SEMINAR phân tích saccharide trong tỏi đen và hoạt tính chống oxi hóa của nó (dược PHÂN TÍCH SLIDE)

Chủ đề: PHÂN TÍCH

SACCHARIDE TRONG TỎI
ĐEN VÀ HOẠT TÍNH
CHỐNG OXI HÓA CỦA NÓ


TĨM TẮT
• Tỏi thường: nhiệt độ 700C800C/10-15 ngày (khơng xử lí
nhân tạo hay chất phụ gia)tỏi
đen
• Thu dẫn xuất ethanol từ tỏi
đen
• Đường saccharide của chiết
xuất xác định theo PP đo màu
fenol sulfate, DNS và HPLC.
• Khả năng chống oxi hóa được
đánh giá bằng cách đo các hoạt
động tìm kiếm trên 1,1-difenyl2-Picrylhydrazyl (DPPH).


- Ruồi giấm(Drosophila melanogaster):tuổi thọ và chỉ
số chống oxi hóa
* Kết quả:
-Hàm lượng đường: 55,5% (monosaccharide,
disaccharide và polysaccharide), lượng đường khử là
25,22%.
 Chiết xuất từ tỏi đen:
 Khả năng chống oxi hóa mạnh
 Tuổi thọ của ruồi giấm kéo dài
 Lượng MDA giảm

GIỚI THIỆU
-Tỏi:gia vị, thành phần món ăn và thuốc cổ truyền điều
trị và ngăn ngừa bệnh, tỏi đen mềm, chua, và ngọt giống
trái cây.
-Gây độc (liều cao)
-Tỏi đen được sản suất bằng cách lên men tự nhiên tỏi
thông thường (to, độ ẩm cao) trong vài ngày
- Tỏi đen có hàm lượng polyphenol tăng gấp 7 lần, acid
amin tăng gấp 2,5 lần, carbohydrate tăng 28,7-40%,
lượng SAC là gấp 8 lần.


- Hoạt động sinh học: chống oxi hóa, chống ung thư, hạ
đường huyết , hạ lipid máu, tính kháng viêm, bảo vệ gan
và các hoạt động miễn dịch, tìm kiếm các gốc tự do cao
hơn so với tỏi tươi.
- Ruồi giấm: mẫu kiểm tra hiệu quả chống oxy hóa( tuổi
thọ ngắn và bộ gen hồn chỉnh)
Mục đích:
• Kiểm tra thành phần hóa học của chiết xuất ethanol trong
tỏi đen
• Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa
• Tác động của các chất chiết xuất từ tỏi đen đối với tuổi
thọ của ruồi giấm.


Vật liệu và phương pháp
Vật liệu

-Tỏi, bột ngô, bột nấm men
-Ethanol,phenol, glucosum anhydricum và thạch
-1,1-Diphenyl-2-Picrilhydrazyl (DPPH), ascorbic acid (Vc)
và T-series tiêu chuẩn dextran
-Thuốc thử Sigma (St. Lous, MO, U.S.A.).
-Superoxide Dismutase (SOD) khảo nghiệm
-Bộ khảo nghiệm Catalase(CAT)
-Bộ khảo nghiệm Malondialdehyde (MDA)
-Commassie xanh nhuộm KIT


Chuẩn bị chiết xuất tỏi đen
Cắt, nghiền 100g tỏi đen sạchtrộn ethanol 80%
(tỉ lệ 1:3)
Chiết ethanol 3 lần/24h
Ly tâm, lọc và bốc hơi dung môichiết xuất ethanol từ
tỏi đen


Mơi trường và động vật thí nghiệm
ĐVTN: ruồi giấm đen hoang dã. Lị ấp sinh hóa: độ ẩm
tương đối (55±5)%, nhiêt độ(25±0,5)0C,chu kì chiếu
sáng:12h
Thức ăn: đun sơi ngơ72g+ glucosum anhydricum+6g
thạch+750ml nước+40ml ethyl p-hydroxybenzoate 1%
trong ethanol 75% thêm 10g bột nấm men rồi giữ cho
nấm men sống
Cho 8ml/ống nghiệm+ chiết xuất từ tỏi đen với nồng độ
lần lượt là: 18,5; 37,5 và 75mg/ml

Xác định tổng hàm lượng đường
Theo phương pháp đo màu phenol sulfate
1ml chiết xuất vào pitpet+1ml nước+1ml
phenol 6%+5ml H2SO4 đ đo ở 490nmlăc nhẹ,
để yên 20p(T0 phòng)
Chỗ trống thay bằng nước cất có V bằng V dd
chiết xuất
PT: y = 0.080x - 0.063, R = 0.999


Xác định hàm lượng đường khử
Theo phương pháp DNS
Sử dụng Fructose: đường chuẩn
Thuốc thử DNS cho vào huyết thanh có fructoselắc
đềulàm nóng 7plàm lạnh nhanh bằng nước ghi
nhận KQ ở 540nm
PT: y = 2.877x - 0.046, R = 0.999


Phép đo phân phối trọng lượng phân tử
carbohydrate
Phương pháp GPC của hệ thống HPLC máy dị tìm chỉ sỗ
khúc xạ 10A
Các dữ liệu phân tích đánh giá bởi hệ thống xử lí Shimadzu
LC solution 1.26 SP1
Cột gel: pha động(nước cất), nhiệt độ cột (300C), áp lực
cột( 3.0 MPa), tốc độ dịng chảy( 0.8ml/phút), khối lượng
tiêm( 20ml)
Kiểm tra đường kính cột: tiêu chuẩn Tdextra

PT: Y = -0.0723 X3 + 2.0859 X2 - 20.225 X + 68.868
(r = 0.9996)


Phép đo DPPH căn bản
Phương pháp của Blois
Chiết xuất hòa tan trong 0,1ml nước vào một loạt dung dịch
mẫu có nồng độ khác nhau thêm 1ml ethanol DPPHđể yên
370/60p
Hấp thu:517nm
Chỗ trống: Vc thay nước cất
• Hoạt động tìm kiếm gốc tự do của DPPH đã được tính tốn
bằng cách sử dụng phương trình sau:
• [DPPH·] hoạt động tìm kiếm(%) = (Achỗ trống – Amẫu) /Achỗ
trống×100


Khảo sát tuổi thọ
Ruồi đực 2 ngày tuổi-4 nhóm ngẫu nhiên(1 đối chứng-3
thực nghiệm)
20 ruồi/ống; 10 ống/ nhóm
Số lượng ruồi chết biết được là đếm lượng ruồi sống
sót khi chuyển đến môi trường mới dưới ánh sáng gây
mê ni tơ công nghiệp 3 ngày 1 lần cho đến khi tất cả các
con ruồi chết
Gía trị trung bình, số liệu tuổi thọ tối đa và thời gian
chết mội nữa: ghi nhận lần lượt


Xác định CAT, hoạt động SOD và lượng

MDA trên ruồi giấm
Ruồi đực 2 ngày tuổi: 1đối chứng-3 thực nghiệm
25 ruồi/ống; 10 ống/ nhóm
Nhóm khác nhau ni bằng mơi trường khác nhau
trong 30 ngày
Loại bỏ mơi trườngruồi đói trong 2hghi nhận cân
nặng trong trạng thái mê man
Đồng nhất ruồi trong nước muối sinh lí lạnhpha lỗng
2%loại bỏ phần nổily tâm 350rpm/10p ở 40C
So sánh với mẫu đối chứng


KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Hàm lượng đường từ chiết xuất tỏi đen
Trong q trình lão hóa hàm lượng carbohydrat
có sự thay đổi từ 28,7 lên 47,0%
Kết quả từ thí nghiệm:
•Hàm lượng đường là 55% gồm sucrose,
glucose và fructose.
•Hàm lượng đường khử là 25,22%
Hàm lượng đường khử chiếm tỉ lệ cao trong
tổng hàm lượng đường.


Kết quả từ HPLC trong các phép đo phân
phối trọng lượng phân tử carbohydrate


Hoạt động khử gốc tự do DPPH
• Khảo nghiệm Hoạt động khử gốc tự do DPPH là một

trong những cách đơn giản và cách hiệu quả để đánh
giá hoạt động chống oxy hóa trong phịng thí nghiệm
(MacDonald-Wicks et al., 2006). 
• Kiểm tra khả năng cho điện tử của chiết xuất tỏi
đen sự đổi màu của dung dịch DPPH tại bước sóng
517nm


• hoạt động khử gốc tự do
ở nồng độ 0,3125
mg/mL thấp hơn so với
Vc
• ở nồng độ 10mg / ml,
chiết xuất từ tỏi đen
tăng khả năng khử gốc
tự do gần bằng Vc
==>chiết xuất từ tỏi đen
có hoạt động mạnh mẽ
khử gốc tự do DPPH
trong một liều lượng
nhất định.


Tác dụng của chiết xuất từ tỏi đen
trên tuổi thọ ở ruồi giấm
Nhóm

Nồng độ Thời gian chết
chiết xuất một nữa

Tuổi thọ trung
bình

Tuổi thọ tối đa

Nhóm đối chứng

0

43.75±1.16

47.53±2.03

79.40±2.07

nhóm thực nghiệm

18.75

44.82±1.55

49.06±2.82

80.85±1.91

37.5

47.97±1.95**

51.16±2.57*

81.56±1.77

75

49.66±1.45**

51.50±2.18*

82.02±1.92*

*Chỉ ra sự khác biệt đáng kể với p < 0,05 so sánh với nhóm chứng
**Chỉ ra sự khác biệt đáng kể với p < 0,01 độ so sánh với nhóm chứng


KẾT QUẢ
Thời gian chết một nữa của các nhóm sử dụng chiết
xuất tỏi đen: kéo dài đáng kể so với nhóm đối chứng
Tuổi thọ trung bình và tuổi thọ tối đa của ruồi sử dụng
chiết xuất từ tỏi đen được mở rộng
Tăng nồng độ cao chiết xuất từ tỏi đen đã được quan
sát trong ba thử nghiệm đó là một cách phụ thuộc vào
liều.


Tác dụng của chiết xuất tỏi đen trên hoạt
động SOD ở ruồi giấm
Superoxide dismutase(SOD) là enzyme chống oxi hóa,
phân bố rộng trên nhiều SV
SOD đóng vai trị quan trọng trong bảo vệ và cải thiện

bệnh
SOD: trong tế bào có 2 hình thức: CuZn-SOD và
Mn-SOD


Tác dụng tỏi đen trên SOD ở ruồi giấm bảng 2

+ So với nhóm đối chứng, nhóm thực nghiệm thực hiện các
hoạt động cao hơn trong hai hình thức của SOD.
=> hoạt động SOD trên ruồi giấm Drosophila melanogaster
được tăng cường bằng tỏi đen.
+ T-SOD, CuZn-SOD và hoạt động Mn SOD được cải thiện,
nồng độ tỏi đen tăng phụ thuộc vào liều và ảnh hưởng đến
hoạt động SOD.


Ảnh hưởng của tỏi đen trong hoạt động CAT và
hàm lượng MDA trên ruồi
Catalase(CAT):enzyme trong hệ thống phòng thủ, được sản xuất
trong peroxisome và xúc tác phân hủy H202 thành H20 và O2
Ức chế tạo chất độc hại phát sinh từ phản ứng H202 với chất
thuộc nhóm sắtbảo vệ tế bào khỏi nhiễm độc
Malonaldehyde là một trong những sản phẩm cuối cùng trong
peroxid hóa màng tế bào lipid, phản ánh mức độ peroxy màng tế
bào gián tiếp
Xác định hàm lượng MDA thường kèm đo hoạt động SOD, hàm
lượng MDA và hoạt động SOD phản ánh mức độ của các tế bào
bị tấn công bởi các gốc tự do và khả năng làm sạch gốc oxy tự do
trong cơ thể

Tác dụng của tỏi đen trên hoạt động CAT và hàm lượng
MDA trên ruồi giấm được thể hiện trong Bảng 3.

Kết quả: hoạt động CAT của nhóm thực nghiệm tăng rõ
rệt so với nhóm đối chứng.
Hàm lượng MDA trên ruồi giấm giảm rõ ràng khi tăng
nồng độ của tỏi đen (sự khác biệt có ý nghĩa với p <
0,05)


KẾT LUẬN
Kết quả thực nghiệm tổng hàm lượng đường trong các
chất chiết xuất tỏi đen 55,5%, lượng đường khử 25,22%.
Trong thử nghiệm chất chống oxy hóa, chiết xuất tỏi đen
có khả năng phân hủy gốc tự do, phụ thuộc vào liều, làm
kéo dài tuổi thọ của ruồi giấm cách rõ rệt, các hoạt động
SOD và CAT cũng được cải thiện.
Nồng độ của chiết xuất tỏi đen tăng hàm lượng MDA
giảm, chiết suất tỏi đen có thể kéo dài tuổi thọ của ruồi
giấm qua SOD, kích hoạt CAT và ức chế sản xuất MDA.