1850 trở đi, ủ xanh đã trở thành một ngành cơng nghiệp chế

biến thức ăn Châu Âu, sau đó lan truyền sang các nƣớc khác trên thế giới [4].
2.2.3. Ứng dụng trong một số lĩnh vực khác
Ứng dụng quan trọng của vi khuẩn lactic là sản xuất axit lactic và các muối
lactat. Lên men lactic là phƣơng pháp duy nhất hiện nay dùng để sản xuất axit này

14


trong công nghiệp. Axit lactic và các dẫn xuất của nó có những ứng dụng rất quan
trong trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
Trong dƣợc phẩm và y học, có ý nghĩa nhất phải kể đến chất kháng sinh
Bacterioxin. Loại kháng sinh này cho phép tăng cƣờng tính miễn dịch, giảm lƣợng
cholesterol trong máu, điều trị chứng loạn khuẩn và chống ung thƣ. Rất nhiều tác giả
đã khẳng định tác dụng hữu hiệu của Bacterioxin trong việc bảo vệ sức khoẻ con
ngƣời. Nhờ có hoạt tính quang học đặc biệt, các este tạo bởi axit lactic với metyl, etyl
hay izopropyl đƣợc dùng nhƣ chất trung gian để tổng hợp các phân tử đối xứng (cấu
trúc thƣờng gặp của nhiều loại dƣợc liệu). Lactat natri cịn đƣợc sử dụng làm dung
mơi thẩm tích thận. Một số các muối khác nhƣ lactat canxi, magiê là các chất thƣờng
xuyên đƣợc sử dụng để bổ sung sự thiếu hụt các nguyên tố này cho cơ thể, đặc biệt ở
trẻ em [4].
Trong lĩnh vực mĩ phẩm, lactat canxi và lactat natri đƣợc sử dụng nhiều đối
với các loại kem bơi da nhờ tính giữ ẩm tốt của chúng.
Este của axit lactic khơng tan trong nƣớc cịn đƣợc dùng để sản xuất sơn, mực in.
Etyl và butyl lactat là các dung mơi ít độc tính khi hồ tan các loại thuốc nhuộm. Etyl
L (+) lactat có thể thay thế cho nhiều loại dung môi độc khác để rửa các chi tiết kim
loại có độ chính xác cao tronh ngành điện, hàng không và sản xuất chất bán dẫn.
2.3. Nấm men
2.3.1. Vai trò của nấm men
Nấm men là nhóm vi sinh vật đƣợc con ngƣời sử dụng sớm nhất trong chế
biến thực phẩm, hàng nghìn năm trƣớc cơng nguyên con ngƣời đã biết sử dụng quá

trình lên men để sản xuất rƣợu, làm nở bột mì. Ngày nay rất nhiều nhà máy với quy
mô lớn sử dụng vi sinh vật nói chung và nấm men nói riêng để sản xuất ra các sản
phẩm quan trong nhƣ glyxerin, bia, rƣợu nho, các sản phẩm rƣợu chƣng cất: Rum,
whisky [30].
Nấm men cũng đã đƣợc sử dụng làm vật chủ trong công nghệ cấy chuyển gen
để tạo ra những sản phẩm rất quý giá nhờ kỹ nghệ chuyển gen và tái tổ hợp [31]. Có
thể kể đến một số kết quả cụ thể sau:
Năm 1985 hãng Suntory (Mỹ) đã tạo đƣợc giống nấm men mới bằng cơng
nghệ gen có thể giết chết các vi khuẩn xuất hiện trong bia.
Kimura. A (Nhật) năm 1980 đã tạo ra đƣợc các chủng nấm men có khả năng
sản xuất Insulin và Interferon. Tháng 3-1981 các thành viên bộ môn di truyền học,
đại học Oa sinh ton đã sử dụng tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae đã đƣợc
tái tổ hợp để sản xuất Interferon đạt hiệu suất cao... [8].

15


2.3.2. Ứng dụng của nấm men
Hơn 6000 năm trƣớc đây ngƣời Ai Cập đã biết làm tăng hƣơng vị và độ nở
của bột bánh mì bằng cách để bột mì đã nhào vài ngày trƣớc khi đem nƣớng.
Thậm chí trƣớc đó nữa ngƣời Summarian đã khắc lên bia đá phƣơng pháp lên men
để làm cồn. Ngày nay chúng ta đều biết cả hai việc này dựa trên hoạt động sống
của nấm men Saccharomyces cerevisiae và một vài loài gần gũi. Khoa học hiện
đại bắt nguồn từ kiến thức cổ điển đó chiếm vị trí đặc biệt trong cuộc sống con
ngƣời [9].
Ngồi tác dụng làm nở bột mì, làm cồn, nấm men từ lâu đã đƣợc dùng để sản
xuất các loại đồ uống rất đa dạng nhƣ bia, vang, sâm banh, nƣớc ngọt có ga, dùng để
sản xuất sinh khối, giàu đạm và vitamin, nhiều dƣợc phẩm quý đắt tiền, các chất sinh
học dùng trong phịng thí nghiệm sinh học và y học hiện đại [9]. Theo tài liệu quốc
tế năm 1984, các sản phẩm từ nấm men chiếm gần 70% tổng số các sản phẩm cơng

nghệ sinh học tồn thế giới [10].
Ngồi ra chúng ta cịn thấy một ứng dụng rất quan trọng của nấm men đó là sử
dụng trong chăn ni. Bởi vì trong tế bào nấm men chứa đầy đủ các chất cần thiết
cho sự sống với hàm lƣợng cao. So với khối lƣợng khô, protein chiếm 48- 52%,
hydratcacbon 13- 16%, lipit 2- 3%, các chất trích ly và vitamin 23- 40%.
Ngoài việc thu sinh khối nấm men ở các nhà máy bia, nhà máy rƣợu, ngay từ
những năm 70 ngƣời ta đã xây dựng các nhà máy chuyên sản xuât nấm men gia súc
đi từ các nguồn là rỉ đƣờng, dịch thủy phân xenlulose từ nƣớc thải các nhà máy giấy,
phế phẩm của nhà máy đồ hộp quả, nhà máy sản xuất phomat,... . Những năm đầu
thập kỷ trƣớc, ngƣời ta đặc biệt chú ý đến khả năng sản xuất nấm men đi từ metan
[11] và nhất là từ parafin của dầu mỏ [12]. Một số nghiên cứu đề cập tới việc sản
xuất sinh khối nấm men trực tiếp từ nguồn thức ăn là tinh bột [11].
Ở nƣớc ta, vấn đề nghiên cứu và sử dụng nấm men trong chăn nuôi cũng đã
tiến hành từ vài chục năm trƣớc đây. Năm 1961, một số nông trƣờng và hợp tác xã
dùng men bia [21] S.cerevisiae có khi thêm Bac.subtilis để ủ thức ăn.
Trong thời kỳ 1963- 1967 [13] Viện chăn nuôi đã tiến hành nghiên cứu men
bia và xây dựng quy trình phổ biến cho nhiều hợp tác xã.
Năm 1964 trƣờng Đại học Nông nghiệp đã đúc kết kinh nghiệm quần chúng
về men rƣợu và làm bánh men thuốc bắc đem ứng dụng ở các hợp tác xã.
Năm 1965 trƣờng Đại học Tổng hợp đã phân lập, nuôi cấy và hƣớng dẫn làm
bánh men thuốc bắc đƣa áp dụng và có kết quả ở nhiều địa phƣơng [14] và trƣờng
Đại học Tổng hợp tiếp tục nghiên cứu lựa chọn chủng nấm men và điều kiện sản xuất
sinh khối để đƣa ứng dụng [15].
16


2.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nƣớc
2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước.
Hiện nay trong nƣớc ngày càng có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn lactic, đặc
biệt là những ứng dụng trong chăm sóc sức khoẻ và chăn ni. Phân lập có ý nghĩa

rất to lớn để lựa chọn những lồi có tiềm năng cao trong lên men.
Nhóm của Nguyễn Thu Hà và cs (2006), nghiên cứu sự biểu hiện của enzyme
lactase ở 2 chủng Lactobacillus reuteri L103 và L461. Đây là nghiên cứu hoàn toàn
cơ bản, cho thấy 2 enzyme biểu hiện 2 tiểu phần (2 chuỗi peptide có trọng lƣợng là
35kDa và 85kDa). Các enzyme nay có khoảng pH hoạt động khá hẹp, một enzyme từ
pH 3.8 – 4.0 (chủng L461) và một pH 4.6 – 4.8 (chủng L103). Kết quả nghiên cứu
này sau đó đƣợc trình bày tại Hội nghị lần thứ V, Trƣờng Đại học Khoa học Hà Nội,
(2006) và đã đăng trong tạp chí quốc tế. Nhóm tác giả này về sau có một số nghiên
cứu tinh sạch enzyme để sử dụng tổng hợp galactooligosaccharides mang hoạt tính
sinh học.
Nghiên cứu của Mai Đàm Linh và cộng sự (2008) về đặc điểm của các chủng
vi khuẩn lactic phân lập trên địa bàn thành phố Hà Nội, từ 17 mẫu lên men chua đã
phân lập đƣợc 50 chủng vi khuẩn lactic, tuyển chọn đƣợc 10 chủng có hoạt lực axit
mạnh (trên 200oT) có hoạt lực kháng khuẩn và sinh enzyme proteaza, 3 chủng đƣợc
lựa chọn nuôi trên môi trƣờng thay thế, môi trƣờng MRS tốt nhất [16].
Nghiên cứu của Đào Thị Lƣơng và cộng sự năm 2010 đã phân lập và định
danh đƣợc 8 loài vi khuẩn lactic có hoạt lực cao để ứng dụng trong bảo quản và chế
biến thức ăn thô xanh, phế phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai lại. Từ 30 mẫu
khác nhau đã phân lập đƣợc 143 chủng vi khuẩn lactic, tuyển chọn đƣợc 8 chủng có
hoạt lực mạnh nhất, trong đó chủng 2-9 thuộc lồi Lactobacillus pentosus. Các chủng
2-10, 3-5, 3-10, 4-14, 8-4, 9-17 thuộc loài Lactobacllus plantarum. Chủng L01 có tế
bào hình cầu, có đặc điểm thuộc loài Enterococcus lactic. Các chủng đƣợc lựa chọn
đều là những chủng vi sinh vật an tồn, khơng gây bệnh và đƣợc sử dụng rất phổ biến
trong các chế phẩm probiotic. Đây là các chủng nằm trong danh sách các loài vi sinh
vật đƣợc AAFCO (American Feed Control Officials) Mỹ cho phép sử dụng trong chế
biến thức ăn [17].
Nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh và cộng sự năm 2010 đã phân lập và định
danh đƣợc các chủng B6, B8a, B8b, B9a, B9b, B11, B12b, B15, B17, M3, M5 và
T16. Qua các thí nghiệm in vitro, 12 chủng Lactobacillus có đặc tính probiotic thích
hợp cho con ngƣời đã đƣợc chọn lọc. Chúng có thể tồn tại trong đƣờng dạ dày – ruột

ngƣời vì kháng lại pH thấp trong dạ dày, kháng lại dịch mật trong ruột non và kết
17


bám với biểu mô ruột. Các chủng này đƣợc định danh bằng phƣơng pháp phân tích
trình tự rDNA 16S gồm: L. paracasei/ casei B5, L. salivarius B6, L. gasseri B8a, L.
fermentum B8b, L. fermentum B9a, L. gasseri B9b, L. rhamnosus B11, L. paracasei/
casei B12b, L. paracasei/ casei B17, L. rhamnosus M3, L. salivarius M5 và L.
fermentum T16. Ngoài ra, các chủng Lactobacillus có đặc tính probiotic ở trên cũng
thể hiện một số ích lợi đối với sức khỏe con ngƣời nhƣ: kháng với các vi khuẩn gây
bệnh, tạo ra bacteriocin và các chất kháng khuẩn khác. Đồng thời, chúng cũng kháng
với một số loại kháng sinh [18].
Năm 2011, Ngô Thị Phƣơng Dung và cộng sự đã nghiên cứu phân lập và tuyển chọn
vi khuẩn lactic có hoạt tính kháng khuẩn. Kết quả phân lập đƣợc 46 dòng vi khuẩn
lactic và đƣợc kiểm tra tính kháng khuẩn, 23 dịng biểu hiện tính kháng khuẩn chỉ thị
B .subtilis, trong đó 10 dịng có khả năng tổng hợp Bacterioxin. Dịng DC213A đƣợc
ghi nhận có tính kháng khuẩn Leuconostoc, dịng DC2113 thuộc giống Enterococcus
và bốn dòng DC213, DC213A, DC2132, DC2112D thuộc giống Lactobacillus [19].
Hiện nay có nhiều đề tài nghiên cứu về phân lập nấm men trên nhiều môi
trƣờng khác nhau nhƣ:
- Mai Đàm Linh, Kiều Hữu Ảnh, Đỗ Minh Phƣơng. Nghiên cứu tuyển chọn các
chủng nấm men Saccharomyces cevesae chịu cồn cao, có hiệu quả lên men tốt phù hợp
với điều kiện Việt Nam. Tap chí Khoa học, T.XX, N02AP. Tr.136-141. 2014.
- Ngơ Thị Phƣơng Dung, Lý Huỳnh Liên Hƣơng và Huỳnh Xuân Phong. Phân
lập, tuyển chọn nấm men và xác định điều kiện ảnh hưởng quy trình lên men rượu
vang dưa hấu. Tạp chí Khoa học 2011:18b 137-145. Đã kết luân từ 4 nguồn dƣa hấu
đã phân lập đƣợc 6 dòng nấm men thuần thuộc 2 giống Saccharomyces và
Schizosaccharomyces. So sánh khả năng lên men với 3 dịng nấm men sẵn có đã
chọn ra đƣợc dòng nấm men Saccharomyces cerevisiae thƣơng mại do Thái Lan sản
xuất cho hiệu suất lên men cao và giá trị cảm quan tốt. Quy trình lên men rƣợu vang

dƣa hấu đạt hiệu quả và chất lƣợng tốt khi lên men với mật số nấm men là 107 tế
bào/ml, hàm lƣợng đƣờng bổ sung đạt 30°Brix và thời gian lên men là 10 ngày ở
nhiệt độ 25°C.
- Lý Nguyễn Bình, Trần Văn Khánh, Hà Phƣơng Thảo và Nguyễn Văn Thành.
Phân lập và tuyển chọn nấm men có hoạt lực cao từ men rượu. Tạp ch Khoa học
Trƣờng Đại học Cần Thơ Phần B: Nông nghiệp, Thủy sản và Công nghệ Sinh học: 39
(2015): 18-28. Đã kết luận mỗi gam men rƣợu có chứa vài chục triệu đến vài trăm
triệu tế bào nấm men. Chúng gồm 2 giống là Endomycopis (chủ yếu là Endomycopis
fibuligenes) và Saccharomyces (chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae). Từ sáu loại
18


men phổ biến trên thị trƣờng qua quá trình phân lập đã tìm ra 17 dịng men khác
nhau.
2.4.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 2010, Sawan A.A và Maymouna M.O đã tiến hành phân lập và xác
định các vi khuẩn lactic từ mẫu sữa bò, phomat trắng và Rob ở Sudan. Kết quả
nghiên cứu có 52 chủng đƣợc phân lập từ mẫu sữa thô và phomat trắng. LAB phân
lập từ 3 mẫu sữa thuộc 3 chi Lactobacillus, Lactococcus (tên gọi trƣớc đây)
Streptococus và Pediococcus. Chi Lactobacillus chiếm ƣu thế trong tất cả các mẫu
thử nghiệm (69,23%) tiếp đến là chi Lactococcus (19,23%) và chi Pediococcus
(11,53%) [32].
Năm 2011, A. Mohankumar và N. Murugalatha đã tiến hành nghiên cứu đặc
tính kháng khuẩn và hoạt lực sản phẩm bacteriocin của Lactobacillus phân lập từ các
mẫu sữa thô của gia súc. Kết quả đã thu đƣợc 100 chủng Lactobacillus từ các mẫu
sữa khác nhau (50 từ sữa bò, 22 từ sữa trâu và 28 từ sữa dê) với các đặc tính điển
hình cụ thể là màu trắng, nhỏ (đƣờng kính 2-3 mm). Các chủng đƣợc chọn lọc, thuần
giống trên môi trƣờng MRS và sau đó đƣợc phân loại vào chi Lactobacillus dựa trên
đặc điểm hình thái và sinh hố. Qua q trình nghiên cứu đã kết luận Lactobacillus
lactis đƣợc tìm thấy phổ biến trong tất cả các sữa của gia súc trong đó Lactobacillus

casei, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus plantarum đã đƣợc tìm thấy trong sữa
bị. Lactobacillus delbrueckii là đƣợc tìm thấy trong sữa dê [33].
Năm 2013, Moussa M.E. Salem đã có nghiên cứu về đánh giá tiềm năng của
vi khuẩn Probiotic phân lập từ sữa mẹ. Các mẫu sữa tƣơi thu thập từ 30 bà mẹ khỏe
mạnh từ ngày thứ nhất đến ngày thứ 10 sau khi sinh. Từ những mẫu sữa đó, 250 vi
khuẩn sinh axit lactic đƣợc phân lập. Theo đặc điểm hình thái và sinh lý, các vi
khuẩn phân lập đƣợc xác định vào năm nhóm trực khuẩn (55,2%) và cầu khuẩn
(44,8%). Theo API50 CHL chủng L. rhamnosus đƣợc phân lập nhiều nhất (20,8%);
tiếp theo L. plantarum (13,2%) và L. casei và L. fermentum (mỗi chủng chiếm 8,8%)
và một tỷ lệ nhỏ các chủng L. acidophilus thuộc về chi Lactobacillus. Các dữ liệu
mới nhất có đƣợc xác nhận đáng kể sự hiện diện của Enterococci trong sữa mẹ. En.
faecium và En. faecalis đã đƣợc tìm thấy trong sữa mẹ. Các nhà nghiên cứu khác
phân lập đƣợc En.faecium, En. faecalis, L. lactis và S. thermophilus từ sữa mẹ [27].
Năm 2013, Rohit Sharma và cs đã nghiên cứu mô tả vi khuẩn sinh axit lactic từ các
mẫu sữa ngun liệu thơ của bị, dê, cừu, lạc đà, trâu từ đó mở ra các hƣớng phát
triển cho các sản phẩm từ axit lactic. Tổng cộng có 13 chủng với tỷ lệ phần trăm sản
xuất axit lactic cao đƣợc phân tích theo phƣơng pháp mơ tả của Bergey. Kết quả
19


nghiên cứu cho thấy các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ sữa dê có hiệu quả trong
sản xuất axit lactic do khả năng tích lũy và sản xuất axit nhanh chóng so với các mẫu
sữa ngun liệu từ bị, cừu, lạc đà và trâu. Do đó các vi sinh vật phân lập từ sữa dê có
thể đóng một vai trị quan trọng đối với các ngành cơng nghiệp sản xuất axit lactic
thƣơng mại do chúng sản xuất đƣợc các đồng phân nguyên chất của axit lactic [26].
Thế kỷ 20 đã chứng kiến một cuộc cách mạng lớn trong lĩnh vực cải
tiến công nghệ, đặc biệt trong công nghệ sinh học. Kỹ nghệ di truyền nhanh
chóng trở thành mũi nhọn trong lĩnh vực nghiên cứu nấm men, tạo ra nhiều
chủng, giống mới mang đặc tính ƣu việt. Một số thành công đã đƣợc ứng dụng
vào công nghệ sản xuất nhƣ:

Bằng phƣơng pháp đột biến, Malzahn, 1977 đã tuyển chọn đƣợc các chủng
nấm men bia có khả năng kết lắng cao.
Hockney và Frieman, 1980 cũng đã thu nhận đƣợc chùng nấm men bia
có
khả năng tạo cồn cao từ q trình phân lập các thể đột biến bởi EMS.
Sử dụng kỹ nghệ lai ghép gen cho phát triển các chủng giống nấm men công
nghiệp. Lewis và cộng sự, 1976, Russell, 1980 đã xác định đƣợc các gen điểu khiển
quá trình kết lắng của nấm men. Tƣơng tự nhƣ vậy, các gen (DEX, STA) mã hoá cho
sản xuất glucoamylase ngoại bào đã đƣợc xác định và gần đây nhất ngƣời ta đã tạo
đƣợc các chủng nấm men đa bào mang các gen điều khiển q trình đồng hố maltose
(MALT-6). Ngƣời ta cũng tạo nên một chủng nấm men mới có khả năng bền vững với
cycloheximid bằng phƣơng pháp đƣa vectơ trội này vào tế bào nấm men.
Quá trình lai ghép nấm men đã kích thích gen trội đơn Pl, làm tăng khả năng
bền vững đối với axit decarboxylat cinamic và điều này rất có ý nghĩa trong q trình
tạo hƣơng trong cơng nghệ sản xuất bia.
Bằng việc đƣa một đoạn gen endoglucanaza của Trichoderma recset vào gen
của nấm men đã kiến tạo đƣợc một chủng nấm men mới có hoạt tính phân giải βglucan cao, giúp cho q trình lọc thơ trở nên dễ dàng hơn và chống lại sự hình thành
kết tủa trong bia. Đồng thời, một chùng nấm men với hoạt tính xenlulaza cao cũng đã
đƣợc thu nhận từ việc chuyển một gen xenlulaza từ Trichoderma recset và
Saccharomyces.
Những nhà khoa học ở Nhật Bản cũng đã thành công trong việc nghiên cứu
chuyển gen α-axetolactat decacboxylaza từ chủng Enterobacteria aerogenes vào nấm
men để giảm sự tạo thành diaxetyl trong lên men bia và phân lập gen đồng hoá
đƣờng maltoza với tần số copy cao, chuyển vào chủng nấm men bia đã đƣợc ứng

20


dụng thành công trong lên men bia nồng độ đƣờng 24P và hiệu suất lên men tăng
30% [20].

Năm 2007, R.S. Rao, B. Bhadra và S. Shivaji thực hiện ngiên cứu Phân lập và
thử khả năng sản xuất ethanol của nấm men từ trái cây và vỏ trái cây. Tổng cộng có
374 chủng nấm men đƣợc phân lập từ nhiều thối trái cây và vỏ trái cây. Trong số này,
27 chủng nấm men có thể đồng hóa xylose và sản xuất 0Ỉ12-0Ỉ38 g ethanol mỗi
gram của xylose [34].
C. Maragatham và A. Panneerselvam vào năm 2011 đã nghiên cứu [35] Phân
lập, xác định và mô tả đặc điểm của nấm men rƣợu vang từ trái cây đu đủ thối để sản
xuất rƣợu vang. Họ đã phân lâp đƣợc 64 chủng tử 7 mẫu quả đu đủ và đã tìm ra đƣợc
1 chủng có khả năng lên men đƣợc 12% cồn. Ứng dụng vào sản xuất rƣợu vang.

21


CHƢƠNG 3. ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Đối tƣợng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu
3.1.1. Đối tượng nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn LAB và các chủng nấm men từ
tự nhiên
3.1.2. Dụng cụ, hóa chất, thiết bị nghiên cứu
Bảng 3.1. Dụng cụ, hóa chất và thiết bị sử dụng trong thí nghiệm
Nơi sản xuất

STT

Danh mục vật
tƣ, thiết bị

Nơi sản xuất

A
1

Danh mục vật tƣ,
thiết bị
Dụng cụ
Bình tam giác

Trung Quốc

5

Đũa cấy

Trung Quốc

2

Ống nghiệm

Trung Quốc

6

Giấy lọc

Trung Quốc

3

Pipet

Trung Quốc

7

Khay inox

Việt Nam

4

Đũa thủy tin

Trung Quốc

8

Bình xịt

Trung Quốc

B
1

Hóa chất
Trung Quốc

11

Xanh violet

Trung Quốc

Lugon

Trung Quốc

STT

Pepton

2

Cao thịt

Trung Quốc

12

3

Cao nấm men

Trung Quốc

13

Safranin

Trung Quốc

4

Glucose

Việt Nam

14

Dầu soi

Trung Quốc

5

Tween 80

Trung Quốc

15

NaCl

Trung Quốc

NaOH

Trung Quốc
Trung Quốc

6

CH3COONa

Trung Quốc

16

7

Triamonium citrate

Trung Quốc

17

HCl

8

MgSO4.7H2O

Trung Quốc

18

Phenolphtalein Trung Quốc

9

CaCO3

Việt Nam

19

Cồn

Việt Nam

Trung Quốc

Agar

Việt Nam

C
1

K2HPO4
Thiết bị
Nồi hấp thanh trùng

20

Trung Quốc

7

Cân phân tích

Trung Quốc

2

Tủ sấy

Trung Quốc

8

Máy đo pH

Trung Quốc

3

Tủ ấm

Trung Quốc

9

Kính hiển vi

Việt Nam

4

Box cấy

Trung Quốc

10

Máy UV - VIS Việt Nam

5

Máy ly tâm lạnh

Trung Quốc

11

Tủ lạnh

Việt Nam

6

Máy lắc

Trung Quốc

12

Bể ổn nhiệt

Việt Nam

10

22


3.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu: Tại Phịng thí nghiệm Cơng nghệ vi sinh và Phịng thí
nghiệm Cơng nghệ lên men – Khoa Cơng nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm –
Trƣờng Đại học Nông Lâm Thái Nguyên.
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 01/2016 đến tháng 01/2017
3.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phân lập và tuyển chọn chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính cao từ các
nguồn tự nhiên;
Nội dung 2: Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có khả năng tăng sinh khối
mạnh nhất từ các nguồn tự nhiên;
Nội dung 3: Định danh các chủng vi sinh vật đã tuyển chọn;
Nội dung 4: Nghiên cứu điều kiện để tổ hợp chủng vi khuẩn lactic và nấm men đã
tuyển chọn;
Nội dung 5: Nghiên cứu sử dụng chất mang và các điều kiện bảo quản.
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1.Phương pháp nuôi cấy, phân lập
3.3.1.1. Phương pháp phân lập vi khuẩn LAB
Mẫu sữa sau khi thu nhận hút 100µl dịch cấy dàn đều trên môi truờng MRS
thạch trong đĩa petri đã chuẩn bị, môi trƣờng có bổ sung 2% CaCO3. Ni cấy trong
tủ ấm 30oC, 48 giờ.
Kiểm tra sự xuất hiện các khuẩn lạc trên đĩa petri, tách và thuần khiết các
khuẩn lạc có màu sắc trắng đục, trắng sữa, bìa nguyên hoặc chia thuỳ và có vịng
trong suốt xung quanh (acid phân giải CaCO3 tạo vòng trong). Nhận dạng khuẩn lạc
bằng các đặc điểm hình thái tế bào, nhuộm Gram, phản ứng catalase. Nếu là vi khuẩn
lactic thì cấy chuyển sang đĩa petri mới bằng phƣơng pháp cấy ria để thuần giống.

Khi đã thuần giống, ta cấy giữ giống trong môi trƣờng MRS ống thạch nghiêng hoặc
mơi trƣờng MRS lỏng có bổ sung 30% glycerol và bảo quản ở 4oC [21].
3.3.1.2. Phương pháp phân lập nấm men
- Từ các nguyên liệu là các mẫu quả sạch thu thập đƣợc, tiến hành phân lập
nấm men tổng số.

23


- Hút 1ml dịch rửa quả, pha loãng trong 9ml nƣớc vơ trùng. Sau đó pha lỗng
đến 10-4, 10-5,.........
- Hút 100µl dịch để cấy mẫu trên đĩa thạch petri theo các bƣớc sau:
Phân lập và tuyển chọn nấm men trên môi trƣờng hộp petri đặc.
Nguyên tắc: Tách rời các tế bào vi sinh vạt (VSV), nuôi cấy các tế bào trong
môi trƣờng dinh dƣỡng đặc trƣng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
+ Chuẩn bị mơi trƣờng:
Cân chính xác riêng biệt từng thành phần hóa chất của mơi trƣờng nuôi cấy
theo hàm lƣợng đã xác định. Chuẩn bị hai bình tam giác loại 500ml, một bình cho
riêng agar, bình cịn lại cho các hóa chất cịn lại rồi cho nƣớc cất vơ trùng vào từng
bình (đảm bảo khi đổ hai bình vào nhau thì vừa đủ số ml môi trƣờng yêu cầu) [22].
Dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho đến khi agar và các hóa chất tan hết sau đó
đổ hai bình vào với nhau, đem đun trong lị vi song đến sơi thì đem đi kiểm tra pH,
điều chỉnh cho pH = 5 [22].
Sau khi chuẩn pH xong ta đem đi thanh trùng ở nhiệt độ 1210C, trong 30 phút.
Chuẩn bị đĩa petri để đổ môi trƣờng: Rửa sạch, sấy khơ, úp nắp, gói giấy báo, cho
vào túi nilon rồi đem hấp thanh trùng ở 1210C trong vịng 30 phút. Sau khi hấp xong,
đem ra sấy khơ ở nhiệt độ 700C trong 120 phút rồi cất vào tủ ấm dùng dần.
Sau khi hấp xong môi trƣờng tiến hành đổ môi trƣờng sang đĩa petri sạch đã
chuẩn bị sẵn. Quá trình này đƣợc diễn ra trong tủ cấy vơ trùng để đảm bảo khơng có
vi sinh vật tạp nhiễm vào môi trƣờng.

Mỗi hộp petri đổ từ 15 - 20ml môi trƣờng, sau khi đổ xong để mở nắp trong tủ
cấy và bật đèn UV trong 15 phút. Bƣớc này giúp cho môi trƣờng không bị nhiễm vi
sinh vật ngoại lai và tránh đƣợc nƣớc đọng trên nắp hộp petri.
Sau 15 phút bật UV thì thạch đã đơng lại, ta tiến hành gói đĩa petri vào trong
giấy báo và đem để trong tủ ấm 12 giờ để kiểm tra độ vơ trùng. Lƣu ý khi gói đĩa
petri nên để ngƣợc hộp xuống để tránh những giọt nƣớc còn đọng lại rơi vào môi
trƣờng.
Khi đã để và thấy không bị nhiễm thì lấy mơi trƣờng đó ra cấy mẫu cần phân lập.
+ Chuẩn bị mẫu và tiến hành cấy mẫu

24