BÀO cáo (dược PHÂN TÍCH) xác định hàm lượng ure trong nước mắm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y

Chủ đề :XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG URE TRONG
NƯỚC MẮM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ
LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Giáo viên hướng dẫn:

Danh sách sinh viên thực hiện:

TP. HCM - Tháng 5 năm


Dược phân tích

Nhóm

MỤC LỤC
I. ĐẶT VẤN ĐỀ....................................................................................................................................................3
1. Đặt vấn đề................................................................................................................................................3
2. Tình hình nhiễm urea trong nước nắm ở Việt Nam...............................................................................3
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............................................................................................4
1. Đối tượng: Urê trong nước mắm............................................................................................................4
2. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................................................4
2.1. Tính chất hóa học, hóa lý của Ure..................................................................................................4
2.2. Sơ lược về phương pháp xác định urea trong nước mắm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao..................................................................................................................................................5
2.3. Dụng cụ, thiết bị, hóa chất..............................................................................................................6
2.4. Điều kiện quy trình và q trình thực hiện..................................................................................10
III. TÍNH TOÁN KẾT QUẢ.................................................................................................................................14
1. Kết quả khảo sát thành phần qua động, chương trình chạy gradient để tách N-9H-xanthen-9-ylurea

....................................................................................................................................................................14
2. Kết quả khảo sát và định danh phức N-9H-xanthen-9-ylurea..............................................................15
3. Kết quả khảo sát điều kiện phản ứng tạo dẫn xuất..............................................................................16
4. Kết quả khảo sát bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu cho đầu do huỳnh quang........18
5. Kết quả khảo sát thời gian phản ứng giữa xanthydrol với ure và độ bền của phức N-9H-xanthen-9ylurea.........................................................................................................................................................19
5.1. Khảo sát thời gian phản ứng giữa xanthydrol với ure..................................................................19
5.2. Khảo sát độ bền của phức N-9H-xanthen-9-ylurea......................................................................20
6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của biuret và biure.................................................................................21
7. Kết qủa khảo sát khoảng tuyến tính của đường chuẩn.......................................................................23
8. Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp......................................................................................25
9. Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp...............................................25
10. Kết quả khảo sát qui trình chuẩn bị mẫu và hiệu suất thu hồi trên mẫu nước mắm có thêm ure khi
sử dụng chất khử tạp................................................................................................................................26
10.1. Kết quả khảo sát qui trình chuẩn bị mẫu khi sử dụng chất khử tạp..........................................26
10.2. Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi.............................................................................................27
11. Cơng thức tính nồng độ ure có trong mẫu.........................................................................................28
IV. KẾT LUẬN....................................................................................................................................................28
2


Dược phân tích

Nhóm

V. TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................................................................29

I. ĐẶT VẤN ĐỀ
1.

Đặt vấn đề

Thực phẩm là yếu tố quan trọng song hành với sự sinh tồn của lồi người. Theo q trình
tiến hố và phát triển của lồi người, thực phẩm cũng được phát triển theo, cùng với sự
tiến triển của khoa học công nghệ, công nghệ chế biến thực phẩm cũng phát triển.
Nhu cầu về một thực phẩm đáp ứng không những về dinh dưỡng mà cịn về tính an tồn
và không gây hại cho sức khỏe đối với người tiêu dùng là cần thiết. Nguy cơ ảnh hưởng
đến sức khỏe từ những thực phẩm không an toản đang là mối lo lớn của mỗi người dân
và tồn xã hội. Vì vậy mà các kỹ thuật đánh giá mối nguy hại của một thực phẩm đối với
sức khỏe cũng đòi hỏi phải phát triển để bắt kịp với công nghệ chế biến thức ăn ngày
càng cao và đa dạng, nhằm phát hiện và loại trừ bớt những nguy cơ tác hại đến cơ thể
người tiêu dùng.
Nước nắm là một loại thực phẩm được sử dụng phổ biến ở nước ta, là loại gia vị thường
xuyên hiện diện trong các bữa ăn của người Việt. Việc xác đinh hàm lượng urea có trong
nước mắn cũng là một vấn đề được người tiêu dùng quan tâm.
2.

Tình hình nhiễm urea trong nước nắm ở Việt Nam

Theo chemical codex đề nghị mức cho phép urea trong nước mắm là 50mg/l
Theo một kết quả nghiên cứu của Viện Pasteur Nha Trang công bố, trong 45 mẫu nước
mắm chọn ngẫu nhiên trên thị trường Khánh Hịa thì mẫu có Hàm lượng urea lớn hơn
0,1g/l, có mẫu lên đến 2,1g/l. Trong khi đó, urea hồn tồn khơng có trong danh mục các
chất phụ gia thực phẩm do bộ Y tế ban hành.

3


Dược phân tích

Nhóm

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1.

Đối tượng: Urê trong nước mắm

2.

Phương pháp nghiên cứu

2.1.

Tính chất hóa học, hóa lý của Ure

Urea được Hilaire Rouelle phát hiện vào năm 1773

Cơng thức hóa học

2.1.1.
2.1.2.
-

Tính chất hóa học của Ure
Dạng tinh thể hoặc bột màu trắng
Phân tử lượng: 60,1
Khối lượng riêng: 1,34g/cm3
Nhiệt độ nóng chảy: 132-1350C
pH (dung dich 10%): 7,2
Nguồn gốc sự hình thành urea trong nước mắm
Có sẵn trong một số loại cá, ví dụ như cá Nhám có chứa urea trên da

Do người bắt cá thêm vào để ướp cá
Do người chế biến nước mắm thêm vào để tăng độ đạm của sản phẩm
Có thể hình thành một cách tự nhiên trong quá trình chế biến nước mắm

4


Dược phân tích
2.1.3.

Nhóm

Sự bài thải và độc tính của urea

2.1.3.1.

Sự bài thải của urea

Trong cơ thể urea được chuyển hóa ở gan dưới sự điều khiển của N-acetylglutamat, sau
đó chúng theo máu đến thận và đào thải ra ngồi thơng qua nước tiểu.
Nồng độ urea trong máu là 16-54 mg/ml đối với nam và 12-47mg/ml đối với nữ.
2.1.3.2.

Độc tính của urea

Người sản xuất cho urea (chủ yếu ở dạng phân đạm) vào để ướp cá hoặc để tăng độ đạm
có 2 gốc rất độc đối với cơ thể người là ammonium ( NH4+) và nitrate (NO3).
-

NH4+ trong máu tăng cao, làm giảm pH máu, ngăn cản quá trình vận chuyển oxy,

làm rối loạn các phản ứng sinh hóa trong cơ thể, da và niêm mạc bị tím lại, có thể

-

dẫn đến hơn mê, chết.
Nitrate khi đến ruột thì chuyển hóa thành nitrite (NO 2-) gây Methaemoglobinemia,
do nitrite kết hợp với hemoglobin oxy hóa Fe2+ thành Fe3+, ngăn cản sự vận chuyển
oxy, dẫn đến có những biểu hiện như nơn ói, chống váng, chóng mặt, tay chân

-

bủn rủn, tím tái, có thể gây rối loạn thần kinh, đau nhức.
Nếu lượng urea quá mức có thể gây giảm hoạt động của tuyến giáp, rối loạn máu
các tính, rối loạn thần kinh, nếu kéo dài có thể làm da chuyển sang màu xám.

2.2.

Sơ lược về phương pháp xác định urea trong nước mắm bằng phương pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao.

2.2.1.

Nguyên lý của phương pháp sắc khí lỏng hiệu năng cao- đầu dị huỳnh quang
để xác định urea

Cho urea tạo dẫn xuất với thuốc thử xanthydrol tạo thành hợp chất N-9H-xanthen-9ylurea và được đo bằng đầu dò huỳnh quang (λex=213nm; λem=308nm) sau khi tách bằng
cột sắt khí pha đảo (C18) trên thiết bị HPLC.
Phản ứng giữa thuốc thử Xanthydrol với urea: Sử dụng hệ phản ứng tự động phân tích
5

Dược phân tích

Nhóm

carbamate để tạo dẫn xuất urea với xanthydrol (urea được pha trong dung dịch ethanol và
xanthydrol được pha trong propanol) trong mơi trường có thêm 1 lượng nhỏ acid HCl
1,5M. Dưới điều kiện trên sau 5 phút thì chất tạo dẫn xuất được tách trên thiết bị HPLC
và đo trên đầu do huỳnh quang λex=213nm; λem=308nm. Ở điều kiện này, urea phản ứng
với xanthydrol tạo thành hợp chất N-9H-xanthen-9-ylurea.
2.2.2.

Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

a.Ưu điểm
-

Loại được ảnh hưởng của nền và có độ tin cậy cao
Chọn lọc và có độ nhạy cao
Xác định hàm lượng urea ở dạng vết

b.Nhược điểm: giá thành cao và đầu tư lớn
2.3.
2.3.1.

Dụng cụ, thiết bị, hóa chất
Dụng cụ, thiết bị

Thiết bị chính là máy sắc ký lỏng hiệu cao năng ( HPLC) của hãng Perkin Elmer – đầu dị
huỳnh quang , bước sóng λex = 213 nm, λem = 308 nm.

Máy được trang bị bộ tiêm mẫu tự động và hệ thống máy tính nối với phần mềm để thu
nhận dữ liệu.
 Hệ thống sắc kí lỏng hiệu năng cao

6


Dược phân tích

Nhóm

Hình: Hệ thống máy sắc ký lỏng cao áp HPLC

• Bình chứa pha động :
Máy HPLC thường có 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp cho phép chúng ta
sử dụng 4 bình chứa dung mơi cùng một lần để rửa giải theo tỉ lệ mong muốn và
tổng tỉ lệ của 4 đường là 100%.
Tuy nhiên, theo kinh nghiệm, ít khi sử dụng 4 đường dung mơi cùng một lúc mà
thường sử dụng 2 hoặc 3 đường để cho hệ pha động luôn được pha trộn đồng
nhất hơn, hệ pha động đơn giản hơn giúp ổn định q trình rửa giải.
Lưu ý: Tất cả dung mơi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dùng
cho HPLC. Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là
hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.
Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường
nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích.
• Bộ khử khí Degases
Mục đích sử dụng bộ khử khí nhằm lọai trừ các bọt nhỏ cịn sót lại trong dung môi
pha động, tránh xảy ra một số hiện tượng có thể có như sau:
- Tỷ lệ pha động của các đường dung môi không đúng làm cho thời gian lưu của
peak thay đổi.

- Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí khơng thể lọai trừ hết được thì bơm
cao áp có thể khơng hút được dung mơi, khi đó ảnh hưởng đến áp suất và hoạt
động của cả hệ thống HPLC.
7


Dược phân tích

Nhóm

Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích.
• Bơm cao áp
Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải
tạt được áp suất cao khỏang 250-600bar và tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ
0.1 đến 10ml/phút.
• Bộ phận tiêm mẫu
Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đồi.
Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ cơng và tiêm mẫu tự động
(autosample).
• Cột sắc ký
Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao.
Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 525cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,…
Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký.
• Đầu dị
Là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên
sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất phân
tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dị phù hợp.
Tín hiệu đầu dị thu được có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ
điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…
Trên cơ sở đó, người ta sản xuất các lọai đầu dị sau:

- Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát hiện UV
- Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện các
chất hấp thụ quang. Đây là lọai đầu dị thơng dụng nhất.
- Đầu dị hùynh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự
nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang.
- Đầu dị DAD (Detector Diod Array) có khả năng qt chồng phổ để định tính các
chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.
- Đầu dò khúc xạ (chiết suất vi sai) thường dùng đó các loại đường.
- Đầu dị điện hóa: đo dịng, cực phổ, độ dẫn.
- Đầu dị đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt,…
8


Dược phân tích

Nhóm

• Bộ phận ghi nhận tín hiệu
Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dị phát hiện. Đối với các hệ thống HPLC hiện
đại, phần này được phần mềm trong hệ thống ghi nhận, lưu các thông số, sắc ký
đồ, các thông số liên quan đến peak như tính đối xứng, hệ số phân giải,… đồng
thời tính tóan, xử lý các thông số liên quan đến kết quả phân tich.
• In dữ liệu
Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có
cài phần mềm điều khiển.
2.3.2.

Hóa chất, chất chuẩn
- Ethanol tuyệt đối – Merck
- Propanol – 1- Merck

- HCl 37% - Merck
- Sodium acetate – Merck
- Acetronitril dùng cho HPLC – Merck
- Xanhthydrol – Fluka
- Chuẩn urea ≥ 99% - Merck
- Dung dịch xanthydrol 0,07M: hòa tan 140 mg xanthydrol trong dung dịch
propanol – 1 thành 10 ml. Tránh ánh sáng trực tiếp.
- Dung dịch acid HCl 1,5M: lấy 174 ml dung dịch HCl đậm đặc 37% vào
bình
định mức 1 L rồi định mức bằng nước cất đến vạch trao đổi ion.
- Dung dịch đệm sodium acetate 20 mM (pH = 7,2): hòa tan 1,64g sodium
acetate thành 1 L bằng nước cất trao đổi ion. Chỉnh dung dịch về pH = 7,2
bằng dung dịch acid acetic loãng trên máy pH. Lọc qua giấy lọc 0,45µm.
- Dung dịch ZnSO4 2N: hòa tan 30g ZnSO4 thành 100ml bằng nước cất trao
đổi ion.
- Dung dịch K4Fe(CN)6.3H2O 15%: hòa tan 15g K4Fe(CN)6.3H2O thành 100
ml bằng nước cất trao đổi ion.
- Dung dịch Ethanol 75%: pha loãng 750 ml ethanol tuyệt đối thành 1L bằng
dung dịch nước cất.
- Dung dịch chuẩn:
• Chuẩn 100ppm: cân 100mg chuẩn gốc urea >99% pha thành 100ml
bằng dung dịch nước cất
• Chuẩn bị dung dịch chuẩn trung gian 10ppm: lấy 10ml dung dịch
9


Dược phân tích

Nhóm
chuẩn 100ppm pha thành 100ml bằng nước cất

• Pha điểm chuẩn có nồng độ lần lượt là: 0.1 ; 0.4 ; 0.6; 0,8 ;1.0 ppm
bằng cách hút lần lượt vào 1.0 ; 4.0 ; 6.0 ; 8.0 ; 10.0ml dung dịch
chuẩn trung gian rồi định mức thành 100ml bằng dung dịch cồn

2.4.

75%.
Bình định mức: 10ml, 100ml, 1000ml
Micropipet: 10 - 100µl và 100 - 1000µl

Điều kiện quy trình và quá trình thực hiện

2.4.1.

Điều kiện quy trình
a. Pha động
- Dung môi A: Axetonitril
- Dung môi B: Axetonitril và dung dịch natri axetat (pH = 7,2) với tỷ lệ 36 : 64
(% thể tích);
- Lọc các dung mơi pha động qua màng lọc và loại bỏ khí hịa tan bằng cách để

trong thiết bị siêu âm khoảng 10 min trước khi sử dụng.
b. Bước sóng kích hoạt 213 nm, bước sóng phát xạ 308 nm.
c. Thể tích mẫu bơm: 20 µl
d. Chương trình gradient pha động
Thời gian

Tốc độ dịng

Dung mơi A

Dung mơi B

min

ml/min

%

%

0

1,3

0

100

8,00

1,3

0

100

8,01

1,3

100

0

12,00

1,3

100

0

12,01

1,3

0

100

30,00

1,3

0

100

Chú thích: Các thơng số về tỉ lệ pha động, chương trình gradient pha động, thể tích mẫu

bơm có thể được điều chỉnh tùy thuộc vào điều kiện thực tế của thiết bị HPLC
được sử dụng.

10


Dược phân tích
2.4.2.

Nhóm

Q trình thực hiện
a. Xác định các thơng số kỹ thuật của hệ sắc ký lỏng với mẫu chỉ gồm urea-

-

xanthydrol.
Khảo sát thành phần pha động, chương trình chạy gradient
• Tiến hành trên 2 loại cột C18 và C8 có đặc trưng sau: chiều dài 25cm, đường
kính 4,6 mm, ng kớnh ht 5àm.
ã Pha ng c chn khảo sát là đệm acetate pH = 7,2: acetonitril với

-

chương trình chạy gradient .
Khảo sát tách và định danh phức N – 9H- xanthen- 9- ylurea
Để định danh chính xác phức N – 9H- xanthen- 9- ylurea thì thơng thường dựa vào

-

thời gian lưu và kết hợp them khối phổ của cấu tử cần định danh.
Khảo sát điều kiện phản ứng tạo dẫn xuất
Để tiến hành khảo sát, lấy 25µl dung dịch HCl ở nồng độ khác nhau, 50µl dung
dịch thuốc thử xanthydrol ở nồng độ khác nhau, 500µl dung dịch mẫu vào vial có

nắp đậy và lắc đều.
- Khảo sát bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu cho đầu dị huỳnh
quang
• Để khảo sát ành hưởng của bước sóng kích thích, sử dụng dung dịch chuẩn
đã tạo dẫn xuất ở nồng độ 0,3 ppm bằng cách cố định bước sóng phát xạ ở
308nm và thay đổi bước sóng kích thích khác nhau.
• Để khảo sát ảnh hưởng của bước sóng phát xạ, sử dụng dung dịch chuẩn đã
tạo dẫn xuất ở nồng độ 0,3ppm bằng cách cố định bước sóng phát xạ ở
213nm và tahy đổi bước sóng kích thích.
- Khảo sát thời gian phản ứng giữa xanthydrol với urea và độ bền
Lấy 50µl dung dịch HCl 1,5M cho vào vial. Thêm 50µl dung dịch xanthydrol
0,07M và 500µl dung dịch chuẩn 0,6ppm. Để yên hỗn hợp trong 1 thời gian và
tiến hành chạy trên thiết bị trong cùng điều kiện phân tích.
- Khảo sát ảnh hưởng của biuret và biurea đến urea
Tiến hành với nồng độ urea là 0,64ppm có thêm lần lượt biuret với nồng độ là
0,64ppm, 64ppm và 6,4ppm + 2,2ppm biurea
- Khảo sát khoảng tuyến tính của đường chuẩn
- Khảo sát độ lặp lại của phương pháp
Tiến hành thực hiện chạy 6 lần lặp lại của dung dịch chuẩn 0,3ppm trong cùng
điều kiện chạy giống nhau.
11


Dược phân tích
-

Nhóm

Khảo sát giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp
Cách thực hiện tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: từ giá trị thực hiện
chạy 10 mẫu trắng, tính độ lệch chuẩn diện tích peak thu được của mẫu trắng.
Giới hạn phát hiện: LOD = diện tích peak trung bình của mẫu trắng + 3SD diện
tích mẫu trắng
Giới hạn định lượng: LOQ = LOD * 10/3
b. Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu và hiệu suất thu hồi trên mẫu nước mắm

có thêm urea khi sử dụng chất khử tạp
-Khảo sát quy trình chuẩn bị mẫu
• Giai đoạn xử lý mẫu qua giai đoạn khử tạp để làm sạch mẫu: mẫu
nước mắm được lắc đều và dùng pipet lấy 5ml mẫu + 10ml nước cất + 1g
than hoạt tính + V ml dung dịch ZnSO 4 2N + V ml dung dịch
K4Fe(CN)6.3H2O 15%. Định mức thành 100ml bằng dung dịch cồn tuyệt đối.
Lọc qua giấy lọc băng xanh. Khảo sát lượng dung dịch ZnSO 4 2N và
K4Fe(CN)6.3H2O 15% dùng để xử lý mẫu.
• Việc sử dụng chất khử tạp dung dịch ZnSO4 2N + K4Fe(CN)6.3H2O
15% dùng để loại bỏ các chất như: các hạt lơ lững có trong mẫu, một số
protein mạch dài… Dung dịch sau khi khử tạp rất dễ lọc và loại bỏ một số tạp
chất. Điều này rất quan trọng trong việc xác định các mẫu có nhiều chất rắn
lơ lửng, các dung dịch nước mắm chưa được chế biến.

V ml dung dịch mẫu vào
bình định mức 100ml

- Thêm 1g than hoạt tính
- Thêm

12 20ml nước
- Thêm V ml dung dịch ZnSO4 2N
- Thêm V ml dung dịch K4Fe(CN)6.3H2O 15%.


Dược phân tích

Nhóm

Định mức thành 100ml

- Lấy V1 µl dung dịch xanthyldrol 0,02M vào vial
- Thêm V2 µl dung dịch HCl 1,5M
- Thêm V3 µl dung dịch mẫu, lắc đều

Định lượng trên HPLC đầu dị
huỳnh quang
Sơ đồ: Quy trình xác định urea trong nước mắm
-Khảo sát hiệu suất thu hồi
Thực hiện phân tích các mẫu nước mắm có độ đạm lần lượt là: 10 độ đạm, 20 độ
đạm, 25 độ đạm, 30 độ đạm, 35 độ đạm, 40 độ đạm ( nước mắm 10N, 20N, 25N,
30N, 35N, 40N) và mẫu nước mắm trên có thêm chuẩn. Thực hiện các bước xử
lí mẫu, tạo dẫn xuất và xác định trên thiết bị. Từ kết quả thu được, tính tốn hiệu
suất thu hồi đạt được.
2.4.3.

Tiến hành phân tích trên máy

-Thiết lập phương pháp chạy máy
Đối với máy sắc ký lỏng hiệu cao năng, các thông số cần phải thiết lập cho phù hợp

với việc phân tích. Các thơng số bao gồm thơng số cho hệ thống bơm, chương trình
cho autosampler, chương trình gradient pha động, bước sóng kích thích và bước
sóng phát xạ cho đầu dò huỳnh quang.
Sau khi tất cả các yếu tố đạt yêu cầu, mẫu chuẩn và mẫu thật sẽ được tiêm vào máy
dùng hệ thống tiêm mẫu tự động autosampler.
Kết quả thu được sẽ được tiến hành định tính và định lượng dựa vào phần mềm
TCNAV của hãng Perkin Elmer.
-Xử lý số liệu định tính và định lượng
• Phương pháp định tính: dựa trên thơng số thời gian lưu tR
• Phương pháp định lượng:
Kết quả định lượng được tính tốn dựa vào diện tích peek, nồng độ của urea có
trong dung dịch mẫu được suy ra từ đường chuẩn.
13


Dược phân tích

Nhóm

Cc * V * k
X=
M
Trong đó:
X: là nồng độ urea có trong mẫu, mg/l
V: thể tích định mức mẫu, ml
M: thể tích mẫu, ml
k: hệ số pha lỗng

III.TÍNH TOÁN KẾT QUẢ
1.

Kết quả khảo sát thành phần qua động, chương trình chạy gradient để tách N9H-xanthen-9-ylurea

Để khảo sát quá trình tách N-9H-xanthen-9-ylurea, chúng tơi sử dụng pha động là đệm
sodium acetate 20 mM (pH=7,2): acetonitril (ACN) theo chương trình gradient bằng cách
thay đổi thành phần pha động. Qua khảo sát chương trình chạy gradient để tách hợp chất
cần phân tích cho cột C18 và C8 ta thu được như sau:

Hình II-1: Chương trình chạy gradient bơm A ( đệm sodium acetate 20 mM ) và bơm C
( ACNI ) để xác định urea
14


Dược phân tích

Nhóm

Điều kiện các thơng số để xác định urea: thể tích tiêm là 20 µL, thời gian xác định là 35,5
phút, bộ tiêm mẫu tự động Series 200, detector 900 series A/D. Bơm sử dụng là bơm A và
bơm C.

- Sắc kí đồ tách như sau:

Biểu đồ II-1: Sắc kí đồ tách của chuẩn trên cột C18
2.

Kết quả khảo sát và định danh phức N-9H-xanthen-9-ylurea

Quá trình khảo sát để định danh N-9H-xanthen-9-ylurea dựa trên thời gian lưu và tỷ lệ
tương ứng của chúng theo nồng độ khác nhau có nồng độ từ 0,1; 0,2; 0,3 ppm chuẩn ure

trên cột C18. Sắc kí đồ thu được như sau:

15


Dược phân tích

Nhóm

Biểu đồ II-2: Sắc kí đồ để định danh N-9H-xanthen-9-ylurea dựa theo thời gian lưu trên
cột C18.
Nhận xét: Qua sắc kí đồ thu được ta thấy rằng sắc kí đồ thu được ở ba nồng độ trên có
thời gian lưu trùng nhau sau ba lần chạy và chiều cao của peak tỷ lệ với nồng đọ của chất
cần phân tích. Điều đó cho ta có thể xác nhận rằng peak có thời gian lưu 12 phút ứng với
hợp chất N-9H-xanthen-9-ylurea .
3.

Kết quả khảo sát điều kiện phản ứng tạo dẫn xuất

Giai đoạn này rất quan trọng trong quá trình chuẩn bị mẫu vì nó ảnh hưởng rất nhiều đến
kết quả xác định urea. Phản ứng giữa urea và xanthydrol để tạo thành hợp chất N-9Hxanthen-9-ylurea là một phản ứng thuận nghịch nên việc khảo sát nồng độ xanthydrol và
HCl rất quan trọng. Để tối ưu hóa nồng độ cần dùng này chúng tôi đã sử dụng phần mềm
thống kê Umetrics để khảo sát với 11 thí nghiệm khác nhau theo bảng sau:

16


Dược phân tích

Nhóm

Hình II-2: Các thơng số khảo sát xanthydrol (mol/L*/10) và thể tích HCl 1,5 M (µL) theo
độ hấp thu.
Nhận xét: Từ hình ảnh thu được phân tích từ phần mềm Umetric cho ta thấy rằng hàm
lượng xanthydrol lớn hơn 0,06 mol/L và nồng độ HCl từ 10-45 µL HCl 1,5 M thì tín hiệu
thu được cao nhất. Đó là vùng tối ưu đối với phản ứng này. Ở hàm lượng xanthydrol càng
nhỏ thì tín hiệu thu được càng kém. Hàm lượng chất tạo dẫn xuất N-9H-xanthen-9-ylurea
phụ thuộc vào hàm lượng xanthydrol dùng tham gia phản ứng và môi trường HCl, do
phản ứng giữa ure và xanthydrol để tạo thành N-9H-xanthen-9-ylurea là một phản ứng
thuạn nghịch và acid HCl đóng vai trị là mơi trường của phản ứng.
17


Dược phân tích
4.

Nhóm

Kết quả khảo sát bước sóng kích thích và bước sóng phát xạ tối ưu cho đầu do
huỳnh quang

Cố định bước sóng phát xạ, thay đổi lần lượt bước sóng kích thích trên dung dịch chuẩn
đã tạo dẫn xuất có nồng độ 0,3 ppm. Kết quả thu được như sau:

Biểu đồ II-7: Mối quan hệ giữa bước sóng kích thích và diện tích peak
Thực hiện khảo sát tương tự, tiến hành cố định bước sóng kích thích và thay đổi lần lượt
bước sóng phát xạ trên dung dịch chuẩn đã tạo dẫn xuất có nồng độ 0,3 ppm. Kết quả thu
được như sau:

18

Dược phân tích

Nhóm

Biểu đồ II-8: Mối quan hệ bước sóng kích thích và diện tích peak
Nhận xét: Qua các số liệu trên thấy rằng ở bước sóng kích thích 213 nm và bước sóng
phát xạ 308 nm thì tins hiệu thu được cực đại.
5.

Kết quả khảo sát thời gian phản ứng giữa xanthydrol với ure và độ bền của phức
N-9H-xanthen-9-ylurea

5.1.

Khảo sát thời gian phản ứng giữa xanthydrol với ure

Tiến hành khảo sát thời gian phản ứng giữa xanthydrol với ure theo thhowif gian và độ
bền phức hợp N-9H-xanthen-9-ylurea, kết quả thu được theo hình sau:

19


Dược phân tích

Nhóm

Biểu đồ II-9: Biểu đồ khảo sát thời gian tạo phản ứng với ure và xanthydrol
5.2.

Khảo sát độ bền của phức N-9H-xanthen-9-ylurea

Biểu đồ II-10: Biểu đồ thể hiện độ bền của chất dẫn xuất theo thời gian
Nhận xét: Biểu đồ cho thấy chất nhận xét bền và đạt tín hiệu cực đại sau thời gian dẫn
xuất 5 phút và bền theo thời gian. Việc dẫn xuất bền rất thuận lợi cho việc chuẩn bị mẫu
phân tích và hạn chế gây sai lệch khi phân tích mẫu liên tục trong 24 giờ. Điều kiện này
20


Dược phân tích

Nhóm

rất tốt giúp chúng ta chuẩn bị mẫu và tạo dẫn xuất hàng loạt khi thiết bị có hệ thống tiêm
mẫu tự động.
6.

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của biuret và biure

Sau khi tiến hành khảo sát trên nồng độ ure là 0,64 ppm có thêm lần lượt nồng độ biuret
là 0,64 ppm; 6,4 ppm và 6,4 ppm + 2,2 ppm biurea, sắc kí đồ thu được như sau:

Biểu đồ II-11: Khảo sát ảnh hưởng của biuret

Biểu đồ II-12: Khảo sát ảnh hưởng của biuret
21


Dược phân tích

Nhóm

Biểu đồ II-13: Khảo sát ảnh hưởng của biuret và biurea

Biểu đồ II-14: Khảo sát ảnh hưởng của biuret
Kết quả khảo sát như sau:

22


Dược phân tích
Nồng độ

Nhóm
0 ppm

0,64 ppm

6,4 ppm

64 ppm

biuret
Diện tích

6,4 + 2,2
ppm biurea

5133877

5096394

5141317

5152212

5163231

peak

Bảng II-2: Bảng khảo sát ảnh hưởng của nồng độ biuret đến diện tích peak urea
Nhận xét: Qua sắc kí đồ thu được ta thấy rằng biuret và biurea ảnh hưởng khơng đáng kể
đến q trình phân tích ure. Việc sử dụng thuốc thử xanthydrol ở nồng độ này đủ để phản
ứng với ure và hông bị ảnh hưởng khi trong mẫu có hợp chất biuret và biure. Các peak
biurea, ure và biuret tách hồn tồn trên sắc kí đồ.
7.

Kết qủa khảo sát khoảng tuyến tính của đường chuẩn

Từ giới hạn định lượng trên mẫu là 1,92 ppm thì hàm lượng nhỏ nhất suy ra trên đường
chuẩn là 0,09 ppm. Từ giá trị này chúng tôi tiến hành khảo sát xây dựng dãy chuẩn có
nồng độ 0,074; 0,147; 0,295; 0,591; 1,033 và 1,47 ppm. Kết quả thu được như sau:
STT

C (mg/l)

Diện tích

1

0,074

825589

2

0,148

1564745

3

0,295

2979736

4

0,591

6111304

5

1,034

9911857

6

1,470

11630994

Bảng II-3: Bảng khảo sát mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak.

23


Dược phân tích

Nhóm

Biểu đồ II-15: Quan hệ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích peak
Nhận xét: Qua khảo sát mối quan hệ tuyến tính thì chúng tơi nhận thấy rằng ở nồng độ từ
0,074 đến 1,033 ppm thì hệ số tương quan tốt theo hàm bậc 1 : y= ax +b với hệ số tương
quan R2 = 0,998. Từ nồng độ từ 0,074 đến 1,47 ppm thì hệ số tương quan không theo hàm
bậc 1: y = ax + b với hệ số tương quan R2 = 0,977. Từ kết quả trên cho thấy rằng khi nồng
độ ure tạo dẫn xuất lớn hơn 1 ppm thì tín hiệu thu được đã vượt khỏi thang dị của đầu dị
( tín hiệu của đầu dị đo được diện tích tối đa (10 7) và tín hiệu khơng cịn tuyến tính theo
hàm y = ax + b.
Như vậy hàm lượng ure có trong mẫu có giá trị từ 1,92 ppm đến 20 ppm thì kết quả phân
tích ure thu được sau khi định mức pha loãng sẽ nằm trong khoảng của đường chuẩn.
Trong trường hợp mẫu phân tích có hàm lượng ure lớn hơn khoảng này thì ta phải pha
lỗng mẫu để kết quả phân tích nằm trong đường chuẩn. Nếu mẫu có nồng độ nhỏ hơn
1,92 ppm thì ta phải lấy lượng mẫu lớn hơn hoặc có thể dùng thể tích tiêm mẫu trên thiết
bị lớn hơn.

24

Dược phân tích
8.

Nhóm

Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp

Sau khi tiến hành thực hiện chạy 6 lần lặp lại của chuẩn 0,3 ppm trong cùng điều kiện
giống nhau. Kết quả thu được như sau:
STT

Diện tích peak

Thời gian lưu

Lần 1

2764682

11,787

Lần 2

2782794

11,780

Lần 3

2748659

11,793

Lần 4

2713425

11,787

Lần 5

2765655

11,793

Lần 6

2663676

11,773

SD

44057

0,008

RSD(%)

1.61

0,066

Bảng II-4: Độ lặp lại của thời gian lưu và diện tích peak
Nhận xét: Qua kết quả khảo sát trên các lần sắc kí của cùng một dung dịch cho thấy rằng
thời gian lưu tR của cấu tử không sai lệc quá 0,07%. Sự ổn định về mặt thời gian lưu dựa
trên kết quả khảo sát nêu trên cho thấy có thể sử dụng thời gian lưu làm yếu tố định danh.
Độ lặp lại của tín hiệu: Sự ổn định độ lặp lại tương đối trng bình của 6 lần chạy của cấu
tử khơng quá 1,61%. Sự lặp lại rất tốt này cho phép ta định lượng một cách chính xác và
ít sai lệch do tín hiệu rất ổn định.
9.

Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện và định lượng của phương pháp

Các thực hiện tính giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng như sau: từ giá trị thực hiện
chạy 10 mẫu trắng. Tính độ lệch chuẩn diện tích peak thu được của mẫu trắng.
Giới hạn phát hiện: LOD = Diện tích peak trung bình của mẫu trắng + 3SD diện tích mẫu
trắng.
25