SEMINAR khảo sát tồn dư kháng sinh oxytetracycline trong thịt nhập khẩu bằng phương pháp HPLC (dược PHÂN TÍCH SLIDE)

Chuyên đề:

Khảo sát tồn dư kháng sinh Oxytetracycline trong thịt nhập khẩu bằng
phương pháp sắc ký lỏng cao áp


Nội dung

Đặt vấn đề

Đối tượng
và phương
pháp

Tính tốn
kết quả

Kết luận


Đặt vấn đề


Tình hình sử dụng kháng sinh trên thế giới và Việt Nam
Châu Âu đã sử dụng 35% (4700 tấn) tổng lượng kháng sinh
đăng ký trong chăn ni; 65% cịn lại sử dụng cho người (8500
tấn). Trong số kháng sinh dùng trong chăn ni có 3900 tấn
(chiếm 29%) được dùng để điều trị bệnh động vật; 786 tấn (6%)
trộn vào thức ăn kích thích tăng trưởng
Ở Mỹ, hàng năm có 6 triệu pounds (2730 tấn) kháng sinh được
dùng trong chăn nuôi,năm 1999 là khoảng 20,42 triệu pounds

(9270 tấn), trong đó Tetracycline chiếm 15,67%, lượng kháng
sinh này dùng để kích thích tăng trưởng
Ở Việt Nam (năm 2007) 100% các cơ sở chăn ni có sử dụng
kháng sinh Oxytetracycline, 67% các cơ sở chăn ni có sử
dụng Chloramphenicol, 30% sử dụng Olaquindox và 77% các
cơ sở chăn ni có sử dụng Dexamethasol. Khơng ngưng thuốc
theo đúng quy định, thậm chí bán chạy khi điều trị thấy không
hiệu quả.


Tình hình sử dụng kháng sinh trên thế giới và Việt Nam


Đối tượng và phương pháp
1.

Đối tượng:

Thịt nhập khẩu trước khi đưa vào tiêu thụ từ cảng hàng
không Tân Sơn Nhất và cảng Sài Gịn
KS. Oxytetracycline
CTPT: C22H24N2O9
Tính chất lý hóa: tồn tại ở 2 dạng
 Dạng bazơ: ít tan trong nước, tan trong alcohol và dung môi
hữu cơ
 Dạng muối hydrochloride tan trong nước nhiều hơn
Cả hai dạng Oxytetracycline đều mất hoạt tính nhanh trong mơi
trường kiềm và các dung dịch có pH <2

Đối tượng và phương pháp
• Oxytetracycline là một loại kháng sinh phổ rộng có nguồn gốc từ
mơi trường ni cấy nấm Streptomyces rimosus
• Việc lạm dụng quá mức kháng sinh này để phòng bệnh cho thú
bằng cách bổ sung vào thức ăn hay thời gian ngưng thuốc để đi
vào giết mổ còn sớm sẽ gây nên tồn dư kháng sinh trong thịt
• Kháng sinh tồn dư tích tụ lâu ngày sẽ ảnh hưởng những cơ quan
quan trọng của cơ thể (thần kinh, tuần hoàn,…) giảm sức sống và
phát triển xương, răng, giảm miễn dịch của cơ thể
• Thời gian ngưng thuốc
Viên Oxytetracycline (500mg) uống: 7 ngày đối với trâu bò thịt
Dung dịch tiêm Oxytetracycline: 15-22 ngày đối với trâu bò, 20-26
ngày đối với heo và 5 ngày đối với gia cầm


Đối tượng và phương pháp
2.
•  Phương pháp
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Hệ
thống HPLC của hãng Agilent gồm: hệ thống bơm
mẫu tự động, cột phân tích sắc ký lỏng pha đảo RP
C18 (125mm 5 4,6 mm), detector UV, buồng ổn
nhiệt sắc ký, bình chứa dung mơi, hệ thống máy vi
tính và phần mềm sắc ký
Quy định về dư lượng kháng sinh họ tetracycline
trong thịt theo Bộ Y tế


Dụng cụ và thiết bị
• Hệ thống HPLC gồm: hệ thống bơm mẫu tự động, cột phân tích sắc ký

lỏng pha đảo RP C18 (125mm x 5µm x4,6 mm), detector UV, buồng ổn
nhiệt sắc ký, bình chứa đựng mơi trường, hệ thống máy vi tính và phần
mềm sắc ký.
• Cân phân tích Mettler toledo (MODEL: AL204) có độ chính xác 0,0001g.
• Máy đồng nhất mẫu T25 Basic của hãng IKA
• Máy lắc bằng tốc độ cao Orbital Shaker SO3 của hãng Stuart Scientific.
• Máy ly tâm Rotina 35R của hãng Hettich Zentrifugen.
• Máy khuấy Vortex.
• Máy đo pH
• Máy rửa siêu âm Branson 5210
• Bình định mức 10, 20,100, 500,… (ml)
ã Mng lc whatman
ã Pipet 100àl
Húa cht :Oxytetracycline chun; methanol; oxalic acid dehydrate;
acetone nitrile (ACN); Na2HPO4 khan; acid citric monohydrate; HCl 0,1M;
EDTA; nước cất 2 lần,…


Đối tượng và phương pháp
Điều kiện quy trình phân tích
• Bảo quản mẫu thử sao cho không bị giảm chất lượng
và thay đổi thành phần (Mẫu thử là thịt thi cần tối
thiểu 1kg sản phẩm).
• Điều kiện tiến hành sắc ký:
• Đầu dị UV phát hiện ở bước sóng 350nm.
• Ct RP C18 (125mm x 5àm x 4,6mm).
ã Pha ng gồm dung dịch acetone nitrile, dung dịch
acid oxalic 0,01M và dung dịch methanol với tỉ lệ
tương ứng: 11%: 82%: 7%.
• Tốc độ dòng 1ml/phút.

Quy trình thực hiện
Dung dịch chuẩn Oxytetracycline


Quy trình thực hiện
Dung dịch rửa giải
Cân 0,126g oxalic acid dihydrate, sau đó hịa tan trong
100ml methanol, trộn đều
Pha dãy chuẩn có nồng độ lần lượt là: 0,025 – 0,05
– 0,1 – 0,25 – 0,5 ppm
Dung dịch đệm Mcllvaine- EDTA
•Mcllvaine pH 4,0 ± 0,05
•Mcllvaine- EDTA 0,1M
Xử lý mẫu thịt bằng cột chiết SPE


Quy trình thực hiện


Chuẩn
SPE

Quy trình thực hiện
bị

cột

Quy trình thực hiện
Chuẩn bị pha động
Chuẩn bị trên máy HPLC
Gắn cột sắc ký pha đảo RPI8e vào hệ thống HPLC, cho các
lọ nhỏ đựng chuẩn vào khay, bật máy sắc ký và máy vi tính. Kết
nối máy vi tính và máy HPLC, bật bơm đuổi khí trong các dây
dẫn dung môi, hay máy để rửa cột bằng nước, sau đó chạy với
pha động (dung dịch oxalic, acetone nitrile và methanol), kiểm
tra tính ổn định của đường nền.


Tiến hành phân tích trên máy
Hệ thống HPLC
•Được sử dụng rộng rãi trong phịng thí nghiệm.
Dùng một pha chất lỏng để phân tích các thành
phần mẫu
Gồm có
•Nguồn cấp pha động
•Hệ thống bơm
•Hệ thống bơm mẫu
•Cột sắc ký lỏng
•Đầu dị



Tiến hành phân tích trên máy
Xây dựng đường chuẩn Oxytetracycline
•Bơm lần lượt 5 chuẩn oxytetracycline vào máy HPLC
với các nồng độ 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 ppm.
•TR= 7,882 phút (±0,1).

Xác định kháng sinh oxytetracycline trong mẫu thịt
Bơm mẫu vào máy HPLC→ sắc ký đồ hiển thị trên màn
hình với TR = 7,882 phút( nếu có) → tính diện tích trung
bình /peak → nồng độ kháng sinh tồn dư trong 10g mẫu
thịt


Lập đường chuẩn
• Đường chuẩn Oxytetracycline được xây dựng dựa vào các
điểm chuẩn với các nồng độ: 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5 ppm
• Ứng với mỗi mức nồng độ ta được một diện tích peak (S).
Sau đó xây dựng phương trình đường chuẩn
• PT đường chuẩn y = 114,62x – 0,5244, R2 = 0,9999


Sắc kí đồ của mẫu khơng và có chứa kháng sinh


Cụng thc tớnh toỏn
ã

Cc =

(àg/ml)

Cks = Cc ì ì (µg/kg hay ppb)


LOD và LOQ
• Bằng cách chuẩn bị một dung dịch chất chuẩn trong

một dung môi tinh khiết ( mẫu trắng) và bơm vào
máy với một thể tích xác định V(µl). Lấy sắc ký đồ
và đo S/N
• LOD được chấp nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu
lơn gấp 3 lần nhiễu đường nền(S/N =3).LOD của
phương pháp là 60 ppb
• LOQ được chấp nhận ở nồng độ mà tại đó tín hiệu
lớn gấp 10 lần nhiễu đường nền (S/N =10).LOQ của
phương pháp là 200ppb


Hiệu suất thu hồi
• Sử dụng mẫu trắng

R% = (Ctt / Cc) × 100
Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
Ctt : Nồng độ chất phân tích trong mẫu
trắng thêm chuẩn


Kết Luận
• Phương trình đường chuẩn Oxytetracycline y = 114,62x –
0,5244 và hệ số tương quan tuyến tính khá tốt (R2 = 0,999),
có thể dùng để tính tốn hàm lượng Oxytetracycline cho một
đối tượng cụ thể.
• Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là 60ppb rất có
ý nghĩa.
• Điều kiện sắc kí có thể áp dụng là: Đầu dị UV 350nm; Cột
sắc kí pha đảo RP C18; Pha động (ACN: A.oxalic 0,01M :
MeOH) : (11%: 82%: 7%); Tốc độ dịng: 1ml/phút. Thể tích

bơm mẫu: 60µl. Thời gian lưu TR = 7,882 phút. Thời gian
chạy một mẫu là 12 phút. Nhiệt độ phòng (20 – 250 C).


Tài liệu tham khảo
•

Khóa luận tốt nghiệp “Khảo sát sự tồn dư kháng sinh
Oxytetracycline trong thịt nhập khẩu bằng phương pháp HPLC” tủ
sách thư viện đại học Nơng Lâm

•

Website: Cục chăn nuôi và Viện Chăn Nuôi Việt Nam
http://
text.123doc.org/document/3174954-danh-gia-tinh-hinh-su-dung-khangsinh-trong-chan-nuoi-lon-va-ton-du-khang-sinh-trong-thit-lon-ban-t
ren-thi-truong-ha-noi.htm
http://
text.123doc.org/document/3174954-danh-gia-tinh-hinh-su-dung-khangsinh-trong-chan-nuoi-lon-va-ton-du-khang-sinh-trong-thit-lon-ban-t
ren-thi-truong-ha-noi.htm