BÁO cáo (dược PHÂN TÍCH) định lượng quercetin bằng phương pháp HPLC

Trường Đại Học Nơng Lâm TP Hồ Chí Minh
Khoa Chăn Ni – Thú Y


DƯỢC PHÂN TÍCH
Đề tài:

“Định lượng Quercetin bằng phương pháp HPLC”
GVHD:
SVTH:

Thành phố Hồ Chí Minh

1


ĐẶT VẤN ĐỀ...............................................................................................................3
Phần 1 TỔNG QUAN....................................................................................................4
1.1 Tổng quan về Quercetin...............................................................................4
1.1.1 Cơng thức của Quercetin..................................................................4
1.1.2 Tính chất lý hóa................................................................................4
1.1.3 Nguồn gốc và cách điều chế.............................................................5
1.1.4 Tác dụng và cơ chế tác dụng............................................................5
1.1.5 Chỉ định............................................................................................6
1.1.6 Một số chế phẩm............................................................................6
1.2 Một số phương pháp định lượng Quercetin.................................................6
1.2.1 Định lượng bằng phương pháp HPLC..............................................6
1.2.2 Định lượng bằng phương pháp Von ampe........................................8
1.3 Tổng quan về HPLC.....................................................................................8
1.3.1 Nguyên tắc của quá trình sắc ký........................................................8
1.3.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình sắc ký..................................................8

1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC....................................9
1.3.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký....................................10
Phần 2 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ.....................................................................18
2.1 Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm................................................18
2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét..............................................................20
Phần 3 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT.............................................................................41
3.1 Kết luận.......................................................................................................41
3.2 Đề xuất........................................................................................................41

2


TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................43

ĐẶT VẤN ĐỀ
Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Flavonoid được
khám phá bởi một trong những nhà sinh hóa nổi tiếng nhất thế kỷ 20: Albert Szent –
Gyorgyi (1893-1896). Ông đã nhận thấy được đặc tính của Flavonoid và khả năng chống
bệnh Scurvy của Flavonoid. Ngày nay, những tác dụng sinh học của Flavonoid đã được
tìm hiểu và đưa vào sử dụng để phòng và chữa bệnh cho con người một cách rộng rãi.
Trong số đó khơng thể khơng nhắc đến Quercerin.
Quercetin là một Flavonoid, được nghiên cứu là có khả năng làm giảm nguy cơ
mắc các bệnh về tim mạch, ngăn chặn sự phát triển của bệnh ung thư, chống dị ứng và
giảm đau cho bệnh gout…Hiện nay, Quercetin được sử dụng khá rộng rãi chủ yếu dưới
dạng thực phẩm chức năng và có mặt trên thị trường dược phẩm với những dạng bào chế
khác nhau: viên nén, viên nang, dạng dung dịch,…Và hiện tại có một số cơ sở đang
nghiên cứu sản xuất nguyên liệu Quercetin như Liên hiệp khoa học sản xuất công nghệ
mới, sản xuất thực phẩm chức năng chứa Quercetin như công ty TNHH Đại Y,…
Việc xác định hàm lượng Quercetin trong nguyên liệu và các thực phẩm chức năng
này rất cần thiết. Tuy nhiên, ở nước ta chưa có phương pháp định lượng Quercetin chính

thức trong các tiêu chuẩn ngành và quốc gia.
Để giúp một số cơ sở đang nghiên cứu sản xuất nguyên liệu Quercetin, góp phần
xây dựng tiêu chuẩn của Quercetin, chúng tơi đã tiến hành đề tài nghiên cứu “Định lượng
Quercetin bằng phương pháp HPLC” với mục tiêu sau:
1. Xậy dựng qui trình kỹ thuật định lượng Quercetin nguyên liệu bằng phương
pháp HPLC
2. Đánh giá phương pháp mới xây dựng theo các chỉ tiêu của một phương pháp
đinh lượng

3


Phần 1
TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Quercetin
Quercetin là flavonoid thuộc nhóm flavonol. Nhóm flavonol có màu vàng nhạt đến
vàng. Flavonoid là những chất màu thực vật có cấu tạo khung kiểu C 6 – C3 - C6 hay nói
cách khác khung cơ bản gồm 2 vòng benzene A và B nối với nhau qua một mạch 3
carbon. Phần lớn các flavonoid là các dẫn chất có gốc phenyl vì vậy về bản chất chúng là
những polyphenol có tính acid.
1.1.1 Cơng thức của Quercetin

Tên khoa học: 3, 3’ ,4’ ,5, 7 – penta hydroxy flavon
Tên khác: 3’, 4’, 5, 7 – tetra hydro flavon – 3- ol
1.1.2 Tính chất lý hóa

4

Bột mịn, màu vàng chói. Tan trong nước và dung mơi hữu cơ phân cực.
Nhiệt độ nóng chảy là 3140C
1.1.3 Nguồn gốc và cách điều chế
+ Nguồn gốc:
Tự nhiên: Quercetin có nhiều trong táo, hành tây, tỏi, rượu vang đỏ, cải hoa,
súp lơ, cải bắp,…
Bán tổng hợp: Quercetin được bán tổng hợp bằng cách thủy phân Rutin.
+ Cách điều chế Quercetin bán tổng hợp:
Khoa hóa trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học quốc gia Hà
Nội đã tiến hành như sau:
Rutin được tổng hợp bằng cách đun hồi lưu với dung dịch HCl 5% trong
vòng 1 giờ, cho Quercetin kết tủa màu vàng ở dạng hydrat ở 0 0C. Kết tinh lại
Quercetin trong hỗn hợp ethanol – nước.
Viên cơng nghệ hóa học, viện KH & CN Việt Nam đã tiến hành như
sau:
Rutin được thủy phân bằng dung dịch H2SO4 2% ở nhiệt độ sôi của dung
dịch trong 90 phút sử dụng máy khuấy từ có gia nhiệt, đệm lọc, phần trên lọc rửa
nhiều lần bằng nước lạnh thu được Quercetin thô và kết tinh bằng ethanol nhiều
lần ta sẽ có Quercetin tinh khiết.
1.1.4 Tác dụng và cơ chế tác dụng
Quercetin có khả năng làm giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch, ngăn
chặn sự phát triển của bệnh ung thư, chống dị ứng và giảm đau do gout, giảm nguy
cơ biến chứng bệnh nhân đái tháo đường…Bên cạnh đó, Quercetin cịn có phổ
kháng rộng cả với vi khuẩn và nấm, trong đó kháng mạnh với vi nấm và vi khuẩn
Gram+
Cơ chế tác dụng:
Quercetin tác động lên peroxyl radicals và ức chế sự hình thành của
hydroperoxide, đồng thời tác động lên alkoxyl radicals và ngăn chặn sự oxy hóa
của LDL – Cholesterol nên làm giảm nguy cơ mắc các bệnh về tim mạch.
Quercetin có tác dụng chống dị ứng do nó ngăn cản phóng thích histamin.

Quercetin làm giảm bớt sự sản xuất của “mutant p53 protein” và ngăn chặn sự
hoạt động của các enzyme Tyrosine kinase nên làm chậm sự phát triển của bướu
ung thư. Quercetin có khả năng chống bệnh gout do nó ức chế xanthin oxidase.

5


Quercetin ức chế aldose reductase rất mạnh. Enzyme này có nhiệm vụ chuyển
glucose máu thành sorbitol – một hợp chất liên quan chặt chẽ với sự tiến triển các
biến chứng của đái tháo đường (đục thủy tinh thể, tổn thương thần kinh, bệnh
võng mạc đái tháo đường).
1.1.5 Chỉ định
Dùng để phòng và điều trị các bệnh về dị ứng, ung thư (ung thư tuyến tiền
liệt, vú, dạ dày, ruột kết), tim mạch và bệnh gout, các biến chứng của bệnh đái
tháo đường.
1.1.6 Một số chế phẩm
Các dạng bào chế của Quercetin
- Dạng viên nén 500mg hoặc 1000mg Quercetin
- Dạng viên nang 300mg hoặc 500mg Quercetin
- Dạng dung dịch chứa 134mg Quercetin
Hiện nay trên thị trường dược phẩm Việt Nam được biết có cơng ty TNHH
Dược phẩm Đại Y sản xuất sản phẩm Cao Bạch Quả chứa Quercetin còn lại hầu
hết là nhập khẩu như Ginkogink, Tanakan, Quercetin $ Bromelain, Ginkgo
flavoglycosides,…
1.2 Một số phương pháp định lượng Quercetin
1.2.1 Định lượng Quercetin bằng phương pháp HPLC
1.2.1.1 Chương trình 1
- Cột C18 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm)
- Pha động: Methanol:nước:acid phosphoric (100:100:1)
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút

- Detector UV ở bước sóng 270 nm
- Thể tích tiêm: 20µl.
1.2.1.2 Chương trình 2
- Cột C8 (125 mm x 4mm, 5 µm)
- Pha động:
+ Dung môi A: acid phosphoric R 0,3g/l pH 2,0
+ Dung môi B: Methanol
Tỉ lệ pha động như ở bảng 1:
Thời gian (phút)
0 -1
1 – 20
20 -21

Dung môi A
60
60 -> 45
45 -> 0

6

Dung môi B
40
40 -> 55
55 -> 100


21 - 25

0
100

Bảng 1. Tỉ lệ pha động
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Detector quang phổ ở 370 nm.
- Thể tích tiêm 10µl
- Nhiệt độ: 25oC
1.2.1.3 Chương trình 3
- Cột Lichrosorb RP 18 (10µm, 250 mm x 4 mm)
- Pha động: Hỗn hợp dung môi A:B (58:42)
+ Dung môi A: dung dịch acid phosphoric 0,5%
+ Dung môi B: methanol
- Tốc độ dịng: 2,0 ml/phút
- Detector UV ở bước sóng 370 nm
- Thể tích tiêm: 20µl.
1.2.1.4 Chương trình 4
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HITACHI –LC – 1210
- Cột C 18, 300 mm x 3,9mm
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
- Thể tích tiêm: 50µl
- Pha động: methanol:nước:acetonitrile (80:19:1)
- Detector UV ở bước sóng 362 nm
- Nhiệt độ: 370C ± 10C
1.2.2 Định lượng Quercetin bằng phương pháp Von ampe
Quercetin trong công thức cấu tạo có nhóm phenol nên có khả năng oxi hóa
trên điện cực carbon, định lượng theo sóng anod bằng kỹ thuật von ampe,
dung dịch nền là đệm phosphate 0,1M, pH 4,0
Nhận xét: Qua các thực nghiệm chúng tôi nhận thấy phương pháp 1.2.1.3 và
1.2.1.4 nêu trên đều cho peak khơng đẹp, có hệ số bất đối xứng AF lớn, còn
phương pháp Von ampe do điều kiện trang thiết bị của phịng thí nghiệm khơng
cho phép nên chúng tơi khơng thể tiến hành định lượng. Vì vậy, với những trang
thiết bị sẵn có ở phịng thí nghiệm chúng tơi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng một

quy trình định lượng Quercetin bằng phương pháp HPLC cho hình dạng peak khá
cân đối và thời gian lưu ngắn, có thể ứng dụng trong cơng tác kiểm nghiệm – góp
phần quản lý chất lượng các sản phẩm chứa Quercetin.
1.3 Tổng quan về HPLC
1.3.1 Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là yếu
tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký. Nếu pha tĩnh là chất hấp phụ thì ta có

7


sắc ký hấp phụ pha thuận hay pha đảo. Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì ta có sắc ký
phân bố. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion thì ta có sắc ký trao đổi ion.
Khi đặt chất phân tích lên pha tĩnh đầu cột rồi cho pha động liên tục đi qua
chúng ta đã thực hiện quá trình sắc ký.
1.3.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình sắc ký
Quá trình phân tách trong kỹ thuật HPLC là do quá trình vận chuyển và
phân bố chất tan giữa hai pha khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ
nhất định qua cột sắc ký sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ ra khỏi cột. Tùy
theo bản chất pha tĩnh, chất tan và pha động mà quá trình rửa giải tách được các
chất ra khỏi cột sắc ký. Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được phát triển và ghi dưới
dạng peak. Tín hiệu của cả quá trình sắc ký cho ta sắc ký đồ. Một sắc ký đồ sẽ có
một hay nhiều peak phụ thuộc vào thành phần mẫu. Nếu quá trình tách sắc ký tốt
thì hỗn hợp mẫu có bao nhiêu chất sẽ có bấy nhiêu peak riêng biệt trên sắc ký đồ.
1.3.3 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống máy HPLC
Hệ thống HPLC đơn giản và đủ để làm việc theo kỹ thuật HPLC bao gồm 6
bộ phận chính sau:
1.3.3.1 Hệ thống bơm
Để bơm pha động vào cột sách. Bơm này phải điều chỉnh được áp
suất (thường từ 0-400 bar) để đẩy pha động qua hệ thống với một tốc độ dòng ổn

định, phù hợp với q trình sắc ký
Có 2 loại bơm:
- Một là bơm áp suất hằng định, ít được áp dụng
- Hai là bơm tốc độ dòng hằng định, loại này được áp dụng cho phân tách
HPLC thông thường.
1.3.3.2 Bình chứa dung mơi và hệ thống xử lý dung mơi
Bình chứa dung mơi thường bằng thủy tinh đơi khi bằng thép không
gỉ. Dung môi chạy sắc ký được lọc qua màng lọc (thường dùng màng lọc cỡ lỗ
0,45µm) và đã đuổi khí hịa tan. Trong phương pháp thơng thường chỉ cần một
bình, trong phương pháp gradient cần phải có nhiều bình.
1.3.3.3 Hệ tiêm mẫu
Để đưa mẫu phân tách vào cột. Có thể tiêm mẫu bằng tay hay tiêm
mẫu bằng hệ tiêm mẫu tự động. Thể tích tiêm được xác định nhờ vòng chứa mẫu
(tiêm tay) hay microsyringe tiêm (hệ tiêm mẫu tự động)

8


Trong sắc ký lỏng, mẫu lỏng có thể được tiêm ngay sau khi loại tạp
qua màng lọc 0,45µm, cịn mẫu rắn cần hịa tan trong 1 dung mơi thích hợp.
1.3.3.4 Cột sắc ký lỏng HPLC
Cột là bộ phận có thể coi là quan trọng nhất của hệ thống sắc ký.
Quá trình tách các chất diễn ra ở cột. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với
hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột được nhồi pha tĩnh.
Cột tách có nhiều cỡ khác nhau tùy thuộc vào mức độ và mục đích của quá trình
sắc ký.
Nói chung, các cột phân tách thường có chiều dài từ 10-25 cm,
đường kính trong từ 2-5mm.
1.3.3.5 Detector
Là bộ phân phát hiện chất phân tách. Tùy theo bản chất của các chất

cần phân tách mà sử dụng detector thích hợp bao gồm các loại sau:
- Detector hấp thụ UV-VIS
- Detector phổ phát xạ nguyên tử
- Detector huỳnh quang
- Detector điện hóa
- Detector khúc xạ kế
- Detector đo độ dẫn điện
Detector hay được sử dụng nhất là detector hấp thụ UV-VIS
1.3.3.6 Thiết bị hiển thị kết quả
Có nhiều loại nhưng đơn giản nhất là máy tự ghi để tín hiệu đo dưới
dạng peak
1.3.4 Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký
Kết quả của quá trình tách các chất được detector phát hiện, phóng đại và
ghi thành sắc ký đồ với các thông số:
Thời gian lưu tR (phút): là thời gian từ lúc tiêm mẫu thử đến khi xuất
hiện đỉnh của chất tan trên sắc ký đồ, tR càng lớn chất tan bị lưu giữ càng mạng và
tốc độ di chuyển của nó càng nhỏ. Thời gian lưu là thơng tin về mặt định tính trên
sắc ký đồ của một chất tan. Trong những điều kiện sắc ký nhất định (cột, pha
động, nhiệt độ, tốc độ dịng,…) thì thời gian lưu là hằng số đối với một chất tan.
- Thời gian chết t0: là thời gian lưu của một chất không bị lưu giữ bởi pha
-

tĩnh.
Thời gian lưu thực (tR’): tR’ = tR – t0

9


-

Thể tích lưu V R: là thể tích của lượng pha động bị đẩy ra khỏi cột từ lúc

bắt đầu tiêm mẫu thử đến khi xuất hiện đỉnh của chất tan trên sắc ký đồ:
VR=tR.Fc (Fc là thể tích pha động trên một đơn vị thời gian)
- Hệ số phân bố K: K= k. Cs/Cm
Cs và Cm là nồng độ chất tan ở pha tĩnh và pha động tương ứng, k là hệ
số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan
do pha động vận chuyển khi nó đi qua cột. K chỉ phụ thuộc vào: bản chất chất tan,
bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ.
K lớn thì tR lớn (ra muộn)
K nhỏ thì tR nhỏ (ra sớm)
- Hệ số dung lượng k’: là một đại lượng dùng để mô tả tốc dộ di chuyển
của một chất:
k’= – 1
k’ phụ thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, đặc tính của pha tĩnh, pha động
và đặc điểm của cột. Với một chất k’ càng lớn thì tốc độ di chuyển càng thấp. Nếu
k’ lớn, peak bị doãng, độ nhạy kém. Nếu k’ nhỏ thì t R cũng nhỏ và sự tách kém.
Trong thực tế k’ nằm trong khoảng từ 2-5 là tốt nhất. Hai chất chỉ được tách ra
khỏi nhau nếu chúng có giá trị k’ khác nhau.
Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tách sao cho
1≤k’≤8
-

Nếu k’≤1 thì peak ra sớm dễ lẫn với peak tạp
Nếu k’≥8 thì thời gian phân tách sẽ quá dài
Độ chọn lọc α là một biểu diễn về mức độ tách giữa hai đỉnh. Độ chọn
lọc là tỷ số giữa thời gian lưu của các đỉnh trên sắc ký đồ.
α=
α khác 1 càng nhiều thì khả năng tách càng rõ rang, tối ưu từ 1,5-2. Nếu
α càng lớn 2 chất tách nhau càng tốt, α nhỏ 2 chất khó tách nhau, nhưng

-

α q lớn thì thời gian phân tách quá dài
Số đĩa lý thuyết N: đặc trưng cho hiệu lực của cột
N=16 []2
Số đĩa lý thuyết N càng lớn hiệu lực cột càng cao (đỉnh nhọn, hẹp)
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, thì chiều cao của đĩa lý thuyết H
được tính theo cơng thức: H=
Trị số H càng nhỏ thì hiệu lực cột càng cao

10


-

Độ phân giải R: đặc trưng cho mức độ tách của 2 chất ra khỏi nhau trên
một điều kiện sắc ký. Độ phan giải của 2 peak ở cạnh nhau được tính
theo cơng thức:
Rs phụ thuộc vào: hiệu lực cột, độ chọn lọc α, hệ số dung lượng k’, số

đĩa lý thuyết.
Trong thực tế: Rs ≤ 0,4: dạng của đỉnh không rõ, bị chồng phủ lên nhau
nhiều
Rs = 0,5-1: Hai đỉnh tách nhau, có thể xác định được nhưng bị chồng
phủ nhiều hay ít.
Rs > 1 Hai đỉnh có thể bắt đầu tách nhau nhưng chưa hoàn toàn
Rs tối ưu ≥ 1,5
Để tang độ phan giải Rs ta có thể tang N (dựng cột dài hơn, giảm tốc độ
dòng của pha động), tăng k’ (thay đổi thành phần pha động), tăng α (thay loại pha

tĩnh hoặc thay đổi thành phần pha động)
- Hệ số bất đối xứng AF: AF =
Trong đó: W1/20: chiều rộng của peak được đo ở 1/20 chiều cao của peak
a: khoảng cách tư đường vng góc hạ từ đỉnh peak đến mép đường cong phía
trước tại vị trí 1/20 chiều cao của peak
Hệ số bất đối xứng AF càng gần 1 thì peak càng có dạnh phân phối
chuẩn Gauss nên kết quả tính diện tích peak càng chính xác. Khi AF quá lớn, điểm
cuối của peak rất khó xác định, peak bị kéo đi dài, khi tính diện tích peak sẽ
mắc nhiều sai số,
Trong phép định lượng, yêu cầu: 0,9≤AF≤2
Muốn làm cho peak cân xứng hơn ta có thể làm giảm thể tích chết (đoạn
nối từ cột tới Detector) thay đổi thành phần pha động sao cho khả năng rửa giải
tăng lên, điều chỉnh pH để chất tan tồn tại ở một dạng thích hợp, giảm bớt lượng
đưa mẫu vào cột bằng cách pha loãng mẫu phân tách hoặc giảm thể tích tiêm.
1.3.5 Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký
1.3.5.1 Lựa chọn pha tĩnh cho HPLC
Pha tĩnh trong HPLC là chất nhồi cột, là yếu tố quan trọng quyết
định sự tách của một hỗn hợp nhiều chất

11


Vì phương pháp sắc ký sử dụng trong nghiên cứu này là sắc ký hấp
phụ nên các phân tích dưới đây chỉ tập trung vào lựa chọn pha tĩnh cho sắc ký hấp
phụ
Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC: trơ và bền vững trong mơi trường
sắc ký, tính chất bề mặt ổn định, cỡ hạt phải tương đối ổn định, có khả năng tách
chọn lọc một hỗn hợp chất tan trong những điều kiện sắc ký xác định, cân bằng
của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt.
Pha tĩnh thường được chế tạo trên nền Silica, nền oxit nhôm, nền

hợp chất cao phân tử (Cellulose) hay trên nền mạch cacbon. Trong sắc ký hấp phụ,
pha tĩnh trên nền Silica có nhiều ưu điểm và sử dụng nhiều nhất. Có thể phân loại

chất nhồi cột theo gốc siloxan:
-

R là các nhóm phân cực (ưa nước): nhóm OH hoặc các alkylamin –

CH2-NH2, alkynitril –CH2-CN. Sử dụng làm pha tĩnh trong sắc ký hấp phụ pha
thuận để phân tích các chất ít hoặc khơng phân cực
R là các nhóm ít phân cực như octyl, octadecyl, phenyl, được điều
chế bằng cách alkyl hóa các nhóm OH trên bề mặt silica trung tính bằng các gốc
alkyl-R của mạch cacbon (C2,C8, C18) hay các gốc carbom vịng (phenyl). Do các
nhóm OH thân nước được thay bằng các gốc R kỵ nước nên bề mặt trở nên ít phân
cực.
1.3.5.2 Lựa chọn pha động cho HPLC
Pha động là dung mơi để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột sắc ký, là
yếu tố thứ 2 quyết định hiệu suất tách của một hỗn hợp pha động có thể là nước,
dung mơi hữu cơ hay hỗn hợp dung môi theo tỷ lệ nhất định.

12


Pha động trong HPLC ảnh hưởng tới rất nhiều thông số của quá trình
sắc ký như độ chọn lọc α, thời gian lưu t R, hiệu lực tách của cột, độ phân giải R s,
độ rộng của peak sắc ký,…
Chính vì vậy nên khi các điều kiện khác đã cố định thì việc lựa chọn
pha động thích hợp là rất quan trọng
Yêu cầu của một pha động: phải trơ đối với pha tĩnh, hòa tan được
chất phân tách, bền vững theo thời gian, có độ tinh khiết cao, nhanh đạt cân bằng

trong quá trình sắc ký, phù hợp với detector, có tính kinh tế và đảm bảo mơi
trường.
Trong sắc ký pha đảo, pha động là hệ dung môi hữu cơ phân cực
như: nước, methanol, acetonitril,…hay hỗn hợp của chúng. Các dung mơi này có
thể hịa tan thêm một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ.
Có 4 yếu tố quan trọng của pha động ảnh hưởng đến kết quả tách
của một hỗn hợp mẫu: bản chất của dung môi đê pha pha động, thành phần của
các chất trong pha động, pH của pha động và tốc độ dòng của pha động.
1.3.5.3 Chọn đệm pH
Trong sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion, sắc ký hấp phụ mà chất
tan có tính chất acid hay base thường phải cho thêm đệm vào pha động để ổn định
pH cho quá trình sắc ký. Giá trị pH thích hợp sẽ làm tăng hiệu lực tách của sắc ký.
Thông thường với chất tan là aicd hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid
nhưng cũng có trường hợp đặc biệt, cịn trong sắc ký tạo cặp ion thì pH tùy từng
trường hợp.
1.3.5.4 Tốc độ dịng
Sau khi có pha tĩnh, pha động, pH thích hợp, để tăng hiệu lực tách
của quá trình sắc ký phải chọn tốc độ dòng của pha động phù hợp.
1.3.5.5 Lựa chọn detector
Khi hệ pha động rửa giải các chất ra khỏi cột, chúng được ghi nhận
bởi detector và chuyển thành tín hiệu được ghi trên sắc ký đồ
Detector huỳnh quang và detector điện hóa có độ nhạy và độ chọn
lọc cao, chủ yếu được dùng trong phân tích vết và phân tích dịch sinh học
Detector từ ngoại (đèn Deuterium) và khả kiến (đèn Tungsten) có thể
làm việc ở bước sóng tùy chọn theo tính chất hập thụ của chất cần phân tích
1.3.6 Cách đánh giá peak

13

-

Đánh gí diện tích peak: để tính diện tích peak có thể dùng tính phân

kế hoặc dùng máy tính đã cài sẵn chương trình. Phương pháp này có thể dùng cho
các peak không bị trôi đường nền và cả peak có đường nền bị trơi. Phương pháp
này chỉ cần điểm đầu và điểm cuối của peak được nhận ra chính xác và cho kết
quả tốt với nồng độ trung bình, vừa và cao.
1.3.7 Ứng dụng của HPLC
Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính
1.3.7.1 Định tính và thử độ tinh khiết
Thời gian lưu của chất thử trên sắc đồ phải tương ứng với thời gian
lưu chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ
1.3.7.2 Sắc ký điều chế
Qua quá trình sắc ký các chất được tách ra và dịch rửa giải được
hứng riêng rồi bốc hơi dung môi thu lấy chất
1.3.7.3 Định lượng và xác định giới hạn tạp chất
Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn trong định lượng chất
trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất. Các phương pháp định lượng sắc ký
đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích peak
của nó. Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong HPLC:
a. Phương pháp chuẩn ngoại:
Nguyên tắc: So sánh trực tiếp chiều cao hoặc diện tích đỉnh của
mẫu thử với chiều cao hoặc diện tích đỉnh của một dung dịch chất chuẩn tương
ứng có nồng độ đã biết
Cả hai mẫu thử và mẫu chuẩn đều được tiến hành sắc ký trong
cùng điền kiện. So sánh diện tích (hoặc chiều cao) peak của mẫu thử với mẫu
chuẩn đã biết nồng độ. Kết quả có thể được tính theo cách chuẩn hóa một điểm
hay từ đường chuẩn tuyến tính.
b. Phương pháp chuẩn nội

Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất
chuẩn thứ hai có thời gian lưu và đáp ứng gần giống mẫu thử vào cả mẫu chuẩn và
mẫu thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai được gọi là chất chuẩn nội.
c. Phương pháp thêm chuẩn
Phương pháp này được dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của
chất phụ hay quá trình xử lý mẫu phức tạp. Dung dịch mẫu thử được thêm một
lượng chính xác chất chuẩn. Các peak thu được của dung dịch chuẩn và thử được

14


đo cùng một điều kiện sắc ký. Phương pháp này có thể thực hiện nhiều lần.
Trường hợp đơn giản nhất, với một lần thêm chuẩn, nồng độ chưa biết của mẫu
được tính bằng sự chênh lệch nồng độ và độ tăng của diện tích peak. Với phương
pháp thêm nhiều lần ở các nồng độ khác nhau ta có phương pháp thêm đường
chuẩn.
d. Phương pháp chuẩn hóa diện tích peak:
Ngun tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp
nhiều thành phần được tính bằng tỉ lệ phầm trăm diện tích peak của nó so với tổng
diện tích của tất cả các peak trên sắc đồ, trừ peak của dung môi.
Yêu cầu:
- Tất cả các thành phần đều được rửa giải và phát hiện
Tất cả các thành phần có đáp ứng giống nhau với detector. Áp dụng: ít
dùng, chỉ dùng trong xác định hàm lượng tạp chất khi coi đáp ứng của các tạp
chất là như nhau.

PHẦN 2
15

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
2.1. Nguyên liệu và phương pháp thực nghiệm
2.1.1. Nguyên liệu
-

Các mẫu Quercetin của Liên hiệp khoa học sản xuất công nghệ mới.

-

Chất đối chiếu: của Viện đo lường chất lượng, hàm lượng là 98.0%.

2.1.2. Thiết bị dụng cụ hóa chất
2.1.2.1. Thiết bị dụng cụ
- Máy quang phổ UV – VIS lamda EZ 210.
- Máy siêu âm Sonorex.
- Máy đo pH Meter 3305 – Jenway.
- Máy lọc chân khơng Satorius.
- Cần phân tích metler AB 204 có độ chính xác 0,1 mg.
- Bình định mức các loại: 10ml, 20ml, 100ml.
- Cốc có mơ các loại 100ml, 200ml, 500ml.
- Pipet chính xác các loại, đũa thủy tinh, màng lọc 0,45μm.
- Bơm tiêm, lọ đựng mẫu.
- Tủ sấy.
2.1.2.2. Hóa chất
-

Quercetin: chất chuẩn – hàm lượng 98,0%, Rutin chuẩn – hàm lượng

98,2% do Viện đo lường chất lượng sản xuất.
-

Acid phosphoric đặc (H3PO4) (PA).

-

Muối Kali dihdrophosphat (KH2PO4) (PA).

16


-

Methanol, acetonitril dùng cho HPLC (hãng Merk/ Prolabor).

-

Nước cất 2 lần dùng cho HPLC

2.1.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1.3.1. Phương pháp nghiên cứu
-

Tham khảo các phương pháp định lượng Quercetin đã công bố.

-

Tham khảo các phương pháp định lượng Quercetin bằng HPLC.

-

Dựa vào cơng thức cấu tạo, tính chất hóa lý của Quercetin cũng như

điều kiện thực nghiệm ở nước ta hiện nay để xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng
Quercetin bằng phương pháp HPLC.
-

Bằng thực nghiệm nghiên cứu các điều kiện tiến hành để xây dựng

phương pháp tiến hành:
+ Khảo sát điều kiện sắc ký: chọn cột, pha động, bước sóng, thể tích tiêm và tốc độ
dịng thích hợp để định lượng.
+ Xây dựng phương pháp định lượng.
2.1.3.2 Đánh giá phương pháp vừa xây dựng về các mặt:
-

Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký.

-

Đánh giá sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ Quercetin và diện

tích peak trên sắc đồ.
-

Đánh giá tính chính xác của phương pháp.

-

Đánh giá tính đúng của phương pháp.

-

Đánh giá tính đặc hiệu của phương pháp.

2.1.3.3. Một số cơng thức tính tốn trong xử lý thống kê kết quả
-

Giá trị trung bình:

-

Độ lệch chuẩn:

17


-

Độ lệch chuẩn tương đối (RSD (%)):

-

Sai số chuẩn:

-

Sai số tương đối:

-

Khoảng tin cậy:

2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét
2.2.1. Xây dựng phương pháp định lượng Quercetin bằng HPLC
2.2.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký
Chọn phương pháp sắc ký: Quercetin là chất hữu cơ phân cực, tan
trong nước và dung mơi hữu cơ phân cực. Vì vậy để định lượng tốt, chúng tôi chọn
phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo.
Chọn cột sắc ký: Trong phương pháp định lượng HPLC pha đảo, cột
sắc ký thông dụng là C8, C18,…Với điều kiện sẵn có của phịng thí nghiệm, chúng tơi sử
dụng cột Nucleosil (250 x 4mm, 5μm).
Chọn pha động: Trong phương pháp định lượng HPLC pha đảo, pha
động thông dụng nhất là acetonitril, methanol, nước, hỗn hợp dung mơi trên. Do
Quercetin là một polyphenol có bản chất acid nên để định lượng tốt thì pha động được
thêm acid phosphoric (H3PO4).
Chọn bước sóng: Dựa vào cấu trúc Quercetin có 2 vịng benzen và
vịng γ- pyron nên có khả năng hấp phụ quang phổ tử ngoại. Do Quercetin có 3 –OH tự
do nên có đỉnh hấp thụ cực đại trong vùng 350 – 385 nm (băng I), ngoài ra Quercetin
cũng có một đỉnh hấp thụ trong vùng 250 – 280 nm (băng II).
2.2.1.2. Khảo sát chọn điều kiện sắc ký
Trên cơ sở có sẵn cột Nucleosil C18 (250 x 4nm; 5μm), qua tham khảo các
tài liệu, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện sắc ký như pha động, tốc độ dịng và
bước sóng phát hiện cho phép phân tích và định lượng tốt Quercetin.

18


a. Khảo sát chọn bước sóng thích hợp
Để xác định bước sóng thích hợp phát hiện Quercetin, chúng tơi tiến hành quét
phổ UV trên máy quang phổ UV – VIS Lambda EZ210.

Tiến hành: Cân chính xác khoảng 20,0 mg Quercetin chuẩn cho vào bình định
mức 20,0 ml. Hịa tan và pha loãng bằng Methanol – acetonitril – đệm phosphat 0,01M
pH 3 (tỷ lệ 30: 60: 10) vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 1ml dung dịch trên cho
vào bình định mức 10,0 ml; thêm Methanol – acetonitril – đệm phosphat 0,01M pH 3 (tỷ
lệ 30: 60: 10) vừa đủ đến vạch, lắc đều.
Quét phổ hấp phụ tử ngoại của dung dịch này với dải sóng từ 200 – 600 nm, cuvet
thạch anh dày 1cm, mẫu trắng là hệ dung môi Methanol – acetonitril – đệm phosphat
0,01M pH 3 (tỷ lệ 30: 60: 10).
Kết quả ghi ở hình 2.1

Hình 2.1 Phổ hấp thu của Quercetin
Nhận xét: Phổ hấp phụ của dung dịch Quercetin chuẩn 0,1mg/ml cho cực
đại hấp phụ ở 256,5 và 3371,5 nm. Để giảm ảnh hưởng của dung môi và tạp chất nhưng
vẫn đảm bảo định lượng được Quercetin chúng tơi chọn bước sóng đo là 371nm.
b. Khảo sát chọn thành phần pha động và tốc độ dòng

19


 Lựa chọn pha động:
Trong phương pháp HPLC pha đảo, pha động hay dùng nhất là acetonitril, methanol,
nước,…Khi chạy thử pha động với dung môi và hệ dung môi:
Methanol 100%
Methanol: acetonitril: nước
Methanol: acetonitril
Chúng tôi nhận thấy với hệ pha động methanol: acetonitril sẽ cho peak có hệ số bất
đối xứng AF nhỏ hơn, cân đối hơn
 Lựa chọn hệ đệm:
Trên cơ sở lý thuyết trên, chúng tôi khảo sát hệ pha động là hỗn hợp Methanol,
acetonitril với các dung dịch đệm có: pH = 3,5, pH = 3, pH = 2,5. Qua thực nghiệm

chúng tôi nhận thấy khi thêm hệ đệm phosphat 0,01M pH = 3 vào pha động thì hệ số bất
đối xứng AF nhỏ hơn, hình ảnh peak đẹp hơn hệ đệm pH = 2,5 và pH = 3,5. Hơn nữa khi
pH = 2,5 thì cột dễ bị hỏng hơn pH = 3. Do ở pH < 3 các nhóm liên kết của Silica pha
liên kết sẽ bị khử. Vì vậy chúng tơi chọn hệ pha động là hỗn hợp Methanol: acetonitril:
đệm phosphat 0,01M pH = 3 để tiếp tục khảo sát.
 Chọn tỉ lệ pha động:
Thực hiện thay đổi thành phần pha động với mục đích chọn được pha động có khả
năng tách tốt nhất, chúng tơi tiến hành khảo sát hệ pha động là hỗn hợp Methanol:
acetonitril: đệm phosphat 0,01M pH = 3 với các tỉ lệ khác nhau, chúng tôi thấy pha động
với tỉ lệ Methanol: acetonitril: đệm phosphat 0,01M pH = 3 (30: 60: 10) thì thời gian lưu
tR= 4,2 phút là hệ tối ưu nhất cho peak cân xứng, đồng thời thời gian chạy sắc ký là phù
hợp.
 Khảo sát tốc độ dòng:

20


Tiếp tục tiến hành khảo sát khả năng tách Quercetin trong mẫu chuẩn và mẫu thử với
pha động đã chọn: Methanol - acetonitril - đệm phosphat 0,01M pH = 3 (30: 60: 10) với
các tốc độ dòng khảo sát 0,5; 0,6; 0,8; 1,0 ml/phút nhằm chọn được tốc độ dòng thích hợp
đảm bảo việc phân tách và định lượng Quercetin đồng thời rút ngắn thời gian phân tích.
Qua kết quả thực nghiệm chúng tôi nhận thấy với cột nucleosil C18 (250 x 4 nm,
5μm), pha động là Methanol - acetonitril - đệm phosphat 0,01M pH = 3 (30: 60: 10), tốc
độ dòng là 0,6 ml/phút, nhiệt độ cột ở nhiệt độ phịng cho kết quả tách tốt, peak cân đối,
có thời gian phân tích ngắn (thời gian lưu khoảng 4,2 phút)
 Điều kiện sắc ký lựa chọn:
- Cột sắc ký Nucleosil C18 (250 x 4 mm, 5 µm).
- Detector UV: λ = 371nm.
- Pha động: Methanol; acetonitrile; đệm phosphate 0,01M pH 3 = 30:60:10
- Thể tích tiêm: 10 µl

- Tốc độ dịng: 0,6ml/ phút.
- Nhiệt độ phân tích: Nhiệt độ phịng thí nghiệm.
2.2.1.3. Cách tiến hành
a. Chuẩn bị mẫu thử; mẫu chuẩn và pha động
 Dung dịch thử:
Cân chính xác khoảng 10,0 mg Quercetin nguyên liệu cho vào bình định mức
100,0 ml. Hịa tan và pha lỗng bằng hệ dung mơi pha động. Lấy chính xác 1,0 ml dung
dịch trên cho vào bình định mức 10,0 ml. Thêm dung mơi pha động vừa đủ đến vạch, lắc
đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
 Dung dịch chuẩn (đối chiếu):
Cân chính xác khoảng 10,0 mg Quercetin nguyên liệu cho vào bình định mức 100,0
ml. Hịa tan và pha lỗng bằng hệ dung mơi pha động. Lấy chính xác 1,0 ml dung dịch

21


trên cho vào bình định mức 10,0 ml. Thêm dung môi pha động vừa đủ đến vạch, lắc đều.
Lọc qua màng lọc 0,45 µm.
 Mẫu trắng:
Dung mơi pha động: Methanol: acetonitrile: đệm phosphate 0,01M pH 3
(30:60:10).
 Pha động:
+ Acetonitril, methanol: siêu âm đuổi khí 15 phút.
+ Đệm phosphate 0,01M pH 3:
+ Hòa tan 0,68 g KH 2PO4 trong nước và pha loãng bằng nước vừa đủ đến vạch 500
ml. Điều chỉnh về pH 3,0 bằng H3PO4 đặc. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, siêu âm đuổi khí
15 phút.
b. Chương trình sắc ký
 Cột Nucleosil C18 (250 x 4 mm, 5 µm).
 Pha động: Methanol; acetonitrile; điệm phosphate 0,01M pH 3 (30:60:10).

 Tốc độ dịng: 0,6 ml/ phút.
 Thể tích tiêm: 10 µl.
 Detector UV 371 nm.
 Nhiệt độ phân tích: nhiệt độ phịng.
Nhận xét:
Với chương trình sắc ký trên chúng tơi thu được sắc ký đồ của Quercetin hình 2.2
với peak cân đối, thời gian lưu ngắn tR = 4,213 phút.

22


c.

Tính kết

quả

Ghi diện tích thu được trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử tương ứng. Tính
hàm lượng % của Quercetin có trong mẫu thử dựa trên mẫu chuẩn Quercetin đã biết hàm
lượng theop cơng thức sau:

Trong đó:
At và Ae : là diện tích mẫu thử tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAU.min).
mt và me : là hàm lượng tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn (mg).
p

: là hàm lượng % ghi trên nhãn của Quercitin chuẩn.
2.2.1.4. Đánh giá phương pháp định lượng Quercetin
Chúng tôi tiến hành đánh giá phương pháp định lượng Quercetin nguyên

liệu bằng HPLC mới xây dựng với các chỉ tiêu sau:
- Đánh giá tính thích hợp của hệ thống sắc ký.
- Đánh giá tính chính xác.
- Đánh giá tính truyền tính.
- Đánh giá tính đúng.
- Đánh giá tính đặc hiệu.

23


a. Thử tính thích hợp của hệ thống
Nguyên tắc: Tính thích hợp của hệ thống HPLC được biểu thị qua hệ số bất đối
xứng, độ lệch chuẩn tương đối RSD của 5 phép thử song song đối với thời gian.
Tiến hành: Cân chính xác khoảng 10,0 mg Quercetin nguyên liệu cho vào bình
định mức 100,0 ml. Hịa tan và pha lỗng bằng hệ dung mơi pha động (Methanol;
acetonitrile; điệm phosphate 0,01M pH 3 (30:60:10)) vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính
xác 1,0 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 10,0 ml, thêm dung môi pha động vừa
đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45 µm, dung dịch tiêm sắc ký.
Tiêm 5 lần mẫu chuẩn vào hệ thống HPLC, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã
chọn ở trên. Ghi kết quả: thời gian lưu, diện tích và hệ số bất đối của peak tạo bởi
Quercetin.
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký được trình bày ở bảng 2.1

24


Nhận xét:
Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC cho thấy độ lệch chuẩn tương
đối (RSD%) của thời gian lưu và diện tích peak Quercetin trong 5 phép thử đều nhỏ hơn
2%, các giá trị của hệ số bất đối xứng AF nằm trong khoảng cho phép 0,9 ≤ AF ≤ 2. Điều

này chứng tỏ hệ thống HPLC mà chúng tôi sử dụng phù hợp và đảm bảo sự ổn định cho
phép phân tích định lượng Quercetin.
b. Tính chính xác
Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được đánh giá bằng độ lệch chuẩn
hoặc độ lệch chuẩn tương đối của 6 lần định lượng mẫu thử.
Xác định ở nồng độ làm việc của Quercetin là 0,01mg/ml.
Tiến hành:
Pha mẫu chuẩn: Cân lượng Quercetin chuẩn chính xác khoảng 10,0 mg rồi pha
trong bình định mức 100,0 được dung dịch 0.1 mg/ml, lấy chính xác 1,0 ml dung dịch
trên pha lỗng trong bình định mức 10,0 ml được dung dịch có nồng độ khoảng 0,01
mg/ml.
Pha 6 mẫu thử Quercetin có nồng độ khoảng 0,01 mg/ml. Cách pha như pha mẫu ở
trên.
Tiến hành sắc ký và ghi kết quả của mẫu chuẩn và 6 mẫu thử. Kết quả khảo sát
tính chính xác được trình bày ở bảng 2.2

25