BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) xác định hàm lượng vitamin b2 trong thực phẩm bằng phương pháp HPLC

BÁO CÁO
MƠN: DƯỢC PHÂN TÍCH
CHUN ĐỀ: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN B2 TRONG
THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG
CAO ( HPLC)

Giáo viên hướng dẫn:
Danh sách nhóm báo cáo:


I./ Đặt vấn đề:
Vitamin có vai trị quan trọng đối với sức khỏe con người, đặt biệt là khả năng tăng
trưởng và phát triển của trẻ nhỏ. Trong 13 loại vitamin quan trong, trong đó có vitamin
nhóm B tan trong nước cụ thể là vitamin B2 có vai trị khá quan trọng trong cơ thể. Nó là
thành phần quan trọng của các men oxydase; trực tiếp tham gia vào các phản ứng ơxy hóa
hồn ngun; khống chế các phản ứng hơ hấp chuyển hố của tế bào; chuyển hố các
chất: đường, đạm, béo ra năng lượng để cung cấp cho các tế bào hoạt động; tác động đến
việc hấp thu, tồn trữ và sử dụng sắt trong cơ thể (rất quan trọng trong việc phòng chống
thiếu máu do thiếu sắt).
Vai trò của vitamin là rất quan trọng nhưng cũng cần lưu ý khi sử dụng dược phẩm bổ
sung vitamin để để tránh dư thừa và gây ra tác dụng không mong muốn. Vitamin B2 có
rất nhiều trong thực phẩm nên việc lựa chọn thực phẩm để bổ sung vitamin là sự lựa
chọn được ưu tiên. Vì vậy việc xác định hàm lượng vitamin được bổ sung có ý nghĩa
trong vấn đề đảm bảo quyền lợi và sức khỏe người tiêu dùng.
Xuất phát từ nhu cầu trên để nghiên cứu vấn đề dinh dưỡng chúng tôi tiến hành nghiên
cứu đề tài “ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN B2 TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG
PHÁP SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ( HPLC)”.
II./ Đối tượng nghiên cứu và phương pháp nghiên cứu:
1. Tính chất lý hóa của vitamin B2:
Vitamin B2 hay cịn gọi là Riboflavin
Cơng thức :C17H20N4O6

- Tính chất: bột kết tinh màu vàng hoặc cam hơi khó mùi, khó tan trong nước , ethanol,
khơng tan trong ether, clorofrom, benzene. Dễ tan nhưng không ổn định trong môi trường
kiềm , ổn định trong môi trường acid , khơng ổn định với ánh sáng. Do có hệ nối đôi luân
phiên nên vitamin B2 hấp thụ bức xạ UV_Vis


Do đó, các thao tác phân tích và hoạt động với các giải pháp riboflavin nên được
thực hiện trong bóng tối hoặc dưới ánh sáng đỏ. Nếu được bảo vệ từ ánh sáng, riboflavin
là tương đối ổn định so với nhiệt và oxy. Riboflavin hoặc vitamin B2 là thành phần hoạt
động (nhóm giả) của các nucleotide flavin FAD (flavin adenine dinucleotide) và FMN
(flavin mononucleotide = riboflavin-5'-phosphate), mà hoạt động như một coenzyme của
oxidoreductase nhiều chức năng liên quan đến chuyển nhượng hydro xúc tác phản ứng
trong q trình chuyển hóa carbohydrate, chất béo và protein. FMN và FAD hòa tan được
trong nước (3 g trong 100 ml ở pH 7 và 25 ° C).
Nói chung, riboflavin được coi như một loại vitamin "quan trọng" ít hơn, thay đổi từ
1 đến 2 mg mỗi ngày cho người lớn, được đáp ứng hoặc thậm chí cao hơn trong các
nhóm dân số của các nước phương Tây. Vitamin B2 có trong các loại thực phẩm ta dùng
hằng ngày như: ngũ cốc, rau xanh, đậu các loại, thịt, trứng, sữa, tim, thận, gan, lách... đều
có vitamin B2 (tỷ lệ mất vitamin B2 khi chế biến thức ăn khoảng 15 - 20%). Hàm lượng
vitamin B2 trong động vật cao hơn thực vật. thường phối hợp với vitamin PP
2. Ảnh hưởng của vitamin B2 đến sức khỏe của con người:
Nếu thiếu sẽ gây sẽ biểu hiện ơ mắt như : Ngứa, rát bỏng, sợ ánh sáng, chảy nước
mắt, viêm bờ mi hoặc loét mi, sung huyết mắt, viêm kết mạc kết tụ quanh rìa, viêm giác


mạc chấm nông hoặc viêm kết, giác mạc bong, dẫn đến hoại tử và loét sâu (không do vi
khuẩn ),quáng gà, đục nhân mắt. Đáy mắt đơi khi có phù gai thị, chảy máu võng mạc.
Dấu hiệu toàn thân như: Mệt mỏi, giảm khả năng làm việc, vết thương lâu lành;
thiếu máu; rối loạn chức năng ruột, ăn không tiêu; viêm ruột kết mạn tính; suy gan, viêm
gan cấp; phát ban, ngứa toàn thân và bong vảy; viêm mép (nứt, lt); viêm lưỡi (có màu

tím hoặc đỏ, lưỡi hình bản đồ); phù ở niêm mạc môi hoặc teo niêm mạc mơi; viêm da
tăng tiết bã nhờn (ở mặt, bìu dái, âm hộ); trẻ con chậm lớn.
Dùng quá liều loại vitamin này gây nên chuột rút. Đặc biệt ở phụ nữ có thai sẽ ảnh
hưởng đến nhau thai trong việc cung cấp dinh dưỡng cho thai nhi, khiến thai nhi phát
triển kém, nước tiểu sẽ chuyển màu vàng nhạt, gây sai lệch đối với một số xét nghiệm
nước tiểu trong phòng thí nghiệm.
3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất:
3.1 Chuẩn bị dụng cụ, thiết bị:
- Hệ thống sắc ký lỏng cao áp với detector huỳnh quang FL hoặc detector PDA
- Cân phân tích độ chính xác 0,0001g
- Cân kỹ thuật độ chính xác 0,01g
- Bếp đun cách thuỷ
- Máy đo pH
- Bình nón 250 ml
-Phễu lọc
- Bình định mức 100, 200 ml
- Lọ thuỷ tinh nâu nút nhám loại 50ml, 100.
- Pipet các cỡ 5. 10,20 ml
- bình định mức các cỡ
3.2 Chuẩn bị hóa chất:
 Hố chất thuốc thử sử dụng là loại tinh khiết PA
- Dung dịch HCl 1N
- Dung dịch CH3COONa 0,05M
-Dung môi Methanol (Merck)
- Men amilase (Prolabo)
- Acid acetic (Merck)
- Dung dịch vitamin B2 chuẩn gốc 100ppm:


 Cân 0,0250g chuẩn vitaminB2 dạng riboflavin cho vào bình định mức 250ml,

hồ tan và pha lỗng tới vạch mức bằng nước. (Lắc và siêu âm để tan hoàn toàn,
bọc giấy bạc tránh ánh sáng và bảo quản ở nhiệt độ 4oC)
- Dung dịch chuẩn làm việc vitamin B2 nồng độ 50, 25, 10, 5...ppm pha khi dùng.
4. Điều kiện quy trình và quá trình thực hiện:
4.1 Điều kiện quy trình:
: Vitamin B2 rất nhạy với ánh sáng. Cần có các biện pháp để bảo vệ mẫu và các
dung dịch tương ứng trong suốt q trình phân tích như đựng trong dụng cụ thủy
tinh màu nâu.

 Điều kiện chạy sắc ký:
- Chạy sắc ký với detector FL bước sóng kích thích 422 và bước sóng phát xạ
522nm
- Dung mơi pha động Pha động: CH3COONa 0,05M : MeOH = 70:30 (V/V)
- Cột sắc ký pha ngược C18
- Tốc độ dòng 1ml/phút
- Nhiệt độ phòng
- Điều kiện chạy sắc ký với detector PDA ở bước sóng 254nm
- Dung mơi Pha động H2O : MeOH: aceic acid tỷ lệ 45: 65: 0,1 (V/V/V)
- Tốc độ dòng 0,8 ml/ phút
- Cột RP 18
4.2 Quá trình thực hiện:
 Chiết vitamin B2 từ thực phẩm.
* Xử lý mẫu:
- Đối với mẫu rắn phải nghiền hoặc xay nhỏ và đồng nhất kỹ đóng vào túi nilon
hay hộp kín tránh hút ẩm.
- Với mẫu thực phẩm lỏng: Đồng nhất và lắc trộn kỹ.


- Với thực phẩm vừa lỏng vừa rắn phải lấy cả cái và nước đem nghiền kỹ và đồng
nhất trước khi cân.

* Tiến hành
- Cân chính xác khoảng 0,1- 10g mẫu cho vào bình nón 250 ml.
- Thêm vào mỗi bình 10 ml HCl 1N và 90 ml nước
- Thuỷ phân trong nồi cách thuỷ ở 1000C trong 1 giờ.
- Chỉnh pH của dịch thuỷ phân đến pH=4,5 bằng dung dịch natri acetat 2,5M.
- Thêm vào mỗi bình 0,1g men Amilase
- Đặt bình vào tủ ấm ủ 370C trong 18 giờ.
- Định mức dung dịch đến 200ml hoặc 250 ml bằng nước cất và lọc.
- Dịch lọc mẫu và chuẩn được bơm vào HPLC
5. Tiến hành phân tích bằng máy:
 Giới hạn phát hiện của vitamin B2: 0.02 ng
 Nhận biết riboflavin bằng cách so sánh thời gian lưu của pic trong sắc phổ thu được
của dung dịch mẫu thử và của dung dịch chuẩn. Có thể thực hiện phép nhận biết pic bằng
cách thêm các lượng nhỏ dung dịch chuẩn thích hợp vào dung dịch mẫu thử.
 Pha tĩnh: Supelco® LC-18-DB, 5 m, 250 mm x 4,6 mm
 Pha động: metanol (4.2.1): đệm phosphat, pH 3,5 (4.2.16) có chứa tetraetyl
amoniclorua 1 g/l (4.2.17) và natri heptansulfonat 5 mmol/l (4.2.18) (35:65)
 Tốc độ dịng: 1,0 ml/min
 Thể tích bơm: 20 l
 Detector: huỳnh quang; bước sóng kích thích: 468 nm; bước sóng phát xạ: 520 nm.
III./ Tính tốn kết quả:
Xây dựng đường chuẩn:


- Khi thẩm định phương pháp cần phải xây dựng đường đường chuẩn qua 5 điểm. Tuy
nhiên do mẫu làm nhiều và phương pháp ổn định q trình phân tích mẫu hàng ngày chỉ
cần tính trên cơ sở một điểm chuẩn nằm trong khoảng tuyến tính.
- Các dung dịch chuẩn vitaminB2 để xây dựng đường chuẩn có nồng độ là 20; 10; 5; 1,
0.5...mcg/ml. Dung dịch các chuẩn bơm vào máy HPLC, phần mềm của máy sẽ lập
đường chuẩn tương quan giữa diện tích hoặc chiều cao peak với nồng độ chuẩn tương

ứng.
Căn cứ vào diện tích hay chiều cao peak của mẫu và đường chuẩn xây dựng được, tính
hàm lượng vitaminB2 theo công thức sau:
X(mcg/g)= 200 x Cm / m
Trong đó : 200 là thể tích bình định mức của dịch sau thuỷ phân (ml)
Cm: là nồng độ mẫu phân tích tính theo đường chuẩn (mcg/ml) hay nồng độ một
dung dịch chuẩn.
m: Khối lượng mẫu lấy phân tích (g).

Sắc kí đồ


CHÚ DẪN
X: min
Y: độ hấp thụ
1: 6,380 vitamin B2
 Ngoài tính kết quả dựa trên đồ thị chuẩn hoặc sử dụng chương trình tương ứng của
máy tích phân có thể sử dụng theo cơng thức giản lược sau đây:
- Tính phần khối lượng vitamin B 2 của mẫu thử, w, bằng miligam trên 100 g (mg/100 g),
sử dụng Công thức (2):
(2)
Trong đó:
 As là diện tích pic hoặc chiều cao pic của riboflavin thu được từ dung dịch mẫu thử
(6.3.3), tính bằng đơn vị diện tích hoặc chiều cao;
 AST là diện tích pic hoặc chiều cao pic của riboflavin thu được với dung dịch chuẩn
(4.4.2), tính bằng đơn vị diện tích hoặc chiều cao;
 V là tổng thể tích của dung dịch mẫu thử cuối cùng (6.3.3), tính bằng mililit (ml);
 VE là thể tích của dịch chiết (6.3.2), tính bằng mililit (ml);
 VA là thể tích phần mẫu thử được dùng để pha lỗng cuối cùng (6.3.3), tính bằng mililit
(ml);

  là nồng độ khối lượng của riboflavin trong dung dịch chuẩn (4.4.2), tính bằng
microgam trên mililit (g/ml);
 ms là khối lượng mẫu thử, tính bằng gam (g);
 1000 là hệ số chuyển đổi từ microgam thành miligam;
 100 là hệ số chuyển đổi của phần khối lượng trên 100 g;
 E là phần khối lượng riboflavin có trong enzym, tính bằng miligam trên 100 g (mg/100
g);
 mE là khối lượng enzym đã sử dụng trong phép phân tích, tính bằng gam (g).
Báo cáo kết quả vitamin B2 bằng miligam trên 100 g (mg/100g).
 Độ chính xác ( độ lặp lại):
Chênh lệch tuyệt đối giữa các kết quả của hai phép thử độc lập, đơn lẻ dựa trên vật
liệu thử giống hệt nhau do một người thực hiện, sử dụng cùng thiết bị, thực hiện trong
một khoảng thời gian ngắn, không quá 5 % các trường hợp lớn hơn giới hạn lặp lại r.
Các giá trị riboflavin là:
Sữa bột
= 14,54 mg/100g
r = 1,3048 mg/100g
Gan lợn
= 105,46 mg/100g
r = 5,1104 mg/100g

 Độ đúng (độ tái lập):
Chênh lệch tuyệt đối giữa hai kết quả của hai phép thử độc lập, thu được khi tiến
hành thử trên vật liệu giống nhau bởi hai phịng thử nghiệm khác nhau, khơng q 5 %
các trường hợp lớn hơn giới hạn tái lập R.
Các giá trị riboflavin là:
Sữa bột
= 14,54 mg/100g

R = 3,0078 mg/100g
Gan lợn
= 105,46 mg/100g
R = 23,5342 mg/100g
 Đảm bảo chất lượng:
Sai lệch giữa hai lần thử song song trong cùng điều kiện so với giá trị trung bình
khơng chênh lệch nhau q 15%.

Các hệ thống HPLC thay thế


Pha tĩnh

Hypersil® ODS, 5 m

Kích thước
cột mm x
mm

Pha động

125 x 4,6 Metanol: nước (50:50)

Tốc độ
dịng
ml/min

Detector huỳnh
quang,
nm

1,0

Kích thích: 462
Phát xạ: 520

Supelco® LC-18-DB, 5 m

Lichropher® RP 18, 5 m

Apex® C18, 3 m

250 x 4,6 Metanol: đệm phosphat (4.2.16)
chứa tetraetylamoniclorid,
(C8H20NCl) = 1 g/l và natri
heptansulfonat, c(C7H15NaO3S) = 5
mmol/l (35:65)

1,0

25 x 4 +

1,5

125 x 4

Metanol: amoniac 0,025 % (+ 1 g
axit hexansulfonat); (250:500); pH
3,6

250 x 4

Metanol: nước (1:1)

1,0

Kích thích: 468
Phát xạ: 520

Kích thích: 467
Phát xạ: 525
Kích thích: 450
Phát xạ: 510

Bondapak® C18 radialpak
catridges

Spherisorb® ODS2, 5 m

100 x 8

Metanol: 5 mmol điện phosphat pH
7 (35:65)

250 x 4,6 Metanol: nước (50:50)

1,0

Kích thích: 440
Phát xạ: 520

1,0

Kích thích: 450
Phát xạ: 510

Bondapak®C18, 10 m

Kromasil®C-18, 5 m

100 x 8

Metanol: đệm natri axetat 0,05 M,
pH 4.5 (40:60)

250 x 4,6 Metanol: nước (40:60)

1,0

Kích thích: 422
Phát xạ: 522

1,0

Kích thích: 440
Phát xạ: 520

Eurospher® C18, 5 m

250 x 4,6 Metanol: nước (50:50)

1,0

Kích thích: 445
Phát xạ: 530

Spherisorb® ODS, 5 m

250 x 4,6 Metanol: nước (50:50)

1,0

Kích thích: 410
Phát xạ: 510

IV./ Kết luận:


Phân tích HPLC được thành lập như là phương pháp lựa chọn để xác định riboflavin
trong thực phẩm. Phạm vi của phân tích xác định quy trình được sử dụng. Sắc ký được
thực hiệnchủ yếu trên các cột RP C18 bằng cách sử dụng giải hấp isocratic hoặc ít thường
xuyên Gradient với methanol-nước hoặc hỗn hợp acetonitril bị chua hoặc đệm tiếp theo
phát hiện fluorimetric như các phương pháp định lượng nhạy cảm nhất. Trong thực phẩm
giàu bổ sung, riboflavin cũng có thể được xác định bằng UV phát hiện với đầy đủ độ
chính xác.

Tài liệu tham khảo
TCVN 8975-2011 - Thực Phẩm - Xác Định Vitamin B2 Bằng Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng
Cao (HPLC)
HPLC Determination of Riboflavin in fortified food - Roland Bitsch, Irmgard Bitsch

/>